JPH07128596A - コンフォーカル顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 軸上色収差や倍率色収差のある対物レンズを
使用してもシェーディングが発生しないコンフォーカル
顕微鏡を得る。 【構成】 光源から発せられた光束の光路を偏向して走
査する光路偏向部材を介して標本上に集光させ、この集
光スポットで照射された標本からの戻り光を、標本と互
いに共役な位置に配置されたピンホール付き遮光部材を
介して選択的に検出するコンフォーカル顕微鏡におい
て、遮光部材が光路偏向部材による光路の移動に伴って
生じる戻り光の集光点位置の移動範囲を含む大きさのピ
ンホールを備えているもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば、生体試料等の
観察に用いるコンフォーカル顕微鏡に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】一般に、コンフォーカル顕微鏡は、光源
から発せられた光束を標本上に集光させ、この集光スポ
ットで照射された標本からの戻り光を、標本と互いに共
役な位置に配置されたピンホール付き遮光部材を介して
選択的に検出することにより画像情報を得る構成となっ
ている。

【０００３】ここで、従来のこの種のコンフォーカル顕
微鏡の概略構成を図２に示す。この図に示すコンフォー
カル顕微鏡は、大別して光源ユニット２１０、ビームス
プリッタ２２０、偏向光学系２３０、対物光学系２４０
及び検出系２６０とから構成されている。

【０００４】図２において実線で示したレーザ光は、レ
ーザ光源２１１及びビームエキスパンダ２１２を含む光
源ユニット２１０から発せられ、ダイクロイックミラー
２２０に反射されて、少なくとも一つの光偏向器を含む
偏向光学系２３０に入射する。

【０００５】ビームスプリッタ２２０は、光源ユニット
２１０から発せられたレーザー光束を反射することによ
り光路を折り曲げて偏向光学系２３０に導くと共に、標
本からの戻り光束を透過させて検出系に導く光路分割手
段の役割を果たしており、この従来例では蛍光を検出す
る蛍光顕微鏡の構成例であるため、励起光（レーザ光）
と検出戻り光（蛍光）とを分離するダイクロックミラー
が用いられている。

【０００６】ビームスプリッタ２２０により偏向光学系
２３０に導かれたレーザ光束は、偏向光学系２３０に設
けられた光路偏向部材により水平方向及び垂直方向（図
における紙面に対して）に任意量だけ偏向された後、対
物光学系２４０により集光されて標本２５０上にスポッ
ト状に照射される。

【０００７】前記集光スポットは、偏向光学系２３０の
水平方向及び垂直方向の偏向量（可変）に応じて標本２
５０上を２次元走査するが、このとき集光スポットの照
射による標本２５０からの戻り光として、反射光、蛍光
発光、ラマン散乱光等が生じるので、標本２５０から発
せられた検出光は標本の２次元（画像）情報となる。

【０００８】これらの戻り光は、光源ユニット２１０か
ら発せられたレーザー光束が入射した時と逆の経路で再
度前記対物光学系２４０に入射する。さらに、この戻り
光束は偏向光学系２３０に入射して光軸に沿う（偏向し
ていない）光路に導かれる。

【０００９】戻り光のうち蛍光等は、ビームスプリッタ
２２０を透過してその他の戻り光と分離された後、検出
光となって検出系２６０に入射する。ここでは、集光レ
ンズ群２６１により標本上と共役な位置に集光され、ピ
ンホール付の遮光板２６２を透過した光束のみが検出光
として光検出器２６３に入射する。

【００１０】検出系２６０に入射した戻り光束は、集光
レンズ群２６１によって標本２５０と共役な位置にある
遮光板２６２上のピンホール位置に光スポットを結ぶ
が、このとき不必要な戻り光成分は、ピンホール位置に
集光しないので遮光板により除かれ、走査点の像の必要
な戻り光成分のみが選択的にピンホールを通過する。

【００１１】ピンホールを通過した光（戻り光のうち必
要な蛍光成分）は、光検出器２６３により電気信号に変
換され、さらに画像処理を施されて標本２５０の明瞭な
画像として表示される。

【００１２】このようにコンフォーカル顕微鏡の特徴
は、光源から発せられた光束を標本上に照射してここか
らの戻り光を検出する際に、標本上の集光スポットの周
囲からの戻り光束や、ピントのズレた所からの戻り光束
等の不要光束がピンホール付き遮光部材により遮蔽され
るので、走査集光点の像の周囲にぼけた像が重なるのを
防ぐ点にある。

【００１３】また、前述した偏向光学系２３０は水平走
査用と垂直走査用の二つの光偏向器を含んでおり、これ
ら二つの光偏向器の配置方法として次に説明する二つの
方式がある。

【００１４】図３に一方の方式の配置である焦点リレー
配置を示す。これは、対物光学系４０ａの光偏向器側焦
点と共役な位置に二つの光偏向器３１ａ、３３ａを配置
する方式である。

【００１５】図４にもう一方の方式である焦点近配置を
示す。これは、これは走査光学系４０ｂの光偏向器側焦
点に近接して二つの光偏向器３１ｂ、３３ｂを配置する
方式であり、この図からも判るようにこの焦点近配置
は、全体の光学系が単純で小型化できるという利点があ
り多く採用されている。

【００１６】また、図５に光偏向器としてガルバノメー
ターミラーを用いたコンフォーカル顕微鏡の該略図を示
す。但し、簡略化のため図では一つの光偏向器のみを描
いている。このような光偏向器として、ガルバノメータ
ーミラー、ポリゴンミラー等の光の反射を用いたものが
挙げられるが、このような光の反射を用いた光偏向器
は、偏向角が波長にかかわらず一定であり、使い易いた
めに多く使用されている。

【００１７】一般に、コンフォーカル顕微鏡の中でもコ
ンフォーカル走査型蛍光顕微鏡、すなわち光源ユニット
からのレーザ光を励起光として標本に照射し、この励起
光により標本から発生する蛍光を検出するコンフォーカ
ル走査型顕微鏡は光軸方向に良好な分解能を有してい
る。

【００１８】これは、通常の蛍光顕微鏡にはない大きな
特徴であり細胞や生態組織等を立体的に観察する必要の
ある医学、生物学の分野では非常に有用である。さら
に、遮光板のピンホールを小さくすれば、より良い光軸
方向分解能を得ることができる。

【００１９】また、蛍光を使用するコンフォーカル走査
型顕微鏡においては、例えば、励起光が紫外光で戻り光
束が可視光の場合等のように、励起光の波長と戻り光束
の波長は異なっているため、対物レンズが軸上色収差及
び倍率収差を持つことがある。

【００２０】ここで、軸上色収差のある対物レンズ群を
コンフォーカル走査型蛍光顕微鏡に使用した時の励起光
及び蛍光の様子を図６（ａ）に示す。図６（ａ）中で励
起光は実線、蛍光は破線で示してある。

【００２１】図６（ａ）において、光源ユニット４１０
から出た励起光は、ダイクロイックミラー４２０により
反射されて偏向光学系４３０、対物光学系４４０を通
り、標本４５０上に集光する。標本４５０から出た蛍光
は対物光学系４４０、偏向光学系４３０、ダイクロイッ
クミラー４２０を通って集光レンズ群４６１により集光
され光スポットを結ぶ。

【００２２】しかし、軸上色収差のある対物レンズを用
いているため、蛍光の収束または発散の程度は励起光と
異なってしまい、スポット状に集光された光束は、図６
（ｂ）に示したように遮光板４６２で大きく拡がってし
まう。図６（ｂ）において破線で示した光スポット４７
０は、遮光板４６２の斜線で示した遮光部４６２Ａにま
で広がっている。

【００２３】このときの画像状態の模式図を図６（ｃ）
に示す。遮光板４６２のピンホール４６２Ｂを通って光
検出器４６３に到達する蛍光は、標本４５０から発せら
れた蛍光の一部であり、結果として検出される光量が減
少してしまうため、全体として標本４５０の暗い画像し
か得られていない。

【００２４】この軸上色収差による光量の減少を防ぐに
は、対物光学系の軸上色収差を光学系以外の部分で補正
しなければならない。最も容易にこれを行うには、図７
（ａ）に示したように、レーザ光源５１１とダイクロイ
ックミラー５２０の間またはダイクロイックミラー５２
０と遮光板５６２との間に軸上色収差補正レンズ５１３
を配置して標本５５０から出てくる蛍光が遮光板に集光
するように補正すればよい。

【００２５】図７（ｂ）に、このときの集光レンズ群５
６１側から見た遮光板上での蛍光の光スポット５７０を
示す。図において、破線で示した蛍光の光スポット５７
０は、遮光板５６２のピンホール５６２Ｂの中にすべて
はいる程充分小さく集光している。そのため、標本５５
０から発せられた蛍光の大部分が遮光板５６２のピンホ
ール５６２Ｂを通って光検出器５６３に到達するので検
出される光量は減少せず、図７（ｃ）に示したように標
本５５０の明るい画像が得られる。

【００２６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、軸上色
収差がある対物光学系を用いた場合の遮光板上での戻り
光のデフォーカスの問題は、上記のように補正レンズを
用いることで解決できるが、このようにして補正した場
合、光路偏向部材が瞳位置に配置されていないと図８に
示したような画像の中心部が長方形に明るくなり、それ
以外の部分は、暗くなるシェーディングが発生してしま
う。このシェーディングが激しいと、画像の周辺部は完
全に暗くなって観察できなくなる。

【００２７】また、対物光学系に倍率色収差がある場合
においても、同様にシェーディングが発生する。この場
合は、光偏向器の配置にかかわらず視野の周辺部が円形
に暗くなる状態になり、さらに軸上色収差によるシェー
ディングが激しい時と同様にシェーディングが激しい時
も画像の周辺が完全に暗くなって観察ができなくなる。

【００２８】本発明は、以上の問題点に鑑み、軸上色収
差や倍率色収差のある対物光学系を使用してもシェーデ
ィングが発生しないコンフォーカル顕微鏡を提供するこ
とを目的としている。

【００２９】

【課題を解決するための手段】請求項１の発明では、光
源と、光源から発せられた光の光路を偏向する光路偏向
部材を備えた偏向光学系と、偏向された光を標本上に集
光する対物光学系と、標本からの戻り光を対物光学系と
偏向光学系とを介して標本上の集光点と共役な位置に集
光し、さらにピンホール付き遮光部材を介して検出する
検出系とを備えたコンフォーカル顕微鏡において、遮光
部材のピンホールの大きさを偏向光学系による光路の移
動に伴って生じる戻り光の集光点の移動範囲を含む大き
さとすることにより前述の課題を達成した。

【００３０】又、請求項２の発明では、請求項１のコン
フォーカル顕微鏡において、ピンホールの形状をスリッ
ト状とした。

【００３１】更に、請求項３の発明では、請求項１又は
２のコンフォーカル顕微鏡において、前記ピンホールの
長さを以下のように特定した。即ち、この発明によるコ
ンフォーカル顕微鏡は、励起光を発する光源と、光源か
ら発せられた励起光の光路を偏向する光路偏向部材を備
えた偏向光学系と、励起光を標本上に集光する対物光学
系と、励起光により励起されて標本から発せられた戻り
光を対物光学系と偏向光学系とを介して集光レンズ群に
より標本上の集光点と共役な位置に集光し、さらにピン
ホール付き遮光部材を介して検出する検出系とを備えて
いる。

【００３２】ここで、対物光学系の戻り光波長による焦
点距離をＧ、対物光学系の励起光波長による焦点距離を
Ｆ、対物光学系の戻り光波長による光路偏向部材側の焦
点面と標本面の共役面との距離をＬ、対物光学系の励起
光波長による光路偏向部材側の焦点面と標本面の共役面
との距離をＫ、対物光学系の戻り光波長による光路偏向
部材側の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向面位置との
距離をＮ、対物光学系の励起光波長による光路偏向部材
側の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向面位置との距離
をＭ、集光レンズ群の光路偏向部材側焦点と光路偏向部
材の偏向面と光軸との交点との距離をＳ、集光レンズ群
の戻り光波長における焦点距離をＨ、光路偏向部材のビ
ーム偏向角をαとした時、光路偏向部材の偏向方向に対
するピンホールの長さＰが、次に示す（１）式を満たす
ように定められる。

【００３３】

【数３】

【００３４】この場合、前記Ｌ及び前記Ｋは、前記焦点
面に対して前記共役面が対物光学系と反対側にあるとき
を＋、同じ側にある時を−とし、前記Ｎ、前記Ｍ及び前
記Ｓは、前記焦点に対して交点が対物光学系と反対側に
あるときを＋、同じ側にある時を−とする。

【００３５】また、請求項４の発明では、請求項３のコ
ンフォーカル顕微鏡において、遮光部材上の戻り光のエ
アリーディスク直径をＤとした時、光路偏向部材の偏向
方向に対するピンホールの長さＰは、次に示す式を満た
すように定められる。

【００３６】

【数４】

【００３７】

【作用】先ず、コンフォーカル蛍光顕微鏡を例にして、
照射光と波長の異なる戻り光を検出する際に倍率色収差
によるシェーディングのおきる原理を簡単に説明する。

【００３８】図９（ａ）は、倍率色収差を持った対物光
学系を用いた時の励起光及び蛍光の集光の原理図であ
り、ここでは、説明を簡略化するために、対物光学系に
は軸上色収差は存在せず、倍率色収差のみが存在する場
合を想定している。この図において、実線は光源ユニッ
ト６１０から発せられた励起光（レーザ光）を示してお
り、破線は標本から発せられた戻り光のうち蛍光を示す
ものとする。

【００３９】また、偏向光学系を構成する光路偏向部材
６３１、６３３は、対物光学系６４０の偏向光学系側の
焦点位置及び前記焦点位置と共役な位置に配置されると
共に、それぞれ光軸に対して任意の角度を保って配設さ
れている。尚、図中では説明を簡単にするために一つの
光路偏向部材のみを示している。

【００４０】図９（ａ）において、光源６１０から発せ
られた励起光は、ダイクロイックミラー６２０により反
射されて偏向光学系に導かれる。このダイクロイックミ
ラー６２０は、光源ユニット６１０からの励起光（レー
ザ光）を反射して偏向光学系内の光路偏向部材６３１、
６３３に導くと共に、標本６５０から発せられた戻り光
（蛍光）を透過させて検出系内の集光レンズ群６６１に
導いている。

【００４１】また、ダイクロイックミラー６２０により
偏向光学系に導かれた励起光は、偏向光学系内のそれぞ
れの配設角度が可変に設けられた光路偏向部材６３１、
６３３により、光路を水平方向及び垂直方向に偏向され
た後、対物光学系に導かれて集光され標本６５０上を集
光スポットにより照射する。この集光スポットは、光路
偏向部材６３１、６３３の偏向量に応じて移動し、標本
６５０上を２次元走査することになる。

【００４２】そして、この集光スポットが照射された標
本６５０から蛍光が生じる。この標本６５０からの戻り
光（蛍光）は、対物光学系６４０を通り、光路偏向部材
６３１、６３３により照射光とは逆向きに偏向されて光
軸に沿う光束に変化される。

【００４３】しかし、対物光学系は倍率色収差を持って
いるため、対物光学系６４０の励起光波長に対する焦点
距離と蛍光波長に対する焦点距離とが異なり、そのた
め、光路偏向部材６３１、６３３への蛍光の入射角（破
線光路）は、光路偏向部材６３１、６３３から射出され
る励起光光束の射出角（実線光路）とは異なるものとな
る。

【００４４】従って、光路偏向部材６３１、６３３によ
り偏向されて集光レンズに向かう戻り光（蛍光）は、光
軸に対してある０でない角をなす光束としてダイクロイ
ックミラー６２０を透過し、検出系内の集光レンズ群６
６１に入射する。

【００４５】集光レンズ群６６１は光軸に沿って入射し
た光束を遮光部材に設けられたピンホール位置に集光さ
せるように配置されたものであるため、集光レンズ群６
６１に入射した戻り光（蛍光）は、ピンホール中心から
ずれた位置に集光されることになる。

【００４６】ここで、対物光学系６４０の励起光波長に
おける焦点距離をＦ、対物光学系６４０の戻り光（ここ
では蛍光）波長における焦点距離をＧ、集光レンズ群６
６１の戻り光波長における焦点距離をＨ、光路偏向部材
６３１、６３３のビーム偏向角をα、励起光と光軸との
成す角をβ、戻り光と光軸の成す角をγとし、tan θを
θで近似した時、遮光部材上の戻り光スポット中心と光
軸上に位置するピンホール中心との距離Ｕは、次に示す
（３）式により表すことができる。 Ｕ＝Ｈ（β−γ）＝（１−Ｆ／Ｇ）Ｈα …（３）式

【００４７】この（３）式よりも明らかなように、倍率
色収差による遮光部材上の戻り光スポットの動き量Ｕ
は、光路偏向部材の偏向角αが大きいとき、すなわち走
査する部分（集光スポットが照射された位置）が標本の
周辺部になればなるほど大きくなる。

【００４８】従って、集光スポットの走査点（照射位
置）が標本の周辺部分になるにつれて、検出光である戻
り光（蛍光）は、遮光部材により遮光される割合が多く
なり、一部の光しか検出系に届かないこととなる。この
ため、この様な検出信号から得られる画像は図９（ｂ）
に示したような、標本の中心部が円形に明るく周辺部は
暗くなる円形シェーディングを起こしたものとなる。

【００４９】以上では、対物光学系に倍率色収差のみが
存在する場合を想定した場合について述べたが、上記の
ようなシェーディングは、対物光学系に倍率色収差が存
在する場合だけではなく、軸上色収差が存在する場合に
おいても発生する。以下、軸上色収差によるシェーディ
ングのおきる原理を簡単に説明する。

【００５０】図１０（ａ）及び図１０（ｂ）は、軸上色
収差を持った対物光学系を用いた時の励起光及び蛍光の
集光の原理図である。ここでは、説明を簡略化するため
に対物光学系には倍率色収差は存在せず、軸上色収差の
みが存在する場合を想定している。また、前述の場合と
同様に偏向光学系は、実際には二つの光路偏向部材を備
えているものであるが、両図中には一つの部材として表
している。

【００５１】図１０（ａ）及び図１０（ｂ）において、
実線は励起光（レーザ光）、破線は戻り光（蛍光）を表
わしており、光源ユニットより発せられた励起光を、点
光源から発せられたものとして表わしている。この場
合、対物光学系に倍率色収差は存在しないので励起光波
長による焦点距離と蛍光波長による焦点距離は変わらな
いが、軸上色収差があるため光路偏向部材側の励起光の
焦点と蛍光の焦点は一致せず、同一の直線上に存在して
いる。

【００５２】一般に、標本のある平面上における励起光
の集光点位置Ｐと光軸位置Ｏとの距離ＰＯは、対物光学
系の励起光波長による焦点距離と、点光源より発して対
物光学系の光路偏向部材側の焦点と共役な位置を通る光
線と光軸とがなす角δにより、ｙ＝ｆ・ｔａｎφの式を
用いて容易に計算される。

【００５３】図１０（ａ）は、光路偏向部材７３１、７
３３の偏向角が０の時の励起光及び戻り光（蛍光）の集
光の様子を示している。光軸上の点光源７１０より発し
た励起光は、光路偏向部材７３１、７３３により反射さ
れて対物光学系７４０に入射し、標本７５０上に集光さ
れて光スポットを作る。

【００５４】この場合、光路偏向部材７３１、７３３の
偏向角が０であるので、対物光学系７４０の光路偏向部
材７３１、７３３側の焦点７４０Ａと共役な点７４０Ｂ
は光軸上にあり、点光源７１０より発して点７４０Ｂを
通る光線と光軸がなす角もまた０（光軸に沿って進行す
る）である。従って、標本７５０上の集光点位置Ｐと光
軸位置Ｏとの距離は、対物光学系７４０の焦点距離にか
かわらず０である。

【００５５】さらに、標本７５０の光軸上の励起光の集
光点位置（Ｐ）から発せられた戻り光（蛍光）は、対物
光学系７４０を通り、光路偏向部材７３１、７３３によ
り反射されたあとに点７４０Ｂを通る光線上に位置する
点７１７ａに集光する。

【００５６】即ち、光路偏向部材による偏向角が０のと
き、点７４０Ｂは光軸上に位置し、励起光の集光点位置
（Ｐ）から発せられて点７４０Ｂを通る戻り光（蛍光）
の主光線と光軸がなす角度は０である。

【００５７】このため、戻り光（蛍光）の集光点７１７
ａも光軸上に位置するが、対物光学系７４０の軸上色収
差のため、励起光とは異なる波長の戻り光（蛍光）の集
光点７１７ａと点光源７１０とは一致せず、光軸方向に
所定の距離だけ離れている。

【００５８】一方、図１０（ｂ）には、光路偏向部材７
３１、７３３の偏向角（点光源から発せられて光路偏向
部材７３１、７３３の偏向面と光軸との交点を通り対物
光学系７４０に入射する光線が光軸となす角）がθ（但
し、θ≠０）の時の励起光及び戻り光の集光の様子を示
している。上述の場合と同様に光軸上の点光源７１０よ
り出射された励起光は、光路偏向部材７３１、７３３に
より偏向（反射）されて対物光学系７４０に入射し、標
本７５０上の光軸以外の位置に集光されて光スポットを
結ぶ。

【００５９】標本７５０上に作られた励起光の集光点位
置から発せられた戻り光（蛍光）は、対物光学系７４０
を通り、光路偏向部材７３１、７３３により励起光とは
逆向きに偏向（反射）された後に集光する。

【００６０】ここで、倍率色収差がないと想定したこと
により、光偏向部材側での励起光の焦点と戻り光（蛍
光）の焦点とは、共に点光源７１０と点７４０Ｂとを通
る同一直線上にある。そして、光路偏向部材７３１、７
３３が、対物光学系の焦点位置７４０Ａとは異なる位置
７３０Ａに配設され、かつ光偏向部材による偏向角が０
でないため、点７４０Ｃは光軸外に位置する。

【００６１】このため、光偏向部材側での励起光の主光
線と戻り光（蛍光）の主光線は、光軸に対して任意の角
度（ε）だけ傾くこととなり、点光源７１０と点７４０
Ｃとはこの光軸に対して傾いた主光線上にあるので、戻
り光（蛍光）の集光点７１７ｂは、光軸外に位置するこ
とになる。

【００６２】従って、点７１７ｂに集光する戻り光を検
出光学系内部の集光レンズ群により集光させても、その
集光点はやはり光軸外に中心を持つものとなり、遮光板
にピンホール以外の部分で遮光されて検出できない部分
が生じてしまう。

【００６３】又、水平方向の光路偏光部材と対物光学系
の焦点との距離と、垂直方向の光路偏光部材と対物光学
系の焦点との距離が異なれば、水平方向の横ずれ量と垂
直方向の横ずれ量も異なる。

【００６４】従って、標本の水平方向を走査した時と垂
直方向を走査した時では検出系に到達する光量の減少の
仕方も異なるため、倍率色収差のみが存在する場合では
円形であったシェーディングの形状は、軸上色収差のみ
が存在する場合では長方形になる。

【００６５】図１０（ａ）及び図１０（ｂ）では、原理
的な説明のため、励起光、蛍光の両方を光路偏向部材７
３１、７３３側で収束する光線として表わしているが、
以上の説明は励起光または蛍光が平行光または発散光の
場合にも成り立つ。

【００６６】図１１（ａ）は、実際のコンフォーカル走
査型蛍光顕微鏡の構成図である。図において、対物レン
ズ群８４３を含む対物光学系８４０の軸上色収差をレー
ザ光源８１１とダイクロイックミラー８２０の間に設け
られた軸上色収差補正レンズ８１３によって補正されて
いるが、光路偏向部材８３１、８３３が瞳位置に一致し
ていない場合の原理図である。この構成では、標本８５
０の走査のために光路偏向部材８３１、８３３の偏向角
が変わると遮光板８６２上での蛍光スポットの位置が移
動する。

【００６７】図１１（ｂ）に、このときの集光レンズ群
８６１側から見た遮光板８６２上での蛍光スポット８７
０を示す。蛍光スポット８７０の位置が移動して遮光板
８６２のピンホール８６２Ｂからはずれると光検出器に
到達する光量が減少しシェーディングがおきる。

【００６８】焦点リレー配置の場合、二つの光路偏向部
材８３１、８３３は、共に対物光学系８４０の光路偏向
部材８３１、８３３側焦点にある。従って、光路偏向部
材８３１、８３３と対物光学系の光路偏向部材８３１、
８３３側焦点との距離が小さいので遮光板８６２上での
蛍光スポットの位置変化も小さく、シェーディングは目
立たないが、蛍光スポットの位置は、光路偏向部材８３
１、８３３の偏向角の変化に伴いわずかに移動してい
る。

【００６９】また、焦点近接配置の場合、水平方向の光
路偏向部材８３１、８３３と対物光学系８４０の光偏向
側焦点との距離は、垂直方向の光路偏向部材８３１、８
３３と対物光学系８４０の光路偏向部材８３１、８３３
側の焦点との距離とは異なる。そのため、標本８５０の
水平方向を走査した時の蛍光スポットの移動量と垂直方
向を走査した時の蛍光スポットの移動量も異なる。

【００７０】従って、標本の８５０の水平方向を走査し
た時と垂直方向を走査した時では光検出器８６３に到達
する光量の減少の仕方も異なるため、従来のような円形
のピンホールであるとシェーディングの形状は上述した
ように長方形になる。

【００７１】以上説明したようなシェーディングのない
画像を得るために、本発明のコンフォーカル顕微鏡にお
いては、遮光部材が光路偏向部材による光路の移動に伴
って生じる戻り光の集光点位置の移動範囲を含む大きさ
のピンホールを備えている。

【００７２】そのため、標本上の集光点と共役な位置に
集光された蛍光スポットの位置が光軸中心から移動して
も遮光部材によって遮られることがないので、検出光の
減少によるシェーディングが発生せず良好な画像を得る
ことができる。従って、蛍光を基にした高精度のイオン
定量が可能になる。

【００７３】また、軸上色収差や倍率色収差の許容量が
拡がるため、コンフォーカル走査型顕微鏡用の対物レン
ズの設計が容易になる。さらに好ましくは、前記ピンホ
ールの形状を図１（ｂ）に示したようなスリット状のも
のとすることにより、ピンホールの開口面積がさらに小
さくなり、シェーディングの発生を抑止すると共に光軸
方向分解能をさらに向上させることができる。

【００７４】ここで、対物光学系に倍率色収差は存在せ
ず、軸上色収差のみが存在する場合の標本の走査のため
に移動する遮光部材上の戻り光スポット中心の光軸から
の動き量Ｖは、対物光学系の光路偏向部材側での戻り光
（蛍光）波長による焦点面と標本面の共役面との距離を
Ｌ（但し、焦点面に対して共役面が対物光学系と反対側
にあるときを＋、同じ側にある時を−とする。）、対物
光学系の励起光波長による光路偏向部材側の焦点面と標
本面の共役面との距離をＫ（但し、焦点面に対して共役
面が対物光学系と反対側にあるときを＋、同じ側にある
時を−とする。）、対物光学系の戻り光波長による光路
偏向部材側の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向面位置
との距離をＮ（但し、焦点に対して交点が対物光学系と
反対側にあるときを＋、同じ側にある時を−とす
る。）、対物光学系の励起光波長による光路偏向部材側
の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向面位置との距離を
Ｍ、集光レンズ群の光路偏向部材側焦点と光路偏向部材
の偏向面と光軸との交点との距離をＳ（但し、焦点に対
して交点が対物光学系と反対側にあるときを＋、同じ側
にある時を−とする。）、集光レンズ群の戻り光波長に
おける焦点距離をＨ、光路偏向部材のビーム偏向角をα
とした時、次に示す（４）式で表すことができる。

【００７５】

【数５】

【００７６】実際に用いられている対物光学系には倍率
色収差と軸上色収差との両方が存在するので、（３）式
及び（４）式より、戻り光スポットの移動量Ｗは、次に
示す（５）式で表すことができる。

【００７７】

【数６】

【００７８】従って、請求項３の発明では、光路偏向部
材の偏向方向に対するピンホールの長さＰが、戻り光ス
ポットの移動量Ｗよりも大きな値となるようにしてい
る。即ち、光路偏向部材の偏向方向に対して遮光部材上
に設けたピンホールの長さＰは、次に示す（１）’式を
満たすものとしている。

【００７９】

【数７】

【００８０】この場合、光路偏向部材の作用により標本
上の集光スポットの移動に伴い、検出系における戻り光
の集光スポットが移動しても、遮光部材上に集光された
戻り光がすべてピンホールを通過できるため、標本上の
（走査）位置によらず常に戻り光が適正に検出される。
このため、観察画像にシェーディング等が生じない優れ
た検査特性を持つコンフォーカル顕微鏡が構築されるこ
ととなる。

【００８１】また、光路偏向部材の偏向方向に対するピ
ンホールの長さＰが大きくなればなる程、視野周辺部で
の検出光量が増加して明るい画像を得ることができる。
ピンホールの長さＰが大きくなるに伴って光軸方向分解
能が低下するが、光軸方向分解能の低下よりも光量を得
たい場合では、光路偏向部材の偏向方向に対するピンホ
ールの長さＰを所望の光量が得られるまで大きくするこ
とも考えられる。

【００８２】しかし、一般的に光軸方向分解能が低下す
ることは好ましくないため、請求項４に記載した発明で
は、光路偏向部材の偏向方向に対するピンホールの長さ
Ｐを、以下に示す（２）’式を満たすものとしている。

【００８３】

【数８】

【００８４】（但し、Ｄは、遮光部材上での蛍光のエア
リーディスク直径であり、この遮光部材上での蛍光のエ
アリーディスク直径Ｄは、蛍光の波長λ、集光レンズの
遮光部材側での開口数ＮＡにより、Ｄ＝１．２２λ／Ｎ
Ａで定義されるものである。）

【００８５】即ち、請求項４の発明では、光路偏向部材
の偏向方向に対するピンホールの長さＰを、戻り光スポ
ットの移動量Ｗよりも大きな値とするだけでなく、戻り
光スポットの移動量Ｗに遮光部材上での戻り光のエアリ
ーディスク直径Ｄを加えた値よりも小さくなるように規
定している。

【００８６】このように、戻り光スポットの移動量Ｗに
遮光部材上での戻り光のエアリーディスク直径Ｄを加え
た値とすることによって、戻り光スポットが光軸から最
も離れた時でも戻り光の大部分がピンホールを通過でき
るので、検出系に到達する光量が減少しないだけでな
く、光軸方向の分解能が低下することがない。従って、
シェーディングにない良好な画像を得ることができる。

【００８７】従って、標本上に照射された集光スポット
の位置が光軸対応位置から離れた何れの位置であっても
遮光部材上での戻り光スポットが遮られることがないた
め、例えば、戻り光（蛍光）を基にしたイオン定量等の
測定を行う場合にも、画像面内全般で十分に高い精度を
発揮することができる。

【００８８】また、対物光学系の軸上色収差や倍率色収
差に対する許容量が広がるため、対物光学系の設計が容
易になる。

【００８９】尚、以上の軸上色収差と倍率色収差による
シェーディングは、戻り光のうちの蛍光に限らず、例え
ばラマン散乱光等の光源からの光と標本から発する光の
波長が異なる時等にも起こる可能性があり、このように
照射波長とは異なる波長の戻り光を検出する場合には、
本発明により充分な効果を上げることができる。

【００９０】

【実施例】図１に本発明の一実施例に係るコンフォーカ
ル走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示すが、対物光学系の
軸上色収差並びに倍率色収差は、従来使用していたもの
と同程度であり、特に格段の補正はなされていないもの
を使用している。

【００９１】本実施例では、標本としてラットの心臓伸
縮性細胞を用意し、この細胞内のカルシウムイオンの観
察を行うことを目的としている。細胞内のカルシウムイ
オンを観察するために、蛍光試薬ＩＮＤＯ−１を用いて
いる。

【００９２】このＩＮＤＯ−１は、紫外光により励起さ
せると光量比がカルシウムイオンの量により変化する二
つの波長の蛍光が得られる。この二つの蛍光の波長は４
０５ｎｍ及び４８５ｎｍであり、これらの二種類の波長
の蛍光の光量比からカルシウムイオン量を求めることが
できる。

【００９３】本実施例では、光源からのレーザ光の波長
による対物光学系の焦点距離（Ｆ）を−０．９７３ｍ
ｍ、蛍光波長による対物光学系の焦点距離（Ｇ）を−
０．９７１ｍｍ、対物光学系の蛍光波長による光路偏向
部材側の焦点面と標本面の共役面との距離（Ｌ）を−５
２９０ｍｍ、対物光学系のレーザ光波長による光路偏向
部材側の焦点面と標本面の共役面との距離（Ｋ）を−５
００ｍｍ、対物光学系の蛍光波長による光路偏向部材側
の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向面位置との距離
（Ｎ）を２．２７ｍｍ、対物光学系のレーザ光波長によ
る光路偏向部材側の焦点と光路偏向部材の光軸での偏向
面位置との距離（Ｍ）を２．３１ｍｍ、集光レンズ群の
光路偏向部材側焦点と光路偏向部材の偏向面と光軸との
交点との距離（Ｓ）を１５８０ｍｍ、集光レンズ群の蛍
光波長における焦点距離（Ｈ）を３８１ｍｍ、光路偏向
部材のビーム偏向角（α）を０．１８２ｒａｄ、遮光板
上でのエアリーディスク直径（Ｄ）を０．１２７ｍｍと
し、これらより、光路偏向部材の偏向方向に対するピン
ホールの長さＰを上記（２）式より決定し、即ち、Ｐ＝
０．７４６ｍｍとなるように遮光板にピンホール６２Ｂ
を設けた。

【００９４】又、この実施例では、光源として水冷の紫
外Ａｒレーザを使用し、この光源から発せられる波長３
５１ｎｍのレーザ光を励起光として用いている。レーザ
光源１１から発せられたレーザ光は、ビームエキスパン
ダ１２及び対物光学系の軸上色収差補正レンズ群１３を
通過した後、ダイクロックミラー２０に入射する。

【００９５】ダイクロックミラー２０は、レーザ光源１
１から発せられたレーザ光の波長の光を反射し、それ以
外の波長の光を透過させる光路分割手段の役割を果たし
ており、ダイクロックミラー２０に入射したレーザ光
は、ここで反射されて、ガルバノミラーを用いた垂直方
向偏向器３１及び水平方向偏向器３３に入射する。

【００９６】垂直方向偏向器３１及び水平方向偏向器３
３は、入射したレーザ光を水平方向及び垂直方向に偏向
して、最終的に標本に照射させる励起光の照射位置を決
定するものであり、垂直方向偏向器３１及び水平方向偏
向器３３に入射したレーザ光は、水平方向及び垂直方向
に光路を偏向されて対物光学系４０のリレーレンズ群４
１と焦点投影レンズ群４２とを透過した後、光路折り曲
げミラー４４により反射されて対物レンズ群４３に入射
し、標本５０上にスポット状に集光される。

【００９７】標本５０上にスポット状に集光されたレー
ザー光は、垂直方向偏向器３１及び水平方向偏向器３３
の偏向角変化に応じて標本５０上を２次元走査する。こ
のとき、標本５０のレーザー光スポットにより照明され
た部分からは、前述した二種類の蛍光が発せられる。

【００９８】標本５０から発せられた蛍光は、戻り光と
なって対物レンズ群４３、光路折り曲げミラー４４、焦
点投影レンズ群４２、リレーレンズ群４１を、励起光
（レーザ光）とは逆の順番に通過した後、水平方向偏向
器３３、垂直方向偏向器３１に入射して光軸とほぼ平行
な光束に変換される。

【００９９】この状態で、標本５０から戻ってきた蛍光
は、ダイクロックミラー２０を通過して他の戻り光成分
（反射レーザ光等）と分離された後、集光レンズ群６１
に入射して遮光板６２上に集光される。

【０１００】前述したように、本実施例では、垂直方向
偏向器３１及び水平方向偏向器３３の偏向方向に対する
ピンホールが長手寸法Ｐ＝０．７４６ｍｍのスリット状
に形成されている。この様子を図１（ｂ）に示す。

【０１０１】図１（ｂ）よりも明らかなように、遮光板
６２上の蛍光スポットが移動して光軸から最も離れた位
置にある時でも大部分がピンホール６２Ｂを通過できる
ので、光検出器６３ａ、６３ｂに到達する光量が減少し
ないだけでなく、ピンホールの長さＰを遮光板上での蛍
光の集光点の動き量と遮光板上での蛍光のエアリーディ
スクの直径を加えた長さにしているため、光軸方向の分
解能が不必要に低下しないようになっている。

【０１０２】遮光板６２のピンホールを通過した蛍光
は、蛍光分光用の第２のダイクロックミラー６４に入射
して波長域別に分けられる。この場合、蛍光分光用ダイ
クロックミラー６４により反射された蛍光と、ダイクロ
ックミラー６４を通過した後に、光路折り曲げミラー６
５により反射された蛍光とは、それぞれバリアフィルタ
６６、６７に入射する。

【０１０３】それぞれのバリアフィルタ６６、６７に入
射した蛍光は、ここで僅かに残った励起光や異なる波長
成分の蛍光を除去された後、それぞれ光検出器６３ａ、
６３ｂに入射して、波長域別の蛍光成分として検出され
ている。

【０１０４】そして、これらの光検出器６３ａ、６３ｂ
からの検出信号は、ＣＰＵ（図示せず）に送られ、ここ
で二種類の波長の蛍光の光量比が算出されると共に、画
像処理がなされる。この処理により、標本５０のカルシ
ウムイオン量が算出され、更に検査面の画像が表示され
る。

【０１０５】従って、レーザースポットにより照明され
た標本５０から発せられる蛍光は、標本５０上の何れの
位置からのものであっても、遮光部材６２により遮られ
ることなく検出されるので、この検出信号に基づいて系
により画像処理を施した時にシェーディングのない明る
い画像面が得られると共に、二つの波長の蛍光量の比か
ら生体中のカルシウムイオンの分布が極めて高精度に定
量的に測定することができる。

【０１０６】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、簡単な構
成で且つ、軸上色収差や倍率色収差の残る対物レンズ群
を使用してもシェーディングが発生しない画像を得るこ
とができる。

【０１０７】さらに、コンフォーカル顕微鏡の大きな特
徴である光軸方向に対する良好な分解能が損なわれるこ
となく、検出光量を増大させるとともに、標本上のレー
ザースポットの走査位置によらず常に必要な検出光が得
られるので、これらの検出光に基づいて検査領域の全域
に亘り良好な画像情報が得られ、これらの検出信号に基
づいて高精度のイオン定量測定等の光分析が可能であ
る。

【０１０８】また、軸上色収差や倍率色収差の許容量が
拡がるため、コンフォーカル顕微鏡の対物レンズ群（対
物光学系）の設計が容易になり、光学設計上の自由度が
広がると共に、製造コストを安価に抑えることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）は、本発明の一実施例に係るコンフォー
カル顕微鏡の概略構成を示す説明図であり、（ｂ）は、
対物レンズ群側から見た本発明の遮光板と蛍光スポット
の断面図である。

【図２】従来のコンフォーカル顕微鏡の概略構成を示す
説明図である。

【図３】コンフォーカル顕微鏡の偏向光学系が、焦点リ
レー配置である場合の概略構成図である。

【図４】コンフォーカル顕微鏡の偏向光学系が、焦点近
接配置である場合の概略構成図である。

【図５】コンフォーカル顕微鏡において、光路偏向部材
としてガルバノメーターミラーを用いた場合の光路図で
ある。

【図６】（ａ）は、従来のコンフォーカル蛍光顕微鏡に
おいて、対物レンズ群が軸上色収差を持っている時の励
起光及び蛍光の集光の原理図であり、（ｂ）は、この時
の対物光学系側から見た遮光板状の蛍光の様子を示した
模式図であり、（ｃ）はこの時得られた画像の模式図で
ある。

【図７】（ａ）は、従来のコンフォーカル蛍光顕微鏡に
おいて、対物レンズ群の軸上色収差を補正した時の光路
図であり、（ｂ）は、この時の対物光学系側から見た遮
光板状の蛍光の様子を示した模式図であり、（ｃ）はこ
の時得られた画像の模式図である。

【図８】従来のコンフォーカル蛍光顕微鏡において、対
物レンズ群の軸上色収差を補正してはいるが、光路偏向
部材が瞳位置に配置されていない時に得られる画像の模
式図である。

【図９】（ａ）は、コンフォーカル走査型蛍光顕微鏡に
おいて、対物光学系が倍率色収差のみを持っており光路
偏向部材による偏向角がθ（但し、θ≠０）の時の励起
光及び蛍光の集光の原理図であり、（ｂ）は、この時得
られた画像の模式図である。

【図１０】コンフォーカル走査型蛍光顕微鏡において、
対物光学系が軸上色収差のみを持っている時の励起光及
び蛍光の集光の原理図で、（ａ）は光路偏向部材による
偏向角が０の時のものであり、（ｂ）は光路偏向部材に
よる偏向角がθ（但し、θ≠０）の時のものである。

【図１１】（ａ）は、実際のコンフォーカル蛍光顕微鏡
において、対物レンズ群の軸上色収差を補正してはいる
が、光路偏向部材が瞳位置に配置されていない時の光路
図であり、（ｂ）は、この時の対物光学系側から見た遮
光板状の蛍光の様子を示した模式図である。

【符号の説明】

１０、６１０ 光源ユニット ７１０ 光源ユニットと等価な点光源 １１、２１１ レーザー光源 １２、２１２ ビームエキスパンダ １３、５１３ 軸上色収差補正レンズ ７１７ａ 光路偏向部材の偏向角が０の時の光路偏向部
材側の蛍光の集光点 ７１７ｂ 光路偏向部材の偏向角がθ（但し、θ≠０）
の時の光路偏向部材側の蛍光の集光点 ２０、２０ａ、２０ｂ、２２０、６２０ ダイクロイッ
クミラー ３０ａ、３０ｂ、２３０ 偏向光学系 ３１、３１ａ、３１ｂ、３３１、６３１ 垂直方向光
路偏向部材 ３３、３３ａ、３３ｂ、３３３、６３３ 水平方向光
路偏向部材 ３２ａ リレー光学系 ７３０Ａ 光路偏向部材の反射面と光軸との交
点 ４０、４０ａ、４０ｂ、２４０、６４０ 対物光学系 ７４０Ａ 光路偏向部材の偏向角が０の時の対
物光学系光路偏向部材側の焦点 ７４０Ｂ 光路偏向部材の偏向角が０の時の対
物光学系の光路偏向部材側の焦点と共役な点 ７４０Ｃ 光路偏向部材の偏向角がθ（但しθ
≠０）の時の対物光学系の光路偏向部材側の焦点と共役
な点 ４１、４１ａ、４１ｂ、２４１ リレーレン
ズ群 ４２、２４２ 焦点投影レンズ群 ４３、２４３ 対物レンズ群 ４４、６５ 光路折り曲げミラー ５０、２５０ 標本 ６０、２６０ 光検出器ユニット ６１、２６１ 集光レンズ ６２、２６２ ピンホール付き遮光板 ６２Ａ ピンホール ６２Ｂ 遮光部 ６３ａ、６３ｂ、２６３ 光検出器 ６４ ダイクロックミラー ６６、６７ バリアフィルタ ７０ 遮光板上の蛍光スポット β 励起光の主光線と光軸のなす角 γ 蛍光の主光線と光軸のなす角 Ｕ 蛍光スポット中心とピンホール中心
との距離 ε 蛍光の主光線（及び励起光の主光
線）と光軸のなす角

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源と、光源から発せられた光の光路を
   偏向する光路偏向部材を備えた偏向光学系と、偏向され
   た光を標本上に集光する対物光学系と、標本からの戻り
   光を対物光学系と偏向光学系とを介して標本上の集光点
   と共役な位置に集光し、さらにピンホール付き遮光部材
   を介して検出する検出系とを備えたコンフォーカル顕微
   鏡において、 前記遮光部材が、前記偏向光学系による光路の移動に伴
   って生じる戻り光の集光点の移動範囲を含む大きさのピ
   ンホールを備えていることを特徴とするコンフォーカル
   顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記ピンホールの形状が、スリット状で
   あることを特徴とする請求項１に記載のコンフォーカル
   顕微鏡。
3. 【請求項３】 励起光を発する光源と、光源から発せら
   れた励起光の光路を偏向する光路偏向部材を備えた偏向
   光学系と、励起光を標本上に集光する対物光学系と、励
   起光により励起されて標本から発せられた戻り光を対物
   光学系と偏向光学系とを介して集光レンズ群により標本
   上の集光点と共役な位置に集光し、さらにピンホール付
   き遮光部材を介して検出する検出系とを備えたコンフォ
   ーカル顕微鏡において、 対物光学系の戻り光波長による焦点距離をＧ、 対物光学系の励起光波長による焦点距離をＦ、 対物光学系の戻り光波長による前記光路偏向部材側の焦
   点面と標本面の共役面との距離をＬ、 対物光学系の励起光波長による光路偏向部材側の焦点面
   と標本面の共役面との距離をＫ、 対物光学系の戻り光波長による光路偏向部材側の焦点と
   前記光路偏向部材の光軸上での偏向面位置との距離を
   Ｎ、 対物光学系の励起光波長による光路偏向部材側の焦点と
   前記光路偏向部材の光軸上での偏向面位置との距離を
   Ｍ、 集光レンズ群の光路偏向部材側焦点と、光路偏向部材の
   偏向面と光軸との交点との距離をＳ、 集光レンズ群の戻り光波長における焦点距離をＨ、 光路偏向部材のビーム偏向角をαとした時、 光路偏向部材の偏向方向に対するピンホールの長さＰ
   が、次に示す（１）式を満たすことを特徴とする請求項
   １又は２に記載のコンフォーカル顕微鏡。 【数１】
4. 【請求項４】 遮光部材上の戻り光のエアリーディスク
   直径をＤとした時、光路偏向部材の偏向方向に対するピ
   ンホールの長さＰが、次に示す（２）式を満たすことを
   特徴とする請求項３に記載のコンフォーカル顕微鏡。 【数２】