JPH07123977A - 乳酸菌及び発酵乳製品 - Google Patents
乳酸菌及び発酵乳製品Info
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- JPH07123977A JPH07123977A JP5275791A JP27579193A JPH07123977A JP H07123977 A JPH07123977 A JP H07123977A JP 5275791 A JP5275791 A JP 5275791A JP 27579193 A JP27579193 A JP 27579193A JP H07123977 A JPH07123977 A JP H07123977A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 培養物を１０℃、２週間保存時の乳酸酸度増
加量が０．５％以下を示すこと、細胞膜結合性アデノシ
ントリホスファターゼ活性が５μmol・Pi/min/mg蛋白質
以下であること、並びにネオマイシン耐性を有するする
ラクトバチルス属乳酸菌並びにこのラクトバチルス属乳
酸菌を含む乳酸菌を用いて発酵処理した発酵乳製品。 【効果】 前記ラクトバチルス属乳酸菌は、長期低温保
存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することができるヨー
グルト等の発酵乳製品の製造に利用することができる。
また前記発酵乳製品は、前記乳酸菌を使用するので、長
期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することがで
きる他、発酵終了直後の風味を維持しながら、発酵乳中
に血圧低下作用を有する。
加量が０．５％以下を示すこと、細胞膜結合性アデノシ
ントリホスファターゼ活性が５μmol・Pi/min/mg蛋白質
以下であること、並びにネオマイシン耐性を有するする
ラクトバチルス属乳酸菌並びにこのラクトバチルス属乳
酸菌を含む乳酸菌を用いて発酵処理した発酵乳製品。 【効果】 前記ラクトバチルス属乳酸菌は、長期低温保
存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することができるヨー
グルト等の発酵乳製品の製造に利用することができる。
また前記発酵乳製品は、前記乳酸菌を使用するので、長
期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することがで
きる他、発酵終了直後の風味を維持しながら、発酵乳中
に血圧低下作用を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低ｐＨ領域及び低温保
存時における酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品及び
該発酵乳製品の製造等に利用可能な新規なラクトバチル
ス属乳酸菌に関する。
存時における酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品及び
該発酵乳製品の製造等に利用可能な新規なラクトバチル
ス属乳酸菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラクトバチルス属乳酸菌は、古くから発
酵乳製造時の代表的なスターターとして用いられてい
る。ラクトバチルス属等の乳酸桿菌は、ストレプトコッ
カス属およびラクトコッカス属等の乳酸球菌よりも乳酸
酸度が高くなり、乳蛋白質を分解するプロティナーゼ活
性も高いものが多い。特に、ラクトバチルス・ヘルベチ
カスは強い蛋白分解活性を有しており、その菌体外プロ
ティナーゼが乳蛋白質を分解して生成されるペプチド
は、血圧上昇作用の原因物質であるアンギオテンシン変
換酵素（Angiotensin Converting Enzyme 以下ＡＣＥ
と称す）に対して阻害活性を有することが報告されてい
る。更に、ラクトバチルス・ヘルベチカスによる発酵乳
にも同様の活性が認められる。これらのＡＣＥ阻害ペプ
チドは、自然発症高血圧ラット（SHR: Spontaneously H
ypertensive Rat）において血圧降下活性を示す事が確
認されている［Nakamura.Yら日本農芸化学会誌、67,289
(1993）］。
酵乳製造時の代表的なスターターとして用いられてい
る。ラクトバチルス属等の乳酸桿菌は、ストレプトコッ
カス属およびラクトコッカス属等の乳酸球菌よりも乳酸
酸度が高くなり、乳蛋白質を分解するプロティナーゼ活
性も高いものが多い。特に、ラクトバチルス・ヘルベチ
カスは強い蛋白分解活性を有しており、その菌体外プロ
ティナーゼが乳蛋白質を分解して生成されるペプチド
は、血圧上昇作用の原因物質であるアンギオテンシン変
換酵素（Angiotensin Converting Enzyme 以下ＡＣＥ
と称す）に対して阻害活性を有することが報告されてい
る。更に、ラクトバチルス・ヘルベチカスによる発酵乳
にも同様の活性が認められる。これらのＡＣＥ阻害ペプ
チドは、自然発症高血圧ラット（SHR: Spontaneously H
ypertensive Rat）において血圧降下活性を示す事が確
認されている［Nakamura.Yら日本農芸化学会誌、67,289
(1993）］。
【０００３】しかし、ラクトバチルス・ヘルベチカス
は、乳発酵において乳酸の生成量が多く（従ってｐＨの
低下が著しく）、更に低温保存時にも乳酸酸度が上昇し
易いためにヨーグルト等への利用が困難であり、現在ヨ
ーグルトにはほとんど用いられていない。
は、乳発酵において乳酸の生成量が多く（従ってｐＨの
低下が著しく）、更に低温保存時にも乳酸酸度が上昇し
易いためにヨーグルト等への利用が困難であり、現在ヨ
ーグルトにはほとんど用いられていない。
【０００４】一般に、ヨーグルト製造後の低温保存時の
酸度上昇は重要な問題であり、酸度上昇を抑える工夫と
して変異処理による育種等の種々の検討がなされている
が、増殖活性の低い変異株が分離され易いために、目的
の変異株が得られていないのが現状である。
酸度上昇は重要な問題であり、酸度上昇を抑える工夫と
して変異処理による育種等の種々の検討がなされている
が、増殖活性の低い変異株が分離され易いために、目的
の変異株が得られていないのが現状である。
【０００５】これまでにアデノシントリホスファターゼ
（以下ＡＴＰａｓｅと称す）が微生物菌体内のｐＨ調整
に関与していることが知られている。即ち、乳酸菌の発
酵における最終代謝産物である乳酸の産生により菌体外
のｐＨは酸性になるが、ＡＴＰａｓｅの働きにより乳酸
菌体内のｐＨは中性に保たれる。また菌体内ｐＨと菌体
外ｐＨとの差が大きくなるに従いＡＴＰａｓｅの発現量
も増大する傾向にある。従って、酸性培地においてこの
ような細胞膜バリアーを破壊し、プロトンの濃度勾配を
なくした条件では、微生物細胞は増殖できないことが確
認されている［Hiroshi Kobayashi,Takashi Suzuki,and
Tsutomu Umemoto;The J. of Biological Chemistry.26
1,2.627-630(1986)]、[NANCY L-NANNEN and ROBERT W.
HUTKINS;J. of Dairy Sci.,74,747-751(1991)]。しかし
これらの報告は、いずれも微生物細胞外ｐＨとＡＴＰａ
ｓｅ活性との関係について示されているものであり、微
生物発酵により得られる発酵物の最終的なｐＨについて
は記載されていない。
（以下ＡＴＰａｓｅと称す）が微生物菌体内のｐＨ調整
に関与していることが知られている。即ち、乳酸菌の発
酵における最終代謝産物である乳酸の産生により菌体外
のｐＨは酸性になるが、ＡＴＰａｓｅの働きにより乳酸
菌体内のｐＨは中性に保たれる。また菌体内ｐＨと菌体
外ｐＨとの差が大きくなるに従いＡＴＰａｓｅの発現量
も増大する傾向にある。従って、酸性培地においてこの
ような細胞膜バリアーを破壊し、プロトンの濃度勾配を
なくした条件では、微生物細胞は増殖できないことが確
認されている［Hiroshi Kobayashi,Takashi Suzuki,and
Tsutomu Umemoto;The J. of Biological Chemistry.26
1,2.627-630(1986)]、[NANCY L-NANNEN and ROBERT W.
HUTKINS;J. of Dairy Sci.,74,747-751(1991)]。しかし
これらの報告は、いずれも微生物細胞外ｐＨとＡＴＰａ
ｓｅ活性との関係について示されているものであり、微
生物発酵により得られる発酵物の最終的なｐＨについて
は記載されていない。
【０００６】更に、ネオマイシン耐性については、大腸
菌(Escherchia coli)のネオマイシン耐性変異株が、Ａ
ＴＰａｓｅ活性も欠損していることが知られている[BAR
RY P. ROSEN;J. of Bacteriology,116,3.1124-1129(197
3)]。しかし、乳酸産生については一切記載されていな
い。
菌(Escherchia coli)のネオマイシン耐性変異株が、Ａ
ＴＰａｓｅ活性も欠損していることが知られている[BAR
RY P. ROSEN;J. of Bacteriology,116,3.1124-1129(197
3)]。しかし、乳酸産生については一切記載されていな
い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、強い
蛋白分解活性及び乳蛋白質に対する基質特異性を有し、
発酵乳中にＡＣＥ阻害ペプチドを産生させるというラク
トバチルス属乳酸菌の特性を維持しつつ、培養時、培養
物の保存時における乳酸酸度の増加が低い等の特性を有
する変異株を利用したラクトバチルス属乳酸菌を提供す
ることにある。
蛋白分解活性及び乳蛋白質に対する基質特異性を有し、
発酵乳中にＡＣＥ阻害ペプチドを産生させるというラク
トバチルス属乳酸菌の特性を維持しつつ、培養時、培養
物の保存時における乳酸酸度の増加が低い等の特性を有
する変異株を利用したラクトバチルス属乳酸菌を提供す
ることにある。
【０００８】本発明の別の目的は、低ｐＨ領域、低温保
存時において乳酸酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品
を提供することにある。
存時において乳酸酸度の上昇等が抑制された発酵乳製品
を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、培養物
を１０℃、２週間保存時の乳酸酸度増加量が０．５％以
下を示すこと、細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性が５μmo
l・ Pi/min/mg蛋白質以下であること、並びにネオマイシ
ン耐性を有することを特徴とするラクトバチルス属乳酸
菌（以下乳酸菌Ａと称す）が提供される。
を１０℃、２週間保存時の乳酸酸度増加量が０．５％以
下を示すこと、細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性が５μmo
l・ Pi/min/mg蛋白質以下であること、並びにネオマイシ
ン耐性を有することを特徴とするラクトバチルス属乳酸
菌（以下乳酸菌Ａと称す）が提供される。
【００１０】また本発明によれば、前記乳酸菌Ａを含む
乳酸菌を用いて発酵処理したことを特徴とする発酵乳製
品が提供される。
乳酸菌を用いて発酵処理したことを特徴とする発酵乳製
品が提供される。
【００１１】以下本発明を更に詳細に説明する。
【００１２】本発明の乳酸菌Ａは、ラクトバチルス属乳
酸菌の変異株であって、親株の乳酸菌が有する菌学的性
質に変化はなく、特に、菌体外プロテアーゼ活性の強
さ、並びに基質に対する特異性には変化がないが、以下
の(1)〜(3)の点において、親株と相違する特異的性質を
有する。(1)培養物を１０℃、２週間保存時の乳酸酸度
増加量が０．５％以内を示すこと、(2)細胞膜結合性Ａ
ＴＰａｓｅ活性が５μmol・Pi/min/mg蛋白質以下である
こと、並びに(3)ネオマイシン耐性を有すること。
酸菌の変異株であって、親株の乳酸菌が有する菌学的性
質に変化はなく、特に、菌体外プロテアーゼ活性の強
さ、並びに基質に対する特異性には変化がないが、以下
の(1)〜(3)の点において、親株と相違する特異的性質を
有する。(1)培養物を１０℃、２週間保存時の乳酸酸度
増加量が０．５％以内を示すこと、(2)細胞膜結合性Ａ
ＴＰａｓｅ活性が５μmol・Pi/min/mg蛋白質以下である
こと、並びに(3)ネオマイシン耐性を有すること。
【００１３】前記(1)培養物の保存時の乳酸酸度増加量
は、１０℃、２週間保存時において、乳酸酸度上昇が
０．５％以内、好ましくは０．４％以内であれば、他の
条件における乳酸酸度増加量は特に限定されるものでは
ないが、培養時の場合、最終乳酸酸度が０．５〜１．２
％、特に０．６〜１．０％の範囲であるのが好ましく、
一方１０℃、１週間保存時においては、好ましくは乳酸
酸度上昇が０．４％以内、特に好ましくは０．２％以内
を示すのが望ましい。
は、１０℃、２週間保存時において、乳酸酸度上昇が
０．５％以内、好ましくは０．４％以内であれば、他の
条件における乳酸酸度増加量は特に限定されるものでは
ないが、培養時の場合、最終乳酸酸度が０．５〜１．２
％、特に０．６〜１．０％の範囲であるのが好ましく、
一方１０℃、１週間保存時においては、好ましくは乳酸
酸度上昇が０．４％以内、特に好ましくは０．２％以内
を示すのが望ましい。
【００１４】前記(2)細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性
は、培地中のｐＨにより変化するが５μmol. Pi/min/mg
蛋白質以下である。該細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性
の測定は、例えば各細胞からＮｅｕらの方法［Neu, H.
C ＆ Heppel. L. A. J. Biol.Chem. 240. 3685(1965)］
に従い浸透圧ショックにより蛋白質を抽出し、２５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．５）、２５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、２５ｍＭアデノシントリフォスフェートナトリウム
および１６．５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の溶液１０μｌに抽出液４０μｌを加え３７℃で１
分間反応させた後、５μｌの０．１Ｎ塩酸を加えて反応
を停止させ、その後、生成された無機リン酸の濃度を商
品名「Ｐ−テストワコー」（和光純薬工業（株）製品）
により測定し、また、抽出液中の蛋白質濃度をブラッド
フォードの方法［Bradford.M. M.（1976) Anal. Bioche
m. 72, 284 (1976) ］により測定する方法等により行な
うことができる。
は、培地中のｐＨにより変化するが５μmol. Pi/min/mg
蛋白質以下である。該細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性
の測定は、例えば各細胞からＮｅｕらの方法［Neu, H.
C ＆ Heppel. L. A. J. Biol.Chem. 240. 3685(1965)］
に従い浸透圧ショックにより蛋白質を抽出し、２５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．５）、２５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、２５ｍＭアデノシントリフォスフェートナトリウム
および１６．５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の溶液１０μｌに抽出液４０μｌを加え３７℃で１
分間反応させた後、５μｌの０．１Ｎ塩酸を加えて反応
を停止させ、その後、生成された無機リン酸の濃度を商
品名「Ｐ−テストワコー」（和光純薬工業（株）製品）
により測定し、また、抽出液中の蛋白質濃度をブラッド
フォードの方法［Bradford.M. M.（1976) Anal. Bioche
m. 72, 284 (1976) ］により測定する方法等により行な
うことができる。
【００１５】前記ネオマイシン耐性を有するとは、ネオ
マイシンを含む培地で培養した際に死滅せずに増殖性を
示すものであれば良い。
マイシンを含む培地で培養した際に死滅せずに増殖性を
示すものであれば良い。
【００１６】本発明の乳酸菌Ａとしては、前記親株の菌
学的性質を維持しており、且つ(1)〜(3)の特異的な性質
を有するものであれば特に限定されるものではなく、具
体的には、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１３９１４（以下ＣＰＮ４と称す）として寄託さ
れているラクトバチルス属乳酸菌等を挙げることができ
る。
学的性質を維持しており、且つ(1)〜(3)の特異的な性質
を有するものであれば特に限定されるものではなく、具
体的には、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１３９１４（以下ＣＰＮ４と称す）として寄託さ
れているラクトバチルス属乳酸菌等を挙げることができ
る。
【００１７】前記ＣＰＮ４の菌学的性質を光岡の方法
(臨床検査18.1163(1974))による同定の結果、親株であ
るラクトバチルス・ヘルベチカスJCM1004と菌学的性質は
同様であるが、ネオマイシン耐性、低ＡＴＰａｓｅ活
性、更に低ｐＨ領域における低い増殖性の点において明
らかに親株と異なる性質を有しており、ｐＨ感受性変異
株であることが確認できた。その具体的菌学的性質を表
１に示す。
(臨床検査18.1163(1974))による同定の結果、親株であ
るラクトバチルス・ヘルベチカスJCM1004と菌学的性質は
同様であるが、ネオマイシン耐性、低ＡＴＰａｓｅ活
性、更に低ｐＨ領域における低い増殖性の点において明
らかに親株と異なる性質を有しており、ｐＨ感受性変異
株であることが確認できた。その具体的菌学的性質を表
１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】本発明の乳酸菌Ａを調製するには、親株で
あるラクトバチルス属乳酸菌を、以下の方法等により変
異させることにより得ることができる。
あるラクトバチルス属乳酸菌を、以下の方法等により変
異させることにより得ることができる。
【００２０】前記親株としては、ラクトバチルス属であ
れば特に限定されるものではなく、例えばラクトバチル
ス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラク
トバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガ
リカス（Lactobacillus delburueckii subsp. bulgaric
us）等の乳酸産生能の高い乳酸菌等を挙げることができ
る。
れば特に限定されるものではなく、例えばラクトバチル
ス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）、ラク
トバチルス・デルブルッキ・サブスピーシーズ・ブルガ
リカス（Lactobacillus delburueckii subsp. bulgaric
us）等の乳酸産生能の高い乳酸菌等を挙げることができ
る。
【００２１】まず親株であるラクトバチルス属乳酸菌
を、各菌株の増殖性の良い培地、例えば、ブリッグス・
リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）、ＭＲＳ培地、
ＢＬ培地、ＧＡＭ培地等で増殖培養し、対数増殖期に集
菌する。この際各培地における乳酸菌の添加量は、約１
×１０6cells／ｍｌであるのが好ましく、また培養条件
としては、培養温度３０〜４５℃で、３〜２４時間培養
するのが好ましい。
を、各菌株の増殖性の良い培地、例えば、ブリッグス・
リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）、ＭＲＳ培地、
ＢＬ培地、ＧＡＭ培地等で増殖培養し、対数増殖期に集
菌する。この際各培地における乳酸菌の添加量は、約１
×１０6cells／ｍｌであるのが好ましく、また培養条件
としては、培養温度３０〜４５℃で、３〜２４時間培養
するのが好ましい。
【００２２】次にBarry［Barry,P.R.J. of Bacteriolog
y,116,1124-1129(1973)］により、ＡＴＰａｓｅ活性の
低い株を分離するためには、ネオマイシン耐性株の中か
らの分離が効果的とされているので、好ましくはこの方
法に従って、ネオマイン５〜１００μｇ／ｍｌを含む前
記増殖用培地を含む寒天培地に接種しネオマイシン耐性
株を選択する。
y,116,1124-1129(1973)］により、ＡＴＰａｓｅ活性の
低い株を分離するためには、ネオマイシン耐性株の中か
らの分離が効果的とされているので、好ましくはこの方
法に従って、ネオマイン５〜１００μｇ／ｍｌを含む前
記増殖用培地を含む寒天培地に接種しネオマイシン耐性
株を選択する。
【００２３】前記方法において、変異を積極的に誘発す
るには、例えば紫外線照射や化学変異誘起剤等の前処理
を行うこともできる。前記紫外線照射の処理条件は、波
長５００ｎｍ以下、照射時間数秒〜３０分、照射距離１
０〜３０ｃｍで行うのが好ましい。また変異株を効率的
に選択するためには、増殖用培地中に対数増殖期の生菌
を懸濁し、生菌率０．１〜１．０％となるような条件で
紫外線照射するのが好ましい。更に化学変異誘起剤によ
る処理は、例えばニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−ニトロソグアニジン）、エチルメタンス
ルホン酸、メチルメタンスルホン酸、５−ブロモウラシ
ル等を使用し、例えばニトロソグアニジンを使用する場
合には、好ましくは処理ｐＨ５．０〜８．０、特に好ま
しくはｐＨ６．０〜７．０の増殖用培地中に対数増殖期
の生菌を懸濁し、ニトロソグアニジン濃度を３０〜１０
００μｇ／ｍｌ、特に１００〜３００μｇ／ｍｌとし、
処理温度を室温〜５０℃、特に３０〜３７℃として、処
理時間１０〜６０分間、特に１５〜３０分間処理するの
が好ましい。
るには、例えば紫外線照射や化学変異誘起剤等の前処理
を行うこともできる。前記紫外線照射の処理条件は、波
長５００ｎｍ以下、照射時間数秒〜３０分、照射距離１
０〜３０ｃｍで行うのが好ましい。また変異株を効率的
に選択するためには、増殖用培地中に対数増殖期の生菌
を懸濁し、生菌率０．１〜１．０％となるような条件で
紫外線照射するのが好ましい。更に化学変異誘起剤によ
る処理は、例えばニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−ニトロソグアニジン）、エチルメタンス
ルホン酸、メチルメタンスルホン酸、５−ブロモウラシ
ル等を使用し、例えばニトロソグアニジンを使用する場
合には、好ましくは処理ｐＨ５．０〜８．０、特に好ま
しくはｐＨ６．０〜７．０の増殖用培地中に対数増殖期
の生菌を懸濁し、ニトロソグアニジン濃度を３０〜１０
００μｇ／ｍｌ、特に１００〜３００μｇ／ｍｌとし、
処理温度を室温〜５０℃、特に３０〜３７℃として、処
理時間１０〜６０分間、特に１５〜３０分間処理するの
が好ましい。
【００２４】前記ネオマイシン耐性株を選択した後、該
選択株の中から、増殖能の低いものを除き、更にｐＨ
４．５以下においてのみ増殖能の低い細胞株を選択す
る。更に、ここで選択された低ｐＨ領域における増殖活
性低下株は、脱脂粉乳等の乳培地にて例えば３０〜４５
℃で１〜３日間培養し、最終ｐＨが親株より低い細胞
株、即ち最終的な乳酸酸度の上昇が低い細胞株を選択す
る。ここで前記培養後の最終ｐＨ３．４〜３．８の変異
株を最終的に選択し、乳培地において例えば３０〜４５
℃で、３〜２４時間培養し、最終的に前記親株の菌学的
性質を維持し、前記(1)〜(3)の特性を有する細胞株を選
択することのより乳酸菌Ａを得ることができる。
選択株の中から、増殖能の低いものを除き、更にｐＨ
４．５以下においてのみ増殖能の低い細胞株を選択す
る。更に、ここで選択された低ｐＨ領域における増殖活
性低下株は、脱脂粉乳等の乳培地にて例えば３０〜４５
℃で１〜３日間培養し、最終ｐＨが親株より低い細胞
株、即ち最終的な乳酸酸度の上昇が低い細胞株を選択す
る。ここで前記培養後の最終ｐＨ３．４〜３．８の変異
株を最終的に選択し、乳培地において例えば３０〜４５
℃で、３〜２４時間培養し、最終的に前記親株の菌学的
性質を維持し、前記(1)〜(3)の特性を有する細胞株を選
択することのより乳酸菌Ａを得ることができる。
【００２５】本発明の発酵乳製品は、前記乳酸菌Ａを用
いて発酵処理したものであれば特に限定されるものでは
なく、例えばヨーグルト、乳酸発酵飲料、チーズ等を挙
げることができ、それぞれ公知の方法により得ることが
できる。この際乳酸菌Ａは、公知の乳酸菌例えばストレ
プトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermo
philus）、ラクトコッカス・ラクテス(Lactococcus Lac
tis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriu
m Longum)等を併用して用いることができる。発酵乳製
品を調製するには、前記乳酸菌Ａを用いる以外は、公知
の方法等により得ることができる。
いて発酵処理したものであれば特に限定されるものでは
なく、例えばヨーグルト、乳酸発酵飲料、チーズ等を挙
げることができ、それぞれ公知の方法により得ることが
できる。この際乳酸菌Ａは、公知の乳酸菌例えばストレ
プトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermo
philus）、ラクトコッカス・ラクテス(Lactococcus Lac
tis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriu
m Longum)等を併用して用いることができる。発酵乳製
品を調製するには、前記乳酸菌Ａを用いる以外は、公知
の方法等により得ることができる。
【００２６】
【発明の効果】本発明のラクトバチルス属乳酸菌は、長
期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することがで
きるヨーグルト等の発酵乳製品の製造に利用することが
できる。また本発明の発酵乳製品は、前記乳酸菌を使用
するので、長期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制
することができる他、発酵終了直後の風味を維持しなが
ら、発酵乳中に血圧低下作用を有する。
期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制することがで
きるヨーグルト等の発酵乳製品の製造に利用することが
できる。また本発明の発酵乳製品は、前記乳酸菌を使用
するので、長期低温保存した際の乳酸酸度の上昇を抑制
することができる他、発酵終了直後の風味を維持しなが
ら、発酵乳中に血圧低下作用を有する。
【００２７】
【実施例】以下本発明を実施例に基づいて具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
【実施例１】 （変異株の分離）ラクトバチルス・ヘルベチカスＪＣＭ
−１００３(以下親株と称す)１×１０6細胞／ｍｌをブ
リッグス・リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）に接
種して３７℃で２０時間培養した。更に新しい同培地で
３７℃にて６時間再培養し、対数増殖期のものを集菌
し、紫外線照射処理（１５ワット紫外線ランプ、照射時
間３０秒、照射距離２０ｃｍ）を行なった。次にネオマ
イシン５μｇ／ｍｌを含むブリッグス寒天培地上に、生
菌数が１×１０6細胞となるように接種し、３７℃、２
日間培養した。比較的大きいコロニーを形成するもの５
０株を選び、次いでｐＨ６．５及びｐＨ４．５に調整し
たブリッグス寒天培地上にレプリカし、ｐＨ６．５の培
地上で親株と同程度の増殖を示し、ｐＨ４．５の培地上
では親株に比較して増殖性の悪いもの１５株を選択し
た。次に、これら１５株を、９％脱脂粉乳に接種し、３
７℃で３日間培養して最終ｐＨを比較した結果、親株に
比較して高い最終ｐＨであった１株（以下ＣＰＮ４と称
す）を選択した。更にこれら変異株ＣＰＮ４及び親株に
ついて、それぞれ３日間培養後の最終ｐＨ、濁度（５９
０ｎｍの吸光度）を測定した。結果を表２に示す。
−１００３(以下親株と称す)１×１０6細胞／ｍｌをブ
リッグス・リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）に接
種して３７℃で２０時間培養した。更に新しい同培地で
３７℃にて６時間再培養し、対数増殖期のものを集菌
し、紫外線照射処理（１５ワット紫外線ランプ、照射時
間３０秒、照射距離２０ｃｍ）を行なった。次にネオマ
イシン５μｇ／ｍｌを含むブリッグス寒天培地上に、生
菌数が１×１０6細胞となるように接種し、３７℃、２
日間培養した。比較的大きいコロニーを形成するもの５
０株を選び、次いでｐＨ６．５及びｐＨ４．５に調整し
たブリッグス寒天培地上にレプリカし、ｐＨ６．５の培
地上で親株と同程度の増殖を示し、ｐＨ４．５の培地上
では親株に比較して増殖性の悪いもの１５株を選択し
た。次に、これら１５株を、９％脱脂粉乳に接種し、３
７℃で３日間培養して最終ｐＨを比較した結果、親株に
比較して高い最終ｐＨであった１株（以下ＣＰＮ４と称
す）を選択した。更にこれら変異株ＣＰＮ４及び親株に
ついて、それぞれ３日間培養後の最終ｐＨ、濁度（５９
０ｎｍの吸光度）を測定した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】（細胞膜結合性ＡＴＰａｓｅ活性の測定）
ラクトバチルス・ヘルベティカス株９株をｐＨ５．０の
ブリッグス培地で３７℃、６時間培養し、各細胞からＮ
ｅｕらの方法［Neu, H. C ＆ Heppel. L. A. J. Biol.
Chem. 240. 3685(1965)］に従い浸透圧ショックにより
蛋白質を抽出し、以下の方法により活性測定した。酸素
活性は２５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．５）、２５ｍＭ
塩化マグネシウム、２５ｍＭアデノシントリフォスフェ
ートナトリウムおよび１６．５μｇ／ｍｌウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）の溶液１０μｌに、抽出液４０μｌを
加えて、３７℃で１０分間反応させた後、５μｌの０．
１Ｎ塩酸を加えて反応を停止させた。その後、生成され
た無機リン酸の濃度を商品名「Ｐ−テストワコー」（和
光純薬工業（株）製品）により測定した。また、抽出液
中の蛋白質濃度をブラッドフォードの方法［Bradford.
M. M.（1976) Anal.Biochem. 72, 284 (1976) ］により
測定した。ＡＴＰａｓｅ活性を上記条件において測定
し、一定蛋白質当りに含まれる酵素の無機リン酸の生成
量（mol・ Pi/min/mg 蛋白質）で示した（表３）。ま
た、各菌株のネオマイシン耐性度を最小成育阻止濃度を
測定することにより求めた。これらの結果を表３に示
す。
ラクトバチルス・ヘルベティカス株９株をｐＨ５．０の
ブリッグス培地で３７℃、６時間培養し、各細胞からＮ
ｅｕらの方法［Neu, H. C ＆ Heppel. L. A. J. Biol.
Chem. 240. 3685(1965)］に従い浸透圧ショックにより
蛋白質を抽出し、以下の方法により活性測定した。酸素
活性は２５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．５）、２５ｍＭ
塩化マグネシウム、２５ｍＭアデノシントリフォスフェ
ートナトリウムおよび１６．５μｇ／ｍｌウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）の溶液１０μｌに、抽出液４０μｌを
加えて、３７℃で１０分間反応させた後、５μｌの０．
１Ｎ塩酸を加えて反応を停止させた。その後、生成され
た無機リン酸の濃度を商品名「Ｐ−テストワコー」（和
光純薬工業（株）製品）により測定した。また、抽出液
中の蛋白質濃度をブラッドフォードの方法［Bradford.
M. M.（1976) Anal.Biochem. 72, 284 (1976) ］により
測定した。ＡＴＰａｓｅ活性を上記条件において測定
し、一定蛋白質当りに含まれる酵素の無機リン酸の生成
量（mol・ Pi/min/mg 蛋白質）で示した（表３）。ま
た、各菌株のネオマイシン耐性度を最小成育阻止濃度を
測定することにより求めた。これらの結果を表３に示
す。
【００３１】
【表３】
【００３２】表３の結果から、親株JCM-1003及び他の７
株は、高いレベルのＡＴＰａｓｅ活性が確認された。し
かし、ＣＰＮ４株は親株に比べて低いＡＴＰａｓｅ活性
を示した。
株は、高いレベルのＡＴＰａｓｅ活性が確認された。し
かし、ＣＰＮ４株は親株に比べて低いＡＴＰａｓｅ活性
を示した。
【００３３】次に、ＣＰＮ４株及び親株を９％脱脂粉乳
中で再度３７℃、３０時間培養し、これら変異株の発酵
乳中のペプチド量及びＡＣＥ阻害活性が親株と同程度で
あるかどうかを以下に示す方法により詳細に測定した。
また、参考に各菌株の菌体外プロテアーゼ活性を測定
し、最終ｐＨを再度確認した。これらの測定結果を表４
に示す。
中で再度３７℃、３０時間培養し、これら変異株の発酵
乳中のペプチド量及びＡＣＥ阻害活性が親株と同程度で
あるかどうかを以下に示す方法により詳細に測定した。
また、参考に各菌株の菌体外プロテアーゼ活性を測定
し、最終ｐＨを再度確認した。これらの測定結果を表４
に示す。
【００３４】（発酵乳中のＡＣＥ阻害活性の測定）ＡＣ
Ｅ阻害活性の測定は、CushmanとCheungとの方法［Cushm
an. D. W ＆Cheung.H.S.Pharmacol.,20 1637(1971)］に
基づいて行った。即ち、各種発酵乳を１５０００回転、
５分間の遠心分離により上清（ホエー）を調製し、その
後１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを中性とし、
８０μｌを試験管に移し、次に基質として０．１Ｍホウ
酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）で
５ｍＭに調整したヒプリル・ヒスチジル・ロイシン（Hi
p-His-Leu, シグマ社製品）０．２ｍｌを加えて、更に
酵素溶液（０．１unit／ｍｌ、シグマ社製品）２０μｌ
を添加して３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ
塩酸を２５０μｌ加えて反応を停止させた後、１．７ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて約２０秒間撹拌した。次いで３
０００回転で１０分間遠心分離し、酢酸エチル層１．４
ｍｌを回収し、１２０℃で４０分間加熱して溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加えて、約２０秒間
撹拌し抽出されたヒプリル酸の吸光度（２２８ｎｍ）を
測定した。酸素活性１ユニットはＡＣＥ活性の５０％阻
害を与える量として下記式により算出した。
Ｅ阻害活性の測定は、CushmanとCheungとの方法［Cushm
an. D. W ＆Cheung.H.S.Pharmacol.,20 1637(1971)］に
基づいて行った。即ち、各種発酵乳を１５０００回転、
５分間の遠心分離により上清（ホエー）を調製し、その
後１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを中性とし、
８０μｌを試験管に移し、次に基質として０．１Ｍホウ
酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）で
５ｍＭに調整したヒプリル・ヒスチジル・ロイシン（Hi
p-His-Leu, シグマ社製品）０．２ｍｌを加えて、更に
酵素溶液（０．１unit／ｍｌ、シグマ社製品）２０μｌ
を添加して３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ
塩酸を２５０μｌ加えて反応を停止させた後、１．７ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて約２０秒間撹拌した。次いで３
０００回転で１０分間遠心分離し、酢酸エチル層１．４
ｍｌを回収し、１２０℃で４０分間加熱して溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加えて、約２０秒間
撹拌し抽出されたヒプリル酸の吸光度（２２８ｎｍ）を
測定した。酸素活性１ユニットはＡＣＥ活性の５０％阻
害を与える量として下記式により算出した。
【００３５】酸素量（１ユニット）＝［（Ａ−Ｂ）／
（Ａ−Ｃ）］×１００×１／５０ Ａ：試料を含まない場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｂ：試料を添加した場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｃ：酸素及び試料を添加しない場合の吸光度（２２８ｎ
ｍ） ペプチド量の定量はＯＰＡ法［Charch.F.C.らJ.of Dair
y. Sci. 66 1219(1883)］により行った。検量線の作成
は、スタンダードとしてカゼインのトリプシン分解物を
用いた。
（Ａ−Ｃ）］×１００×１／５０ Ａ：試料を含まない場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｂ：試料を添加した場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｃ：酸素及び試料を添加しない場合の吸光度（２２８ｎ
ｍ） ペプチド量の定量はＯＰＡ法［Charch.F.C.らJ.of Dair
y. Sci. 66 1219(1883)］により行った。検量線の作成
は、スタンダードとしてカゼインのトリプシン分解物を
用いた。
【００３６】（菌体外プロテアーゼ活性の測定）菌体外
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酸素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−カゼイン（シグマ社製）
２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを加え４２℃で１時間イ
ンキュベートし、５％トリクロロ酢酸溶液を１２０μｌ
加え室温にて約２０分間放置し、１５０００回転、１０
分間の遠心分離を行った。上清６０μｌを３ｍｌの５０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に加え、蛍光強
度を測定した。蛍光強度は励起波長４９０ｎｍで生じる
５２５ｎｍの蛍光を測定した。活性は上記反応条件で、
１％の蛍光強度を生じる酸素量を１ユニットと定義し
た。ＣＰＮ４株は親株と同程度の菌体外プロテアーゼ活
性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻害活性についても、ほ
ぼ同様の値を示した。しかし、最終ｐＨは、親株に比べ
高いことが再確認された。従って、その発酵乳に親株と
同程度のＡＣＥ阻害活性を有し、最終ｐＨが親株より高
いＣＰＮ４株のみが、目的にかなうものとして選択され
た。
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酸素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−カゼイン（シグマ社製）
２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを加え４２℃で１時間イ
ンキュベートし、５％トリクロロ酢酸溶液を１２０μｌ
加え室温にて約２０分間放置し、１５０００回転、１０
分間の遠心分離を行った。上清６０μｌを３ｍｌの５０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に加え、蛍光強
度を測定した。蛍光強度は励起波長４９０ｎｍで生じる
５２５ｎｍの蛍光を測定した。活性は上記反応条件で、
１％の蛍光強度を生じる酸素量を１ユニットと定義し
た。ＣＰＮ４株は親株と同程度の菌体外プロテアーゼ活
性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻害活性についても、ほ
ぼ同様の値を示した。しかし、最終ｐＨは、親株に比べ
高いことが再確認された。従って、その発酵乳に親株と
同程度のＡＣＥ阻害活性を有し、最終ｐＨが親株より高
いＣＰＮ４株のみが、目的にかなうものとして選択され
た。
【００３７】
【表４】
【００３８】（低温保存試験）更に、変異株ＣＰＮ４株
の１０℃における低温保存試験を行った。親株とＣＰＮ
４株を牛乳中で３７℃で培養し、乳酸産生量が０．６％
となった時点で冷却後、１０℃に保存した。保存後、１
週間後、２週間後に各発酵乳のｐＨ、乳酸酸度（％）、
ＡＣＥ阻害活性及びペプチド量を測定した。結果を表５
に示す。
の１０℃における低温保存試験を行った。親株とＣＰＮ
４株を牛乳中で３７℃で培養し、乳酸産生量が０．６％
となった時点で冷却後、１０℃に保存した。保存後、１
週間後、２週間後に各発酵乳のｐＨ、乳酸酸度（％）、
ＡＣＥ阻害活性及びペプチド量を測定した。結果を表５
に示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】表５の結果からＣＰＮ４株は親株に比べペ
プチド量及びＡＣＥ阻害活性に大きい違いはなかった。
一方、親株では乳酸酸度の上昇及びそれに伴うｐＨの低
下がみられたが、ＣＰＮ４株では保存期間中において乳
酸酸度の大きい変化はみられなかった。ＣＰＮ４株の２
週間保存中のｐＨの変化は０．２、酸度の上昇は０．２
７％であり、酸味の上昇はかなり抑制されていた。
プチド量及びＡＣＥ阻害活性に大きい違いはなかった。
一方、親株では乳酸酸度の上昇及びそれに伴うｐＨの低
下がみられたが、ＣＰＮ４株では保存期間中において乳
酸酸度の大きい変化はみられなかった。ＣＰＮ４株の２
週間保存中のｐＨの変化は０．２、酸度の上昇は０．２
７％であり、酸味の上昇はかなり抑制されていた。
【００４１】（高血圧ラットにおける血圧降下作用確
認）以上のようにして得られた変異株ＣＰＮ４を用い
て、ヨーグルトを作製し（上記低温保存試験における１
０℃、１週間保存のもの）、自然発症高血圧ラット（日
本チャールズリバー（株））に胃ゾンデで経口投与し、
血圧降下値を測定した。コントロールとしては、牛乳を
乳酸で同じ酸度としたものを用いた。１８週令雄ラット
（１群５匹）に発酵乳及びコントロール（未発酵乳）そ
れぞれを６ｍｌ／ｋｇ強制投与し６時間後に血圧を測定
した。血圧測定は、ソフトロン社の装置（型式「Softro
n BP-98A」）を用いて、tail-cuff法で最高血圧を求め
た。結果を表６に示す。
認）以上のようにして得られた変異株ＣＰＮ４を用い
て、ヨーグルトを作製し（上記低温保存試験における１
０℃、１週間保存のもの）、自然発症高血圧ラット（日
本チャールズリバー（株））に胃ゾンデで経口投与し、
血圧降下値を測定した。コントロールとしては、牛乳を
乳酸で同じ酸度としたものを用いた。１８週令雄ラット
（１群５匹）に発酵乳及びコントロール（未発酵乳）そ
れぞれを６ｍｌ／ｋｇ強制投与し６時間後に血圧を測定
した。血圧測定は、ソフトロン社の装置（型式「Softro
n BP-98A」）を用いて、tail-cuff法で最高血圧を求め
た。結果を表６に示す。
【００４２】
【表６】
【００４３】表６の結果より、未発酵乳は高血圧ラット
に対して血圧降下活性を示さず、ＣＰＮ４株発酵乳は強
い血圧降下活性を示すことが確認された。
に対して血圧降下活性を示さず、ＣＰＮ４株発酵乳は強
い血圧降下活性を示すことが確認された。
【００４４】
【実施例２】実施例１で得られたＣＰＮ４株１×１０6
／ｍｌに、ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-
144885 または ATCC-19258（Streptococcus thermophil
us ATCC-144885またはATCC-19258）をそれぞれ１×１０
5／ｍｌとなるように加えて乳培地中で３７℃、２４時
間混合培養し乳酸酸度、ｐＨ、ペプチド量及びＡＣＥ阻
害活性を、親株、ＣＰＮ４、ストレプトコッカス・サー
モフィラス ATCC-144885 または ATCC-19258をそれぞれ
単独で使用した場合と比較した。結果を表７に示す。
／ｍｌに、ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-
144885 または ATCC-19258（Streptococcus thermophil
us ATCC-144885またはATCC-19258）をそれぞれ１×１０
5／ｍｌとなるように加えて乳培地中で３７℃、２４時
間混合培養し乳酸酸度、ｐＨ、ペプチド量及びＡＣＥ阻
害活性を、親株、ＣＰＮ４、ストレプトコッカス・サー
モフィラス ATCC-144885 または ATCC-19258をそれぞれ
単独で使用した場合と比較した。結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】表７の結果、親株は最終ｐＨが低く、酸度
も最も高くなったが、ＣＰＮ４株は最終ｐＨが親株に比
べ、酸度も低かった。一方ストレプトコッカス・サーモ
フィラス ATCC-144885 または ATCC-19258 株単独で発
酵した場合、酸度の上昇は少ないもののペプチド量が少
なくＡＣＥ阻害活性は低かった。しかし、ＣＰＮ４株と
ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-144885また
はATCC-19258の併用においては、いずれの株においても
ＡＣＥ阻害活性が確認され、酸度の上昇が低かった。ま
た、このような混合培養を行うことでラクトバチルス・
ヘルベチカス単独の場合よりも風味の生成が付加され
た。
も最も高くなったが、ＣＰＮ４株は最終ｐＨが親株に比
べ、酸度も低かった。一方ストレプトコッカス・サーモ
フィラス ATCC-144885 または ATCC-19258 株単独で発
酵した場合、酸度の上昇は少ないもののペプチド量が少
なくＡＣＥ阻害活性は低かった。しかし、ＣＰＮ４株と
ストレプトコッカス・サーモフィラス ATCC-144885また
はATCC-19258の併用においては、いずれの株においても
ＡＣＥ阻害活性が確認され、酸度の上昇が低かった。ま
た、このような混合培養を行うことでラクトバチルス・
ヘルベチカス単独の場合よりも風味の生成が付加され
た。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【表１】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】（発酵乳中のＡＣＥ阻害活性の測定）ＡＣ
Ｅ阻害活性の測定は、CushmanとCheungとの方法［Cushm
an. D. W ＆Cheung.H.S.Pharmacol.,20 1637(1971)］に
基づいて行った。即ち、各種発酵乳を１５０００回転、
５分間の遠心分離により上清（ホエー）を調製し、その
後１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを中性とし、
８０μｌを試験管に移し、次に基質として０．１Ｍホウ
酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）で
５ｍＭに調整したヒプリル・ヒスチジル・ロイシン（Hi
p-His-Leu, シグマ社製品）０．２ｍｌを加えて、更に
酵素溶液（０．１unit／ｍｌ、シグマ社製品）２０μｌ
を添加して３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ
塩酸を２５０μｌ加えて反応を停止させた後、１．７ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて約２０秒間撹拌した。次いで３
０００回転で１０分間遠心分離し、酢酸エチル層１．４
ｍｌを回収し、１２０℃で４０分間加熱して溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加えて、約２０秒間
撹拌し抽出されたヒプリル酸の吸光度（２２８ｎｍ）を
測定した。酵素活性１ユニットはＡＣＥ活性の５０％阻
害を与える量として下記式により算出した。
Ｅ阻害活性の測定は、CushmanとCheungとの方法［Cushm
an. D. W ＆Cheung.H.S.Pharmacol.,20 1637(1971)］に
基づいて行った。即ち、各種発酵乳を１５０００回転、
５分間の遠心分離により上清（ホエー）を調製し、その
後１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを中性とし、
８０μｌを試験管に移し、次に基質として０．１Ｍホウ
酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）で
５ｍＭに調整したヒプリル・ヒスチジル・ロイシン（Hi
p-His-Leu, シグマ社製品）０．２ｍｌを加えて、更に
酵素溶液（０．１unit／ｍｌ、シグマ社製品）２０μｌ
を添加して３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ
塩酸を２５０μｌ加えて反応を停止させた後、１．７ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて約２０秒間撹拌した。次いで３
０００回転で１０分間遠心分離し、酢酸エチル層１．４
ｍｌを回収し、１２０℃で４０分間加熱して溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加えて、約２０秒間
撹拌し抽出されたヒプリル酸の吸光度（２２８ｎｍ）を
測定した。酵素活性１ユニットはＡＣＥ活性の５０％阻
害を与える量として下記式により算出した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】酵素量（１ユニット）＝［（Ａ−Ｂ）／
（Ａ−Ｃ）］×１００×１／５０ Ａ：試料を含まない場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｂ：試料を添加した場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｃ：酵素及び試料を添加しない場合の吸光度（２２８ｎ
ｍ） ペプチド量の定量はＯＰＡ法［Charch.F.C.らJ.of Dair
y. Sci. 66 1219(1883)］により行った。検量線の作成
は、スタンダードとしてカゼインのトリプシン分解物を
用いた。
（Ａ−Ｃ）］×１００×１／５０ Ａ：試料を含まない場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｂ：試料を添加した場合の吸光度（２２８ｎｍ） Ｃ：酵素及び試料を添加しない場合の吸光度（２２８ｎ
ｍ） ペプチド量の定量はＯＰＡ法［Charch.F.C.らJ.of Dair
y. Sci. 66 1219(1883)］により行った。検量線の作成
は、スタンダードとしてカゼインのトリプシン分解物を
用いた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】（菌体外プロテアーゼ活性の測定）菌体外
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酵素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−カゼイン（シグマ社製）
２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを加え４２℃で１時間イ
ンキュベートし、５％トリクロロ酢酸溶液を１２０μｌ
加え室温にて約２０分間放置し、１５０００回転、１０
分間の遠心分離を行った。上清６０μｌを３ｍｌの５０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に加え、蛍光強
度を測定した。蛍光強度は励起波長４９０ｎｍで生じる
５２５ｎｍの蛍光を測定した。活性は上記反応条件で、
１％の蛍光強度を生じる酵素量を１ユニットと定義し
た。ＣＰＮ４株は親株と同程度の菌体外プロテアーゼ活
性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻害活性についても、ほ
ぼ同様の値を示した。しかし、最終ｐＨは、親株に比べ
高いことが再確認された。従って、その発酵乳に親株と
同程度のＡＣＥ阻害活性を有し、最終ｐＨが親株より高
いＣＰＮ４株のみが、目的にかなうものとして選択され
た。 ─────────────────────────────────────────────────────
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酵素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−カゼイン（シグマ社製）
２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを加え４２℃で１時間イ
ンキュベートし、５％トリクロロ酢酸溶液を１２０μｌ
加え室温にて約２０分間放置し、１５０００回転、１０
分間の遠心分離を行った。上清６０μｌを３ｍｌの５０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に加え、蛍光強
度を測定した。蛍光強度は励起波長４９０ｎｍで生じる
５２５ｎｍの蛍光を測定した。活性は上記反応条件で、
１％の蛍光強度を生じる酵素量を１ユニットと定義し
た。ＣＰＮ４株は親株と同程度の菌体外プロテアーゼ活
性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻害活性についても、ほ
ぼ同様の値を示した。しかし、最終ｐＨは、親株に比べ
高いことが再確認された。従って、その発酵乳に親株と
同程度のＡＣＥ阻害活性を有し、最終ｐＨが親株より高
いＣＰＮ４株のみが、目的にかなうものとして選択され
た。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】
【表１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】前記ネオマイシン耐性株を選択した後、該
選択株の中から、増殖能の低いものを除き、更にｐＨ
４．５以下においてのみ増殖能の低い細胞株を選択す
る。更に、ここで選択された低ｐＨ領域における増殖活
性低下株は、脱脂粉乳等の乳培地にて例えば３０〜４５
℃で１〜３日間培養し、最終ｐＨが親株より高い細胞
株、即ち最終的な乳酸酸度の上昇が低い細胞株を選択す
る。ここで前記培養後の最終ｐＨ３．４〜３．８の変異
株を最終的に選択し、乳培地において例えば３０〜４５
℃で、３〜２４時間培養し、最終的に前記親株の菌学的
性質を維持し、前記(1)〜(3)の特性を有する細胞株を選
択することのより乳酸菌Ａを得ることができる。
選択株の中から、増殖能の低いものを除き、更にｐＨ
４．５以下においてのみ増殖能の低い細胞株を選択す
る。更に、ここで選択された低ｐＨ領域における増殖活
性低下株は、脱脂粉乳等の乳培地にて例えば３０〜４５
℃で１〜３日間培養し、最終ｐＨが親株より高い細胞
株、即ち最終的な乳酸酸度の上昇が低い細胞株を選択す
る。ここで前記培養後の最終ｐＨ３．４〜３．８の変異
株を最終的に選択し、乳培地において例えば３０〜４５
℃で、３〜２４時間培養し、最終的に前記親株の菌学的
性質を維持し、前記(1)〜(3)の特性を有する細胞株を選
択することのより乳酸菌Ａを得ることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】本発明の発酵乳製品は、前記乳酸菌Ａを用
いて発酵処理したものであれば特に限定されるものでは
なく、例えばヨーグルト、乳酸発酵飲料、チーズ等を挙
げることができ、それぞれ公知の方法により得ることが
できる。この際乳酸菌Ａは、公知の乳酸菌例えばストレ
プトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermo
philus）、ラクトコッカス・ラクテス(Lactococcus lac
tis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriu
m longum)等を併用して用いることができる。発酵乳製
品を調製するには、前記乳酸菌Ａを用いる以外は、公知
の方法等により得ることができる。
いて発酵処理したものであれば特に限定されるものでは
なく、例えばヨーグルト、乳酸発酵飲料、チーズ等を挙
げることができ、それぞれ公知の方法により得ることが
できる。この際乳酸菌Ａは、公知の乳酸菌例えばストレ
プトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermo
philus）、ラクトコッカス・ラクテス(Lactococcus lac
tis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacteriu
m longum)等を併用して用いることができる。発酵乳製
品を調製するには、前記乳酸菌Ａを用いる以外は、公知
の方法等により得ることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】（菌体外プロテアーゼ活性の測定）菌体外
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酸素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−イソチオシアネート−カ
ゼイン（シグマ社製）２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを
加え４２℃で１時間インキュベートし、５％トリクロロ
酢酸溶液を１２０μｌ加え室温にて約２０分間放置し、
１５０００回転、１０分間の遠心分離を行った。上清６
０μｌを３ｍｌの５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に加え、蛍光強度を測定した。蛍光強度は励起
波長４９０ｎｍで生じる５２５ｎｍの蛍光を測定した。
活性は上記反応条件で、１％の蛍光強度を生じる酸素量
を１ユニットと定義した。ＣＰＮ４株は親株と同程度の
菌体外プロテアーゼ活性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻
害活性についても、ほぼ同様の値を示した。しかし、最
終ｐＨは、親株に比べ高いことが再確認された。従っ
て、その発酵乳に親株と同程度のＡＣＥ阻害活性を有
し、最終ｐＨが親株より高いＣＰＮ４株のみが、目的に
かなうものとして選択された。
プロテアーゼ活性の測定は、Twiningの方法［Twining.
S.Anal.Biochem.143 3410］をもとにYamamotoらの方法
［Yamamoto.N.らJ.of Biochem.(1993)In Press］に従っ
て行った。即ち、各種菌株を９％脱脂粉乳中でｐＨ６．
０に維持して培養し、対数増殖期中期で集菌した。クエ
ン酸ナトリウムを終濃度１％になるように添加し、乳培
地を透明化し、５０００回転、１０分間の遠心分離を行
い菌体を回収した。次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸
により菌体を洗浄後、菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に懸濁し、菌体表面の酸素活性を測定し
た。０．４％フルオレセイン−イソチオシアネート−カ
ゼイン（シグマ社製）２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを
加え４２℃で１時間インキュベートし、５％トリクロロ
酢酸溶液を１２０μｌ加え室温にて約２０分間放置し、
１５０００回転、１０分間の遠心分離を行った。上清６
０μｌを３ｍｌの５００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に加え、蛍光強度を測定した。蛍光強度は励起
波長４９０ｎｍで生じる５２５ｎｍの蛍光を測定した。
活性は上記反応条件で、１％の蛍光強度を生じる酸素量
を１ユニットと定義した。ＣＰＮ４株は親株と同程度の
菌体外プロテアーゼ活性を示し、ペプチド量、ＡＣＥ阻
害活性についても、ほぼ同様の値を示した。しかし、最
終ｐＨは、親株に比べ高いことが再確認された。従っ
て、その発酵乳に親株と同程度のＡＣＥ阻害活性を有
し、最終ｐＨが親株より高いＣＰＮ４株のみが、目的に
かなうものとして選択された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (2)
- 【請求項１】 培養物を１０℃、２週間保存時の乳酸酸
度増加量が０．５％以下を示すこと、細胞膜結合性アデ
ノシントリホスファターゼ活性が５μmol・ Pi/min/mg蛋
白質以下であること、並びにネオマイシン耐性を有する
ことを特徴とするラクトバチルス属乳酸菌。 - 【請求項２】 請求項１記載のラクトバチルス属乳酸菌
を含む乳酸菌を用いて発酵処理したことを特徴とする発
酵乳製品。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5275791A JP2824821B2 (ja) | 1993-11-04 | 1993-11-04 | 乳酸菌及び発酵乳製品 |
| US08/330,302 US5541111A (en) | 1993-11-04 | 1994-10-27 | Lactobacillus helveticus mutants having low increase in acidity of lactic acid during storage |
| DE69431464T DE69431464T2 (de) | 1993-11-04 | 1994-11-03 | Milchsäurebakterien und Sauermilchprodukt |
| EP94308121A EP0652285B1 (en) | 1993-11-04 | 1994-11-03 | Lactic acid bacteria and fermented milk product |
| US08/640,431 US5695796A (en) | 1993-11-04 | 1996-04-30 | Fermented milk product |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5275791A JP2824821B2 (ja) | 1993-11-04 | 1993-11-04 | 乳酸菌及び発酵乳製品 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07123977A true JPH07123977A (ja) | 1995-05-16 |
| JP2824821B2 JP2824821B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=17560467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5275791A Expired - Lifetime JP2824821B2 (ja) | 1993-11-04 | 1993-11-04 | 乳酸菌及び発酵乳製品 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5541111A (ja) |
| EP (1) | EP0652285B1 (ja) |
| JP (1) | JP2824821B2 (ja) |
| DE (1) | DE69431464T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO1998005343A1 (en) * | 1996-08-07 | 1998-02-12 | Calpis Co., Ltd. | Anti-stress drugs and functional foods having anti-stress effects |
| JP2001095561A (ja) * | 1999-09-30 | 2001-04-10 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規乳酸菌株 |
| JP2002544146A (ja) * | 1999-05-06 | 2002-12-24 | カンパーニ ジェルヴェ ダノン | 抗不安特性を有する乳酸菌及びその使用 |
| JP2009532018A (ja) * | 2006-02-20 | 2009-09-10 | コンパニ・ジェルベ・ダノン | ヘルベティカス乳酸桿菌の新規株 |
| JP2014133731A (ja) * | 2013-01-10 | 2014-07-24 | National Taiwan Univ | プロバイオティクスを使用して尿毒素の除去のために製造される組成物の用途 |
| WO2023038073A1 (ja) | 2021-09-09 | 2023-03-16 | 株式会社明治 | 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法 |
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| JP3013157B2 (ja) * | 1996-09-27 | 2000-02-28 | カルピス株式会社 | 乳酸酸度上昇が抑制された乳酸菌発酵乳材料 |
| EP1142481B2 (en) * | 1999-01-11 | 2009-09-02 | Calpis Co., Ltd. | Process for producing fermented milk containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide and process for producing milk serum |
| US6998259B1 (en) | 1999-05-20 | 2006-02-14 | Davisco Foods International | Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides and the resulting products |
| US6630320B1 (en) | 2000-05-08 | 2003-10-07 | Devisco Foods International, Inc. | Treatment of hypertension in mammals with hydrolyzed whey proteins |
| FI113741B (fi) | 1999-11-01 | 2004-06-15 | Valio Oy | Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi |
| ATE483791T1 (de) * | 2001-11-05 | 2010-10-15 | Yakult Honsha Kk | Bakterium des genus bifidobacterium und vergorene lebensmittel, bei denen dieses eingesetzt wird |
| AU2003214038A1 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-13 | Chr. Hansen A/S | Peptides with anti-hypertensive properties |
| CN1735347A (zh) * | 2003-01-06 | 2006-02-15 | 荷兰联合利华有限公司 | 含有三肽vpp和/或ipp的发酵乳制品 |
| US7718171B2 (en) * | 2003-04-07 | 2010-05-18 | Chr. Hansen A/S | Reducing heart rate in mammals using milk derived fermentation products produced using Lactobacillus helveticus |
| MY143693A (en) | 2004-03-24 | 2011-06-30 | Nestec Sa | Shelf stable product wih living micro-organisms |
| ES2762445T3 (es) * | 2011-04-29 | 2020-05-25 | Gervais Danone Sa | Uso de cepas mutantes resistentes a la nisina de lactobacilos para reducir la post-acidificación en productos alimenticios |
| CN111206003B (zh) * | 2020-02-20 | 2021-09-10 | 扬州大学 | 弱后酸化瑞士乳杆菌sh2-5-66及其应用 |
Family Cites Families (5)
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| FR2215201A1 (en) * | 1973-01-24 | 1974-08-23 | Theranol Lab | Broad-spectrum antibiotic compsns. - contg. antibiotic resistant lactic bacilli and enzyme diffusing-agent |
| US3984575A (en) * | 1974-02-06 | 1976-10-05 | Microlife Technics, Inc. | Bacterial compositions for changing the digestive system bacteria in animals |
| JPS59106291A (ja) * | 1982-12-11 | 1984-06-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新菌種 |
| US4839281A (en) * | 1985-04-17 | 1989-06-13 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Lactobacillus strains and methods of selection |
| US5179020A (en) * | 1991-08-19 | 1993-01-12 | Bio Techniques Laboratories, Inc. | Antibiotic resistant strain of lactobacillus acidophilus |
-
1993
- 1993-11-04 JP JP5275791A patent/JP2824821B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-10-27 US US08/330,302 patent/US5541111A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-03 DE DE69431464T patent/DE69431464T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-03 EP EP94308121A patent/EP0652285B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-30 US US08/640,431 patent/US5695796A/en not_active Expired - Lifetime
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| WO1998005343A1 (en) * | 1996-08-07 | 1998-02-12 | Calpis Co., Ltd. | Anti-stress drugs and functional foods having anti-stress effects |
| US6596301B1 (en) | 1996-08-07 | 2003-07-22 | Danone, Groupe | Anti-stress drugs and functional foods having anti-stress effects |
| JP2002544146A (ja) * | 1999-05-06 | 2002-12-24 | カンパーニ ジェルヴェ ダノン | 抗不安特性を有する乳酸菌及びその使用 |
| JP2001095561A (ja) * | 1999-09-30 | 2001-04-10 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 新規乳酸菌株 |
| JP2009532018A (ja) * | 2006-02-20 | 2009-09-10 | コンパニ・ジェルベ・ダノン | ヘルベティカス乳酸桿菌の新規株 |
| JP2014133731A (ja) * | 2013-01-10 | 2014-07-24 | National Taiwan Univ | プロバイオティクスを使用して尿毒素の除去のために製造される組成物の用途 |
| WO2023038073A1 (ja) | 2021-09-09 | 2023-03-16 | 株式会社明治 | 乳酸菌、乳酸菌スターター、発酵乳、発酵乳の製造方法、及び乳酸菌のスクリーニング方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0652285B1 (en) | 2002-10-02 |
| US5541111A (en) | 1996-07-30 |
| EP0652285A2 (en) | 1995-05-10 |
| US5695796A (en) | 1997-12-09 |
| DE69431464D1 (de) | 2002-11-07 |
| JP2824821B2 (ja) | 1998-11-18 |
| DE69431464T2 (de) | 2003-08-28 |
| EP0652285A3 (en) | 1997-05-02 |
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