JPH07116232B2 - 新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを含有する抗菌剤 - Google Patents
新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを含有する抗菌剤Info
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- JPH07116232B2 JPH07116232B2 JP1089100A JP8910089A JPH07116232B2 JP H07116232 B2 JPH07116232 B2 JP H07116232B2 JP 1089100 A JP1089100 A JP 1089100A JP 8910089 A JP8910089 A JP 8910089A JP H07116232 B2 JPH07116232 B2 JP H07116232B2
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は特定のアミノ酸配列を有する新規なポリペプチ
ド、及び該ポリペプチドを有効成分として含有する抗菌
剤に関する。
ド、及び該ポリペプチドを有効成分として含有する抗菌
剤に関する。
従来技術の問題点 近年、食品加工においては滅菌処理，無菌包装技術の発
展によって、食品の細菌学的安全性は改善されている
が、加工食品を殺菌処理したのち，あるいは殺菌処理せ
ずに、通常の環境下（無菌環境下ではない）において包
装することも未だに行われている。後者の場合には、食
品の包装中，または保存中，輸送中における細菌の混入
により、製品の品質を損なう虞れがある。この品質劣化
の問題を防止するためには、製品中に防腐剤を添加し
て、細菌の増殖を抑制しなければならない。
展によって、食品の細菌学的安全性は改善されている
が、加工食品を殺菌処理したのち，あるいは殺菌処理せ
ずに、通常の環境下（無菌環境下ではない）において包
装することも未だに行われている。後者の場合には、食
品の包装中，または保存中，輸送中における細菌の混入
により、製品の品質を損なう虞れがある。この品質劣化
の問題を防止するためには、製品中に防腐剤を添加し
て、細菌の増殖を抑制しなければならない。
しかしながら、防腐剤として従来用いられて来た物質
は、人体に好ましくない影響を与える場合があり、より
安全な物質の開発が望まれていた。
は、人体に好ましくない影響を与える場合があり、より
安全な物質の開発が望まれていた。
上記のような技術の現状に鑑みて、本発明者らは、種々
の天然物の中から、人体に対して，より安全な抗菌性物
質を探索してきた結果、ロイヤルゼリー中に優れた抗菌
作用を有する物質が存在することを見いだした。この物
質を分離，精製し、分析した結果、その有効物質が、未
知のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを確
認し、本発明を完成するに至った。
の天然物の中から、人体に対して，より安全な抗菌性物
質を探索してきた結果、ロイヤルゼリー中に優れた抗菌
作用を有する物質が存在することを見いだした。この物
質を分離，精製し、分析した結果、その有効物質が、未
知のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを確
認し、本発明を完成するに至った。
該新規物質は、100℃,15分間の加熱処理の後にも抗菌作
用を維持しており、包装後、加熱殺菌される食品包装製
品にも使用できることが判明した。
用を維持しており、包装後、加熱殺菌される食品包装製
品にも使用できることが判明した。
従って本発明の目的は、特定のアミノ酸配列を有する新
規なポリペプチドを提供することである。
規なポリペプチドを提供することである。
本発明の他の目的は、上記新規なポリペプチドを有効成
分として含有し、人体に対して安全な抗菌剤，特にグラ
ム陽性菌に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤を提供
することである。
分として含有し、人体に対して安全な抗菌剤，特にグラ
ム陽性菌に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤を提供
することである。
本発明の更に他の目的は、主として食品加工においてあ
らかじめ食品に混入した後、通常の加熱殺菌処理に耐え
る抗菌剤を提供することである。
らかじめ食品に混入した後、通常の加熱殺菌処理に耐え
る抗菌剤を提供することである。
問題点を解決する手段 本発明に係る新規物質は、下記のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。
ポリペプチドである。
（但し、３番目と31番目、21番目と38番目のシステイン
（Cys）がジスルフィド結合を有する。） 本発明によるグラム陽性菌に対する抗菌剤は、上記ポリ
ペプチドを有効成分として含有する。
（Cys）がジスルフィド結合を有する。） 本発明によるグラム陽性菌に対する抗菌剤は、上記ポリ
ペプチドを有効成分として含有する。
上記のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、グラム陽
性菌に対して優れた抗菌作用を有し、該ポリペプチドを
有効成分として含有する抗菌剤は加工食品に添加したと
き優れた防腐効果を有し、更に通常の加熱殺菌処理の後
にも抗菌活性が維持される。
性菌に対して優れた抗菌作用を有し、該ポリペプチドを
有効成分として含有する抗菌剤は加工食品に添加したと
き優れた防腐効果を有し、更に通常の加熱殺菌処理の後
にも抗菌活性が維持される。
実施例 ロイヤルゼリー中に含まれるポリペプチドを下記の工程
に従い精製し、各精製段階における抗菌活性を検査し
た。
に従い精製し、各精製段階における抗菌活性を検査し
た。
［試験例１］ポリペプチドの分離，精製 （１−１） ポリペプチドの精製（第１段階） 実施例１の前段に記載された方法と同一の精製方法で、
ロイヤルゼリー50gから、約1.71gの粗製物を得た。尚、
上述の方法は、図１に工程図として示されている。
ロイヤルゼリー50gから、約1.71gの粗製物を得た。尚、
上述の方法は、図１に工程図として示されている。
得られた粗製物1gを、20mlの20mM塩化ナトリウムを含む
10mM燐酸アンモニウム緩衝液（pH4.8）に溶解し、セフ
ァデックスＧ−100カラム（直径2.6cm×長さ90cm、ファ
ルマシア社製）に重層し、同緩衝液を用いて約20ml/時
間の流速でゲル過を行い、溶出液を10mlづつ分取し
た。
10mM燐酸アンモニウム緩衝液（pH4.8）に溶解し、セフ
ァデックスＧ−100カラム（直径2.6cm×長さ90cm、ファ
ルマシア社製）に重層し、同緩衝液を用いて約20ml/時
間の流速でゲル過を行い、溶出液を10mlづつ分取し
た。
ゲル濾過後、各分画より0.5mlづつ採取し、試験例３に
示した試験方法に従い、ラクトバシラス・ヘルベティク
ス菌（Lactobacillus helveticus ss jugurti）に対す
る増殖抑制活性を抗菌作用の指標として調べた。また、
ペプチドの溶出パターンは、分光光度計（日本分光社
製）を用いて、254nmの吸光度で測定した。
示した試験方法に従い、ラクトバシラス・ヘルベティク
ス菌（Lactobacillus helveticus ss jugurti）に対す
る増殖抑制活性を抗菌作用の指標として調べた。また、
ペプチドの溶出パターンは、分光光度計（日本分光社
製）を用いて、254nmの吸光度で測定した。
これらの結果を図２に示した。図において、横軸は分画
の数（60分画）、左縦軸は吸光度（●−●）、右縦軸は
微生物の増殖抑制率（○−○）をそれぞれ示す。
の数（60分画）、左縦軸は吸光度（●−●）、右縦軸は
微生物の増殖抑制率（○−○）をそれぞれ示す。
この結果から、Ve（排除容積）380〜430mlの画分で強力
な抗菌活性が観察され、抗菌活性のピークは蛋白質の最
大溶出のピークと異なることが判明した。
な抗菌活性が観察され、抗菌活性のピークは蛋白質の最
大溶出のピークと異なることが判明した。
抗菌活性の高い画分（Ve380〜430ml）を集め、蒸留水に
対して透析したのち、凍結乾燥し、11.7mgの粗精製物を
得た。この段階での粗精製物の収率は、上記粗製物に関
して約1.2％（重量、以下特記しない場合は同じ）ロイ
ヤルゼリーに関して約0.04％であった。
対して透析したのち、凍結乾燥し、11.7mgの粗精製物を
得た。この段階での粗精製物の収率は、上記粗製物に関
して約1.2％（重量、以下特記しない場合は同じ）ロイ
ヤルゼリーに関して約0.04％であった。
（１−２） ポリペプチドの精製（第２段階） 試験例（１−１）で得られた粗精製物10mgを0.1mlの注
射用蒸留水に溶解し、0.1％（容量）トリフルオロ酢酸
水溶液で平衡化した高速液体クロマトグラフィーのアク
アポアRP-300（C8型）カラム（直径4.6mm×長さ100mm）
に吸着させた後、90％（容量）アセトニトリルを含む0.
1％（容量）トリフルオロ酢酸水溶液の直線濃度勾配（1
5〜35％勾配、流速0.7ml/min）によって連続的に溶出
し、連続的に吸光測定を行った。
射用蒸留水に溶解し、0.1％（容量）トリフルオロ酢酸
水溶液で平衡化した高速液体クロマトグラフィーのアク
アポアRP-300（C8型）カラム（直径4.6mm×長さ100mm）
に吸着させた後、90％（容量）アセトニトリルを含む0.
1％（容量）トリフルオロ酢酸水溶液の直線濃度勾配（1
5〜35％勾配、流速0.7ml/min）によって連続的に溶出
し、連続的に吸光測定を行った。
尚、上述の測定において、高速液体クロマトグラフィー
は日本分光Tri VI型を、吸収測定は日本分光UNIDEC-100
型検出器を用いて、220nmの波長で行った。
は日本分光Tri VI型を、吸収測定は日本分光UNIDEC-100
型検出器を用いて、220nmの波長で行った。
上記連続的溶出の間に、適宜の間隔でサンプルを抽出
し、各画分の抗菌活性を、試験例３に記述した方法に従
って、ラクトバシラス・ヘルベティクス菌（Lactobacil
lus helveticus ss jugurti）に対する増殖抑制を測定
した。
し、各画分の抗菌活性を、試験例３に記述した方法に従
って、ラクトバシラス・ヘルベティクス菌（Lactobacil
lus helveticus ss jugurti）に対する増殖抑制を測定
した。
この結果、抗菌活性をもつメインピークはアセトニトリ
ル32％（容量）で抽出した画分であり、この分画に強い
抗菌活性が認められた。
ル32％（容量）で抽出した画分であり、この分画に強い
抗菌活性が認められた。
活性のある画分を集め、凍結乾燥して、精製物9mgを得
た。
た。
［試験例２］アミノ酸配列の決定 （２−１） 気相プロテインシークエンサーによる分析 試験験例１（１−２）と同一の方法で得られた粗精試料
（以下、この試験例において、単に「試料」と記載す
る。）を気相プロテインシークエンサーModel 470A（ア
プライドバイオシステム社製）を用いてエドマン分解
し、得られたPTHアミノ酸をPTHアナライザーModel 120A
（アプライドバイオシステム社製）に注入し、常法によ
り分析した。
（以下、この試験例において、単に「試料」と記載す
る。）を気相プロテインシークエンサーModel 470A（ア
プライドバイオシステム社製）を用いてエドマン分解
し、得られたPTHアミノ酸をPTHアナライザーModel 120A
（アプライドバイオシステム社製）に注入し、常法によ
り分析した。
PTHアミノ酸の検出は269nmの紫外吸収にて行い、あらか
じめ標準PTHアミノ酸（和光純薬社製）各1n molを同一
の系で分離して得た各PTHアミノ酸の保持時間と、検体
の保持時間から同定を行った。
じめ標準PTHアミノ酸（和光純薬社製）各1n molを同一
の系で分離して得た各PTHアミノ酸の保持時間と、検体
の保持時間から同定を行った。
この結果、Ｎ末端からのアミノ酸配列を次のように決定
され、本発明のポリペプチドは51個のアミノ酸残基から
なることが判明した。
され、本発明のポリペプチドは51個のアミノ酸残基から
なることが判明した。
尚、上記アミノ酸配列においてＸは気相プロテインシー
クエンサーによって同定できなかったアミノ酸を示す
（以下、同じ）。
クエンサーによって同定できなかったアミノ酸を示す
（以下、同じ）。
本発明において、ペプチド及びポリペプチドは、IUPAC-
IUB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記し
てある。念のために、アミノ酸の略号を下に列挙する。
IUB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記し
てある。念のために、アミノ酸の略号を下に列挙する。
Alg:L−アラニン Arg:L−アルギニン Asn:L−アスパラギン Asp:L−アスパラギン酸 Cys:L−システイン Gln:L−グルタミン Glu:L−グルタミン酸 Gly:L−グリシン His:L−ヒスチジン Ile:L−イソロイシン Leu:L−ロイシン Lys:L−リジン Met:L−メチオニン Phe:L−フェニルアラニン Pro:L−プロリン Ser:L−セリン Thr:L−スレオニン Trp:L−トリプトファン Tyr:L−チロシン Val:L−バリン 上記試験において、51個のアミノ酸残基中、４個が同定
できなかったため、以下の試験を行って、これらの同定
を試みた。
できなかったため、以下の試験を行って、これらの同定
を試みた。
（２−２） 黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼ（Staphylo
coccus aureus V8 protease）による加水分解 試料0.5mgを、0.1M蟻酸アンモニウム（pH4.0）0.2mlに
溶解し、酵素がペプチド試料に対して1:50の濃度比にな
るようV8プロテアーゼ（シグマ社製）を加え、37℃で４
時間反応させた。反応後、反応物を前記（１−３）に記
載したのと同一の方法で高速液体クロマトグラフィーに
付し、二つの蛋白質のフラグメントを得た。溶出時間の
早い順にVP1,VP2と命名し、アミノ酸配列を前記（２−
１）と同一の条件で分析した。その結果、VP1,VP2は、
それぞれ次のアミノ酸配列を有することが判明した。
coccus aureus V8 protease）による加水分解 試料0.5mgを、0.1M蟻酸アンモニウム（pH4.0）0.2mlに
溶解し、酵素がペプチド試料に対して1:50の濃度比にな
るようV8プロテアーゼ（シグマ社製）を加え、37℃で４
時間反応させた。反応後、反応物を前記（１−３）に記
載したのと同一の方法で高速液体クロマトグラフィーに
付し、二つの蛋白質のフラグメントを得た。溶出時間の
早い順にVP1,VP2と命名し、アミノ酸配列を前記（２−
１）と同一の条件で分析した。その結果、VP1,VP2は、
それぞれ次のアミノ酸配列を有することが判明した。
（２−３） リシルエンドペプチダーゼ（Lysyl Endpep
tidase）による加水分解 資料1mgを0.25μｌのトリス塩酸緩衝液（pH9.0）に溶解
し、同じ緩衝液に溶かしたリシルエンドペプチダーゼ
（0.15U、約30μｇ）（和光純薬社製）15μｌを添加
し、37℃で１時間反応させた。反応溶液を前記（１−
３）に記述した逆相系高速液体クロマトグラフィーに付
し、濃度勾配をつけたアセトニトリル溶液にて溶出させ
た。異なる蛋白吸光をもつ５個のピークが検出された。
これらのピークを示す夫々の画分を取り出し、溶出時間
の早い順にVP1,VP2,VP3,VP4,VP5と命名した。各々の画
分のアミノ酸配列の決定は、前記（２−１）と同一条件
で行った。結果は下記の通りであった。
tidase）による加水分解 資料1mgを0.25μｌのトリス塩酸緩衝液（pH9.0）に溶解
し、同じ緩衝液に溶かしたリシルエンドペプチダーゼ
（0.15U、約30μｇ）（和光純薬社製）15μｌを添加
し、37℃で１時間反応させた。反応溶液を前記（１−
３）に記述した逆相系高速液体クロマトグラフィーに付
し、濃度勾配をつけたアセトニトリル溶液にて溶出させ
た。異なる蛋白吸光をもつ５個のピークが検出された。
これらのピークを示す夫々の画分を取り出し、溶出時間
の早い順にVP1,VP2,VP3,VP4,VP5と命名した。各々の画
分のアミノ酸配列の決定は、前記（２−１）と同一条件
で行った。結果は下記の通りであった。
分析の結果、画分VP4とVP5とは夫々二つのフラグメント
を含むことが判明した。
を含むことが判明した。
尚、上記VP4のフラグメントの同定できなかったアミノ
酸は質量分析のFAB-MS法の結果からシステインであるこ
とが判明した。
酸は質量分析のFAB-MS法の結果からシステインであるこ
とが判明した。
（２−４） フラグメントの修飾によるアミノ酸配列の
決定 前記（２−３）におけるフラグメント中で、アミノ酸残
基の解析ができなかったフラグメントVP4とVP5をメルカ
プトエタノールで還元後、ビニルピリジンによりシステ
インまたはシスチンの修飾反応を行った。先ずフラグメ
ントVP4とVP5とをそれぞれ凍結乾燥し、その乾燥物100
μｇを50μｌの0.2Nエチルモルホリン酢酸溶液（pH8.
0）に溶解した。還元は、上記各フラグメント溶液に２
−メルカプトエタノール１μｌを添加し、室温で30分間
放置して行った還元後、得られた溶液に４−ビニルピリ
ジン１μｌを加え、撹拌し、30分間室温で反応を進行さ
せた。得られたピリジルエチル化したフラグメントを前
記（１−３）と同一の逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーにて分離，精製した。分取したピリジルエチル化フラ
グメントは前記（２−１）と同一条件でペプチドの一次
構造解析を行った。その結果、VP4からはVP6とVP7と
が、VP5からはVP8とVP9とが、それぞれ２個のフラグメ
ントとして分離され、それぞれ次のアミノ酸配列を有す
ることが判明した。
決定 前記（２−３）におけるフラグメント中で、アミノ酸残
基の解析ができなかったフラグメントVP4とVP5をメルカ
プトエタノールで還元後、ビニルピリジンによりシステ
インまたはシスチンの修飾反応を行った。先ずフラグメ
ントVP4とVP5とをそれぞれ凍結乾燥し、その乾燥物100
μｇを50μｌの0.2Nエチルモルホリン酢酸溶液（pH8.
0）に溶解した。還元は、上記各フラグメント溶液に２
−メルカプトエタノール１μｌを添加し、室温で30分間
放置して行った還元後、得られた溶液に４−ビニルピリ
ジン１μｌを加え、撹拌し、30分間室温で反応を進行さ
せた。得られたピリジルエチル化したフラグメントを前
記（１−３）と同一の逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーにて分離，精製した。分取したピリジルエチル化フラ
グメントは前記（２−１）と同一条件でペプチドの一次
構造解析を行った。その結果、VP4からはVP6とVP7と
が、VP5からはVP8とVP9とが、それぞれ２個のフラグメ
ントとして分離され、それぞれ次のアミノ酸配列を有す
ることが判明した。
尚、上記アミノ酸配列において、PECysはピリジルエチ
ルシステインを示す。
ルシステインを示す。
VP4のフラグメントは還元後、２個のフラグメントに分
離され、それぞれピリジルエチル化されたシステインを
含有する結果より、VP4中のシステインがジスルフィド
結合していることが判明した。
離され、それぞれピリジルエチル化されたシステインを
含有する結果より、VP4中のシステインがジスルフィド
結合していることが判明した。
同様に、VP5中にもジスルフィド結合が存在することが
判明した。この結果は、VP5を酵素サーモリシンにより
加水分解した結果とも一致していた。サーモリシンの加
水分解反応は、0.2Nエチルモルホリン酢酸0.05mlに溶解
したポリペプチド0.3mgに２μｌのサーモリシン（25mg/
ml）を加え、37℃で２時間行った。反応後、反応液を前
記（１−３）と同一の逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーにて分離，精製し、（NH2）-Ala-Ala-Asp-Cys-（COO
H）と（NH2）-Ile-Cys-Arg-Lys-（COOH）とを含むペプ
チドが得られ、このペプチド間にジスルフィド結合が存
在することが確認された。
判明した。この結果は、VP5を酵素サーモリシンにより
加水分解した結果とも一致していた。サーモリシンの加
水分解反応は、0.2Nエチルモルホリン酢酸0.05mlに溶解
したポリペプチド0.3mgに２μｌのサーモリシン（25mg/
ml）を加え、37℃で２時間行った。反応後、反応液を前
記（１−３）と同一の逆相系高速液体クロマトグラフィ
ーにて分離，精製し、（NH2）-Ala-Ala-Asp-Cys-（COO
H）と（NH2）-Ile-Cys-Arg-Lys-（COOH）とを含むペプ
チドが得られ、このペプチド間にジスルフィド結合が存
在することが確認された。
以上の結果を総合すると、ロイヤルゼリーより単離，精
製されたポリペプチドの全体の一次構造は、次のアミノ
酸配列を有することが判明した。
製されたポリペプチドの全体の一次構造は、次のアミノ
酸配列を有することが判明した。
（但し、３番目と31番目、21番目と38番目のシステイン
（Cys）がジスルフィド結合を有する。） このポリペプチドは、従来知られていない新規な物質で
あり、分子量が約5000で、水溶液に紫外線吸収スペクト
ルは268nmに最大吸収を有し、酸性でも溶解性を示す。
（Cys）がジスルフィド結合を有する。） このポリペプチドは、従来知られていない新規な物質で
あり、分子量が約5000で、水溶液に紫外線吸収スペクト
ルは268nmに最大吸収を有し、酸性でも溶解性を示す。
上記精製ポリペプチドを、種々の温度，時間で加熱した
試料、加熱しない試料として添加したMRSブロース（Dif
co社製）中でラクトバシラス・ヘルベチカス菌（Lacoba
cillus helveticus ss jugurti）の増殖を指標とした抗
菌活性の測定を行ったところ、このポリペプチドは100
℃,15分間の加熱処理を行っても活性を消失しないこと
が判明した。
試料、加熱しない試料として添加したMRSブロース（Dif
co社製）中でラクトバシラス・ヘルベチカス菌（Lacoba
cillus helveticus ss jugurti）の増殖を指標とした抗
菌活性の測定を行ったところ、このポリペプチドは100
℃,15分間の加熱処理を行っても活性を消失しないこと
が判明した。
［試験例３］抗菌性の検定 （３−１） 菌体液の調製 検定には15属,22種の菌株を使用した。全ての菌株は−7
6℃で冷凍保存されていたものを、融解後、MRSブロース
（Difco社製）で37℃にて２回継代培養を行った。２回
目の培養後、培養液を1,300gで10分間遠沈して菌体を集
め、10mlの生理食塩水に懸濁し、菌体液を調製した。
6℃で冷凍保存されていたものを、融解後、MRSブロース
（Difco社製）で37℃にて２回継代培養を行った。２回
目の培養後、培養液を1,300gで10分間遠沈して菌体を集
め、10mlの生理食塩水に懸濁し、菌体液を調製した。
（３−２） 検体液の調製 試験例（１−２）と同一の方法で得た精製ポリペプチド
を所定の濃度、即ち0.01μＭ（約0.05ppm）,0.1μＭ
（約0.5ppm）,1μＭ（約5ppm）の各濃度をMRSブロース
に溶解し、マイレクスGVフィルター（孔隙サイズ0.22μ
ｍ、ミリポア社製）を通して滅菌濾過し、検体液を調製
した。
を所定の濃度、即ち0.01μＭ（約0.05ppm）,0.1μＭ
（約0.5ppm）,1μＭ（約5ppm）の各濃度をMRSブロース
に溶解し、マイレクスGVフィルター（孔隙サイズ0.22μ
ｍ、ミリポア社製）を通して滅菌濾過し、検体液を調製
した。
（３−３） 検定方法 検体液3mlに各種供試菌の菌体液90μｌを加え、嫌気的
条件下手37℃にて10時間培養した。10時間後の培養液の
濁度を660nmの波長透過率で測定し、対照と比較して、
本発明のポリペプチドの増殖抑制効果を試験した。
条件下手37℃にて10時間培養した。10時間後の培養液の
濁度を660nmの波長透過率で測定し、対照と比較して、
本発明のポリペプチドの増殖抑制効果を試験した。
結果は第１表に示すとおりであった。第１表から判るよ
うに、0.1μＭの濃度で50％以上の増殖抑制効果が、ラ
クトバシラス・ラクチス、ラクトバシラス・ヘルベチカ
ス、ラクトバシラス・ブルガリカス、及びコリコノスト
ック・クレモリスのグラム陽性菌に対して観察され、ま
た１μＭの濃度ではクロストリジウム・ブチリカム、ス
タヒロコッカス・アウレウス、コリネバクテリウム、ス
トレプトコカッス・クレモリス及びストレプトコカッス
・サーモフィルスに対して抑制効果が観察され、本発明
のポリペプチドの優れた抗菌活性が認められた。しかし
ながら、グラム陰性の各種菌に対しては、１μＭのペプ
チド濃度でも、何等効果が観察できず、グラム陽性菌に
対して特異的な効果を示すことが確認された。
うに、0.1μＭの濃度で50％以上の増殖抑制効果が、ラ
クトバシラス・ラクチス、ラクトバシラス・ヘルベチカ
ス、ラクトバシラス・ブルガリカス、及びコリコノスト
ック・クレモリスのグラム陽性菌に対して観察され、ま
た１μＭの濃度ではクロストリジウム・ブチリカム、ス
タヒロコッカス・アウレウス、コリネバクテリウム、ス
トレプトコカッス・クレモリス及びストレプトコカッス
・サーモフィルスに対して抑制効果が観察され、本発明
のポリペプチドの優れた抗菌活性が認められた。しかし
ながら、グラム陰性の各種菌に対しては、１μＭのペプ
チド濃度でも、何等効果が観察できず、グラム陽性菌に
対して特異的な効果を示すことが確認された。
尚、表中の濃度欄の記号は夫々下記の抑制率を示す。
−:0〜20％、 ±:21〜40％、 ＋:41〜60％、 ＋＋:61〜80％、 ＋＋＋:81〜100％ 以上の結果から、本発明のポリペプチドは一部のクロス
トリジウム属、コリネバクテリウム属、スタヒロコッカ
ス属等の、食品加工上望ましく微生物に対して抗菌作用
を有する。また、本発明のポリペプチドは、ストレプト
コッカス属、ラクトバチルス属及びロイコノストック属
に対しても抗菌作用を有するので、漬け物及び発酵乳製
品における過発酵の防止、防腐並びに安定剤としても利
用可能である。
トリジウム属、コリネバクテリウム属、スタヒロコッカ
ス属等の、食品加工上望ましく微生物に対して抗菌作用
を有する。また、本発明のポリペプチドは、ストレプト
コッカス属、ラクトバチルス属及びロイコノストック属
に対しても抗菌作用を有するので、漬け物及び発酵乳製
品における過発酵の防止、防腐並びに安定剤としても利
用可能である。
［試験例４］食品加工における利用 （４−１） 食品の調製 本発明のポリペプチドの食品保存剤としての有用性を、
豆乳中における黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性によっ
て試験した。
豆乳中における黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性によっ
て試験した。
ブイヨン培地にて37℃,24時間培養した黄色ブドウ球菌
（Streptococcus aureus F.D.A.209P）を滅菌済み原豆
乳（森永乳業社製）の５倍希釈液50mlに初発菌数が100
個/mlになるよう接種し保存すべき食品とした。
（Streptococcus aureus F.D.A.209P）を滅菌済み原豆
乳（森永乳業社製）の５倍希釈液50mlに初発菌数が100
個/mlになるよう接種し保存すべき食品とした。
（４−２） 本発明のポリペプチドを含む添加液の調製 実施例２と同一の方法で得られた1mgのポリペプチドを1
0mlの蒸留水に溶解後、マイレクスGV（孔隙サイズ0.22
μmg、ミリポア社製）で濾過滅菌して調製した。
0mlの蒸留水に溶解後、マイレクスGV（孔隙サイズ0.22
μmg、ミリポア社製）で濾過滅菌して調製した。
（４−３） 菌数の経時変化から見た保存効果 上記（４−１）において調製した食品50mlに、（４−
２）で調製した試料添加液10mlを加え、培養フラスコに
て37℃で１週間培養し、黄色ブドウ球菌の生菌数を測定
した。尚、ポリペプチドの添加濃度は10ppm（約２μ
Ｍ）であった。
２）で調製した試料添加液10mlを加え、培養フラスコに
て37℃で１週間培養し、黄色ブドウ球菌の生菌数を測定
した。尚、ポリペプチドの添加濃度は10ppm（約２μ
Ｍ）であった。
測定方法は、培養フラスコから1mlの培養液を24時間毎
に採取し、0.8％塩化ナトリウム水溶液で適当に希釈
後、その1mlを平板寒天培地（10ml標準培地）にて24時
間培養して測定した。
に採取し、0.8％塩化ナトリウム水溶液で適当に希釈
後、その1mlを平板寒天培地（10ml標準培地）にて24時
間培養して測定した。
尚、本発明のポリペプチドの代わりに蒸留水を添加した
コントロール群の生菌数も同時に測定した。この生菌数
の経時的変化を図３に示した。
コントロール群の生菌数も同時に測定した。この生菌数
の経時的変化を図３に示した。
図３において、横軸は培養時間を日数で表し、縦軸は生
菌数を表し、図中（●−●）は本発明のポリペプチドを
添加した場合、（○−○）はコントロール群を示す。こ
の結果、最大菌数はコントロール群では培養後２日目に
約108個に達したが、ポリペプチド添加群では、著しい
増殖抑制効果が観察され、この効果は１週間持続した。
グラフからも判るように、更に長期の効果が維持するこ
とが推測される。本発明のポリペプチドによる菌の抑制
効果は初発菌数に大きく左右されるが、初発菌数のすく
ないものほど有効であり、抑制効果が著しいことが判明
した。この事から、本発明の抗菌剤は一定の殺菌を施さ
れた食品に添加した場合に、特に有効である。
菌数を表し、図中（●−●）は本発明のポリペプチドを
添加した場合、（○−○）はコントロール群を示す。こ
の結果、最大菌数はコントロール群では培養後２日目に
約108個に達したが、ポリペプチド添加群では、著しい
増殖抑制効果が観察され、この効果は１週間持続した。
グラフからも判るように、更に長期の効果が維持するこ
とが推測される。本発明のポリペプチドによる菌の抑制
効果は初発菌数に大きく左右されるが、初発菌数のすく
ないものほど有効であり、抑制効果が著しいことが判明
した。この事から、本発明の抗菌剤は一定の殺菌を施さ
れた食品に添加した場合に、特に有効である。
本発明におけるリヤルゼリー由来のポリペプチドの食品
への添加量は、ロイヤルゼリーの通常の摂取量の範囲内
の量であり、従って、食品に添加した場合に人体への好
ましくない影響は無い。ロイヤルゼリーから分離して得
られた本発明のポリペプチドは、バイオテクノロジーの
技術により微生物に生産せしめることも可能である。
への添加量は、ロイヤルゼリーの通常の摂取量の範囲内
の量であり、従って、食品に添加した場合に人体への好
ましくない影響は無い。ロイヤルゼリーから分離して得
られた本発明のポリペプチドは、バイオテクノロジーの
技術により微生物に生産せしめることも可能である。
実施例１ 図１に示した精製工程に従い、ロイヤルゼリー（秋田屋
製、岐阜県）50gを1000mlの注射用蒸留水に溶解し、10
％（容量）アンモニア水にてpH8.5に調製後、４℃で30
分間静置した。静置後、高速遠心機（SCR-20BB、日立社
製）を使用し、10,000rpmで10分間遠沈した。上清は捨
て、沈澱物を1000mlの注射用蒸留水に再溶解し、0.2N塩
酸でpH2.0に調製し、４℃で30分間静置後、10,000rpmで
10分間遠沈した。上清を再び10％（容量）アンモニア水
でpH5.0に調整し、４℃で30分間静置した後、10,000rpm
で10分間遠沈した。得られた上清を凍結乾燥して粗製物
約1.710gを得た。粗製物の収率は約３％であった。
製、岐阜県）50gを1000mlの注射用蒸留水に溶解し、10
％（容量）アンモニア水にてpH8.5に調製後、４℃で30
分間静置した。静置後、高速遠心機（SCR-20BB、日立社
製）を使用し、10,000rpmで10分間遠沈した。上清は捨
て、沈澱物を1000mlの注射用蒸留水に再溶解し、0.2N塩
酸でpH2.0に調製し、４℃で30分間静置後、10,000rpmで
10分間遠沈した。上清を再び10％（容量）アンモニア水
でpH5.0に調整し、４℃で30分間静置した後、10,000rpm
で10分間遠沈した。得られた上清を凍結乾燥して粗製物
約1.710gを得た。粗製物の収率は約３％であった。
得られた粗製物1gを20mM塩化ナトリウムを含む10mM燐酸
アンモニウム緩衝液（pH4.8）20mlに溶解し、セファデ
ックスＧ−100カラム（直径2.6cm×長さ90cm、ファルマ
シア社製）に重層した。同緩衝液で流速約20ml/時間で
ゲル濾過を行い、Ve（排除容積）380〜430mlの画分を集
め、蒸着水に対して透析後、凍結乾燥し、約11.7mgの粗
精製物を得た。
アンモニウム緩衝液（pH4.8）20mlに溶解し、セファデ
ックスＧ−100カラム（直径2.6cm×長さ90cm、ファルマ
シア社製）に重層した。同緩衝液で流速約20ml/時間で
ゲル濾過を行い、Ve（排除容積）380〜430mlの画分を集
め、蒸着水に対して透析後、凍結乾燥し、約11.7mgの粗
精製物を得た。
得られた粗精製物について、試験例３と同一の方法によ
りラクトバシラス・ヘルベチカス菌に対する増殖抑制効
果を測定したところ、試験例３と実質的に同等の効果が
あることが確認された。
りラクトバシラス・ヘルベチカス菌に対する増殖抑制効
果を測定したところ、試験例３と実質的に同等の効果が
あることが確認された。
実施例２ 実施例１で得られた粗精製物10mgを注射用蒸留水0.1ml
に溶解し、0.1％（容量）トリフルオロ酢酸水溶液で平
衡化した高速液体クロマトグラフィーのアクアポアRP-3
00（C8型）カラム（直径4.6mm×長さ100mm）に吸着さ
せ、次いで、90％（容量）アセトニトリルを含む0.1％
（容量）トリフルオロ酢酸水溶液（15〜35％直線濃度勾
配、流速0.7ml/min）によって連続的に溶出し、32％
（容量）アセトニトリルで溶出した画分を集め、凍結乾
燥して、精製物9mgを得た。
に溶解し、0.1％（容量）トリフルオロ酢酸水溶液で平
衡化した高速液体クロマトグラフィーのアクアポアRP-3
00（C8型）カラム（直径4.6mm×長さ100mm）に吸着さ
せ、次いで、90％（容量）アセトニトリルを含む0.1％
（容量）トリフルオロ酢酸水溶液（15〜35％直線濃度勾
配、流速0.7ml/min）によって連続的に溶出し、32％
（容量）アセトニトリルで溶出した画分を集め、凍結乾
燥して、精製物9mgを得た。
尚、上述の測定において、高速液体クロマトグラフィー
は日本分光Tri VI型を、吸収測定は日本分光UNIDEC-100
型検出器を用いて、220nmの波長で吸収測定を行った。
は日本分光Tri VI型を、吸収測定は日本分光UNIDEC-100
型検出器を用いて、220nmの波長で吸収測定を行った。
上記精製ポリペプチドを、試験例３に記述した方法に従
って、ラクトバシラス・ヘルベティクス（Lactobacillu
s helveticus ss jugurti）に対する増殖抑制を測定し
たところ、試験例３と実質的に同様の効果が確認され
た。
って、ラクトバシラス・ヘルベティクス（Lactobacillu
s helveticus ss jugurti）に対する増殖抑制を測定し
たところ、試験例３と実質的に同様の効果が確認され
た。
発明の効果 本発明の効果は下記のとおりである。
（１） 食品と共に摂取しても、人体への好ましくない
影響がない。
影響がない。
（２） グラム陽性菌の増殖を0.1μＭ（約0.5ppm）の
濃度、好ましくは１μＭ（約5ppm）の濃度でほぼ完全に
抑制できる。
濃度、好ましくは１μＭ（約5ppm）の濃度でほぼ完全に
抑制できる。
（３） 通常の加熱殺菌に対して安定である。
図１は、本発明のポリペプチドの粗精製物を分離する工
程の前段における粗製物の分離工程を示す工程図、 図２は、本発明のポリペプチドのゲル過と抗菌活性を
示すグラフ、 図３は、豆乳中における黄色ブドウ球菌の菌数の経時変
化を示すグラフである。
程の前段における粗製物の分離工程を示す工程図、 図２は、本発明のポリペプチドのゲル過と抗菌活性を
示すグラフ、 図３は、豆乳中における黄色ブドウ球菌の菌数の経時変
化を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する新規なポリペ
プチド、 （但し、３番目と31番目、21番目と38番目のシステイン
（Cys）がジスルフィド結合を有する。） - 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドを有効成分と
して含有することを特徴とするグラム陽性菌に対する食
品加工用抗菌剤。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1089100A JPH07116232B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを含有する抗菌剤 |
| AU52573/90A AU628956B2 (en) | 1989-04-07 | 1990-04-04 | New polypeptide and antibacterial preparations containing the same |
| US07/503,926 US5095005A (en) | 1989-04-07 | 1990-04-04 | Polypeptide and antibacterial preparations containing the same |
| DK90106505.2T DK0391407T3 (da) | 1989-04-07 | 1990-04-05 | Polypeptid og antibakterielle præparater, der indeholder det |
| DE69019581T DE69019581T2 (de) | 1989-04-07 | 1990-04-05 | Polypeptid und dieses enthaltende antibaktierelle Präparate. |
| EP90106505A EP0391407B1 (en) | 1989-04-07 | 1990-04-05 | Polypeptide and antibacterial preparations containing the same |
| CA002013909A CA2013909A1 (en) | 1989-04-07 | 1990-04-05 | Antibacterial preparation and method using polypeptide obtainable from royal jelly |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1089100A JPH07116232B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを含有する抗菌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02268198A JPH02268198A (ja) | 1990-11-01 |
| JPH07116232B2 true JPH07116232B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=13961468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1089100A Expired - Fee Related JPH07116232B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを含有する抗菌剤 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5095005A (ja) |
| EP (1) | EP0391407B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07116232B2 (ja) |
| AU (1) | AU628956B2 (ja) |
| CA (1) | CA2013909A1 (ja) |
| DE (1) | DE69019581T2 (ja) |
| DK (1) | DK0391407T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP5027001B2 (ja) * | 2007-07-05 | 2012-09-19 | アピ株式会社 | 酵素処理ローヤルゼリー及びそれを含有する皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤 |
| CN119285699B (zh) * | 2024-11-13 | 2025-03-28 | 盐城工学院 | 一种核桃粕源的抗菌多肽及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1012121A (en) * | 1961-03-13 | 1965-12-08 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | A method of preparing a pharmacologically active protein material from royal bee jelly |
| DE1921628A1 (de) * | 1969-04-28 | 1970-11-05 | Schulz Hans Juergen | Isolierung der aktiven Substanz im Gelee royal durch Molekularsublimation |
| JPH0826072B2 (ja) * | 1987-01-23 | 1996-03-13 | 株式会社三和化学研究所 | 生理活性ポリペプチド、その製法および用途 |
| AU613074B2 (en) * | 1987-07-01 | 1991-07-25 | Plant Genetic Systems N.V. | Bactericidal and/or bacteriostatic peptides, process for their isolation, their production and their applications |
| DE3850180T2 (de) * | 1987-07-01 | 1995-03-02 | Plant Genetic Systems Nv | Bakteriozide und/oder bakteriostatische Peptide, Verfahren zu ihrer Isolierung, Herstellung und Verwendung. |
-
1989
- 1989-04-07 JP JP1089100A patent/JPH07116232B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-04-04 AU AU52573/90A patent/AU628956B2/en not_active Ceased
- 1990-04-04 US US07/503,926 patent/US5095005A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-05 DE DE69019581T patent/DE69019581T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1990-04-05 CA CA002013909A patent/CA2013909A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 欧州公開２９９８２８（ＥＰ、ＡＩ） |
Also Published As
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| US5095005A (en) | 1992-03-10 |
| EP0391407A1 (en) | 1990-10-10 |
| DE69019581D1 (de) | 1995-06-29 |
| CA2013909A1 (en) | 1990-10-07 |
| JPH02268198A (ja) | 1990-11-01 |
| EP0391407B1 (en) | 1995-05-24 |
| DK0391407T3 (da) | 1995-10-16 |
| AU5257390A (en) | 1990-10-11 |
| DE69019581T2 (de) | 1996-01-25 |
| AU628956B2 (en) | 1992-09-24 |
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