JPH07121875B2

JPH07121875B2 - 免疫グロブリンフラクシヨンの製造法

Info

Publication number: JPH07121875B2
Application number: JP61224296A
Authority: JP
Inventors: 勲藤田; 小林　　孝
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-10-08
Filing date: 1986-09-23
Publication date: 1995-12-25
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPS62174029A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、免疫化学的測定法において抗体として用いる
ことのできる免疫グロブリンフラクシヨンの製造法に関
する。

従来の技術免疫グロブリンはいずれのクラスにおいても２本のＨ鎖
とＬ鎖とからなっている。その代表的なクラスであるIg
Gの構造はたとえば菊地浩吉編「医科免疫学」,P85（198
1），南江堂に示されている。Ｈ鎖は分子量約50,000,L
鎖は分子量約20,000と言われており、１本のジスルフィ
ド結合でつながっている。Ｈ鎖およびＬ鎖のＮ末端側は
共同して抗原結合性部位を形成している。２本のＨ鎖の
Ｃ末端側は共同してFc領域を形成しておりそれぞれ２本
のジスルフィド結合でつながれている。イムノグロブリ
ンの化学構造研究の結果から、パパイン分解によってFa
bとFcとが、ペプシン分解によってＦ（ab′）_２とFc相
当部分がさらに細かく分解されたフラクシヨンとがそれ
ぞれ得られることが知られている。

Fab,Fab′あるいはＦ（ab′）_２は抗原と結合する領域
が存在し、この部分でアミノ酸の配列が変動し抗原抗体
反応の特異性を与えると言われている。一方、Fc領域は
一定のアミノ酸配列を有し抗原に対する結合性を示さな
いが補体結合能を持っている。またFc領域の構造は免疫
グロブリンのクラス、サブクラスによって異なり、また
動物の種類によっても異なる。

発明が解決しようとする問題点上述のように免疫グロブリンのFc領域は抗原結合活性を
有しないが、抗体の補体や細胞に対する作用であるエフ
エクター機能が存在するが免疫グロブリンを、生体外あ
るいは生体内で抗原抗体反応における抗体として利用し
た場合、不都合な面を与えることが多い。生体外では免
疫学的診断に用いられることが多いが、Fc領域は非特異
的反応を与える原因の一つになり得る。例えば、血清中
の干渉因子の一つとしてリウマチ因子があるが、この因
子は不溶化あるいは変性したIgGのFc部分と結合する。
したがって血清中にリウマチ因子が存在すれば、目的と
する抗原抗体反応以外に、上記の反応が進むため誤判定
の原因となる。また、非働化（例えば被検血清を56℃で
30分間熱処理する熱非働化）により除去される物質群が
Fc部分と反応し、非特異的な結果を与えることが多い。
生体内での反応では、免疫グロブリンをイメージングや
免疫学的治療に使われるが、投与される動物と上記免疫
グロブリン産生動物が異なった場合、Fc部分に対する抗
体が生じ易く効果の低減や、副作用が現われる。

かかる欠点を改善するため、免疫グロブリンからFc部分
を除去したFab,Fab′あるいはＦ（ab′）_２が用いられ
ることが多い。Ｆ（ab′）_２およびさらに還元して得ら
れるFab′は生体外あるいは生体内抗原抗体反応のため
の抗体として繁用されており、今後さらに多用されるも
のと思われる。

Ｆ（ab′）_２は免疫グロブリンをペプシンで処理するこ
とによって得られる。しかしながら、免疫グロブリンを
産生する動物の種類によってペプシンからの限定分解の
難易さが異なる。通常、pH4.5の0.05Mあるいは0.1Mの酢
酸緩衝液中で免疫グロブリンに対して約1/50量の結晶ペ
プシンを加えて37℃で15〜72時間消化後、水酸化ナトリ
ウムを加えて中和する。生成物は例えばセファデツクス
Ｇ−75あるいはＧ−150（フアルマシア社，スウェーデ
ン）のカラムクロマトグラフィーで分画されＦ（ab′）
_２が得られる。さらに、Ｆ（ab′）_２をpH中性付近で２
−メルカプトエタノールなど還元剤で処理し、セファデ
ツクスＧ−25などのカラムクロマトグラフィーで精製し
て得られる〔内海爽：医化学実験法講座４（右田俊介
編），中山書店，東京,P108（1972）：ジャーナル・オ
ブ・イムノアッセイ（Journal of Immunoassay）第４巻
209頁（1983年）参照〕。

しかしながら、マウスやラットから得られた免疫グロブ
リンを上記の条件で処理しても、効率良くＦ（ab′）_２
を得ることはできない旨報告されている（上記ジャーナ
ル・オブ・イムノアッセイ，特に第230〜231頁参照）。

問題点を解決するための手段上記した事情に鑑み、本発明者らは、鋭意検討したとこ
ろ、ペプシン処理におけるpHをより酸性側にすると、効
率良くＦ（ab′）_２を製造することができることを見い
出し、さらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、齧歯類動物から得られた免疫グロブリンをpH
2ないし４未満でペプシン処理することを特徴とする免
疫グロブリンＦ（ab′）_２の製造法である。

本発明方法における齧歯類（Rodentia）動物としては、
たとえばネズミ類（真鼠類,Myomorphia）が好ましく、
その例としてはたとえばマウス，ラット，モルモット，
ハムスターなどが挙げられる。

本発明方法における免疫グロブリンとしては、IgG,IgM,
IgE,IgAなどが挙げられるがIgGとくにIgG₁,IgG_2aが好ま
しい。

本発明方法の処理が行なわれる際の免疫グロブリンの量
は、反応液中約0.1ないし約3W/V％，さらに好ましくは
約0.3ないし1W/V％である。

免疫グロブリンが抗体として作用する場合の抗体として
は、特に限定されないが、その例としてはたとえば抗ガ
ン胎児性抗原抗体，抗肝炎ウイルス抗原抗体，抗ヒト絨
毛性ゴナドトロピン抗体，抗アルファフエトプロテイン
抗体，抗破傷風毒素抗体，抗百日咳毒素抗体，抗免疫グ
ロブリン抗体，抗薬剤抗体などが挙げられる。

本発明方法で用いられるペプシンとしては、公知のもの
のいずれを用いてもよい。該ペプシンとしてはたとえば
ブタ胃粘液から得られた結晶ペプシンを凍結乾燥して調
製されたペプシン1:60,000（シグマ社製,USA）などの試
薬用ペプシンが挙げられる。

上記処理におけるペプシンの濃度としては、免疫グロブ
リンに対して約1/40ないし２倍量（重量）、さらに好ま
しくは約1/10ないし1/2量（重量）が挙げられる。

本発明のペプシン処理は、免疫グロブリンをpH2ないし
４未満で処理することにより行なわれる。該処理は、緩
衝液中で行なうのが好ましく、該緩衝液としては、たと
えば0.1M酢酸緩衝液,0.1Mグリシン乾燥液,0.5Mクエン酸
緩衝液などが挙げられる。

該処理のpHは約２ないし４未満で行なわれるが、さらに
2.5〜3.5で行なうのが好ましい。

本発明のペプシン処理は、４℃ないし40℃で、約0.5な
いし96時間，さらに好ましくは約35〜38℃で約１ないし
２時間反応させる。

このようにして得られるペプシン処理された生成物は、
通常行なわれる精製手段により精製することができる。

たとえば、ペプシン処理された生成物は、アルカリ液
（たとえば1N−水酸化ナトリウム）でpH約８に中和さ
れ、公知のゲルクロマトグラフィー（例、セファデック
スＧ−150あるいは−75,ウルトロゲルAcA44（LKB社，ス
ウェーデン）のカラムを利用）で分画されＦ（ab′）_２
として精製，採取される。

このようにして得られた免疫グロブリンＦ（ab′）
_２は、さらに自体公知の方法、たとえばpH中性の緩衝液
で２−メルカブトエチルアミンなどの還元剤を用いて、
Fab′とすることもできる。

これらFab′,F（ab′）_２は（１）担体上に保持された
抗体，（２）放射性同位元素，酵素，螢光物質，発光物
質などで標識化された抗体、あるいは（３）薬剤と結合
した抗体として、いずれもそれ自体公知の免疫化学的測
定法において、試薬として用いることができる。例え
ば、本発明の条件を用い、ペプシン処理して得られたモ
ノクローナル抗体（Ｆ（ab′）_２フラグメントあるいは
Fab′フラグメント）を担体に保持させ、これと同様に
ペプシン処理して得たモノクローナル抗体（Ｆ（ab′）
_２フラグメントあるいはFab′フラグメント）を酵素と
結合させて得た酵素標識抗体を組み合せたサンドイッチ
酵素免疫測定法では感度も良好であり、かつ非特異的な
反応も殆んど見られない。また、本発明の条件を用い、
ペプシン処理して得られたモノクローナル抗体Ｆ（a
b′）_２あるいはFab′は、例えば制癌剤などの薬剤と化
学的に結合させ、インビトロのドラッグデリバリーシス
テム（薬剤配達システム）に利用することができる。

本発明方法を用いれば齧歯類動物から得られた免疫グロ
ブリンから免疫グロブリンＦ（ab′）_２フラクシヨンさ
らにFab′を短時間に収率よく製造することができる。

実施例以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。

参考例１（１）抗原の精製大腸癌組織200gを細断し、これに600mlの１％Tween20
〔シグマ社（米国製〕を含む0.15M NaCl溶液を加えてホ
モジナイザーで氷冷下10分間破砕して懸濁液を調製し
た。さらに超音波発生機で氷冷下１時間処理したのち、
12,000rpm20分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液
（pH6.5）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース4B〔ファルマシア製（ス
ウェーデン）〕のカラム（2.2cm×26cm）にかけた。カ
ラムに保持された物質をα−メチル−Ｄ−マンノサイド
を含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留水に対して透析し
たのち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液（pH6.
5）を用いてウルトロゲルAcA−34〔LKB社製（フラン
ス）〕のカラム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマト
グラフィーを行ない、280〜350mlの画分を蒸留水に対し
て透析し、凍結乾燥してヒト癌胎児性抗原（CEA）の精
製抗原を得た（5mg）。

（２）モノクローナル抗CEA抗体の作製前項（１）で得た精製抗原70μｇを生理食塩水150μ
に溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Freu
nd′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，第
26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μを加えて
よく混合して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に投
与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全アジ
ュパントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原130
μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｇに静脈投与
し、３日後脾臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fied MEM培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×10⁸
個とマウスミエローマ細胞（P₃U₁）２×10⁷個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI−1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI−1640 15mlを徐々に加
えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞を
20％牛胎児血清を含むRPMI−1640倍地100mlに分散させ
た。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
かえた。14日後における培養上清について抗体価を測定
したところ、計72ウエル中９ウエルに陽性を認めた。

次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清20％およびBALB/Cマウス胸線細胞をフィーダー
（feeder）として加えたRPMI−1640培地で希釈し、限界
希釈（limiting dilution）法を繰り返して行ない最終
的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する５種類のハ
イブリドーマが得られた。このようにして得られたハイ
ブリドーマのうち、ハイブリドーマMo272−11（モノク
ローナル抗体Mo−T2）は、財団法人発酵研究所に昭和60
年（1985年）３月４日に受託番号IFO50033として寄託さ
れている。

上記で得られた５種類のハイプリドーマをそれぞれ鉱油
で処理されたBALB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週
間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗CE
A抗体を得た。これらのモノクローナル抗体を硫酸アン
モニウム法で塩析し、それぞれグロブリン画分を得た
（Mo−T1〜Mo−T6）。

実施例１参考例１（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体γ
−グロブリンフラクシヨン（Mo−T4）5mgをpHを1.0,2.
0,3.0,4.0または5.0にそれぞれ調製した0.1M酢酸緩衝液
1mlに溶解し、1mgのペプシンを加え、37℃で２時間反応
させた。1N−NaOHで中和後、ウルトロゲルAcA44カラム
（直径2cm,長さ75cm）でゲル過し、0.1Mホウ酸緩衝液
（pH8.0）で溶出した。各pHで処理したときに得られた
溶出パターン（280nmにおける吸光度で測定）を第１〜
５図に示した。すなわち、pHを1,0,2.0,3.0,4.0または
5.0に調整した場合を第１図，第２図，第３図，第４図
または第５図にそれぞれ示した。

フラクシヨン約50からフラクシヨン約54（１フラクシヨ
ンの容量:2.5ml）の間にＦ（ab′）_２が溶出したが、pH
3.0では他のpHと比べて最も良好な溶出パターンが得ら
れた。これらＦ（ab′）_２画分をプールし、段階希釈し
て被検液を調製した。抗マウスIgG抗体（マイルズ社製,
USA）を各ウエルに10μｇずつ吸着させた96穴のマイク
ロプレート（ヌンク社製，デンマーク）を用いて上述の
被検液を反応させ、次にCEAさらにウサギ抗CEA抗体西洋
わさびペルオキシダーゼ複合体（DAKO社製，デンマー
ク）溶液を加える酵素免疫測定法を行なって抗体価を求
めた。発色には通常のｏ−フエニレンジアミン法を行な
い492nmの吸光度を測定した。

結果を第１表に示したがpH3での処理が最も高収率を与
え、得られたＦ（ab′）_２の抗体価も最高であった。

実施例２実施例１の方法でpH3.0,37℃２時間，またはpH3.0,4℃,
1晩のペプシン処理の条件でペプシンの量を免疫グロブ
リン量に対して5,10または20W/W％と変化させた。第２
表に結果を示したがpH3.0,37℃２時間の条件が最良であ
った。

実施例３実施例１の方法でpH3.0,ペプシンを免疫グロブリン量に
対して20W/W％の条件で４℃,2日,3日または４日と変化
させた。第３表に結果を示したがpH3.0,4℃,3日間の条
件が良好であった。

実施例４実施例１の方法でpH3.0,ペプシンを免疫グロブリン量に
対して20W/W％の条件で、37℃で、15分,30分,1時間,2時
間,3時間または５時間と変化させた。第４表に結果を示
したがpH3.0,37℃,1時間あるいは２時間の条件が良好で
あった。

発明の効果本発明方法によると、齧歯類動物から得られた免疫グロ
ブリンＦ（ab′）_２を効率良く製造することができるの
で、該免疫グロブリンフラクシヨンを免疫化学的測定用
試薬として工業的に有利に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は実施例１で得られた免疫グロブリンＦ（a
b′）_２の溶出パターンをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】齧歯類動物から得られた免疫グロブリンを
pH2ないし４未満でペプシン処理することを特徴とする
免疫グロブリンＦ（ab′）_２の製造法。