JPH07132087A - Ｐｃｒ法による遺伝高分子増幅方法 - Google Patents
Ｐｃｒ法による遺伝高分子増幅方法Info
- Publication number
- JPH07132087A JPH07132087A JP28284293A JP28284293A JPH07132087A JP H07132087 A JPH07132087 A JP H07132087A JP 28284293 A JP28284293 A JP 28284293A JP 28284293 A JP28284293 A JP 28284293A JP H07132087 A JPH07132087 A JP H07132087A
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- JP
- Japan
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- primer
- reaction solution
- dna
- pcr
- pmol
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＤＮＡまたはこれに由来する核酸発列をＰＣ
Ｒ増幅するに際し、反応溶液中の各オリゴヌクレオチド
・プライマー量を各々６ｐｍｏｌ／μｌ以下、好ましく
は２〜４ｐｍｏｌ／μｌの範囲とする。 【効果】 余分なプライマー断片を除去する必要がなく
なり、得られたＰＣＲ産物とそのまま次の解析プロセス
に供することが可能となる。
Ｒ増幅するに際し、反応溶液中の各オリゴヌクレオチド
・プライマー量を各々６ｐｍｏｌ／μｌ以下、好ましく
は２〜４ｐｍｏｌ／μｌの範囲とする。 【効果】 余分なプライマー断片を除去する必要がなく
なり、得られたＰＣＲ産物とそのまま次の解析プロセス
に供することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ＤＮＡまたはこれに
由来する核酸配列（以下、これらをまとめて遺伝高分子
と記載することがある）を増幅するための改良されたＰ
ＣＲ法に関するものである。
由来する核酸配列（以下、これらをまとめて遺伝高分子
と記載することがある）を増幅するための改良されたＰ
ＣＲ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年のバイオテクノロジー分野における
遺伝子操作技術の進歩には目ざましいものがあり、原核
生物からヒトを含めた真核生物にいたるあらゆる生命体
の遺伝子について、その構造と機能とを比較的容易に解
析することができるようになってきた。
遺伝子操作技術の進歩には目ざましいものがあり、原核
生物からヒトを含めた真核生物にいたるあらゆる生命体
の遺伝子について、その構造と機能とを比較的容易に解
析することができるようになってきた。
【０００３】なかでもＰＣＲ（Polymerase Chain React
ion ）法は、細菌等を用いたクローニング手続を介する
ことなく、目的とする遺伝高分子領域を試験管内で容易
に増やすことができることから、様々な研究分野で幅広
く使用されている。このＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラー
ゼ反応を利用した遺伝高分子の増幅法である。ＤＮＡポ
リメラーゼは一本鎖のＤＮＡ配列を鋳型としてそれに相
補的な配列を合成するが、その反応の開始には、鋳型Ｄ
ＮＡの３′側の部分配列に相補的な１５〜３０ヌクレオ
チドのプライマーが必要である。そして、ＰＣＲ法では
鋳型となる２本鎖ＤＮＡの増幅対象領域を挟む２種類の
プライマーを用いることにより、１回の反応でその領域
を倍化する。
ion ）法は、細菌等を用いたクローニング手続を介する
ことなく、目的とする遺伝高分子領域を試験管内で容易
に増やすことができることから、様々な研究分野で幅広
く使用されている。このＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラー
ゼ反応を利用した遺伝高分子の増幅法である。ＤＮＡポ
リメラーゼは一本鎖のＤＮＡ配列を鋳型としてそれに相
補的な配列を合成するが、その反応の開始には、鋳型Ｄ
ＮＡの３′側の部分配列に相補的な１５〜３０ヌクレオ
チドのプライマーが必要である。そして、ＰＣＲ法では
鋳型となる２本鎖ＤＮＡの増幅対象領域を挟む２種類の
プライマーを用いることにより、１回の反応でその領域
を倍化する。
【０００４】図１は、このＰＣＲ法の１反応サイクルを
例示した模式図であり、表１はその反応溶液組成の一例
である。このような反応溶液を試験管（またはチュー
ブ）に充填し、図１の反応ステップを繰り返せば、ｎサ
イクル後には鋳型ＤＮＡが２n−ｎ−１倍に増幅され
る。通常は、２０〜４０回のサイクルが普通である。
例示した模式図であり、表１はその反応溶液組成の一例
である。このような反応溶液を試験管（またはチュー
ブ）に充填し、図１の反応ステップを繰り返せば、ｎサ
イクル後には鋳型ＤＮＡが２n−ｎ−１倍に増幅され
る。通常は、２０〜４０回のサイクルが普通である。
【０００５】
【表１】
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】一般的なＰＣＲ法の場
合、表１の反応溶液組成にも示したように、過剰量のプ
ライマーを使用する。これは１本鎖の鋳型ＤＮＡに各プ
ライマーを効率よくアニーリングさせるためである。し
かしながら、このようにプライマーを多量に使用した場
合には、最終的に得られるＰＣＲ産物中に、増幅された
ＤＮＡ断片のほかにも未使用のプライマー断片が多く残
存することになる。
合、表１の反応溶液組成にも示したように、過剰量のプ
ライマーを使用する。これは１本鎖の鋳型ＤＮＡに各プ
ライマーを効率よくアニーリングさせるためである。し
かしながら、このようにプライマーを多量に使用した場
合には、最終的に得られるＰＣＲ産物中に、増幅された
ＤＮＡ断片のほかにも未使用のプライマー断片が多く残
存することになる。
【０００７】当然のことながら、その後の解析（たとえ
ば配列分析等）に必要なのは増幅されたＤＮＡ断片であ
り、プライマーは不要である。このため、従来はたとえ
ばプライマーを予めビオチン等により標識し余分なプラ
イマー断片を磁気ビーズに吸着させたり、あるいはＰＣ
Ｒ産物を膜フィルターで分別するなどしてプライマー断
片を除去しなければならなかった。
ば配列分析等）に必要なのは増幅されたＤＮＡ断片であ
り、プライマーは不要である。このため、従来はたとえ
ばプライマーを予めビオチン等により標識し余分なプラ
イマー断片を磁気ビーズに吸着させたり、あるいはＰＣ
Ｒ産物を膜フィルターで分別するなどしてプライマー断
片を除去しなければならなかった。
【０００８】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、ＰＣＲ産物中に余分なプライマー断
片が残存することのない新しいＰＣＲ法を提供すること
を目的としている。
されたものであり、ＰＣＲ産物中に余分なプライマー断
片が残存することのない新しいＰＣＲ法を提供すること
を目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ＤＮＡまたはこれに由来する核
酸配列をＰＣＲ増幅するに際して、反応溶液中の各オリ
ゴヌクレオチド・プライマー量を各々６ｐｍｏｌ以下と
する遺伝高分子増幅方法を提供する。またこの発明は、
上記反応溶液中の各オリゴヌクレオチド・プライマー量
を各々２−４ｐｍｏｌの範囲とすることを好ましい態様
としてもいる。
を解決するものとして、ＤＮＡまたはこれに由来する核
酸配列をＰＣＲ増幅するに際して、反応溶液中の各オリ
ゴヌクレオチド・プライマー量を各々６ｐｍｏｌ以下と
する遺伝高分子増幅方法を提供する。またこの発明は、
上記反応溶液中の各オリゴヌクレオチド・プライマー量
を各々２−４ｐｍｏｌの範囲とすることを好ましい態様
としてもいる。
【００１０】以下、この発明の構成について詳しく説明
する。この発明の遺伝高分子増幅方法は、使用する各オ
リゴヌクレオチド・プライマー量を６ｐｍｏｌ／μｌ以
下、より好ましくは２−４ｐｍｏｌ／μｌの範囲とする
ことを除き、表１に示した組成からなる通常の反応溶液
と、図１に示した反応サイクルを用いて鋳型ＤＮＡを増
幅する。
する。この発明の遺伝高分子増幅方法は、使用する各オ
リゴヌクレオチド・プライマー量を６ｐｍｏｌ／μｌ以
下、より好ましくは２−４ｐｍｏｌ／μｌの範囲とする
ことを除き、表１に示した組成からなる通常の反応溶液
と、図１に示した反応サイクルを用いて鋳型ＤＮＡを増
幅する。
【００１１】反応溶液を構成する各材料については特段
の制限はないが、それらを例示すれば、たとえば以下の
通りである。まず、鋳型ＤＮＡとしては、あらゆる生物
の細胞、組織から通常の方法で調製したゲノムＤＮＡま
たはそれらに由来するｃＤＮＡ等の核酸配列を用いるこ
とができる。また、２種類のプライマーは、各々１５−
３０ヌクレオチドの配列を合成して用いることができ
る。ただし、その場合に、２つのプライマー間に相補的
または相同な配列がなく、しかもヘアピン様の２次構造
をとらないものを選択する必要がある。さらには、目的
外のＤＮＡ配列とのアニーリングを防ぐために目的とす
るＤＮＡ特有の配列であること、２つのプライマーが同
じ融解特性を持つことなども考慮する必要がある。な
お、このような条件を満たすプライマーを合成する場合
には、たとえば市販の検索用ソフトフェアーを用いるな
どしてもよく、あるいは特定のＤＮＡを増幅するための
市販プライマーを用いてもよい。
の制限はないが、それらを例示すれば、たとえば以下の
通りである。まず、鋳型ＤＮＡとしては、あらゆる生物
の細胞、組織から通常の方法で調製したゲノムＤＮＡま
たはそれらに由来するｃＤＮＡ等の核酸配列を用いるこ
とができる。また、２種類のプライマーは、各々１５−
３０ヌクレオチドの配列を合成して用いることができ
る。ただし、その場合に、２つのプライマー間に相補的
または相同な配列がなく、しかもヘアピン様の２次構造
をとらないものを選択する必要がある。さらには、目的
外のＤＮＡ配列とのアニーリングを防ぐために目的とす
るＤＮＡ特有の配列であること、２つのプライマーが同
じ融解特性を持つことなども考慮する必要がある。な
お、このような条件を満たすプライマーを合成する場合
には、たとえば市販の検索用ソフトフェアーを用いるな
どしてもよく、あるいは特定のＤＮＡを増幅するための
市販プライマーを用いてもよい。
【００１２】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、市販品のＴ
ａｇポリメラーゼやＶｅｎｔポリメラーゼを用いること
ができ、それらに合わせて反応用緩衝液を選択すればよ
い。また、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ）もそれぞれ市販品を用いることがで
きる。さらに図１に示したようなＰＣＲサイクルは、市
販のプログラム・インキュベーター装置を用いて自動的
に行なうことができる。また、その際の反応サイクルは
３０−５０回程度とする。
ａｇポリメラーゼやＶｅｎｔポリメラーゼを用いること
ができ、それらに合わせて反応用緩衝液を選択すればよ
い。また、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ）もそれぞれ市販品を用いることがで
きる。さらに図１に示したようなＰＣＲサイクルは、市
販のプログラム・インキュベーター装置を用いて自動的
に行なうことができる。また、その際の反応サイクルは
３０−５０回程度とする。
【００１３】このような組成からなる反応溶液を用いて
ＰＣＲサイクルを繰り返すことによって、この発明の方
法は、使用した各オリゴヌクレオチド・プライマーが全
反応サイクルを通じて全て鋳型ＤＮＡに順次アニール
し、消費されつくすため、最終的なＰＣＲ産物中に余分
なプライマー断片は残存せず、ＰＣＲ産物（増幅された
ＤＮＡ断片）を即、次の解析過程に供することができ
る。
ＰＣＲサイクルを繰り返すことによって、この発明の方
法は、使用した各オリゴヌクレオチド・プライマーが全
反応サイクルを通じて全て鋳型ＤＮＡに順次アニール
し、消費されつくすため、最終的なＰＣＲ産物中に余分
なプライマー断片は残存せず、ＰＣＲ産物（増幅された
ＤＮＡ断片）を即、次の解析過程に供することができ
る。
【００１４】次に、実施例を示したこの発明の方法をさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】実施例１ λファージλｇｔ１０にクローニングしたｃＤＮＡを、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたこの発明の方法によ
り増幅した。 （１）試料の調製 マイクロタイタープレート（Falcon３９１１）の各ウェ
ルに、１０ｍＭＭｇＣＯ4 を含むＣＹ−ブイヨン培地
（カザミノ酸１０ｇ；酵母エキス５ｇ；ＮａＣｌ３ｇ；
ＫＣｌ２ｇ）を１００μｌずつ分注し、λｇｔ１０のプ
ラークを１個ずつ植えつぎ、密封した状態で３７℃４−
６時間、溶解するまで保温したのち、２２００ｒｐｍで
１５−２０分間遠心してその上清を回収した。
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたこの発明の方法によ
り増幅した。 （１）試料の調製 マイクロタイタープレート（Falcon３９１１）の各ウェ
ルに、１０ｍＭＭｇＣＯ4 を含むＣＹ−ブイヨン培地
（カザミノ酸１０ｇ；酵母エキス５ｇ；ＮａＣｌ３ｇ；
ＫＣｌ２ｇ）を１００μｌずつ分注し、λｇｔ１０のプ
ラークを１個ずつ植えつぎ、密封した状態で３７℃４−
６時間、溶解するまで保温したのち、２２００ｒｐｍで
１５−２０分間遠心してその上清を回収した。
【００１６】このようにして、ｃＤＮＡを含むλファー
ジ粒子を回収した。 （２）オリゴヌクレオチド・プライマーの調製 ｃＤＮＡインサートの５′側、３′側の各々に接するλ
ｇｔ１０の塩基配列を合成してプライマー１，２を調製
した。 （３）反応溶液の調製 以下の組成からなる３種類の反応溶液（各々１０サンプ
ル分）を調製した。
ジ粒子を回収した。 （２）オリゴヌクレオチド・プライマーの調製 ｃＤＮＡインサートの５′側、３′側の各々に接するλ
ｇｔ１０の塩基配列を合成してプライマー１，２を調製
した。 （３）反応溶液の調製 以下の組成からなる３種類の反応溶液（各々１０サンプ
ル分）を調製した。
【００１７】 反応溶液（Ａ） １０×緩衝液（和光純薬） ２０．０μｌ １．５ｍＭｄＮＴＰ ２０．０μｌ 滅菌水 ６０．０μｌ ４．５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ４．５μｌ （和光純薬） 反応溶液（Ｂ） １０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー１ ３．０μｌ １０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー２ ３．０μｌ 滅菌水 ９４．０μｌ 反応溶液（Ｃ） ４．５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ／
１００μｌを含む１×ＰＣＲ緩衝液 （４）ｃＤＮＡの増幅 サーマル・サイクラーＰＨＣ−３（Techne社製）９６ウ
ェル マイクロタイタープレートの各ウェルにλファー
ジの培養上清０．５−１μｌを分注し、さらに反応溶液
（Ｂ）を１０μｌずつ分注したのち、ミネラル・オイル
で表面を覆い、９５℃で５分間以上保温して、ファージ
粒子を分解した。
１００μｌを含む１×ＰＣＲ緩衝液 （４）ｃＤＮＡの増幅 サーマル・サイクラーＰＨＣ−３（Techne社製）９６ウ
ェル マイクロタイタープレートの各ウェルにλファー
ジの培養上清０．５−１μｌを分注し、さらに反応溶液
（Ｂ）を１０μｌずつ分注したのち、ミネラル・オイル
で表面を覆い、９５℃で５分間以上保温して、ファージ
粒子を分解した。
【００１８】次いで、反応溶液（Ａ）を各ウェルに１０
μｌずつ分注し、ＰＨＣ−３により、変性（９５℃：３
０秒）、アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２
℃：１分）を１５サイクル、変性（９５℃：３０秒）、
アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２℃：２分）
を１５サイクル行った。さらに反応溶液（Ｃ）を各ウェ
ルに１０μｌずつ分注して、変性（９５℃：３０秒）、
アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２℃：１分）
を１０サイクル行なった。 （５）増幅したｃＤＮＡの配列分析 ＡＢｌ Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing キッ
ト〔AppliedBiosystems製〕を用いて上記ＰＣＲ産物の
塩基配列を分析した。その結果、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ
断片はほとんど目的とするｃＤＮＡであり、プライマー
配列は混入していなかった。
μｌずつ分注し、ＰＨＣ−３により、変性（９５℃：３
０秒）、アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２
℃：１分）を１５サイクル、変性（９５℃：３０秒）、
アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２℃：２分）
を１５サイクル行った。さらに反応溶液（Ｃ）を各ウェ
ルに１０μｌずつ分注して、変性（９５℃：３０秒）、
アニーリング（５５℃：１分）、伸長（７２℃：１分）
を１０サイクル行なった。 （５）増幅したｃＤＮＡの配列分析 ＡＢｌ Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing キッ
ト〔AppliedBiosystems製〕を用いて上記ＰＣＲ産物の
塩基配列を分析した。その結果、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ
断片はほとんど目的とするｃＤＮＡであり、プライマー
配列は混入していなかった。
【００１９】なお、コントロールとして、反応溶液
（Ｂ）中のプライマー量を１００ｐｍｏｌとして同様に
ＰＣＲ増幅した場合についても配列分析を行なったが、
これらのＰＣＲ産物中にはプライマー断片が残存してい
るため、正確な分析は不可能であった。
（Ｂ）中のプライマー量を１００ｐｍｏｌとして同様に
ＰＣＲ増幅した場合についても配列分析を行なったが、
これらのＰＣＲ産物中にはプライマー断片が残存してい
るため、正確な分析は不可能であった。
【００２０】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の方
法により、余分なプライマー断片を除去する必要がなく
なり、得られたＰＣＲ産物をそのまま次の解析プロセス
に供することが可能となる。
法により、余分なプライマー断片を除去する必要がなく
なり、得られたＰＣＲ産物をそのまま次の解析プロセス
に供することが可能となる。
【図１】ＰＣＲ法の１反応サイクルを例示した模式図で
ある。
ある。
Claims (2)
- 【請求項１】 ＤＮＡまたはこれに由来する核酸配列を
ＰＣＲ増幅するに際して、反応溶液中の各オリゴヌクレ
オチド・プライマー量を各々６ｐｍｏｌ／μｌ以下とす
る遺伝高分子増幅方法。 - 【請求項２】 反応溶液中の各オリゴヌクレオチド・プ
ライマー量を各々２−４ｐｍｏｌ／μｌの範囲とする請
求項１の遺伝高分子増幅方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28284293A JPH07132087A (ja) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Ｐｃｒ法による遺伝高分子増幅方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28284293A JPH07132087A (ja) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Ｐｃｒ法による遺伝高分子増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07132087A true JPH07132087A (ja) | 1995-05-23 |
Family
ID=17657784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28284293A Pending JPH07132087A (ja) | 1993-11-11 | 1993-11-11 | Ｐｃｒ法による遺伝高分子増幅方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07132087A (ja) |
-
1993
- 1993-11-11 JP JP28284293A patent/JPH07132087A/ja active Pending
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