JPH0712318B2 - 合成遺伝子を使用したウシ成長ホルモンの製造方法 - Google Patents
合成遺伝子を使用したウシ成長ホルモンの製造方法Info
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- JPH0712318B2 JPH0712318B2 JP63500842A JP50084288A JPH0712318B2 JP H0712318 B2 JPH0712318 B2 JP H0712318B2 JP 63500842 A JP63500842 A JP 63500842A JP 50084288 A JP50084288 A JP 50084288A JP H0712318 B2 JPH0712318 B2 JP H0712318B2
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- bovine growth
- escherichia coli
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］この発明は、合成遺伝子によって酵母ま
たはエシェリヒア・コリでウシ成長ホルモンを製造する
方法に関するものである。ウシ成長ホルモンはウシの成
長を促進し、雌牛の乳汁分泌を増大し、飼料効率を高め
るのに使用される。
たはエシェリヒア・コリでウシ成長ホルモンを製造する
方法に関するものである。ウシ成長ホルモンはウシの成
長を促進し、雌牛の乳汁分泌を増大し、飼料効率を高め
るのに使用される。
合成ステロイド、例えばエストラジオール−コンピュド
ーズ（イーライ・リリー社、米国）、エストラジオール
・ベンゾアート−シノバックス（シンタックス社、米
国）は、今日まで、ウシの成長を促進し、飼料効率を高
めるため畜産業において使用されてきた。
ーズ（イーライ・リリー社、米国）、エストラジオール
・ベンゾアート−シノバックス（シンタックス社、米
国）は、今日まで、ウシの成長を促進し、飼料効率を高
めるため畜産業において使用されてきた。
しかし米国を含めて文明国では、合成ステロイドを飼料
と一緒に投与すると長期間体内に残留するため、そのよ
うな生産物がヒトによって消費されると有害な影響があ
ることが判明し、それらの使用を禁止するところが増加
してきた。
と一緒に投与すると長期間体内に残留するため、そのよ
うな生産物がヒトによって消費されると有害な影響があ
ることが判明し、それらの使用を禁止するところが増加
してきた。
一方、ウシの成長ホルモンは投与後体内に残留せず、ま
たそれが天然に産生されるウシのタンパク質であるから
種特異性を有するため、人類にとって望ましい物質であ
る。しかしながら1980年代の初めのころまでは、それは
ウシの下垂体からしか抽出されず、一般に使用するには
その量が著しく限られていたから、容易に畜産業に利用
できなかった。
たそれが天然に産生されるウシのタンパク質であるから
種特異性を有するため、人類にとって望ましい物質であ
る。しかしながら1980年代の初めのころまでは、それは
ウシの下垂体からしか抽出されず、一般に使用するには
その量が著しく限られていたから、容易に畜産業に利用
できなかった。
この発明者は遺伝子操作を利用することによって酵母ま
たはエシェリヒア・コリにウシの成長ホルモンを経済的
かつ大量に生産し得ることを発見し、この発明を完成し
た。
たはエシェリヒア・コリにウシの成長ホルモンを経済的
かつ大量に生産し得ることを発見し、この発明を完成し
た。
［発明の要約］ この発明の一目的は、酵母を発現ベクターの宿主として
使用することによるウシの成長ホルモンの生産方法を提
供することにある。
使用することによるウシの成長ホルモンの生産方法を提
供することにある。
この発明のもう一つの目的は、エシェリヒア・コリを発
現ベクターの宿主として使用することによるウシの成長
ホルモンの生産方法を提供することにある。
現ベクターの宿主として使用することによるウシの成長
ホルモンの生産方法を提供することにある。
第一に、酵母を形質発現ベクター宿主として使用するこ
とによるウシ成長ホルモンの生産方法は、（ａ）ウシの
成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいてSac I、Pst Iお
よびSal I制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを
合成し、（ｂ）ライゲーション・ストラテジーにしたが
ったPst I/Sal I部位を有する一断片およびSac I/Pst I
部位を有するもう一つの断片をPst I、Sac IおよびSal
I制限酵素部位を有するエシェリヒア・コリのベクター
（pUC18）へそれぞれクローニングし、（ｃ）Pst I/Sal
IおよびPst I/Sac I制限酵素で切断された二つのクロ
ーン化した断片をベクターpUC18へ再クローニングして
Ｎ−末端部分を欠いたウシ成長ホルモン遺伝子を得、
（ｄ）プロモーターおよびターミネーターからなるエシ
ェリヒア・コリのベクターへ部分ウシ成長ホルモン遺伝
子およびＮ−末端合成アダプターを挿入して、プロモー
ター−開始アミノ酸コドンを含有するウシ成長ホルモン
遺伝子−ターミネーターからなるカセットを作成し、
（ｅ）このカセットを酵母形質発現ベクターへ挿入し、
（ｆ）得られたベクターを酵母細胞で発現させることか
らなる。
とによるウシ成長ホルモンの生産方法は、（ａ）ウシの
成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいてSac I、Pst Iお
よびSal I制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを
合成し、（ｂ）ライゲーション・ストラテジーにしたが
ったPst I/Sal I部位を有する一断片およびSac I/Pst I
部位を有するもう一つの断片をPst I、Sac IおよびSal
I制限酵素部位を有するエシェリヒア・コリのベクター
（pUC18）へそれぞれクローニングし、（ｃ）Pst I/Sal
IおよびPst I/Sac I制限酵素で切断された二つのクロ
ーン化した断片をベクターpUC18へ再クローニングして
Ｎ−末端部分を欠いたウシ成長ホルモン遺伝子を得、
（ｄ）プロモーターおよびターミネーターからなるエシ
ェリヒア・コリのベクターへ部分ウシ成長ホルモン遺伝
子およびＮ−末端合成アダプターを挿入して、プロモー
ター−開始アミノ酸コドンを含有するウシ成長ホルモン
遺伝子−ターミネーターからなるカセットを作成し、
（ｅ）このカセットを酵母形質発現ベクターへ挿入し、
（ｆ）得られたベクターを酵母細胞で発現させることか
らなる。
Ｎ−末端合成アダプターのアミノ酸コドンは、下記のNc
o IおよびSac I制限酵素部位を有する58量体および50量
体の塩基配列を有する。
o IおよびSac I制限酵素部位を有する58量体および50量
体の塩基配列を有する。
第二に、エシェリヒア・コリを形質発現ベクター宿主と
して使用することによるウシ成長ホルモンの生産方法
は、（ａ）ウシ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいて
Sac I、Pst IおよびSal I制限酵素部位を有するオリゴ
ヌクレオチドを合成し、（ｂ）ライゲーションストラテ
ジーにしたがったSac I/Pst I部位を有するＮ−末端断
片およびPst I/Sal I部位を有するＣ−末端断片をそれ
ぞれエシェリヒア・コリのベクター（pUC18）へクロー
ニングし、（ｃ）Pst I/Sac IおよびPst I/Sal I制限酵
素で切断された二つのクローン化した断片をベクターpU
C18へ再クローニングして、Ｎ−末端部分を欠いたウシ
成長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）部分ウシ成長ホルモン
遺伝子および合成アダプターをエシェリヒア・コリのベ
クターへ挿入して合成アダプターをつないだウシ成長ホ
ルモン遺伝子を得、（ｅ）得られたウシ成長ホルモン遺
伝子を、trpプロモーターの制御下にサケ成長ホルモン
を発現し得るエシェリヒア・コリ形質発現ベクターへ挿
入し、（ｆ）ウシ成長ホルモンをエシェリヒア・コリ発
現することからなる。
して使用することによるウシ成長ホルモンの生産方法
は、（ａ）ウシ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいて
Sac I、Pst IおよびSal I制限酵素部位を有するオリゴ
ヌクレオチドを合成し、（ｂ）ライゲーションストラテ
ジーにしたがったSac I/Pst I部位を有するＮ−末端断
片およびPst I/Sal I部位を有するＣ−末端断片をそれ
ぞれエシェリヒア・コリのベクター（pUC18）へクロー
ニングし、（ｃ）Pst I/Sac IおよびPst I/Sal I制限酵
素で切断された二つのクローン化した断片をベクターpU
C18へ再クローニングして、Ｎ−末端部分を欠いたウシ
成長ホルモン遺伝子を得、（ｄ）部分ウシ成長ホルモン
遺伝子および合成アダプターをエシェリヒア・コリのベ
クターへ挿入して合成アダプターをつないだウシ成長ホ
ルモン遺伝子を得、（ｅ）得られたウシ成長ホルモン遺
伝子を、trpプロモーターの制御下にサケ成長ホルモン
を発現し得るエシェリヒア・コリ形質発現ベクターへ挿
入し、（ｆ）ウシ成長ホルモンをエシェリヒア・コリ発
現することからなる。
終止コドン（TAA）および開始コドン（ATG）と、開始コ
ドン（ATG）の前に独立したSD配列からなり、SD配列お
よび開始コドン（ATG）の間にｍ−RNAの２次構造が形成
されることを防止するように合成アダプターを設計す
る。アダプター配列は73量体（５′−CATG GAG GAA TTA
TAA ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA T
TC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT−３′）からなる上流
鎖および65量体（３′−CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA
GGC CGA TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CA
A GAA GC−５′）からなる下流鎖を含んでいる。
ドン（ATG）の前に独立したSD配列からなり、SD配列お
よび開始コドン（ATG）の間にｍ−RNAの２次構造が形成
されることを防止するように合成アダプターを設計す
る。アダプター配列は73量体（５′−CATG GAG GAA TTA
TAA ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA T
TC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT−３′）からなる上流
鎖および65量体（３′−CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA
GGC CGA TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CA
A GAA GC−５′）からなる下流鎖を含んでいる。
526pbのウシ成長ホルモン遺伝子のSac I/Sal I断片およ
び合成アダプターをNco IおよびSal I制限酵素で処理し
たベクターpSOD［ホールウエル、R.A.ら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、13巻、2017頁（1985年）］にク
ローニングして合成アダプターとつないだウシ成長ホル
モン遺伝子を作成した（pSOD BGH）。このベクター（pS
OD BGH）をNco IおよびSal I制限酵素で処理してウシ成
長ホルモン遺伝子を分離し、分離した断片を、Xba Iお
よびSal I制限酵素でサケ成長ホルモン遺伝子の一部を
除去したエシェリヒア・コリ形質発現ベクターptrp322H
SGH［このベクターはサケ成長ホルモンをptrp322（ファ
ルマシア社、ピカタウエイ、N.J.08854、米国；ラッセ
ル、D.R.＆ベンネット、G.N.ジーン、20巻、231頁（198
1年））へクローニングすることによって作成され、本
発明の出願人によりこの発明の出願日と同日付けで韓国
に出願された］へ挿入して、ptrphsBGH1〜13を作成し
た。開始コドンから37bpのサケ成長ホルモン遺伝子およ
び合成アダプターをウシ成長ホルモン遺伝子へライゲー
ションし、SD配列および開始コドン（ATG）、サケ成長
ホルモン遺伝子の最初の部分をエシェリヒア・コリにお
ける形質発現に使用した。
び合成アダプターをNco IおよびSal I制限酵素で処理し
たベクターpSOD［ホールウエル、R.A.ら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、13巻、2017頁（1985年）］にク
ローニングして合成アダプターとつないだウシ成長ホル
モン遺伝子を作成した（pSOD BGH）。このベクター（pS
OD BGH）をNco IおよびSal I制限酵素で処理してウシ成
長ホルモン遺伝子を分離し、分離した断片を、Xba Iお
よびSal I制限酵素でサケ成長ホルモン遺伝子の一部を
除去したエシェリヒア・コリ形質発現ベクターptrp322H
SGH［このベクターはサケ成長ホルモンをptrp322（ファ
ルマシア社、ピカタウエイ、N.J.08854、米国；ラッセ
ル、D.R.＆ベンネット、G.N.ジーン、20巻、231頁（198
1年））へクローニングすることによって作成され、本
発明の出願人によりこの発明の出願日と同日付けで韓国
に出願された］へ挿入して、ptrphsBGH1〜13を作成し
た。開始コドンから37bpのサケ成長ホルモン遺伝子およ
び合成アダプターをウシ成長ホルモン遺伝子へライゲー
ションし、SD配列および開始コドン（ATG）、サケ成長
ホルモン遺伝子の最初の部分をエシェリヒア・コリにお
ける形質発現に使用した。
図面の簡単な説明 第１図は５′−末端から３′−末端へ塩基配列によって
示した全ウシ成長ホルモン遺伝子に対応する合成オリゴ
ヌクレオチドである。
示した全ウシ成長ホルモン遺伝子に対応する合成オリゴ
ヌクレオチドである。
第２図は第１図の合成オリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン・ストラテジーである。
ョン・ストラテジーである。
第３図は合成オリゴヌクレオチドをエシェリヒア・コリ
のベクターへクローン化するクローニング手順を示した
略図である。
のベクターへクローン化するクローニング手順を示した
略図である。
第４図は確認したウシ成長ホルモン遺伝子の塩基配列お
よび推定アミノ酸配列である。
よび推定アミノ酸配列である。
第５図はエシェリヒア・コリのベクター（pBS100）およ
びウシ成長ホルモンを酵母で生産する酵母形質発現ベク
ター（pC1/1）へのクローニング手順である。
びウシ成長ホルモンを酵母で生産する酵母形質発現ベク
ター（pC1/1）へのクローニング手順である。
第６図はエシェリヒア・コリで形質発現するベクターへ
完全なウシ成長ホルモン遺伝子を再会合する手順であ
る。
完全なウシ成長ホルモン遺伝子を再会合する手順であ
る。
第７図は酵母細胞に生産されたウシ成長ホルモンをSDS
ポリアクリルアミドゲル電動泳動によって確認した成績
を示す。
ポリアクリルアミドゲル電動泳動によって確認した成績
を示す。
第８図はエシェリヒア・コリで生産されたウシ成長ホル
モンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確
認した成績を示す。
モンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確
認した成績を示す。
［好ましい態様の詳細な説明］ この発明では、ミルターら［ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、255巻（1980年）、7521
頁］によって報告されたウシ成長ホルモンのアミノ酸配
列に基づき、酵母細胞に優勢に利用されるアミノ酸コド
ンを選ぶことによってウシ成長ホルモン塩基配列の５′
−末端を変更し、天然状態の成熟ウシ成長ホルモンのNH
2−末端がAlaで開始するように［リ、C.H.＆アシュ、L.
J.、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、203巻、419〜424頁］、全遺伝子をホスホアミデ
ート法により、遺伝子シンセサイザー（アプライド・バ
イオシステム、モデル380B、米国）で化学的に合成し
た。
イオロジカル・ケミストリー、255巻（1980年）、7521
頁］によって報告されたウシ成長ホルモンのアミノ酸配
列に基づき、酵母細胞に優勢に利用されるアミノ酸コド
ンを選ぶことによってウシ成長ホルモン塩基配列の５′
−末端を変更し、天然状態の成熟ウシ成長ホルモンのNH
2−末端がAlaで開始するように［リ、C.H.＆アシュ、L.
J.、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、203巻、419〜424頁］、全遺伝子をホスホアミデ
ート法により、遺伝子シンセサイザー（アプライド・バ
イオシステム、モデル380B、米国）で化学的に合成し
た。
合成オリゴヌクレオチドをエシェリヒア・コリのベクタ
ーpUC18［ノーランダー、J.ら、ジーン、36巻（1983
年）、101〜106頁］へライゲーションしてクローン化
し、526bpのSal I/Sac I制限酵素断片を含んだpBGH（52
6）を作成した（第３図参照）。
ーpUC18［ノーランダー、J.ら、ジーン、36巻（1983
年）、101〜106頁］へライゲーションしてクローン化
し、526bpのSal I/Sac I制限酵素断片を含んだpBGH（52
6）を作成した（第３図参照）。
第一に酵母細胞でウシ成長ホルモンを生産する方法は、
下記のようにウシ成長ホルモン遺伝子を含有するクロー
ンを作成し、合成アダプターを有するpBGH（526）から
得られた526bpのSac I/Sal I断片を、プロモーターおよ
びターミネーター遺伝子を有するベクターpBS100［イー
スト、２巻、72頁（1986年）；シロン・コーポレーショ
ン、エマリービル、CA94608、米国］のNco I部位および
Sal I部位の間へライゲーションして酵母で形質発現す
る（ここで化学的に合成された該アダプターはNco I制
限酵素部位、開始コドンおよびのＮ−末端領域に対応す
るアミノ酸コドンからなる）。得られたベクターはpBS
−BGH（576）である（第５図参照）。
下記のようにウシ成長ホルモン遺伝子を含有するクロー
ンを作成し、合成アダプターを有するpBGH（526）から
得られた526bpのSac I/Sal I断片を、プロモーターおよ
びターミネーター遺伝子を有するベクターpBS100［イー
スト、２巻、72頁（1986年）；シロン・コーポレーショ
ン、エマリービル、CA94608、米国］のNco I部位および
Sal I部位の間へライゲーションして酵母で形質発現す
る（ここで化学的に合成された該アダプターはNco I制
限酵素部位、開始コドンおよびのＮ−末端領域に対応す
るアミノ酸コドンからなる）。得られたベクターはpBS
−BGH（576）である（第５図参照）。
pBS−BGH（576）をBamH Iで処理して、プロモーター、
ウシ成長ホルモン遺伝子およびターミネーターを含有す
るBamH I断片（約2.7Kb）を分離した。このBamH I断片
を、エシェリヒア・コリおよび酵母で自動的に複製され
る酵母形質発現ベクターpC1/1［ATCC37115;ブレーク
ら、プロシーディングズ ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、81巻
（1984年）、4642頁］のBamH I制限酵素部位へ挿入して
pC1/1−BGHを作成した（第５図参照）。
ウシ成長ホルモン遺伝子およびターミネーターを含有す
るBamH I断片（約2.7Kb）を分離した。このBamH I断片
を、エシェリヒア・コリおよび酵母で自動的に複製され
る酵母形質発現ベクターpC1/1［ATCC37115;ブレーク
ら、プロシーディングズ ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、81巻
（1984年）、4642頁］のBamH I制限酵素部位へ挿入して
pC1/1−BGHを作成した（第５図参照）。
上記のDNAを、ヒネンらの方法により、酵母株DCO4［ブ
ローチ、J.R.＆ヒックス、J.B.、セル、21巻、501頁（1
980年）；イースト・ジェネティック・ストック・セン
ター］にクローニングした。形質転換した酵母細胞を実
施例４に示したように２％グルコースを含有するYEPD培
地で48時間培養した。グルコース濃度が消耗されると、
ウシ成長ホルモンは自動的に誘導され、培養１リットル
当り約500mgのウシ成長ホルモンが生産できる。
ローチ、J.R.＆ヒックス、J.B.、セル、21巻、501頁（1
980年）；イースト・ジェネティック・ストック・セン
ター］にクローニングした。形質転換した酵母細胞を実
施例４に示したように２％グルコースを含有するYEPD培
地で48時間培養した。グルコース濃度が消耗されると、
ウシ成長ホルモンは自動的に誘導され、培養１リットル
当り約500mgのウシ成長ホルモンが生産できる。
第二にエシェリヒア・コリでウシ成長ホルモンを生産す
る方法は、下記のように、526bpからなるベクターpBGH
（526）および特別に設計したアダプターをベクターpSO
DのNco IおよびSal I制限酵素部位へクローニングし
て、完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含有するpSOD BGH
を得た（第６図参照）。
る方法は、下記のように、526bpからなるベクターpBGH
（526）および特別に設計したアダプターをベクターpSO
DのNco IおよびSal I制限酵素部位へクローニングし
て、完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含有するpSOD BGH
を得た（第６図参照）。
ウシ成長ホルモンをエシェリヒア・コリで形質発現する
ため、エシェリヒア・コリ形質発現ベクターptrp322H S
GHをクローニングし、サケ成長ホルモンを大量形質発現
する形質発現ベクターであるptrp322H SGHを利用するポ
リシストロン法を特に採用した。ウシ成長ホルモンの形
質発現を最大限に増大するため、SD（シャイン・ダルガ
ーノ）配列、サケ成長ホルモン遺伝子の左側にある開始
コドン（ATG）およびXba I制限酵素部位を含んだ開始コ
ドンから右側に位置する領域を使用した。第二のSD配
列、サケ成長ホルモンの一部の合成を停止するための終
止コドン（TAA）および完全なウシ成長ホルモン遺伝子
をこれにつないだ。
ため、エシェリヒア・コリ形質発現ベクターptrp322H S
GHをクローニングし、サケ成長ホルモンを大量形質発現
する形質発現ベクターであるptrp322H SGHを利用するポ
リシストロン法を特に採用した。ウシ成長ホルモンの形
質発現を最大限に増大するため、SD（シャイン・ダルガ
ーノ）配列、サケ成長ホルモン遺伝子の左側にある開始
コドン（ATG）およびXba I制限酵素部位を含んだ開始コ
ドンから右側に位置する領域を使用した。第二のSD配
列、サケ成長ホルモンの一部の合成を停止するための終
止コドン（TAA）および完全なウシ成長ホルモン遺伝子
をこれにつないだ。
上記方法の特徴は、外来タンパク質をエシェリヒア・コ
リで形質発現する際の問題として報告されているSD配列
とATGとの間のmRNAの２次構造形成の結果である抑制効
果が、形質発現率の高い確立された遺伝子組立て物を使
用することによって取り除かれたことである。
リで形質発現する際の問題として報告されているSD配列
とATGとの間のmRNAの２次構造形成の結果である抑制効
果が、形質発現率の高い確立された遺伝子組立て物を使
用することによって取り除かれたことである。
上記のようにして作成した形質発現ベクターptrphsBGH1
〜13を含有するエシェリヒア・コリW3110（ATCC27325、
ロックビル、MD20852、米国）を選び、形質発現条件下
に培養した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびデンシトメーター・スキャンニングにより、エシェ
リヒア・コリのタンパク質全体の30％より多い量がウシ
成長ホルモンであることが確かめられ、またウェスタン
・ブロッティングによってそれがウシ成長ホルモンであ
ることが判明した。
〜13を含有するエシェリヒア・コリW3110（ATCC27325、
ロックビル、MD20852、米国）を選び、形質発現条件下
に培養した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よびデンシトメーター・スキャンニングにより、エシェ
リヒア・コリのタンパク質全体の30％より多い量がウシ
成長ホルモンであることが確かめられ、またウェスタン
・ブロッティングによってそれがウシ成長ホルモンであ
ることが判明した。
以下に実施例をあげてこの発明を説明する。実施例は単
に発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限
定する目的をもつものではない。
に発明を説明するためのものであって、発明の範囲を限
定する目的をもつものではない。
実施例１ ウシ成長ホルモン遺伝子の合成オリゴヌクレオチドのラ
イゲーションおよびクローニング 合成オリゴヌクレオチド全体のCOOH末端側半分に対応す
るオリゴヌクレオチド（U7−U13/L7−L14）をそれぞれ
0.05（OD260）量づつ取り、これらを別々に乾燥した。5
0mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM ATP、1mM DTTおよび10m
M MgCl2を含有する全量30μｌの緩衝液にT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ４単位を添加し、オリゴヌクレオチドの
５′−末端残基をリン酸化するため、各反応混合物を37
℃で30分間インキュベートした。全部のオリゴヌクレオ
チドをプールし、これと同量のフェノールおよびクロロ
ホルム混合液で処理し、エタノールで沈殿させた。沈殿
を60mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM DTTおよび10mM MgCl
2を含有する緩衝液53μｌに溶解した。この溶液を95℃
の水浴に加え、徐々に温度が室温に下がるよう６時間室
温に保った。T4 DNAリガーゼ（20単位）および10mM ATP
5μｌを加え、各オリゴヌクレオチドの５′−および
３′−末端を室温で10分間、ライゲーションした。上記
の反応液をフェノールおよびクロロホルム混合液で処理
し、エタノールで沈殿させた。
イゲーションおよびクローニング 合成オリゴヌクレオチド全体のCOOH末端側半分に対応す
るオリゴヌクレオチド（U7−U13/L7−L14）をそれぞれ
0.05（OD260）量づつ取り、これらを別々に乾燥した。5
0mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM ATP、1mM DTTおよび10m
M MgCl2を含有する全量30μｌの緩衝液にT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ４単位を添加し、オリゴヌクレオチドの
５′−末端残基をリン酸化するため、各反応混合物を37
℃で30分間インキュベートした。全部のオリゴヌクレオ
チドをプールし、これと同量のフェノールおよびクロロ
ホルム混合液で処理し、エタノールで沈殿させた。沈殿
を60mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM DTTおよび10mM MgCl
2を含有する緩衝液53μｌに溶解した。この溶液を95℃
の水浴に加え、徐々に温度が室温に下がるよう６時間室
温に保った。T4 DNAリガーゼ（20単位）および10mM ATP
5μｌを加え、各オリゴヌクレオチドの５′−および
３′−末端を室温で10分間、ライゲーションした。上記
の反応液をフェノールおよびクロロホルム混合液で処理
し、エタノールで沈殿させた。
60mMトリス−HCl（pH7.6）および10mM NaClを含有する
緩衝液の存在で、この沈殿にPst IおよびSal I制限酵素
それぞれ10単位を加え、37℃で１時間反応した。
緩衝液の存在で、この沈殿にPst IおよびSal I制限酵素
それぞれ10単位を加え、37℃で１時間反応した。
７％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、280〜330bp
に対応するバンドをゲルから切り出した。電気溶出後、
エタノールで溶液を沈殿させ、沈殿を蒸留水20μｌに溶
解した。
に対応するバンドをゲルから切り出した。電気溶出後、
エタノールで溶液を沈殿させ、沈殿を蒸留水20μｌに溶
解した。
沈殿３μｌおよびPst IおよびSal I制限酵素で切断した
ベクターpUC18 10ngを、60mMトリス−HCl（pH7.5）、10
mM DTT、10mM MgCl2、1mM ATPおよびT4 DNAリガーゼ10
単位を含有するライゲーション緩衝液の存在で14℃で16
時間ライゲーションした。
ベクターpUC18 10ngを、60mMトリス−HCl（pH7.5）、10
mM DTT、10mM MgCl2、1mM ATPおよびT4 DNAリガーゼ10
単位を含有するライゲーション緩衝液の存在で14℃で16
時間ライゲーションした。
エシェリヒア・コリJM103［BRL、USA、メッシング、
J.、メソッズ・イン・エンザイモロジー、101巻、20〜7
8頁（1983年）］受容細胞をライゲーション混合液に加
え、ハナハンの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、118巻、557頁（1983年）］にしたが
い、37℃で一夜形質転換した。
J.、メソッズ・イン・エンザイモロジー、101巻、20〜7
8頁（1983年）］受容細胞をライゲーション混合液に加
え、ハナハンの方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、118巻、557頁（1983年）］にしたが
い、37℃で一夜形質転換した。
バーンボイムおよびドリーの方法［ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、７巻、1513頁（1979年）］にしたが
い、p3′−BGHを含有する組換え体クローンを白色コロ
ニーから選び出した。
ッズ・リサーチ、７巻、1513頁（1979年）］にしたが
い、p3′−BGHを含有する組換え体クローンを白色コロ
ニーから選び出した。
一方、合成オリゴヌクレオチド全体の５′−末端に対応
するオリゴヌクレオチド（U2−U7/L2−L7）を上記と同
様の方法によってそれぞれライゲーションし、Sac Iお
よびPst I制限酵素で切断したpUC18へクローニングする
ことにより、第３図に示した方法によってp5′−BGHを
得た。
するオリゴヌクレオチド（U2−U7/L2−L7）を上記と同
様の方法によってそれぞれライゲーションし、Sac Iお
よびPst I制限酵素で切断したpUC18へクローニングする
ことにより、第３図に示した方法によってp5′−BGHを
得た。
サンガーのジデオキシ配列決定法［プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・オブ・ザ・USA、74巻、5473〜5477頁（1977
年）］により、p3′−BGHおよびp5′−BGGのDNA配列を
確認した（第４図参照）。
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ・オブ・ザ・USA、74巻、5473〜5477頁（1977
年）］により、p3′−BGHおよびp5′−BGGのDNA配列を
確認した（第４図参照）。
p3′−BGHからのPst I−Sal I制限断片およびp5′−BGH
からのSac I−Pst I制限断片をそれぞれ１％アガロース
ゲルから分離し、Sac IおよびSal I制限酵素で切断した
ベクターpUC18へライゲーションしてpBGH（526）を作成
した（第３図参照）。
からのSac I−Pst I制限断片をそれぞれ１％アガロース
ゲルから分離し、Sac IおよびSal I制限酵素で切断した
ベクターpUC18へライゲーションしてpBGH（526）を作成
した（第３図参照）。
実施例２ 酵母細胞で形質発現する合成ウシ成長ホルモン遺伝子の
操作 成熟ウシ成長ホルモン遺伝子をクローニングして酵母細
胞で形質発現するため、pBGH（526）における完全なウ
シ成長ホルモン遺伝子の５′−末端の19個のアミノ酸に
対応する欠損部分をDNAシンセサイザーにより合成し
た。酵母細胞で選択的に使用されるコドンを選ぶことに
よって、Nco I制限酵素部位、開始コドンおよび18個の
アミノ酸に対応するヌクレオチドを合成した（第５図参
照）。
操作 成熟ウシ成長ホルモン遺伝子をクローニングして酵母細
胞で形質発現するため、pBGH（526）における完全なウ
シ成長ホルモン遺伝子の５′−末端の19個のアミノ酸に
対応する欠損部分をDNAシンセサイザーにより合成し
た。酵母細胞で選択的に使用されるコドンを選ぶことに
よって、Nco I制限酵素部位、開始コドンおよび18個の
アミノ酸に対応するヌクレオチドを合成した（第５図参
照）。
クローニングの方法は、下記のようにpBGH（526）をSac
IおよびSal I制限酵素で処理して、526bpの制限酵素断
片を得た。分離した断片および上記の合成アダプター
を、誘導プロモーターおよびターミネーターを含んでい
るpBS100［シロン・コーポレーション、エメリービル、
CA94608、米国；イースト、２巻、72頁（1986年）］のN
co IおよびSal I制限酵素部位へ挿入した。
IおよびSal I制限酵素で処理して、526bpの制限酵素断
片を得た。分離した断片および上記の合成アダプター
を、誘導プロモーターおよびターミネーターを含んでい
るpBS100［シロン・コーポレーション、エメリービル、
CA94608、米国；イースト、２巻、72頁（1986年）］のN
co IおよびSal I制限酵素部位へ挿入した。
それぞれリン酸化したアダプター試薬１μｌ、分離した
ウシ成長ホルモンのSac I/Sal I断片３μｌ（30ng）お
よびNco IおよびSal I制限酵素で切断したベクターpBS1
00 1μｌ（7ng）を混合し、15分間65℃に保ち、徐々に
室温に冷却した。10mM ATP 2μｌ、10倍濃厚なライゲー
ション反応緩衝液２μｌ、リガーゼ20単位および蒸留水
８μｌを加え、14℃で16時間反応した。実施例１の記載
と同様に、混合物をエシェリヒア・コリHB101（ATCC336
94）に形質転換し、プロモーター、完全なウシ成長ホル
モン遺伝子およびターミネーターからなるpBS−BGH（57
6）を作成した（第５図参照）。
ウシ成長ホルモンのSac I/Sal I断片３μｌ（30ng）お
よびNco IおよびSal I制限酵素で切断したベクターpBS1
00 1μｌ（7ng）を混合し、15分間65℃に保ち、徐々に
室温に冷却した。10mM ATP 2μｌ、10倍濃厚なライゲー
ション反応緩衝液２μｌ、リガーゼ20単位および蒸留水
８μｌを加え、14℃で16時間反応した。実施例１の記載
と同様に、混合物をエシェリヒア・コリHB101（ATCC336
94）に形質転換し、プロモーター、完全なウシ成長ホル
モン遺伝子およびターミネーターからなるpBS−BGH（57
6）を作成した（第５図参照）。
ベクターpBS100はアルコールデヒドロゲナーゼIIのプロ
モーターとグリセルアルデヒド−３′−リン酸デヒドロ
ゲナーゼプロモーターとのハイブリッドプロモーターを
含んでおり、グルコースが枯渇すると、誘導することが
できる。
モーターとグリセルアルデヒド−３′−リン酸デヒドロ
ゲナーゼプロモーターとのハイブリッドプロモーターを
含んでおり、グルコースが枯渇すると、誘導することが
できる。
pBS−BGH（576）をBamH I制限酵素で処理し、ハイブリ
ッドプロモーター、ウシ成長ホルモンおよびグリセルア
ルデヒド−３′−リン酸デヒドロゲナーゼのターミネー
ターを含んだ約2700塩基対のBamH I制限断片を分離し
た。このBamH I制限断片を酵母細胞で複製可能な形質発
現ベクターpC1/1（ATCC37115）のBamH I制限酵素部位へ
挿入し、pC1/1−BGHを得た（第５図参照）。
ッドプロモーター、ウシ成長ホルモンおよびグリセルア
ルデヒド−３′−リン酸デヒドロゲナーゼのターミネー
ターを含んだ約2700塩基対のBamH I制限断片を分離し
た。このBamH I制限断片を酵母細胞で複製可能な形質発
現ベクターpC1/1（ATCC37115）のBamH I制限酵素部位へ
挿入し、pC1/1−BGHを得た（第５図参照）。
pC1/1−BGH DNA 10μｇを、ヒネンの方法［プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・USA、75巻、1929頁（1978
年）］により、酵母株DCO4［イースト・ジェネティック
・ストック・センター、ユニバーシティー・オブ・カリ
フォルニア・バークレイ、CA、米国；ブローチ、J.R.＆
ヒックス、J.B.、セル、21巻、501頁（1980年）］ヘプ
ロトプラスト形質転換し、１リットル当りアミノ酸無含
有酵母窒素塩基6.7g、ソルビット−２％グルコース182
g、Leu−欠乏アミノ酸サップルメント0.25gおよびバク
トアガール20gを含有する寒天プレートでこれを培養し
た。
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・USA、75巻、1929頁（1978
年）］により、酵母株DCO4［イースト・ジェネティック
・ストック・センター、ユニバーシティー・オブ・カリ
フォルニア・バークレイ、CA、米国；ブローチ、J.R.＆
ヒックス、J.B.、セル、21巻、501頁（1980年）］ヘプ
ロトプラスト形質転換し、１リットル当りアミノ酸無含
有酵母窒素塩基6.7g、ソルビット−２％グルコース182
g、Leu−欠乏アミノ酸サップルメント0.25gおよびバク
トアガール20gを含有する寒天プレートでこれを培養し
た。
30℃で５日間培養後、組換え体が得られた。
実施例３ ウシ成長ホルモン遺伝子のエシェリヒア・コリ形質発現
ベクターへの操作 エシェリヒア・コリに選択的に使用されるコドンを、ウ
シ成長ホルモン遺伝子のSac I制限酵素部位および開始
コドン（ATG）の間に選んだ。SD配列および開始コドン
（ATG）の近接位置にmRNAの２次構造が形成されないよ
う、終止コドン（TAA）およびpSODでポリシストロン的
な組立てをするための独立したSD配列を設計した。アダ
プターは、DNAシンセサイザーによって合成された73量
体（５′−CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG GCT
ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT C
GA GCT−３′）からなる上流鎖および65量体（３′−CT
C CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAT AGA
CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC−５′）からなる
下流鎖である。合成アダプターおよびpBGH（526）から
得られた526bpのSac I−Sal I制限酵素断片をNco Iおよ
びSal I制限酵素で切断したベクターpSODへ挿入して、
完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含むpSOD BGHを得た
（第６図参照）。
ベクターへの操作 エシェリヒア・コリに選択的に使用されるコドンを、ウ
シ成長ホルモン遺伝子のSac I制限酵素部位および開始
コドン（ATG）の間に選んだ。SD配列および開始コドン
（ATG）の近接位置にmRNAの２次構造が形成されないよ
う、終止コドン（TAA）およびpSODでポリシストロン的
な組立てをするための独立したSD配列を設計した。アダ
プターは、DNAシンセサイザーによって合成された73量
体（５′−CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG GCT
ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT C
GA GCT−３′）からなる上流鎖および65量体（３′−CT
C CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAT AGA
CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC−５′）からなる
下流鎖である。合成アダプターおよびpBGH（526）から
得られた526bpのSac I−Sal I制限酵素断片をNco Iおよ
びSal I制限酵素で切断したベクターpSODへ挿入して、
完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含むpSOD BGHを得た
（第６図参照）。
trpプロモターを使用してウシ成長ホルモンをエシェリ
ヒア・コリで大量形質発現するため、エシェリヒア・コ
リで大量形質発現されたサケ成長ホルモン遺伝子のNH2
−末端領域の後へ完全なウシ成長ホルモン遺伝子を配置
するポリシストロン法を開発し、第６図のように実施し
た。
ヒア・コリで大量形質発現するため、エシェリヒア・コ
リで大量形質発現されたサケ成長ホルモン遺伝子のNH2
−末端領域の後へ完全なウシ成長ホルモン遺伝子を配置
するポリシストロン法を開発し、第６図のように実施し
た。
即ち、50mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2および50
mM NaClを含有する緩衝液中で、Xba I制限酵素10単位
を、サケ成長ホルモンを大量形質発現する形質発現ベク
ターptrp322H SGH DNA 5μｇに37℃で１時間反応させ
た。溶液をフェノールおよびクロロホルム混合液で処理
し、エタノールで沈殿させた。沈殿を乾燥し、蒸留水1
5.5μｌに溶解した。
mM NaClを含有する緩衝液中で、Xba I制限酵素10単位
を、サケ成長ホルモンを大量形質発現する形質発現ベク
ターptrp322H SGH DNA 5μｇに37℃で１時間反応させ
た。溶液をフェノールおよびクロロホルム混合液で処理
し、エタノールで沈殿させた。沈殿を乾燥し、蒸留水1
5.5μｌに溶解した。
ついで全反応物20μｌ中の最終濃度が250μＭとなるよ
う、dNTP（dGTP、dCTP、dATP、dTTP）を加え、サケ成長
ホルモン遺伝子をXba I制限酵素で切断した部位を平滑
末端化するため、この溶液を、50mMトリス−HCl（pH8.
0）、10mM MgCl2および50mM NaClを含有する緩衝液中で
クレノウ酵素2.5単位と室温で20分間反応させた。上記
の溶液を95℃で２分間保つことによりクレノウ酵素活性
を失活させた後、Sal I制限酵素10単位、1M NaCl 6.5μ
ｌおよび蒸留水20.5μｌを加えて37℃で１時間インキュ
ベートした。１％アガロースゲルから2.4KbのDNA断片を
分離した。電気溶出したDNAを10mMトリス−HCl（pH7.
5）および1mM EDTAを含有するTE液15μｌに溶解した。
う、dNTP（dGTP、dCTP、dATP、dTTP）を加え、サケ成長
ホルモン遺伝子をXba I制限酵素で切断した部位を平滑
末端化するため、この溶液を、50mMトリス−HCl（pH8.
0）、10mM MgCl2および50mM NaClを含有する緩衝液中で
クレノウ酵素2.5単位と室温で20分間反応させた。上記
の溶液を95℃で２分間保つことによりクレノウ酵素活性
を失活させた後、Sal I制限酵素10単位、1M NaCl 6.5μ
ｌおよび蒸留水20.5μｌを加えて37℃で１時間インキュ
ベートした。１％アガロースゲルから2.4KbのDNA断片を
分離した。電気溶出したDNAを10mMトリス−HCl（pH7.
5）および1mM EDTAを含有するTE液15μｌに溶解した。
一方、完全なウシ成長ホルモン遺伝子のDNA断片および
独立したSD配列を得るため、上記の方法で作成したpSOD
BGH DNA 10μｇを150mM NaCl、6mMトリス−HCl（pH7.
9）および6mM MgCl2からなる緩衝液中、Nco I制限酵素1
2単位で37℃で１時間反応した。反応物をフェノールお
よびクロロホルム混合液で処理し、エタノールで沈殿さ
せた。沈殿を乾燥し、蒸留水31.5μｌに溶解した。最終
濃度が250μＭとなるようにdNTP（dGTP、dCTP、dATP、d
TTP）を加え、この溶液を50mMトリス−HCl（pH8.0）、1
0mM MgCl2および50mM NaClを含有した緩衝液中でクレノ
ウ酵素2.5単位と反応させた。溶液を２分間95℃に保っ
た後、Sal I制御酵素20単位、1M NaCl 7μｌおよび蒸留
水10μｌを加え、37℃で１時間インキュベートした。１
％アガロースゲル電気泳動および電気溶出により、595d
pのDNA断片を単離し、TE液15μｌに溶解した。
独立したSD配列を得るため、上記の方法で作成したpSOD
BGH DNA 10μｇを150mM NaCl、6mMトリス−HCl（pH7.
9）および6mM MgCl2からなる緩衝液中、Nco I制限酵素1
2単位で37℃で１時間反応した。反応物をフェノールお
よびクロロホルム混合液で処理し、エタノールで沈殿さ
せた。沈殿を乾燥し、蒸留水31.5μｌに溶解した。最終
濃度が250μＭとなるようにdNTP（dGTP、dCTP、dATP、d
TTP）を加え、この溶液を50mMトリス−HCl（pH8.0）、1
0mM MgCl2および50mM NaClを含有した緩衝液中でクレノ
ウ酵素2.5単位と反応させた。溶液を２分間95℃に保っ
た後、Sal I制御酵素20単位、1M NaCl 7μｌおよび蒸留
水10μｌを加え、37℃で１時間インキュベートした。１
％アガロースゲル電気泳動および電気溶出により、595d
pのDNA断片を単離し、TE液15μｌに溶解した。
ptrp322H SGH DNAをXba I、クレノウ酵素およびSal I制
御酵素で処理することによって得られた2.4Kbのベクタ
ーDNA10ngおよび完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含ん
だDNA50ngを、60mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM DTTおよ
び10mM MgCl2を含有する緩衝液中、T4 DNAリガーゼ20単
位で14℃で16時間ライゲーションした。ついでハナハン
の方法により、これをエシェリヒア・コリHB101にクロ
ーニングして、ptrphsBGH1〜13を得た。得られたベクタ
ーptrphsBGH1〜13をエシェリヒア・コリW3110（ATCC273
25）へクローニングした。
御酵素で処理することによって得られた2.4Kbのベクタ
ーDNA10ngおよび完全なウシ成長ホルモン遺伝子を含ん
だDNA50ngを、60mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM DTTおよ
び10mM MgCl2を含有する緩衝液中、T4 DNAリガーゼ20単
位で14℃で16時間ライゲーションした。ついでハナハン
の方法により、これをエシェリヒア・コリHB101にクロ
ーニングして、ptrphsBGH1〜13を得た。得られたベクタ
ーptrphsBGH1〜13をエシェリヒア・コリW3110（ATCC273
25）へクローニングした。
実施例４ ウシ成長ホルモン生産のための酵母培養およびその同定 ベクターpC1/1−BGHを形質転換した酵母細胞各3mlをロ
イシン無含有培地（培地１リットル当り、アミノ酸無含
有酵母窒素塩基6.7g、Leu−欠乏アミノ酸サップルメン
ト0.25gおよび２％グルコース含有）中、30℃で24時間
培養した。１夜培養物1mlを２％ペプトン、１％酵母抽
出物および２％グルコースを含有するYEPD培地（100m
l）に接種し、30℃で24時間培養した。これにエタノー
ル40mlを加え、さらに溶液を24時間培養した。
イシン無含有培地（培地１リットル当り、アミノ酸無含
有酵母窒素塩基6.7g、Leu−欠乏アミノ酸サップルメン
ト0.25gおよび２％グルコース含有）中、30℃で24時間
培養した。１夜培養物1mlを２％ペプトン、１％酵母抽
出物および２％グルコースを含有するYEPD培地（100m
l）に接種し、30℃で24時間培養した。これにエタノー
ル40mlを加え、さらに溶液を24時間培養した。
得られたOD650は約40であった。その10（OD650）を取
り、遠心し、10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、2m
Mフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および8
M尿素を含有する緩衝液400μｌに溶解し、直径0.45mmの
ガラスビーズを加えて激しく攪拌した。細胞壁を破壊し
た後、ウシ成長ホルモンを緩衝液へ溶出し、溶出液の４
μｌを12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
掛けた。
り、遠心し、10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、2m
Mフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および8
M尿素を含有する緩衝液400μｌに溶解し、直径0.45mmの
ガラスビーズを加えて激しく攪拌した。細胞壁を破壊し
た後、ウシ成長ホルモンを緩衝液へ溶出し、溶出液の４
μｌを12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
掛けた。
その結果を第７図に示す。
１枠はBRL社からのマーカー蛋白質の分子量を表す。
２枠はベクターpC1/1BGHで形質転換した酵母細胞のエタ
ノール誘導前の全蛋白質を表す。
ノール誘導前の全蛋白質を表す。
３〜８枠はベクターpC1/1−BGHで形質転換した酵母細胞
のエタノール誘導後の全蛋白質を表す。
のエタノール誘導後の全蛋白質を表す。
10枠はウシ成長ホルモン遺伝子を含んでないベクターpC
1/1で形質転換した酵母細胞の全蛋白質を表す。
1/1で形質転換した酵母細胞の全蛋白質を表す。
第７図の３枠に見られるように、ウシ成長ホルモンはタ
ンパク質ゲルのデンシトメトリー・スキャンニングによ
り、約22Kdのバンドに全蛋白質量の20％に相当する量を
発現する。
ンパク質ゲルのデンシトメトリー・スキャンニングによ
り、約22Kdのバンドに全蛋白質量の20％に相当する量を
発現する。
実施例５ エシェリヒア・コリW3110におけるウシ成長ホルモンの
大量形質発現およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびウエスタンブロッティングによる確認 形質発現ベクターptrphsBGH1〜13を含んだエシェリヒア
・コリW3110をアンピシリン40μg/mlを含有するLB培地
で振とうしながら37℃で16時間培養し、OD650が0.5に達
した時点で、IAA（インドールアクリル酸）60μg/mlを
添加した。この溶液をさらに37℃で18時間培養した。OD
650が1.0に相当する培養細胞を遠心し、ラエムリのサン
プル緩衝液［ラエムリ、U.K.、ネーチャー、227巻、680
頁（1970年）］100μｌに溶解した。溶液を100℃で５分
間加熱し、ついでその10μｌを12.5％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に掛けた。
大量形質発現およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびウエスタンブロッティングによる確認 形質発現ベクターptrphsBGH1〜13を含んだエシェリヒア
・コリW3110をアンピシリン40μg/mlを含有するLB培地
で振とうしながら37℃で16時間培養し、OD650が0.5に達
した時点で、IAA（インドールアクリル酸）60μg/mlを
添加した。この溶液をさらに37℃で18時間培養した。OD
650が1.0に相当する培養細胞を遠心し、ラエムリのサン
プル緩衝液［ラエムリ、U.K.、ネーチャー、227巻、680
頁（1970年）］100μｌに溶解した。溶液を100℃で５分
間加熱し、ついでその10μｌを12.5％SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に掛けた。
その結果を第８図（Ａ）に示す。
（Ａ）はウシ成長ホルモンの形質発現株を上記の条件で
培養後、SDS−ポリアクリルアミドゲルによって確認し
た結果を示す。
培養後、SDS−ポリアクリルアミドゲルによって確認し
た結果を示す。
１枠はptrphs BGHを含んだ誘導しなかったエシェリヒア
・コリW3110を示す。
・コリW3110を示す。
２〜６枠はIAAによる誘導を示す。
第８図（Ａ）から判るように、誘導しなかった細胞では
認められない22Kdのタンパク質バンドがエシェリヒア・
コリの全タンパク質の30％を超える量で出現する。
認められない22Kdのタンパク質バンドがエシェリヒア・
コリの全タンパク質の30％を超える量で出現する。
バーネットらの方法［アナリティカル・バイオケミスト
リー、112巻、195頁（1981年）］により、西洋ワサビ・
ペルオキシダーゼ［アキュレート・ケミカル・サイエン
ティフィック・コーポレーション、米国］を結合したウ
シ成長ホルモンに対するモノクローナル抗体を使用した
ウェスタンブロッティングを実施し、第８図（Ｂ）に示
した結果を得た。
リー、112巻、195頁（1981年）］により、西洋ワサビ・
ペルオキシダーゼ［アキュレート・ケミカル・サイエン
ティフィック・コーポレーション、米国］を結合したウ
シ成長ホルモンに対するモノクローナル抗体を使用した
ウェスタンブロッティングを実施し、第８図（Ｂ）に示
した結果を得た。
（Ｂ）はエシェリヒア・コリで形質発現したウシ成長ホ
ルモンのウェスタンブロッティングによって確認した結
果を示す。
ルモンのウェスタンブロッティングによって確認した結
果を示す。
１〜３枠はウシ成長ホルモン遺伝子を含んでいない株を
示す。
示す。
４枠は誘導しなかった細胞を示す。
５枠はIAAによる誘導を示す。
第８図（Ｂ）から判るように、分子量22キロダルトンに
現れたタンパク質バンドと同一の位置に免疫活性が現れ
る。
現れたタンパク質バンドと同一の位置に免疫活性が現れ
る。
即ち、この発明で形質発現されたウシ成長ホルモンが免
疫活性を有することを確認した。
疫活性を有することを確認した。
M9培地は40mM K2HPO4、22mM KH2PO4、8.5mM NaCl、18.7
mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10μg/mlビタミン
B1、0.4％CAA（カザミノ酸）、１％グルコースおよびア
ンピシリン40μg/mlを含有している。
mM NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10μg/mlビタミン
B1、0.4％CAA（カザミノ酸）、１％グルコースおよびア
ンピシリン40μg/mlを含有している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 李 庸范 大韓民国300‐01忠清南道大田市中区龍門 洞276‐８ (72)発明者 李 泰揆 大韓民国132ソウル特別市道峰区水踰１洞 486‐573 (72)発明者 朴 榮祐 大韓民国300‐31忠清南道大田市中区道龍 洞386‐１ (72)発明者 韓 圭范 大韓民国300‐31忠清南道大田市中区道龍 洞386‐１ (56)参考文献 特開 昭59−63197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−996（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−21596（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】（ａ）ウシ成長ホルモンのアミノ酸配列に
したがって、Sac I、Pst IおよびSal Iを有するオリゴ
ヌクレオチド（複数）を合成し、（ｂ）オリゴヌクレオ
チド（複数）をライゲートし、ライゲートしたオリゴヌ
クレオチドをエシェリキア・コリのベクターへクローニ
ングし、ウシ成長ホルモンコード化配列を作成し、
（ｃ）部分ウシ成長ホルモンコード化配列および、上流
鎖ヌクレオチド配列： 73量体（５′−CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG
GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT C
TT CGA GCT−３′） および、下流鎖ヌクレオチド配列： 65量体（３′−CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC GCA
TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC
−５′） を有する合成アダプターをエシェリキア・コリベクター
へクローニングし、上記合成アダプターとライゲートし
たウシ成長ホルモンコード化配列を得、（ｄ）得られた
ウシ成長ホルモンコード化配列を、trpプロモーターの
制御下サケ成長ホルモンを発現し得るエシェリキア・コ
リ発現ベクターに挿入し、（ｅ）エシェリキア・コリで
ウシ成長ホルモン遺伝子を発現させることを含むウシ成
長ホルモンの生産方法。 - 【請求項２】合成アダプターが、終止コドンTAAおよび
ウシ成長ホルモンコード化配列の開始コドンATGの前に
独立したシャイン・ダルガルノ配列を有し、SD配列と開
始コドンの間でmRNAの２次構造の生成を妨げる、請求項
１記載のウシ成長ホルモンの生産方法。 - 【請求項３】合成アダプターにライゲートしたウシ成長
ホルモンコード化配列が、Nco IおよびSal I制限酵素で
処理したベクターpSODへウシ成長ホルモンコード化配列
の526bpのSac I−Sal I断片および合成アダプターをク
ローニングすることによって得られる、請求項２または
３記載のウシ成長ホルモンの生産方法。 - 【請求項４】得られたエシェリキア・コリ形質発現ベク
ターが、（ａ）ベクターpSOD BGHをNco IおよびSal I
制限酵素で処理してウシ成長ホルモン遺伝子を分離し、
（ｂ）分離した断片を、サケ成長ホルモンコード化配列
の一部をXba IおよびSal I制限酵素処理によって除いた
エシェリキア・コリ形質転換ベクター322H SGHへクロ
ーニングすることによって作成されたベクターptrphsBG
H1−13である、請求項１〜３のいずれか１項記載のウシ
成長ホルモンの生産方法。 - 【請求項５】エシェリキア・コリにおける形質発現をシ
ャイン・ダルガルノ配列およびサケ成長ホルモン遺伝子
の前にある開始コドンATGを使用することによって行わ
れる請求項２〜４のいずれか１項記載のウシ成長ホルモ
ンの生産方法。 - 【請求項６】エシェリキア・コリにおける発現が、シャ
イン・ダルガルノ配列および終止コドンTAAを含む合成
アダプターを有するウシ成長ホルモンコード化配列を、
サケ成長ホルモン遺伝子のNH2−末端領域にライゲート
し、ポリシストロン構築物を作成することによって行わ
れる、請求項２〜５のいずれか１項記載のウシ成長ホル
モンの生産方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR86-11712 | 1986-12-31 | ||
| KR1019860011711A KR920003664B1 (ko) | 1986-12-31 | 1986-12-31 | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법 |
| KR86-11711 | 1986-12-31 | ||
| KR1019860011712A KR920003665B1 (ko) | 1986-12-31 | 1986-12-31 | 합성유전자에 의한 대장균으로부터 소성장호르몬의 대량 생산방법 |
| PCT/KR1987/000013 WO1988005078A1 (en) | 1986-12-31 | 1987-12-28 | Method for the production of bovine growth hormone using a synthetic gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02501261A JPH02501261A (ja) | 1990-05-10 |
| JPH0712318B2 true JPH0712318B2 (ja) | 1995-02-15 |
Family
ID=26627646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63500842A Expired - Lifetime JPH0712318B2 (ja) | 1986-12-31 | 1987-12-28 | 合成遺伝子を使用したウシ成長ホルモンの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH0712318B2 (ja) |
| AT (1) | ATE103978T1 (ja) |
| DE (1) | DE3789550T2 (ja) |
| WO (1) | WO1988005078A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| KR100225511B1 (ko) * | 1994-12-30 | 1999-10-15 | 성재갑 | 소 성장호르몬의 대량 생산 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| ZA837173B (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-30 | Univ Case Western Reserve | Genomic bovine growth hormone |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| EP0219814B1 (en) * | 1985-10-21 | 1991-09-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for production of isulin-like growth factor i and plasmid for production thereof |
-
1987
- 1987-12-28 JP JP63500842A patent/JPH0712318B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-28 DE DE3789550T patent/DE3789550T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-28 WO PCT/KR1987/000013 patent/WO1988005078A1/en not_active Ceased
-
1988
- 1988-07-19 AT AT88900596T patent/ATE103978T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-07-19 EP EP88900596A patent/EP0295285B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0295285A1 (en) | 1988-12-21 |
| WO1988005078A1 (en) | 1988-07-14 |
| JPH02501261A (ja) | 1990-05-10 |
| ATE103978T1 (de) | 1994-04-15 |
| DE3789550D1 (de) | 1994-05-11 |
| DE3789550T2 (de) | 1994-08-25 |
| EP0295285B1 (en) | 1994-04-06 |
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