JPH07128337A - （１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法 - Google Patents
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法Info
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- JPH07128337A JPH07128337A JP21629594A JP21629594A JPH07128337A JP H07128337 A JPH07128337 A JP H07128337A JP 21629594 A JP21629594 A JP 21629594A JP 21629594 A JP21629594 A JP 21629594A JP H07128337 A JPH07128337 A JP H07128337A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試料中にリムルスＧ因子系に対する反応妨害
因子および／またはエンドトキシンを含み、かつ試料中
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが三重らせん構造をと
る場合においても、リムルス試薬として非特異的リムル
ス試薬を用いることができる前処理法を提供すると共に
（１→３）−β−Ｄ−グルカンを極めて高い検出率で迅
速に効率よく測定できる方法を提供すること。 【構成】 三重らせん構造を主体とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンと場合により金属イオンを含み得る試料
を、強アルカリ性条件下でかつ場合によりキレート剤の
存在下において前処理し、反応妨害因子として試料中に
含まれる可能性のある、エンドトキシン単独またはエン
ドトキシンとＧ因子系反応妨害因子とを破壊もしくは不
活性化した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法。
因子および／またはエンドトキシンを含み、かつ試料中
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンが三重らせん構造をと
る場合においても、リムルス試薬として非特異的リムル
ス試薬を用いることができる前処理法を提供すると共に
（１→３）−β−Ｄ−グルカンを極めて高い検出率で迅
速に効率よく測定できる方法を提供すること。 【構成】 三重らせん構造を主体とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンと場合により金属イオンを含み得る試料
を、強アルカリ性条件下でかつ場合によりキレート剤の
存在下において前処理し、反応妨害因子として試料中に
含まれる可能性のある、エンドトキシン単独またはエン
ドトキシンとＧ因子系反応妨害因子とを破壊もしくは不
活性化した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、（１→３）−β−Ｄ−
グルカン（以下「β−グルカン」ともいう）の測定方法
に関する。特に、反応妨害因子として試料中に含まれる
可能性のある、リムルスＣ因子系反応に関与するエンド
トキシン（以下「Ｅｔ」とも記す）またはＥｔおよびリ
ムルスＧ因子とβ−グルカンとの特異的反応を妨害する
反応妨害因子（以下「Ｇ因子系反応妨害因子」ともい
う）とを含む可能性のある試料中あるいはリンゲル液、
透析液等の金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカン
をリムルス試薬を用いて高い精度で測定できる方法に関
するものである。
グルカン（以下「β−グルカン」ともいう）の測定方法
に関する。特に、反応妨害因子として試料中に含まれる
可能性のある、リムルスＣ因子系反応に関与するエンド
トキシン（以下「Ｅｔ」とも記す）またはＥｔおよびリ
ムルスＧ因子とβ−グルカンとの特異的反応を妨害する
反応妨害因子（以下「Ｇ因子系反応妨害因子」ともい
う）とを含む可能性のある試料中あるいはリンゲル液、
透析液等の金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカン
をリムルス試薬を用いて高い精度で測定できる方法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】リムルス試薬に含まれるカブトガニ・ア
メボサイト・ライセート（以下単に「ライセート」とも
いう）には、Ｅｔと反応して活性化されるカスケードタ
イプの凝固系（Ｃ因子系）とβ−グルカンと反応して活
性化されるカスケードタイプの凝固系（Ｇ因子系）とが
共存しており（図１）、ライセートはβ−グルカンだけ
でなく、Ｅｔとも反応する。前者の系のみを利用してEt
を特異的に測定する方法、後者の系のみを利用してβ−
グルカンを特異的に測定する方法がそれぞれ知られてい
る（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １４９，
５５−６５（１９８５））。
メボサイト・ライセート（以下単に「ライセート」とも
いう）には、Ｅｔと反応して活性化されるカスケードタ
イプの凝固系（Ｃ因子系）とβ−グルカンと反応して活
性化されるカスケードタイプの凝固系（Ｇ因子系）とが
共存しており（図１）、ライセートはβ−グルカンだけ
でなく、Ｅｔとも反応する。前者の系のみを利用してEt
を特異的に測定する方法、後者の系のみを利用してβ−
グルカンを特異的に測定する方法がそれぞれ知られてい
る（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １４９，
５５−６５（１９８５））。
【０００３】また、真菌感染症の患者は血液中のβ−グ
ルカンが増加し、血液中のβ−グルカンを測定すること
によって真菌感染症を診断できることも知られている。
このようなＧ因子系を利用するβ−グルカン測定法は、
検出感度が非常に高いため生体試料中の微量検出に適し
ており、特に深在性真菌感染症の診断への有効性が検討
確認され、臨床検査に使用され始めている。
ルカンが増加し、血液中のβ−グルカンを測定すること
によって真菌感染症を診断できることも知られている。
このようなＧ因子系を利用するβ−グルカン測定法は、
検出感度が非常に高いため生体試料中の微量検出に適し
ており、特に深在性真菌感染症の診断への有効性が検討
確認され、臨床検査に使用され始めている。
【０００４】β−グルカンのＧ因子に対する反応は、分
子量のみならず、その高次構造が関与し、三重らせん構
造をとるものはＧ因子を活性化せず、一重らせん構造を
とるときＧ因子を活性化することが知られている（Sait
o H. et al., Carbohydr. Res., 217, 181-190(1991);
Tanaka S. et al., Carbohydr. Res., 218, 167-174(19
91);Aketagawa J. et al., J.Biochem.,113,683-686(19
93))。一方、β−グルカンは、天然には、その最も安定
な形である三重らせん構造で存在していることが多く、
かつＥｔと共存している場合が多い。
子量のみならず、その高次構造が関与し、三重らせん構
造をとるものはＧ因子を活性化せず、一重らせん構造を
とるときＧ因子を活性化することが知られている（Sait
o H. et al., Carbohydr. Res., 217, 181-190(1991);
Tanaka S. et al., Carbohydr. Res., 218, 167-174(19
91);Aketagawa J. et al., J.Biochem.,113,683-686(19
93))。一方、β−グルカンは、天然には、その最も安定
な形である三重らせん構造で存在していることが多く、
かつＥｔと共存している場合が多い。
【０００５】そのため、ライセート全体を原料にしてい
る通常のリムルス試薬（非特異的リムルス試薬）では、
Ｇ因子系とＣ因子系が存在しているため、β−グルカン
だけでなくＥｔとも反応してしまい、β−グルカンの測
定はできなかった。これを解決するために、従来は、ラ
イセートからＧ因子系成分を分画、再構成すること（例
えば、Obayashi T. et al., 前出）、またはＣ因子を特
異的に阻害または吸着、除去すること（例えば、ＷＯ９
１／１９９８１、ＷＯ９２／１６６５１）により、Ｃ因
子系成分を実質的に含まないか、あるいはＣ因子系反応
が阻害されて、エンドトキシンと反応しないβ−グルカ
ン特異的リムルス試薬として試料中のβ−グルカンを測
定していた。
る通常のリムルス試薬（非特異的リムルス試薬）では、
Ｇ因子系とＣ因子系が存在しているため、β−グルカン
だけでなくＥｔとも反応してしまい、β−グルカンの測
定はできなかった。これを解決するために、従来は、ラ
イセートからＧ因子系成分を分画、再構成すること（例
えば、Obayashi T. et al., 前出）、またはＣ因子を特
異的に阻害または吸着、除去すること（例えば、ＷＯ９
１／１９９８１、ＷＯ９２／１６６５１）により、Ｃ因
子系成分を実質的に含まないか、あるいはＣ因子系反応
が阻害されて、エンドトキシンと反応しないβ−グルカ
ン特異的リムルス試薬として試料中のβ−グルカンを測
定していた。
【０００６】また、上記のようなＧ因子系の分画・再構
成、Ｃ因子系の吸着除去または特異的阻害等の手段によ
らず、試料に前処理を施すことによってＥｔを不活性化
した後、ライセートを作用させ、β−グルカンを測定す
る方法が提案されている（特開平２−１４１６６６号公
報）。この方法は、被検試料液を加熱処理するものであ
るが、現実には１００℃、２時間の処理が必要であり、
かつ、この処理では三重らせん構造のβ−グルカンは、
一重らせん構造にほとんど変換せず、従ってβ−グルカ
ンの全量を測定できない。
成、Ｃ因子系の吸着除去または特異的阻害等の手段によ
らず、試料に前処理を施すことによってＥｔを不活性化
した後、ライセートを作用させ、β−グルカンを測定す
る方法が提案されている（特開平２−１４１６６６号公
報）。この方法は、被検試料液を加熱処理するものであ
るが、現実には１００℃、２時間の処理が必要であり、
かつ、この処理では三重らせん構造のβ−グルカンは、
一重らせん構造にほとんど変換せず、従ってβ−グルカ
ンの全量を測定できない。
【０００７】ところで、生体試料、特に血液中のβ−グ
ルカンをライセートのＧ因子系によるカスケード反応を
利用して測定する場合には、該反応がライセート中のセ
リンプロテアーゼの反応を利用するため、血液中に含ま
れる種々のＧ因子系反応妨害因子（例えば、トロンビン
やＸａ因子はライセート中の凝固酵素と類似の作用を示
すため、偽陽性因子となり、α2 −プラスミンインヒビ
ター、α1 −アンチトリプシンおよびアンチトロンビン
III はＧ因子系反応を強力に阻害し、偽陰性因子とな
る）を失活あるいは除去するための前処理が必要であ
る。
ルカンをライセートのＧ因子系によるカスケード反応を
利用して測定する場合には、該反応がライセート中のセ
リンプロテアーゼの反応を利用するため、血液中に含ま
れる種々のＧ因子系反応妨害因子（例えば、トロンビン
やＸａ因子はライセート中の凝固酵素と類似の作用を示
すため、偽陽性因子となり、α2 −プラスミンインヒビ
ター、α1 −アンチトリプシンおよびアンチトロンビン
III はＧ因子系反応を強力に阻害し、偽陰性因子とな
る）を失活あるいは除去するための前処理が必要であ
る。
【０００８】この目的のために従来は、血液試料から多
血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、これに過塩素酸を加え
て３７℃で加温処理した後に、変性析出物を遠心分離し
て除去し、その上澄液を採取し、アルカリで中和して被
検液とする方法が採用されていた（Obayashi T. et a
l., J. Lab. Clin. Med. 104, 321-3301(1984)) が、変
性析出物の分離操作が煩雑で全操作工程も多く、操作中
に反応系に影響を与える物質による汚染の危険性がある
などの問題があった。
血小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、これに過塩素酸を加え
て３７℃で加温処理した後に、変性析出物を遠心分離し
て除去し、その上澄液を採取し、アルカリで中和して被
検液とする方法が採用されていた（Obayashi T. et a
l., J. Lab. Clin. Med. 104, 321-3301(1984)) が、変
性析出物の分離操作が煩雑で全操作工程も多く、操作中
に反応系に影響を与える物質による汚染の危険性がある
などの問題があった。
【０００９】そこで、本発明者は、先に遠心分離操作が
不要でかつ迅速な前処理方法として、アルカリ金属水酸
化物で処理する方法等（特願平５−１００４２６号明細
書）を提案した。しかし、先の出願ではリムルス反応妨
害因子の除去が主眼であり、Ｅｔとβ−グルカンをそれ
ぞれ特異的に測定する場合には、各物質に対して特異的
な特別なライセート試薬を用いる必要があった。すなわ
ち、該方法の長所を維持しながら、Ｅｔの不活化とＧ因
子系反応妨害因子の不活化とを同時に満足する条件は見
出すことができず、ＥｔおよびＧ因子系反応妨害因子存
在下で非特異的リムルス試薬を用いてβ−グルカンを測
定することは困難であった。また、そのような試料条件
で、かつβ−グルカンが三重らせん構造をとっている
と、非特異的リムルス試薬を使用した場合、これを十分
に再現性よく測定することは更に困難であった。一方、
リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養用培地お
よび血液透析における透析液などの金属イオンを含み得
る試料中のβ−グルカンをリムルス試薬を用いて測定す
る場合、これらの試料中のβ−グルカンが三重らせん構
造であると、この構造が安定化され、Ｇ因子系反応が十
分に進行しないため、β−グルカンの全量を正確に測定
できいないという問題があった。
不要でかつ迅速な前処理方法として、アルカリ金属水酸
化物で処理する方法等（特願平５−１００４２６号明細
書）を提案した。しかし、先の出願ではリムルス反応妨
害因子の除去が主眼であり、Ｅｔとβ−グルカンをそれ
ぞれ特異的に測定する場合には、各物質に対して特異的
な特別なライセート試薬を用いる必要があった。すなわ
ち、該方法の長所を維持しながら、Ｅｔの不活化とＧ因
子系反応妨害因子の不活化とを同時に満足する条件は見
出すことができず、ＥｔおよびＧ因子系反応妨害因子存
在下で非特異的リムルス試薬を用いてβ−グルカンを測
定することは困難であった。また、そのような試料条件
で、かつβ−グルカンが三重らせん構造をとっている
と、非特異的リムルス試薬を使用した場合、これを十分
に再現性よく測定することは更に困難であった。一方、
リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養用培地お
よび血液透析における透析液などの金属イオンを含み得
る試料中のβ−グルカンをリムルス試薬を用いて測定す
る場合、これらの試料中のβ−グルカンが三重らせん構
造であると、この構造が安定化され、Ｇ因子系反応が十
分に進行しないため、β−グルカンの全量を正確に測定
できいないという問題があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の従来
の問題点を解決しようとするもので、試料中にエンドト
キシンおよび／またはＧ因子系反応妨害因子を含み、か
つ試料中のβ−グルカンが三重らせん構造をとる場合に
おいてもリムルス試薬として非特異的リムルス試薬を用
いることができる前処理法を提供すると共にβ−グルカ
ンを極めて高い検出率で迅速に効率よく測定できる方法
を提供する。さらに、本発明は、試料中に金属イオンを
含み、かつ試料中にβ−グルカンが三重らせん構造をと
る場合においても、β−グルカンの三重らせん構造がＧ
因子活性化能を有する構造に変換されて、β−グルカン
を極めて高い検出率で迅速に効率よく測定できる方法を
提供する。
の問題点を解決しようとするもので、試料中にエンドト
キシンおよび／またはＧ因子系反応妨害因子を含み、か
つ試料中のβ−グルカンが三重らせん構造をとる場合に
おいてもリムルス試薬として非特異的リムルス試薬を用
いることができる前処理法を提供すると共にβ−グルカ
ンを極めて高い検出率で迅速に効率よく測定できる方法
を提供する。さらに、本発明は、試料中に金属イオンを
含み、かつ試料中にβ−グルカンが三重らせん構造をと
る場合においても、β−グルカンの三重らせん構造がＧ
因子活性化能を有する構造に変換されて、β−グルカン
を極めて高い検出率で迅速に効率よく測定できる方法を
提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、 三重らせ
ん構造を主体とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンを含
み得る試料を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨
害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドト
キシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因
子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によ
るリムルス反応に付すことを特徴とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試薬が非特異
的リムルス試薬であることを特徴とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 アルカ
リ金属水酸化物を試料中に存在させて強アルカリ性条件
下とする前記または記載の（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定方法、 試料中のアルカリ金属水酸化物
濃度を０．０３〜２．０モル／Ｌの条件下で前処理する
ことを特徴とする前記に記載の測定方法、および前
処理を０〜１３５℃の条件下で行う前記〜のいずれ
か１項に記載の測定方法、 試料が金属イオンを含み
得るものであり、試料を、キレート剤の存在下において
前処理する前記記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の測定方法、 三重らせん構造を主体とする（１→
３）−β−Ｄ−グルカンと金属イオンとを含み得る試料
を、キレート剤の存在下において強アルカリ性条件下で
前処理した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法、 前記前処理を、試料にキレート剤を添加後、
強アルカリ条件下で行うか、または試料にキレート剤を
添加する際に強アルカリ条件下とする前記記載の（１
→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試
薬が、カブトガニ血リンパ凝固系のＣ因子系成分を実質
的に含まないか、あるいはＣ因子系反応が阻害され、エ
ンドトキシンと反応せず、（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに特異的なものである、前記記載の（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法である。
ん構造を主体とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンを含
み得る試料を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨
害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドト
キシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因
子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によ
るリムルス反応に付すことを特徴とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試薬が非特異
的リムルス試薬であることを特徴とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 アルカ
リ金属水酸化物を試料中に存在させて強アルカリ性条件
下とする前記または記載の（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定方法、 試料中のアルカリ金属水酸化物
濃度を０．０３〜２．０モル／Ｌの条件下で前処理する
ことを特徴とする前記に記載の測定方法、および前
処理を０〜１３５℃の条件下で行う前記〜のいずれ
か１項に記載の測定方法、 試料が金属イオンを含み
得るものであり、試料を、キレート剤の存在下において
前処理する前記記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の測定方法、 三重らせん構造を主体とする（１→
３）−β−Ｄ−グルカンと金属イオンとを含み得る試料
を、キレート剤の存在下において強アルカリ性条件下で
前処理した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法、 前記前処理を、試料にキレート剤を添加後、
強アルカリ条件下で行うか、または試料にキレート剤を
添加する際に強アルカリ条件下とする前記記載の（１
→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試
薬が、カブトガニ血リンパ凝固系のＣ因子系成分を実質
的に含まないか、あるいはＣ因子系反応が阻害され、エ
ンドトキシンと反応せず、（１→３）−β−Ｄ−グルカ
ンに特異的なものである、前記記載の（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法である。
【００１２】以下本発明を具体的に説明する。第一の本
発明は、試料を強アルカリ性条件下で前処理することに
よって、エンドトキシン、Ｇ因子系反応妨害因子等の、
リムルス試薬によってβ−グルカンを測定する際に反応
を妨害する反応妨害因子を破壊もしくは不活性化させ、
β−グルカンが三重らせん構造をとっている場合はこれ
を解いてＧ因子を活性化する構造に変換させ、次いでリ
ムルス試薬と混合して、公知の方法で合成ペプチド基質
の変化またはライセートのゲル化もしくはそれに伴う濁
度の変化等を検出することにより、β−グルカンを測定
するものである。第二の本発明は、試料をキレート剤の
存在下において強アルカリ性条件下で前処理することに
よって、リンゲル液、透析液等の金属イオンを含み得る
試料中の金属イオンの影響を排除してβ−グルカンの三
重らせん構造をＧ因子活性化能を有する構造に変換さ
せ、次いでリムルス試薬を用いて上記と同様にβ−グル
カンを測定するものである。
発明は、試料を強アルカリ性条件下で前処理することに
よって、エンドトキシン、Ｇ因子系反応妨害因子等の、
リムルス試薬によってβ−グルカンを測定する際に反応
を妨害する反応妨害因子を破壊もしくは不活性化させ、
β−グルカンが三重らせん構造をとっている場合はこれ
を解いてＧ因子を活性化する構造に変換させ、次いでリ
ムルス試薬と混合して、公知の方法で合成ペプチド基質
の変化またはライセートのゲル化もしくはそれに伴う濁
度の変化等を検出することにより、β−グルカンを測定
するものである。第二の本発明は、試料をキレート剤の
存在下において強アルカリ性条件下で前処理することに
よって、リンゲル液、透析液等の金属イオンを含み得る
試料中の金属イオンの影響を排除してβ−グルカンの三
重らせん構造をＧ因子活性化能を有する構造に変換さ
せ、次いでリムルス試薬を用いて上記と同様にβ−グル
カンを測定するものである。
【００１３】本発明において対象とする「試料」とはβ
−グルカンを測定しようとする試料であれば、特に制限
はないが、特に反応妨害因子を含む場合で、かつβ−グ
ルカンが三重らせん構造である場合に有効である。ここ
で、「反応妨害因子」とは、Ｃ因子系反応を開始するＥ
ｔのほかに、Ｇ因子系反応妨害因子、即ち、β−グルカ
ンによって開始される図１に示したライセートのＧ因子
系の段階的酵素反応（カスケード反応）のいずれかの段
階においてβ−グルカンとは無関係に反応する前記偽陽
性因子又は反応を阻害する偽陰性因子である。尚、Ｇ因
子系反応妨害因子は、Ｃ因子系においても同様に機能す
るため、リムルス反応妨害因子ともいう。具体的には、
β−グルカンを含有する水溶液、医薬品、リンゲル液、
透析液、細胞培養用培地、緩衝液、生理食塩水などのほ
か、真菌由来のβ−グルカンが含まれる可能性のある真
菌感染症患者の体液（血漿、血清、全血などの血液試
料、尿、脊髄液、腹水など）が例示される。
−グルカンを測定しようとする試料であれば、特に制限
はないが、特に反応妨害因子を含む場合で、かつβ−グ
ルカンが三重らせん構造である場合に有効である。ここ
で、「反応妨害因子」とは、Ｃ因子系反応を開始するＥ
ｔのほかに、Ｇ因子系反応妨害因子、即ち、β−グルカ
ンによって開始される図１に示したライセートのＧ因子
系の段階的酵素反応（カスケード反応）のいずれかの段
階においてβ−グルカンとは無関係に反応する前記偽陽
性因子又は反応を阻害する偽陰性因子である。尚、Ｇ因
子系反応妨害因子は、Ｃ因子系においても同様に機能す
るため、リムルス反応妨害因子ともいう。具体的には、
β−グルカンを含有する水溶液、医薬品、リンゲル液、
透析液、細胞培養用培地、緩衝液、生理食塩水などのほ
か、真菌由来のβ−グルカンが含まれる可能性のある真
菌感染症患者の体液（血漿、血清、全血などの血液試
料、尿、脊髄液、腹水など）が例示される。
【００１４】リムルス試薬としては、上記第一の発明に
は非特異的リムルス試薬を使用できるが、Ｇ因子系反応
に特異的な成分からなるか、あるいはＣ因子系反応が阻
害され、Ｅｔと反応しないβ−グルカン特異的なリムル
ス試薬を使用することもできる。後者の使用は、β−グ
ルカンの三重らせん構造の変換とＧ因子系反応妨害因子
の除去を主眼に前処理できるから、Ｅｔの不活性化の条
件を無視でき、前処理条件の寛容度が広がる効果があ
る。上記第二の発明においては、Ｅｔの破壊もしくは不
活性化を必須要件としておらず、三重らせん構造の変換
とＧ因子系反応妨害因子の除去を主眼とした前処理を行
うので、Ｅｔを含む可能性のある試料を対象とする場合
はβ−グルカン特異的なリムルス試薬を使用することが
好ましい。
は非特異的リムルス試薬を使用できるが、Ｇ因子系反応
に特異的な成分からなるか、あるいはＣ因子系反応が阻
害され、Ｅｔと反応しないβ−グルカン特異的なリムル
ス試薬を使用することもできる。後者の使用は、β−グ
ルカンの三重らせん構造の変換とＧ因子系反応妨害因子
の除去を主眼に前処理できるから、Ｅｔの不活性化の条
件を無視でき、前処理条件の寛容度が広がる効果があ
る。上記第二の発明においては、Ｅｔの破壊もしくは不
活性化を必須要件としておらず、三重らせん構造の変換
とＧ因子系反応妨害因子の除去を主眼とした前処理を行
うので、Ｅｔを含む可能性のある試料を対象とする場合
はβ−グルカン特異的なリムルス試薬を使用することが
好ましい。
【００１５】ここで、「非特異的リムルス試薬」とは、
リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツ
ス、タキプレウス・ギガス、カルシノスコルピウス・ロ
ツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知
の方法（例えば、J. Biochem.,80,1011-1021(1976)参
照）で調製した通常のカブトガニ・アメボサイト・ライ
セートを包含する意味であり、少なくとも図１のＧ因子
系反応およびＣ因子系反応に関与する血リンパ凝固系の
Ｇ因子系成分およびＣ因子系成分を含むものを言う。た
だし、後述の合成ペプチド基質等を含むものでもかまわ
ない。ここで、「金属イオン」とは、β−グルカンの三
重らせん構造がＧ因子活性化能を有する構造に変換され
るのを阻害するか、あるいは変換されたβ−グルカンが
三重らせん構造に戻るのを促進するような金属イオンで
あり、Mg2+, Ca2+などのアルカリ土類金属のイオンやMn
2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, Ga3+などの遷移元素のイオンで
ある。
リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツ
ス、タキプレウス・ギガス、カルシノスコルピウス・ロ
ツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知
の方法（例えば、J. Biochem.,80,1011-1021(1976)参
照）で調製した通常のカブトガニ・アメボサイト・ライ
セートを包含する意味であり、少なくとも図１のＧ因子
系反応およびＣ因子系反応に関与する血リンパ凝固系の
Ｇ因子系成分およびＣ因子系成分を含むものを言う。た
だし、後述の合成ペプチド基質等を含むものでもかまわ
ない。ここで、「金属イオン」とは、β−グルカンの三
重らせん構造がＧ因子活性化能を有する構造に変換され
るのを阻害するか、あるいは変換されたβ−グルカンが
三重らせん構造に戻るのを促進するような金属イオンで
あり、Mg2+, Ca2+などのアルカリ土類金属のイオンやMn
2+, Fe2+, Fe3+, Al3+, Ga3+などの遷移元素のイオンで
ある。
【００１６】本発明において利用し得る非特異的リムル
ス試薬は前記のような機能を有するものであれば、製
法、組成等には限定されない。本発明に使用される前処
理方法は、試料を強アルカリ性とすることが必須条件で
あるが、更に試料中に金属イオンが含有される場合に
は、強アルカリ性条件下で前処理する際にキレート剤を
共存させる必要がある。これは強アルカリ処理によって
βーグルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を有す
る構造に変換されるのを、ある種の金属イオン、すなわ
ちMg2+, Ca2+などのアルカリ土類金属のイオンやMn2+,
Fe2+, Fe3+, Al3+, Ga3+などの遷移元素のイオンが阻害
するのを解除するためである。試料を強アルカリ性とす
る方法に特に制限はないが、アルカリ金属の水酸化物を
用いることが好ましい。その具体例としては、水酸化カ
リウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等が
例示できる。
ス試薬は前記のような機能を有するものであれば、製
法、組成等には限定されない。本発明に使用される前処
理方法は、試料を強アルカリ性とすることが必須条件で
あるが、更に試料中に金属イオンが含有される場合に
は、強アルカリ性条件下で前処理する際にキレート剤を
共存させる必要がある。これは強アルカリ処理によって
βーグルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を有す
る構造に変換されるのを、ある種の金属イオン、すなわ
ちMg2+, Ca2+などのアルカリ土類金属のイオンやMn2+,
Fe2+, Fe3+, Al3+, Ga3+などの遷移元素のイオンが阻害
するのを解除するためである。試料を強アルカリ性とす
る方法に特に制限はないが、アルカリ金属の水酸化物を
用いることが好ましい。その具体例としては、水酸化カ
リウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等が
例示できる。
【００１７】アルカリ金属水酸化物を用いる場合、その
濃度としては、通常、０．０３〜２．０モル／Ｌが例示
できる。キレート剤としては、試料中に含まれる金属イ
オンをキレート化合物に変換し、遊離の金属イオン濃度
を上記の阻害作用を表す最低濃度以下にできるものであ
り、かつリムルス反応を阻害しない限り特に制限はない
が、未知の金属イオンを含む試料を処理する場合には、
多くの金属イオンと安定で強固なキレート化合物を生成
するものが好ましい。この様なキレート剤としては、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸、
トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸、ヒドロキシエチレンジ
アミン三酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ト
リエチレンテトラミン六酢酸、ジアミノプロパノール四
酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、エチレンジアミンテト
ラキス（メチレンホスホン酸）、クエン酸、およびそれ
らのアルカリ塩が例示できる。試料の前処理は、基本的
には、試料を強アルカリ性にすることができるもの（以
下単にアルカリともいう）および必要によりキレート剤
を試料に添加混合することにより行うことができる。ア
ルカリとキレート剤を共に添加するときの添加順序は、
アルカリ添加後にキレート剤を添加しない限りいずれで
もよいが、試料にキレート剤を添加した後、アルカリを
添加する方が低濃度のキレート剤添加で試料中のβーグ
ルカンの構造変換が容易に起こる（これは強アルカリ性
条件下では、金属イオンはキレート剤に配位するよりも
βーグルカンの分子鎖間に配位しやすく、三重らせんか
らの一重らせん構造等への変換を阻止するためと思われ
る。）。これらの前処理剤添加後、所望により、恒温槽
中もしくはオートクレーブ中で、あるいは電子レンジ等
を用いて高周波によって加温することもできる。この際
の処理温度は、通常、０〜１３５℃、特に３０〜６０℃
の範囲が好ましく、処理時間は１〜６０分、特に５〜３
０分の範囲が好ましい。
濃度としては、通常、０．０３〜２．０モル／Ｌが例示
できる。キレート剤としては、試料中に含まれる金属イ
オンをキレート化合物に変換し、遊離の金属イオン濃度
を上記の阻害作用を表す最低濃度以下にできるものであ
り、かつリムルス反応を阻害しない限り特に制限はない
が、未知の金属イオンを含む試料を処理する場合には、
多くの金属イオンと安定で強固なキレート化合物を生成
するものが好ましい。この様なキレート剤としては、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸、
トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸、ヒドロキシエチレンジ
アミン三酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ト
リエチレンテトラミン六酢酸、ジアミノプロパノール四
酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、エチレンジアミンテト
ラキス（メチレンホスホン酸）、クエン酸、およびそれ
らのアルカリ塩が例示できる。試料の前処理は、基本的
には、試料を強アルカリ性にすることができるもの（以
下単にアルカリともいう）および必要によりキレート剤
を試料に添加混合することにより行うことができる。ア
ルカリとキレート剤を共に添加するときの添加順序は、
アルカリ添加後にキレート剤を添加しない限りいずれで
もよいが、試料にキレート剤を添加した後、アルカリを
添加する方が低濃度のキレート剤添加で試料中のβーグ
ルカンの構造変換が容易に起こる（これは強アルカリ性
条件下では、金属イオンはキレート剤に配位するよりも
βーグルカンの分子鎖間に配位しやすく、三重らせんか
らの一重らせん構造等への変換を阻止するためと思われ
る。）。これらの前処理剤添加後、所望により、恒温槽
中もしくはオートクレーブ中で、あるいは電子レンジ等
を用いて高周波によって加温することもできる。この際
の処理温度は、通常、０〜１３５℃、特に３０〜６０℃
の範囲が好ましく、処理時間は１〜６０分、特に５〜３
０分の範囲が好ましい。
【００１８】本発明の方法により前処理された被検液中
では、該処理前のβ−グルカンがＧ因子を活性化しない
三重らせん構造であっても、その構造は迅速にＧ因子を
活性化する構造に変換され、また仮に該処理前のβ−グ
ルカンが三重らせん構造ではない、すでにＧ因子活性化
能を有する状態のものであってもその構造は保持され
る。
では、該処理前のβ−グルカンがＧ因子を活性化しない
三重らせん構造であっても、その構造は迅速にＧ因子を
活性化する構造に変換され、また仮に該処理前のβ−グ
ルカンが三重らせん構造ではない、すでにＧ因子活性化
能を有する状態のものであってもその構造は保持され
る。
【００１９】すなわち、本発明において測定されるβ−
グルカンは、特に制限されず、真菌類等に存在するもの
を含み、その分子構造、高次構造、由来等は特に制限は
ない。また、これらのβ−グルカンは、真菌感染症患者
の体液中に含まれるものを包含する。本発明においてβ
−グルカンの三重らせん構造の他構造への変換は、具体
的には13Ｃ−ＮＭＲ等により確認できる。
グルカンは、特に制限されず、真菌類等に存在するもの
を含み、その分子構造、高次構造、由来等は特に制限は
ない。また、これらのβ−グルカンは、真菌感染症患者
の体液中に含まれるものを包含する。本発明においてβ
−グルカンの三重らせん構造の他構造への変換は、具体
的には13Ｃ−ＮＭＲ等により確認できる。
【００２０】上記の本発明の前処理剤で試料を処理した
被検液は、次いでリムルス試薬と混合されるが、この混
合液は、Ｇ因子系反応を完遂するために至適ｐＨ付近に
調整されることが好ましく、通常ｐＨ７〜９になるよう
に従来公知の緩衝液により所望に調整される。なお、本
発明の前処理で不活性化した偽陽性因子、偽陰性因子お
よびＥｔは、後述の実施例等から活性が再生することは
ないことが判明している。また、逆に、該前処理剤で処
理された比較的高濃度の塩基性（アルカリ性）被検液と
該Ｇ因子系成分との混合において、該前処理剤が該Ｇ因
子系中の各成分に悪影響を与えることがないのも該緩衝
作用によるものであると考えられる。
被検液は、次いでリムルス試薬と混合されるが、この混
合液は、Ｇ因子系反応を完遂するために至適ｐＨ付近に
調整されることが好ましく、通常ｐＨ７〜９になるよう
に従来公知の緩衝液により所望に調整される。なお、本
発明の前処理で不活性化した偽陽性因子、偽陰性因子お
よびＥｔは、後述の実施例等から活性が再生することは
ないことが判明している。また、逆に、該前処理剤で処
理された比較的高濃度の塩基性（アルカリ性）被検液と
該Ｇ因子系成分との混合において、該前処理剤が該Ｇ因
子系中の各成分に悪影響を与えることがないのも該緩衝
作用によるものであると考えられる。
【００２１】該反応混合液において、上記被検液のβ−
グルカンを測定するには、前述したように図１のライセ
ートのＧ因子系カスケード反応によって活性化されて生
成するクロッティングエンザイムの基質に対するアミダ
ーゼ活性またはプロテアーゼ活性を公知の方法で測定す
ればよい。ここで、基質とは、合成のものでも天然のも
のでも任意であり、クロッティングエンザイムによって
加水分解されて容易に検出可能な生成物に導かれ、反応
混合液に酵素反応に基づく変化を生じさせる基質であ
り、この変化を定性または定量的に測定できればかまわ
ない。
グルカンを測定するには、前述したように図１のライセ
ートのＧ因子系カスケード反応によって活性化されて生
成するクロッティングエンザイムの基質に対するアミダ
ーゼ活性またはプロテアーゼ活性を公知の方法で測定す
ればよい。ここで、基質とは、合成のものでも天然のも
のでも任意であり、クロッティングエンザイムによって
加水分解されて容易に検出可能な生成物に導かれ、反応
混合液に酵素反応に基づく変化を生じさせる基質であ
り、この変化を定性または定量的に測定できればかまわ
ない。
【００２２】例えば、合成ペプチド基質を含むリムルス
試薬と前処理された被検液とを接触させて反応を行うこ
とによってアミダーゼ活性を測定することができる。こ
のような合成ペプチド基質としては、上記クロッティン
グエンザイムの基質となり得るペプチド（例えば、メト
キシカルボニル−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ；Ｎ末端が保護されたＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ等の配列からなるペプ
チド）のＣ末端のアルギニンのカルボキシル基に発色性
残基（例えば、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノ）アニリン、ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−
ヒドロキシエチル）アニリン等）、発蛍光性残基（例え
ば、７−アミノ−４−メチルクマリン等）、発光性残基
あるいはアンモニアなどがアミド結合により置換した合
成ペプチド基質が例示される。すなわち、アミダーゼ活
性の測定はクロッティングエンザイムがこれらの合成基
質に作用して生成する反応生成物（ｐ−ニトロアニリ
ン、アンモニア等）を測定することによって行うことが
できる。具体的には、Ｅｔの測定に採用されている方法
を例示することができ、例えば、前記カスケード反応お
よび必要に応じて生成物の他色素等への変換反応を行わ
せ、反応によって生成する色素、蛍光物質、発光物質ま
たはアンモニアをそれぞれ分光光度計（特公昭６３−２
６８７１、特公平３−６６３１９等）、蛍光光度計、発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４
８８６０）等によってβ−グルカンを測定する方法が挙
げられる。
試薬と前処理された被検液とを接触させて反応を行うこ
とによってアミダーゼ活性を測定することができる。こ
のような合成ペプチド基質としては、上記クロッティン
グエンザイムの基質となり得るペプチド（例えば、メト
キシカルボニル−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ；Ｎ末端が保護されたＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ等の配列からなるペプ
チド）のＣ末端のアルギニンのカルボキシル基に発色性
残基（例えば、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノ）アニリン、ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−
ヒドロキシエチル）アニリン等）、発蛍光性残基（例え
ば、７−アミノ−４−メチルクマリン等）、発光性残基
あるいはアンモニアなどがアミド結合により置換した合
成ペプチド基質が例示される。すなわち、アミダーゼ活
性の測定はクロッティングエンザイムがこれらの合成基
質に作用して生成する反応生成物（ｐ−ニトロアニリ
ン、アンモニア等）を測定することによって行うことが
できる。具体的には、Ｅｔの測定に採用されている方法
を例示することができ、例えば、前記カスケード反応お
よび必要に応じて生成物の他色素等への変換反応を行わ
せ、反応によって生成する色素、蛍光物質、発光物質ま
たはアンモニアをそれぞれ分光光度計（特公昭６３−２
６８７１、特公平３−６６３１９等）、蛍光光度計、発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４
８８６０）等によってβ−グルカンを測定する方法が挙
げられる。
【００２３】一方、クロッティングエンザイムのプロテ
アーゼ活性の測定には、例えばリムルス試薬に含まれる
通常の天然基質であるコアギュローゲンに、カスケード
反応で生成したクロッティングエンザイムが作用してコ
アギュリンゲルが形成する反応を、例えば適当な機器
（例えば、濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定する
か、または肉眼で判定するＥｔの測定に採用されている
方法（特公平４−１４３１０等）を利用することができ
る。
アーゼ活性の測定には、例えばリムルス試薬に含まれる
通常の天然基質であるコアギュローゲンに、カスケード
反応で生成したクロッティングエンザイムが作用してコ
アギュリンゲルが形成する反応を、例えば適当な機器
（例えば、濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定する
か、または肉眼で判定するＥｔの測定に採用されている
方法（特公平４−１４３１０等）を利用することができ
る。
【００２４】本発明によるβ−グルカンの測定法は、真
菌感染症、特に診断が極めて困難な深在性真菌感染症の
早期診断に有用である。すなわち、患者から採取した血
液由来試料を本発明の前処理剤で処理した後、β−グル
カンを測定し、血液中のβ−グルカンが正常値を有意に
超えた時に、患者が真菌感染症に罹患していると判断す
ることができる。
菌感染症、特に診断が極めて困難な深在性真菌感染症の
早期診断に有用である。すなわち、患者から採取した血
液由来試料を本発明の前処理剤で処理した後、β−グル
カンを測定し、血液中のβ−グルカンが正常値を有意に
超えた時に、患者が真菌感染症に罹患していると判断す
ることができる。
【００２５】本発明においては、前記前処理剤とリムル
ス試薬の各種類を適宜組み合わせることにより、所望の
測定用キットを構成することができる。該キットには、
β−グルカンの一定量を含有する標準試薬、ブランク用
蒸留水、反応試薬溶解・反応用緩衝液等を付加すること
ができる。該緩衝液としては、グッド緩衝液（例えば、
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸）緩衝液等）、トリス−塩
酸緩衝液等が例示できる。
ス試薬の各種類を適宜組み合わせることにより、所望の
測定用キットを構成することができる。該キットには、
β−グルカンの一定量を含有する標準試薬、ブランク用
蒸留水、反応試薬溶解・反応用緩衝液等を付加すること
ができる。該緩衝液としては、グッド緩衝液（例えば、
ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸）緩衝液等）、トリス−塩
酸緩衝液等が例示できる。
【００２６】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ １００％三重らせん構造からなるシゾフィラン（商品名
ソニフィラン、科研製薬（株）販売、２μｇ／ｍＬ水溶
液）０．１ｍＬとＥｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４
由来、Ｄｉｆｃｏ社販売、８０ｎｇ／ｍＬ水溶液）０．
１ｍＬに０．２ｍＬの各種濃度のＮａＯＨ水溶液（前処
理剤）を加え、混合後、６０℃で１０分間加温した。こ
れを注射用蒸留水で１０００倍希釈し、ソニフィラン１
ｎｇ／ｍＬ、Ｅｔ０．０２ｎｇ／ｍＬ（Ｅｔが破壊され
ない場合の濃度）の溶液を調製した。これら処理液を被
検液として、ブランクには注射用蒸留水を用いて、Ｅｔ
およびβ−グルカンフリーのマイクロプレート（トキシ
ペットプレート９６Ｆ、生化学工業（株）販売）のウェ
ルに別々に５０μＬずつとった。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ １００％三重らせん構造からなるシゾフィラン（商品名
ソニフィラン、科研製薬（株）販売、２μｇ／ｍＬ水溶
液）０．１ｍＬとＥｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４
由来、Ｄｉｆｃｏ社販売、８０ｎｇ／ｍＬ水溶液）０．
１ｍＬに０．２ｍＬの各種濃度のＮａＯＨ水溶液（前処
理剤）を加え、混合後、６０℃で１０分間加温した。こ
れを注射用蒸留水で１０００倍希釈し、ソニフィラン１
ｎｇ／ｍＬ、Ｅｔ０．０２ｎｇ／ｍＬ（Ｅｔが破壊され
ない場合の濃度）の溶液を調製した。これら処理液を被
検液として、ブランクには注射用蒸留水を用いて、Ｅｔ
およびβ−グルカンフリーのマイクロプレート（トキシ
ペットプレート９６Ｆ、生化学工業（株）販売）のウェ
ルに別々に５０μＬずつとった。
【００２７】被検液に存在するβ−グルカンおよびＥｔ
の量は、以下の方法で定量した。前記Ｏｂａｙａｓｈ
ｉ，Ｔ．らの方法に従って、カブトガニ・アメボサイト
・ライセートから調製したＧ因子系成分と発色合成基質
（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｐ−ニト
ロアニリド））とを含むβ−グルカン特異的発色合成基
質法リムルス試薬（以下「Ｇテスト」という）、または
発色合成基質法非特異的リムルス試薬（トキシカラー、
生化学工業（株）販売）、またはエンドトキシン特異的
発色合成基質法リムルス試薬（エンドスペシー、生化学
工業（株）販売）を使用し、被検液５０μＬ に０. ２
モル／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６）で溶解した
Ｇテスト液５０μＬ、または０．２モル／Ｌ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解したトキシカラー
液またはエンドスペシー液５０μＬを加え、３７℃で３
０分間加温して反応させ、次いで０. ０４％（重量／容
量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／Ｌ 塩酸溶液）５０
μＬ 、０. ３％（重量／容量）スルファミン酸アンモ
ニウム５０μＬ ならびに０. ０７％（重量／容量）Ｎ
−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１４％（容
量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）５０μＬ
を順次加えてジアゾカップリングし、マイクロプレー
トリーダーにより６３０nmを対照波長として５４５nmで
吸光度を測定することによって定量した。
の量は、以下の方法で定量した。前記Ｏｂａｙａｓｈ
ｉ，Ｔ．らの方法に従って、カブトガニ・アメボサイト
・ライセートから調製したＧ因子系成分と発色合成基質
（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｐ−ニト
ロアニリド））とを含むβ−グルカン特異的発色合成基
質法リムルス試薬（以下「Ｇテスト」という）、または
発色合成基質法非特異的リムルス試薬（トキシカラー、
生化学工業（株）販売）、またはエンドトキシン特異的
発色合成基質法リムルス試薬（エンドスペシー、生化学
工業（株）販売）を使用し、被検液５０μＬ に０. ２
モル／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６）で溶解した
Ｇテスト液５０μＬ、または０．２モル／Ｌ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解したトキシカラー
液またはエンドスペシー液５０μＬを加え、３７℃で３
０分間加温して反応させ、次いで０. ０４％（重量／容
量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／Ｌ 塩酸溶液）５０
μＬ 、０. ３％（重量／容量）スルファミン酸アンモ
ニウム５０μＬ ならびに０. ０７％（重量／容量）Ｎ
−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１４％（容
量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）５０μＬ
を順次加えてジアゾカップリングし、マイクロプレー
トリーダーにより６３０nmを対照波長として５４５nmで
吸光度を測定することによって定量した。
【００２８】また、前処理剤溶液のＮａＯＨ濃度を種々
変化させて被検液中のＮａＯＨ濃度を種々調整した場合
の三重らせん構造β−グルカンの構造変化をSaito H. e
t al. (Carbohydr. Res., 74, 227-240(1979))の方法に
従って、13Ｃ−ＮＭＲにより測定した。その三重らせん
構造の割合と前処理された被検液の各テストの測定値
（吸光度）を表１に示す。
変化させて被検液中のＮａＯＨ濃度を種々調整した場合
の三重らせん構造β−グルカンの構造変化をSaito H. e
t al. (Carbohydr. Res., 74, 227-240(1979))の方法に
従って、13Ｃ−ＮＭＲにより測定した。その三重らせん
構造の割合と前処理された被検液の各テストの測定値
（吸光度）を表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】なお、表１中、ＮａＯＨ濃度（モル／Ｌ）
は、被検液における濃度を示し、吸光度はブランク値を
差し引いた値を表示した。また、被検液としてＥｔ水溶
液を蒸留水に置換、またはソニフィラン水溶液を蒸留水
に置換した場合も示した。表１によれば、Ｇテストにお
いて、注射用蒸留水のみによる処理では、β−グルカン
は全く検出されず、ＮａＯＨの濃度が０．０３モル／Ｌ
以上では、吸光度の値が一定となる（試料Ｎｏ．１−１
および１−４〜１０）。このことは、前処理した被検液
におけるβ−グルカンの構造変化を観察した結果から、
β−グルカンの三重らせん構造が解けるに従って吸光度
が増加していることと対応する。また、トキシカラーに
おいては、注射用蒸留水のみによる処理では、Ｅｔには
反応するが、β−グルカンとはやはり全く反応しない
（試料Ｎｏ．１−１および１−２）。ＮａＯＨ濃度が、
０．０３モル／Ｌ以上の場合に吸光度が一定となり、β
−グルカンが検出できるようになる（試料Ｎｏ．１−４
〜１０）。エンドスペシーの場合は、注射用蒸留水のみ
による処理では、Ｅｔに反応し、β−グルカンとは全く
反応しない（試料Ｎｏ．１−１および１−２）。ＮａＯ
Ｈ濃度が０．０３モル／Ｌ以上の場合に吸光度が０とな
り、Ｅｔの活性が失われることが判る。
は、被検液における濃度を示し、吸光度はブランク値を
差し引いた値を表示した。また、被検液としてＥｔ水溶
液を蒸留水に置換、またはソニフィラン水溶液を蒸留水
に置換した場合も示した。表１によれば、Ｇテストにお
いて、注射用蒸留水のみによる処理では、β−グルカン
は全く検出されず、ＮａＯＨの濃度が０．０３モル／Ｌ
以上では、吸光度の値が一定となる（試料Ｎｏ．１−１
および１−４〜１０）。このことは、前処理した被検液
におけるβ−グルカンの構造変化を観察した結果から、
β−グルカンの三重らせん構造が解けるに従って吸光度
が増加していることと対応する。また、トキシカラーに
おいては、注射用蒸留水のみによる処理では、Ｅｔには
反応するが、β−グルカンとはやはり全く反応しない
（試料Ｎｏ．１−１および１−２）。ＮａＯＨ濃度が、
０．０３モル／Ｌ以上の場合に吸光度が一定となり、β
−グルカンが検出できるようになる（試料Ｎｏ．１−４
〜１０）。エンドスペシーの場合は、注射用蒸留水のみ
による処理では、Ｅｔに反応し、β−グルカンとは全く
反応しない（試料Ｎｏ．１−１および１−２）。ＮａＯ
Ｈ濃度が０．０３モル／Ｌ以上の場合に吸光度が０とな
り、Ｅｔの活性が失われることが判る。
【００３１】すなわち、本実施例では、試料が水溶液の
場合、ＮａＯＨ濃度が０．０３モル／Ｌ付近以上で、６
０℃、１０分間前処理することにより、Ｅｔを不活性化
するとともにβ−グルカンの三重らせん構造を解いてＧ
因子活性化能を有する構造に変換してＧ因子を活性化す
るため、吸光度の値が一定となり、被検液中のβ−グル
カンの真の値をβ−グルカン特異的リムルス試薬ではも
ちろんのこと、非特異的リムルス試薬を用いても、正確
かつ高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能で
あることが明らかである。
場合、ＮａＯＨ濃度が０．０３モル／Ｌ付近以上で、６
０℃、１０分間前処理することにより、Ｅｔを不活性化
するとともにβ−グルカンの三重らせん構造を解いてＧ
因子活性化能を有する構造に変換してＧ因子を活性化す
るため、吸光度の値が一定となり、被検液中のβ−グル
カンの真の値をβ−グルカン特異的リムルス試薬ではも
ちろんのこと、非特異的リムルス試薬を用いても、正確
かつ高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能で
あることが明らかである。
【００３２】実施例２ 健常人ＰＲＰ１８０μＬに、９９％三重らせん構造から
なるレンチナン（味の素（株）販売、２００ｎｇ／ｍＬ
水溶液）１０μＬとＥｔ（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ由来、Ｓｉｇｍａ社販売、８ｎｇ／ｍＬ水溶
液）１０μＬとを添加し、これに蒸留水あるいは各種濃
度のＫＯＨ水溶液８００μＬを加え、混合後、３７℃で
３０分加温した。氷冷後、処理混液のうち、５０μＬを
試験管にとり、ＨＣｌ水溶液５０μＬを加えて中和し、
これにＧテスト液、トキシカラー液あるいはエンドスペ
シー液１００μＬを加え、３７℃で３０分間加温して反
応させ、次いで０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８
モル／Ｌ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニ
ウム、０．０７％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二
塩酸塩を各０．５ｍＬずつ順次加えてジアゾカップリン
グし、５４５ｎｍで吸光度を測定した。沈殿を生じた場
合は、遠心分離して、その上清を測定した。 該前処理
された被検液の各テストの測定値（吸光度）を表２に示
す。
なるレンチナン（味の素（株）販売、２００ｎｇ／ｍＬ
水溶液）１０μＬとＥｔ（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ由来、Ｓｉｇｍａ社販売、８ｎｇ／ｍＬ水溶
液）１０μＬとを添加し、これに蒸留水あるいは各種濃
度のＫＯＨ水溶液８００μＬを加え、混合後、３７℃で
３０分加温した。氷冷後、処理混液のうち、５０μＬを
試験管にとり、ＨＣｌ水溶液５０μＬを加えて中和し、
これにＧテスト液、トキシカラー液あるいはエンドスペ
シー液１００μＬを加え、３７℃で３０分間加温して反
応させ、次いで０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８
モル／Ｌ塩酸溶液）、０．３％スルファミン酸アンモニ
ウム、０．０７％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二
塩酸塩を各０．５ｍＬずつ順次加えてジアゾカップリン
グし、５４５ｎｍで吸光度を測定した。沈殿を生じた場
合は、遠心分離して、その上清を測定した。 該前処理
された被検液の各テストの測定値（吸光度）を表２に示
す。
【００３３】
【表２】
【００３４】なお、表２中、ＫＯＨ濃度（モル／Ｌ）
は、被検液における濃度を示し、吸光度はブランク値を
差し引いた値を表示した。ブランクは、ＰＲＰの代わり
に蒸留水を用い、前処理剤として注射用蒸留水を用い
た。また、被検液としてＥｔ水溶液を注射用蒸留水に置
換、および／またはレンチナン水溶液を蒸留水に置換し
た場合も示した。
は、被検液における濃度を示し、吸光度はブランク値を
差し引いた値を表示した。ブランクは、ＰＲＰの代わり
に蒸留水を用い、前処理剤として注射用蒸留水を用い
た。また、被検液としてＥｔ水溶液を注射用蒸留水に置
換、および／またはレンチナン水溶液を蒸留水に置換し
た場合も示した。
【００３５】表２によれば、ＰＲＰ中には、リムルス反
応妨害因子が存在するため、注射用蒸留水のみによる処
理では、β−グルカンもＥｔもほとんど検出されず（Ｎ
ｏ．２−１〜４）、この因子は、０．０６モル／Ｌ以上
のＫＯＨ中で、３７℃、３０分間加温処理することによ
り、不活性化されることが判る（試料Ｎｏ．２−６〜１
２）。また、Ｅｔは処理ＫＯＨ濃度の増加に伴って、活
性が低下し、０．７モル／Ｌ以上の処理によって、完全
に不活性化する（試料Ｎｏ．２−１０〜１２）。一方、
９９％三重らせん構造をとるレンチナンは、０．０６モ
ル／Ｌ以上のＫＯＨで処理すると、三重らせんが変化
し、高い反応性を示す。すなわち、Ｅｔとβ−グルカン
が共存する血漿を処理時０．７モル／Ｌ以上となるＫＯ
Ｈ水溶液で３７℃、３０分間前処理すれば、Ｅｔとβ−
グルカンが共存している検体でもβ−グルカン特異的試
薬であるＧテストを用いなくとも両者に反応する通常の
リムルス試薬（非特異的リムルス試薬）により、β−グ
ルカンのみを正確に検出できることが判る（試料Ｎｏ．
２−１０〜１２）。
応妨害因子が存在するため、注射用蒸留水のみによる処
理では、β−グルカンもＥｔもほとんど検出されず（Ｎ
ｏ．２−１〜４）、この因子は、０．０６モル／Ｌ以上
のＫＯＨ中で、３７℃、３０分間加温処理することによ
り、不活性化されることが判る（試料Ｎｏ．２−６〜１
２）。また、Ｅｔは処理ＫＯＨ濃度の増加に伴って、活
性が低下し、０．７モル／Ｌ以上の処理によって、完全
に不活性化する（試料Ｎｏ．２−１０〜１２）。一方、
９９％三重らせん構造をとるレンチナンは、０．０６モ
ル／Ｌ以上のＫＯＨで処理すると、三重らせんが変化
し、高い反応性を示す。すなわち、Ｅｔとβ−グルカン
が共存する血漿を処理時０．７モル／Ｌ以上となるＫＯ
Ｈ水溶液で３７℃、３０分間前処理すれば、Ｅｔとβ−
グルカンが共存している検体でもβ−グルカン特異的試
薬であるＧテストを用いなくとも両者に反応する通常の
リムルス試薬（非特異的リムルス試薬）により、β−グ
ルカンのみを正確に検出できることが判る（試料Ｎｏ．
２−１０〜１２）。
【００３６】また、実際に臨床検体を実施例２に準じて
前処理剤で処理し、トキシカラーで測定したところ、深
在性真菌症患者検体のみが高値を示した。 実施例３ 表３に示す金属イオンを含む水溶液に１００％三重らせ
ん構造からなるシゾフィラン（商品名ソニフィラン）を
１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加したもの０．２ｍＬ
に、０．１モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶液０．０２５
ｍＬを添加し氷冷下５分間放置後、３モル／Ｌ水酸化ナ
トリウム溶液０．０２５ｍＬを添加するか（逐次添
加）、あるいは０．２０モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶
液を含む１．５モル／Ｌ水酸化ナトリウム０．０５ｍＬ
を添加（同時添加）した後、室温下１０分間放置後、注
射用蒸留水で１０倍希釈し、その内の０．０５ｍＬを被
検液として、実施例１と同様にＧテストを用いてその反
応性を調べた。結果を表３に示す。表中には金属イオン
を含まないソニフィラン水溶液をＥＤＴＡ４Ｎａ塩を含
まない水酸化ナトリウム溶液で処理（処理時０．３モル
／Ｌ）した場合を１００％、またＥＤＴＡ４Ｎａ溶液お
よび水酸化ナトリウム溶液の代わりに注射用蒸留水を用
いた場合を０％とした相対活性を示した。なお、金属イ
オンを含む試料を測定する際のＥＤＴＡ４Ｎａ塩の添加
効果を調べるために上記逐次添加においてＥＤＴＡ４Ｎ
ａ塩溶液の代わりに等量の注射用蒸留水を用いた実験も
行った。また上記逐次添加の添加順序を逆にした実験も
行った。
前処理剤で処理し、トキシカラーで測定したところ、深
在性真菌症患者検体のみが高値を示した。 実施例３ 表３に示す金属イオンを含む水溶液に１００％三重らせ
ん構造からなるシゾフィラン（商品名ソニフィラン）を
１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加したもの０．２ｍＬ
に、０．１モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶液０．０２５
ｍＬを添加し氷冷下５分間放置後、３モル／Ｌ水酸化ナ
トリウム溶液０．０２５ｍＬを添加するか（逐次添
加）、あるいは０．２０モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶
液を含む１．５モル／Ｌ水酸化ナトリウム０．０５ｍＬ
を添加（同時添加）した後、室温下１０分間放置後、注
射用蒸留水で１０倍希釈し、その内の０．０５ｍＬを被
検液として、実施例１と同様にＧテストを用いてその反
応性を調べた。結果を表３に示す。表中には金属イオン
を含まないソニフィラン水溶液をＥＤＴＡ４Ｎａ塩を含
まない水酸化ナトリウム溶液で処理（処理時０．３モル
／Ｌ）した場合を１００％、またＥＤＴＡ４Ｎａ溶液お
よび水酸化ナトリウム溶液の代わりに注射用蒸留水を用
いた場合を０％とした相対活性を示した。なお、金属イ
オンを含む試料を測定する際のＥＤＴＡ４Ｎａ塩の添加
効果を調べるために上記逐次添加においてＥＤＴＡ４Ｎ
ａ塩溶液の代わりに等量の注射用蒸留水を用いた実験も
行った。また上記逐次添加の添加順序を逆にした実験も
行った。
【００３７】
【表３】 表３ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 金属イオン水溶液 EDTA4NaとNaOHの添加の 相対活性 有無（＋／−）と添加方法 （％） EDTA4Na NaOH 添加方法 (A) (B) ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 注射用蒸留水 （対照例） − − ０ 注射用蒸留水 （対照例） − ＋ １００ 10 mM MgCl2 − ＋ ２．６ 10 mM MgCl2 ＋ ＋ 逐次(A→B) １２４．０ 10 mM MgCl2 ＋ ＋ 逐次(B→A) ０．６ 10 mM CaCl2 − ＋ ２．８ 10 mM CaCl2 ＋ ＋ 同時 １０５．９ 0.5 mM FeCl2 − ＋ ２．０ 0.5 mM FeCl2 ＋ ＋ 逐次(A→B) ９８．８ 0.5 mM FeCl3 − ＋ ０ 0.5 mM FeCl3 ＋ ＋ 同時 ９５．６ 0.05 mM MnSO4 − ＋ ４．０ 0.05 mM MnSO4 ＋ ＋ 逐次(A→B) １０５．０ リンゲル液（含2.24mM CaCl2） ＋ ＋ 同時 １１３．２ 人工腎臓用透析液 − ＋ ３．８ 人工腎臓用透析液 ＋ ＋ 同時 ９７．５ （含1.5mM CaCl2, 0.5mM MgCl2） PBS (+) ＋ ＋ 逐次(A→B) １０７．４ （含0.901mM CaCl2, 0.492mM MgSO4） ハンクス液 ＋ ＋ 逐次(A→B) １０５．２ （含1.26mM CaCl2, 0.812mM MgSO4） ―――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００３８】表３の結果より、三重らせん構造をとるシ
ゾフィランの水溶液中にＭｇ2+やＣａ2+が存在するとア
ルカリのみで処理してもＧテスト反応性は高まらない
が、キレート剤をアルカリ添加と同時あるいは添加前に
添加すると、シゾフィランのＧテスト反応性が高まり、
高感度に検出定量できることが判った。上記実験におい
て水酸化ナトリウムの代わりに水酸化カリウムを用いた
実験を行ったが、上記とほぼ同様の結果が得られた。
ゾフィランの水溶液中にＭｇ2+やＣａ2+が存在するとア
ルカリのみで処理してもＧテスト反応性は高まらない
が、キレート剤をアルカリ添加と同時あるいは添加前に
添加すると、シゾフィランのＧテスト反応性が高まり、
高感度に検出定量できることが判った。上記実験におい
て水酸化ナトリウムの代わりに水酸化カリウムを用いた
実験を行ったが、上記とほぼ同様の結果が得られた。
【００３９】
【発明の効果】本発明は、三重らせん構造を主体とする
β−グルカンの他に、Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応
妨害因子（リムルス反応妨害因子）を含む試料中のβ−
グルカンを測定する際に、該試料を強アルカリ性の前処
理剤で処理するという簡便な手段を採用することによっ
て、上記Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応妨害因子の反
応系への影響を完全に除去することができ、かつβ−グ
ルカンがＧ因子を活性化しない三重らせん構造をとって
いても、それをＧ因子活性化能を有する構造に変換でき
るので、Ｅｔにも反応性を有する非特異的リムルス試薬
を使用してβ−グルカンを正確に定量できる。また、本
発明は三重らせん構造を主体とするβ−グルカンの他に
金属イオンを含む試料中のβ−グルカンを測定する際
に、該試料をキレート剤の存在下において強アルカリ性
の前処理剤で処理することにより、強アルカリ処理によ
ってβ−グルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を
有する構造に変換されるのを、金属イオンが阻害する現
象を防止することができるので、透析後、リンゲル液な
どの金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカンを正確
に定量することができる。さらに、本発明の測定法を使
用して生体由来試料中のβ−グルカンを測定すると高精
度で再現性の高い結果が得られる。本発明のβ−グルカ
ンの測定法を臨床検査に応用することによって、通常の
検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の診
断を迅速かつ正確に行うことができる。
β−グルカンの他に、Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応
妨害因子（リムルス反応妨害因子）を含む試料中のβ−
グルカンを測定する際に、該試料を強アルカリ性の前処
理剤で処理するという簡便な手段を採用することによっ
て、上記Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応妨害因子の反
応系への影響を完全に除去することができ、かつβ−グ
ルカンがＧ因子を活性化しない三重らせん構造をとって
いても、それをＧ因子活性化能を有する構造に変換でき
るので、Ｅｔにも反応性を有する非特異的リムルス試薬
を使用してβ−グルカンを正確に定量できる。また、本
発明は三重らせん構造を主体とするβ−グルカンの他に
金属イオンを含む試料中のβ−グルカンを測定する際
に、該試料をキレート剤の存在下において強アルカリ性
の前処理剤で処理することにより、強アルカリ処理によ
ってβ−グルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を
有する構造に変換されるのを、金属イオンが阻害する現
象を防止することができるので、透析後、リンゲル液な
どの金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカンを正確
に定量することができる。さらに、本発明の測定法を使
用して生体由来試料中のβ−グルカンを測定すると高精
度で再現性の高い結果が得られる。本発明のβ−グルカ
ンの測定法を臨床検査に応用することによって、通常の
検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の診
断を迅速かつ正確に行うことができる。
【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートの（１
→３）−β−Ｄ−グルカン及びエンドトキシンによるカ
スケード反応の反応機構を示す。
→３）−β−Ｄ−グルカン及びエンドトキシンによるカ
スケード反応の反応機構を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１２月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、（１→３）−β−Ｄ−
グルカン（以下「β−グルカン」ともいう）の測定方法
に関する。特に、反応妨害因子として試料中に含まれる
可能性のある、リムルスＣ因子系反応に関与するエンド
トキシン（以下「Ｅｔ」とも記す）単独またはＥｔおよ
びリムルスＧ因子とβ−グルカンとの特異的反応を妨害
する反応妨害因子（以下「Ｇ因子系反応妨害因子」とも
いう）の双方を含む可能性のある試料中あるいはリンゲ
ル液、透析液等の金属イオンを含み得る試料中のβ−グ
ルカンをリムルス試薬を用いて高い精度で測定できる方
法に関するものである。
グルカン（以下「β−グルカン」ともいう）の測定方法
に関する。特に、反応妨害因子として試料中に含まれる
可能性のある、リムルスＣ因子系反応に関与するエンド
トキシン（以下「Ｅｔ」とも記す）単独またはＥｔおよ
びリムルスＧ因子とβ−グルカンとの特異的反応を妨害
する反応妨害因子（以下「Ｇ因子系反応妨害因子」とも
いう）の双方を含む可能性のある試料中あるいはリンゲ
ル液、透析液等の金属イオンを含み得る試料中のβ−グ
ルカンをリムルス試薬を用いて高い精度で測定できる方
法に関するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、 三重らせ
ん構造を主体とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンを含
み得る試料を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨
害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドト
キシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因
子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によ
るリムルス反応に付すことを特徴とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試薬が非特異
的リムルス試薬であることを特徴とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 アルカ
リ金属水酸化物を試料中に存在させて強アルカリ性条件
下とする前記または記載の（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定方法、 試料中のアルカリ金属水酸化物
濃度を０．０３〜２．０モル／Ｌの条件下で前処理する
ことを特徴とする前記に記載の測定方法、および前
処理を０〜１３５℃の条件下で行う前記〜のいずれ
か１項に記載の測定方法、 試料が金属イオンを含み
得るものであり、試料を、キレート剤の存在下において
前処理する前記記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の測定方法、 三重らせん構造を主体とする（１→
３）−β−Ｄ−グルカンと金属イオンとを含み得る試料
を、キレート剤の存在下において強アルカリ性条件下で
前処理した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法、 前記前処理を、試料にキレート剤を添加後、
強アルカリ性条件下で行うか、または試料にキレート剤
を添加する際に強アルカリ性条件下とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムル
ス試薬が、カブトガニ血リンパ凝固系のＣ因子系成分を
実質的に含まないか、あるいはＣ因子系反応が阻害さ
れ、エンドトキシンと反応せず、（１→３）−β−Ｄ−
グルカンに特異的なものである、前記記載の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法である。
ん構造を主体とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンを含
み得る試料を、強アルカリ性条件下で前処理し、反応妨
害因子として試料中に含まれる可能性のある、エンドト
キシン単独またはエンドトキシンとＧ因子系反応妨害因
子とを破壊もしくは不活性化した後、リムルス試薬によ
るリムルス反応に付すことを特徴とする（１→３）−β
−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムルス試薬が非特異
的リムルス試薬であることを特徴とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 アルカ
リ金属水酸化物を試料中に存在させて強アルカリ性条件
下とする前記または記載の（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカンの測定方法、 試料中のアルカリ金属水酸化物
濃度を０．０３〜２．０モル／Ｌの条件下で前処理する
ことを特徴とする前記に記載の測定方法、および前
処理を０〜１３５℃の条件下で行う前記〜のいずれ
か１項に記載の測定方法、 試料が金属イオンを含み
得るものであり、試料を、キレート剤の存在下において
前処理する前記記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカン
の測定方法、 三重らせん構造を主体とする（１→
３）−β−Ｄ−グルカンと金属イオンとを含み得る試料
を、キレート剤の存在下において強アルカリ性条件下で
前処理した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付す
ことを特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定
方法、 前記前処理を、試料にキレート剤を添加後、
強アルカリ性条件下で行うか、または試料にキレート剤
を添加する際に強アルカリ性条件下とする前記記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法、 リムル
ス試薬が、カブトガニ血リンパ凝固系のＣ因子系成分を
実質的に含まないか、あるいはＣ因子系反応が阻害さ
れ、エンドトキシンと反応せず、（１→３）−β−Ｄ−
グルカンに特異的なものである、前記記載の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】また、実際に臨床検体を実施例２に準じて
前処理剤で処理し、トキシカラーで測定したところ、深
在性真菌症患者検体のみが高値を示した。 実施例３ 表３に示す金属イオンを含む水溶液に１００％三重らせ
ん構造からなるシゾフィラン（商品名ソニフィラン）を
１．０ｎｇ／ｍＬとなるように添加したもの０．２ｍＬ
に、０．１モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶液０．０２５
ｍＬを添加し氷冷下５分間放置後、３モル／Ｌ水酸化ナ
トリウム溶液０．０２５ｍＬを添加するか（逐次添
加）、あるいは０．２０モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶
液を含む１．５モル／Ｌ水酸化ナトリウム０．０５ｍＬ
を添加（同時添加）した後、室温下１０分間放置後、注
射用蒸留水で１０倍希釈し、その内の０．０５ｍＬを被
検液として、実施例１と同様にＧテストを用いてその反
応性を調べた。結果を表３に示す。表中には金属イオン
を含まないソニフィラン水溶液をＥＤＴＡ４Ｎａ塩を含
まない水酸化ナトリウム溶液で処理（処理時０．３モル
／Ｌ）した場合を１００％、またＥＤＴＡ４Ｎａ溶液お
よび水酸化ナトリウム溶液の代わりに注射用蒸留水を用
いた場合を０％とした相対活性を示した。なお、金属イ
オンを含む試料を測定する際のＥＤＴＡ４Ｎａ塩の添加
効果を調べるために上記逐次添加においてＥＤＴＡ４Ｎ
ａ塩溶液の代わりに等量の注射用蒸留水を用いた実験も
行った。また上記逐次添加の添加順序を逆にした実験も
行った。
前処理剤で処理し、トキシカラーで測定したところ、深
在性真菌症患者検体のみが高値を示した。 実施例３ 表３に示す金属イオンを含む水溶液に１００％三重らせ
ん構造からなるシゾフィラン（商品名ソニフィラン）を
１．０ｎｇ／ｍＬとなるように添加したもの０．２ｍＬ
に、０．１モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶液０．０２５
ｍＬを添加し氷冷下５分間放置後、３モル／Ｌ水酸化ナ
トリウム溶液０．０２５ｍＬを添加するか（逐次添
加）、あるいは０．２０モル／ＬのＥＤＴＡ４Ｎａ塩溶
液を含む１．５モル／Ｌ水酸化ナトリウム０．０５ｍＬ
を添加（同時添加）した後、室温下１０分間放置後、注
射用蒸留水で１０倍希釈し、その内の０．０５ｍＬを被
検液として、実施例１と同様にＧテストを用いてその反
応性を調べた。結果を表３に示す。表中には金属イオン
を含まないソニフィラン水溶液をＥＤＴＡ４Ｎａ塩を含
まない水酸化ナトリウム溶液で処理（処理時０．３モル
／Ｌ）した場合を１００％、またＥＤＴＡ４Ｎａ溶液お
よび水酸化ナトリウム溶液の代わりに注射用蒸留水を用
いた場合を０％とした相対活性を示した。なお、金属イ
オンを含む試料を測定する際のＥＤＴＡ４Ｎａ塩の添加
効果を調べるために上記逐次添加においてＥＤＴＡ４Ｎ
ａ塩溶液の代わりに等量の注射用蒸留水を用いた実験も
行った。また上記逐次添加の添加順序を逆にした実験も
行った。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】
【発明の効果】本発明は、三重らせん構造を主体とする
β−グルカンの他に、Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応
妨害因子（リムルス反応妨害因子）を含む試料中のβ−
グルカンを測定する際に、該試料を強アルカリ性の前処
理剤で処理するという簡便な手段を採用することによっ
て、上記Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応妨害因子の反
応系への影響を完全に除去することができ、かつβ−グ
ルカンがＧ因子を活性化しない三重らせん構造をとって
いても、それをＧ因子活性化能を有する構造に変換でき
るので、Ｅｔにも反応性を有する非特異的リムルス試薬
を使用してβ−グルカンを正確に定量できる。また、本
発明は三重らせん構造を主体とするβ−グルカンの他に
金属イオンを含む試料中のβ−グルカンを測定する際
に、該試料をキレート剤の存在下において強アルカリ性
の前処理剤で処理することにより、強アルカリ処理によ
ってβ−グルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を
有する構造に変換されるのを、金属イオンが阻害する現
象を防止することができるので、透析液、リンゲル液な
どの金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカンを正確
に定量することができる。さらに、本発明の測定法を使
用して生体由来試料中のβ−グルカンを測定すると高精
度で再現性の高い結果が得られる。本発明のβ−グルカ
ンの測定法を臨床検査に応用することによって、通常の
検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の診
断を迅速かつ正確に行うことができる。
β−グルカンの他に、Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応
妨害因子（リムルス反応妨害因子）を含む試料中のβ−
グルカンを測定する際に、該試料を強アルカリ性の前処
理剤で処理するという簡便な手段を採用することによっ
て、上記Ｅｔおよび／またはＧ因子系反応妨害因子の反
応系への影響を完全に除去することができ、かつβ−グ
ルカンがＧ因子を活性化しない三重らせん構造をとって
いても、それをＧ因子活性化能を有する構造に変換でき
るので、Ｅｔにも反応性を有する非特異的リムルス試薬
を使用してβ−グルカンを正確に定量できる。また、本
発明は三重らせん構造を主体とするβ−グルカンの他に
金属イオンを含む試料中のβ−グルカンを測定する際
に、該試料をキレート剤の存在下において強アルカリ性
の前処理剤で処理することにより、強アルカリ処理によ
ってβ−グルカンの三重らせん構造がＧ因子活性化能を
有する構造に変換されるのを、金属イオンが阻害する現
象を防止することができるので、透析液、リンゲル液な
どの金属イオンを含み得る試料中のβ−グルカンを正確
に定量することができる。さらに、本発明の測定法を使
用して生体由来試料中のβ−グルカンを測定すると高精
度で再現性の高い結果が得られる。本発明のβ−グルカ
ンの測定法を臨床検査に応用することによって、通常の
検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染症の診
断を迅速かつ正確に行うことができる。
Claims (9)
- 【請求項１】 三重らせん構造を主体とする（１→３）
−β−Ｄ−グルカンを含み得る試料を、強アルカリ性条
件下で前処理し、反応妨害因子として試料中に含まれる
可能性のある、エンドトキシン単独またはエンドトキシ
ンとＧ因子系反応妨害因子とを破壊もしくは不活性化し
た後、リムルス試薬によるリムルス反応に付すことを特
徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項２】 リムルス試薬が非特異的リムルス試薬で
あることを特徴とする請求項１記載の（１→３）−β−
Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項３】 アルカリ金属水酸化物を試料中に存在さ
せて強アルカリ性条件下とする請求項１または２記載の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項４】 試料中のアルカリ金属水酸化物の濃度を
０．０３〜２．０モル／Ｌの条件下で前処理する請求項
３記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項５】 前処理を０〜１３５℃の条件下で行う請
求項１〜４のいずれか１項に記載の（１→３）−β−Ｄ
−グルカンの測定方法。 - 【請求項６】 試料が金属イオンを含み得るものであ
り、キレート剤の存在下において前処理する請求項１記
載の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項７】 三重らせん構造を主体とする（１→３）
−β−Ｄ−グルカンと金属イオンとを含み得る試料を、
キレート剤の存在下において強アルカリ性条件下で前処
理した後、リムルス試薬によるリムルス反応に付すこと
を特徴とする（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方
法。 - 【請求項８】 前記前処理を、試料にキレート剤を添加
後、強アルカリ条件下で行うか、または試料にキレート
剤を添加する際に強アルカリ条件下とする請求項７記載
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法。 - 【請求項９】 リムルス試薬が、カブトガニ血リンパ凝
固系のＣ因子系成分を実質的に含まないか、あるいはＣ
因子系反応が阻害され、エンドトキシンと反応せず、
（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的なものである、
請求項８記載の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方
法。
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|---|---|---|---|
| JP21629594A JP3553656B2 (ja) | 1993-09-10 | 1994-09-09 | （１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24855093 | 1993-09-10 | ||
| JP5-248550 | 1993-09-10 | ||
| JP21629594A JP3553656B2 (ja) | 1993-09-10 | 1994-09-09 | （１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3553656B2 JP3553656B2 (ja) | 2004-08-11 |
Family
ID=26521349
Family Applications (1)
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| JP21629594A Expired - Lifetime JP3553656B2 (ja) | 1993-09-10 | 1994-09-09 | （１→３）−β−Ｄ−グルカンの測定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080448A1 (ja) | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Seikagaku Corporation | リムルス測定用前処理剤 |
| WO2020022467A1 (ja) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 積水メディカル株式会社 | 生体試料中の（１→３）－β－Ｄ－グルカンの免疫学的分析方法、（１→３）－β－Ｄ－グルカン分析用キット、及び（１→３）－β－Ｄ－グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 |
-
1994
- 1994-09-09 JP JP21629594A patent/JP3553656B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080448A1 (ja) | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Seikagaku Corporation | リムルス測定用前処理剤 |
| US7867722B2 (en) | 2005-01-27 | 2011-01-11 | Seikagaku Corporation | Pretreatment agent for limulus test |
| WO2020022467A1 (ja) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 積水メディカル株式会社 | 生体試料中の（１→３）－β－Ｄ－グルカンの免疫学的分析方法、（１→３）－β－Ｄ－グルカン分析用キット、及び（１→３）－β－Ｄ－グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 |
| JPWO2020022467A1 (ja) * | 2018-07-27 | 2020-08-06 | 積水メディカル株式会社 | 生体試料中の（１→３）−β−Ｄ−グルカンの免疫学的分析方法、（１→３）−β−Ｄ−グルカン分析用キット、及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンの免疫学的分析方法に使用するための生体試料用アルカリ前処理液 |
| US20210270821A1 (en) * | 2018-07-27 | 2021-09-02 | Sekisui Medical Co., Ltd. | IMMUNOASSAY METHOD FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN IN BIOLOGICAL SAMPLE, ASSAY KIT FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN, AND ALKALI PRETREATMENT SOLUTION FOR BIOLOGICAL SAMPLE FOR USE IN IMMUNOASSAY METHOD FOR (carbon 1 to carbon 3 bonded)-BETA-D-GLUCAN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3553656B2 (ja) | 2004-08-11 |
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