JPH0713632B2

JPH0713632B2 - 疎水性の充填剤を使用するカラムクロマトグラフイ−の溶離液の循環使用方法

Info

Publication number: JPH0713632B2
Application number: JP60157050A
Authority: JP
Inventors: 広治小林
Original assignee: タマ生化学株式会社
Priority date: 1985-07-18
Filing date: 1985-07-18
Publication date: 1995-02-15
Anticipated expiration: 2010-02-15
Also published as: JPS6219759A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイ
ー用カラムを用い、極性溶媒に非極性溶媒を飽和量まで
の範囲の量添加したもので構成される溶離液でカラムク
ロマトグラフイーを行なう場合の溶離液の効果的な循環
使用方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイー用
カラムを用いて行なうカラムクロマトグラフイーでは、
水、メタノール、エタノール、プロパノール、アセト
ン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン
などの極性溶媒のうちの１種類の溶媒か、または２種類
以上の混合溶媒が溶離液として使用されており、水を含
む溶離液を使用するのが一般的である〔PHARM TECH JAP
AN Vol.1,No.1,25（1985）〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕しかし、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイー
用カラムを用いてカラムクロマトグラフイーを行なう場
合、上記のような極性の高い溶離液を溶質を得る目的で
蒸留、濃縮するためには、一般的に高い熱量と長時間を
要し、また溶離液が２種類以上の混合溶媒である場合、
蒸留、濃縮して回収した溶離液は、蒸留以前の溶質を含
まない溶離液と比較して組成が変わつてしまう場合が多
く、このため蒸留、濃縮して回収した溶離液を再びこの
溶離液を流出させたカラムの上部に注ぎカラムクロマト
グラフイーの溶離液として使用するためには、回収した
溶離液を構成する溶媒の組成をガスクロマトグラフイー
などによつて分析し、その上で溶離液の組成を回収する
以前の組成と同じにするために、例えば精留してそれぞ
れ単一の溶媒にした後、あらためて混合するか、または
新たに溶媒を添加して混合するなどしなければならなか
つた。かくして、蒸留、濃縮して回収した溶離液を、上
記のような操作を行なわず再び溶離液として使用するこ
とは難しかつた。

本発明はこの問題を解決し、疎水性の充填剤を充填した
クロマトグラフイー用カラムを用いてカラムクロマトグ
ラフイーを行なう場合の溶離液の効果的な循環使用方法
を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の問題点を解決するための本発明は、疎水性の充填
剤を充填したクロマトグラフイー用カラムを用い、１種
類または２種類以上の極性溶媒に非極性溶媒を飽和量ま
での範囲の量添加したものを溶離液として用いるカラム
クロマトグラフイーにおいて、上記カラムの下部から流
出する溶質を含んだ溶離液に、これと二相に分離する状
態となるように非極性溶媒を添加、接触させることによ
り溶離液中の溶質を非極性溶媒に移行、抽出させた後、
この非極性溶媒と溶離液とを分離し、溶質を抽出された
後の溶質を含まない溶離液を再び上記カラムの上部に注
ぎ、このカラム中の溶質を溶離させることを特徴とす
る、疎水性の充填剤を使用するカラムクロマトグラフイ
ーの溶離液の循環使用方法である。

本発明において、疎水性の充填剤としては、アルキル基
をシリカゲルに化学結合させた充填剤、スチレンとジビ
ニルベンゼンの共重合物を素材とした吸着樹脂、メタク
リル酸エステルやアクリル酸エステルを母体とする吸着
樹脂、またはシリカゲルにシリコンオイルや炭化水素類
を含浸させた充填剤などを使用することができる。そし
てこれらの充填剤のクロマトグラフイー用カラム（以
下、カラムという）への充填は、従来の充填方法である
湿式充填法、乾式充填法などによつて任意に充填するこ
とができる。

充填剤が充填されたカラムには溶離液を通液し、充填層
中の気泡を取り除くなどして、いわゆるカラムのコンデ
イシヨニングを行なつて分離精製の目的の成分を含む原
料の負荷に備える。

本発明で使用する溶離液としては、１種類の極性溶媒、
または２種類以上の極性溶媒の混合物、あるいはこれら
に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添加したものが用
いられる。

本発明ではカラムの下部から溶質を含んで流出するこれ
らの溶離液は、これと二相に分離する状態となるように
非極性溶媒を接触させることによつて、溶質を非極性溶
媒で抽出した後、溶離液を溶質を含む非極性溶媒と分離
し、この溶質を含まない溶離液を、クロマトグラフイー
用溶離液として再びカラムの上部にもどして循環して使
用するものであるので、溶離液は、循環使用している間
に組成の変化が少ないことが好ましく、また溶質の抽出
に使用する非極性溶媒と二相に分離するのがよく、両
液、すなわち溶離液と溶質の抽出に使用する非極性溶媒
を等量ずつ分液ロートに入れて分配した場合、溶離液側
の容量が全く変わらないか、または増すものが好まし
い。これは、例えば分配した際、溶離液側の容量が減る
場合には、溶離液を構成している溶媒が溶質の抽出に使
用する非極性溶媒によつて抽出されていることを示して
おり、この溶離液を循環使用すれば溶質の抽出を行なう
ごとに溶離液の組成が変化してしまうためであり、一
方、分配した後に溶離液の容量が増す場合には、抽出に
使用した非極性溶媒が溶離液に飽和した場合であるた
め、さらに循環使用しても溶離液の溶媒組成は変わらな
いからである。

溶離液として、１種類の極性溶媒または２種類以上の極
性溶媒の混合物に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添
加したものを使用するのは、非極性溶媒を添加すること
によつて、分離する目的の成分の分離効果を高めるため
であるが、溶離液に添加する非極性溶媒と、溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の種類が異なる場合は、溶離液と
溶質の抽出に使用する非極性溶媒とを分配した際に、溶
離液に添加する非極性溶媒が、抽出のための非極性溶媒
によつて抽出される場合があり、このような溶媒系で溶
離液を循環使用した場合には、溶離液から溶質の抽出を
行なうごとに溶離液の組成が変化してしまう恐れがある
ため、溶離液に添加する非極性溶媒としては、溶質の抽
出に使用する非極性溶媒と同じものを使用することが好
ましい。

このことから、本発明で使用する溶離液としては、循環
使用している間の組成の変化が少ないことが好ましいた
め、１種類の極性溶媒または２種類以上の極性溶媒の混
合物に溶質の抽出に使用する非極性溶媒と同じ非極性溶
媒を飽和量までの範囲の量添加したものを用いることが
好ましい。

本発明で溶離液として用いる極性溶媒の具体例として
は、例えば水、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、メチル
エチルケトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフラン、酢酸などの酸の水溶液、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどの塩基の水溶液を挙げることが
でき、これらのうちの１種類の溶媒か２種類以上の混合
溶媒を、分離する目的の物質に応じて適宜選択し、使用
することができる。

また、溶離液に添加する非極性溶媒、または溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の具体例としては、例えばｎ−ペ
ンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、
イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、
クロロホルム、ジクロルメタンなどを挙げることができ
る。

極性溶媒に非極性溶媒を添加した溶離液の調製には、例
えば選定した１種類または２種類以上の極性溶媒と、非
極性溶媒を分液ロートに入れ、振とうすることにより溶
離液を得ることができる。その際の液温はカラムクロマ
トグラフイーを行なう際のカラムの充填剤の充填層の温
度と同じてあることが好ましい。

カラムクロマトグラフイーは次のようにして行なう。即
ち、コンデイシヨニングが終了したカラムに分離精製の
目的の成分を含む原料を負荷し、上記のようにして調製
した溶離液をカラムに通液して溶離を開始する。そして
カラムの下部から流出する溶質を含む溶離液は一定量ず
つ分画し、それぞれ分液ロートを用いて分画した溶離液
量の1/10〜１倍量程度の非極性溶媒を１〜５回分ほどに
分けて添加し溶離液から溶出を行なうか、または連続抽
出装置などを使用してカラムの下部から流出する溶離液
から連続的に溶質を非極性溶媒で抽出する。この場合、
抽出に使用する非極性溶媒の量や、分液ロートを用いる
場合の抽出回数、また連続抽出装置を使用する場合の抽
出用非極性溶媒と溶離液の流量比などは、抽出用非極性
溶媒による溶離液からの溶質の抽出率などによつて決定
し、溶離液からの溶質の抽出は完全に行なわれることが
好ましい。

非極性溶媒で溶質を抽出した後、分液ロートを用いて抽
出した場合には、それぞれ分画された溶離液からの抽出
分ごとに、非極性溶媒を蒸留、濃縮して各分画分の溶質
を得、また、連続抽出装置などにより溶質を抽出した場
合には、連続抽出装置から溶質を抽出して流出する非極
性溶媒を一定量ずつ分画し、この非極性溶媒を蒸留、濃
縮して溶質を得、分画された溶質は、ガスクロマトグラ
フイー（GLC）、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
などによつて分析することによつて目的の成分を得るこ
とができる。

そして非極性溶媒によつて溶質が抽出された後の溶離液
は、再びカラム中の成分を溶離するべく、カラムの上部
から注ぎ入れ、カラムクロマトグラフイーの溶離液とし
て循環使用する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、疎水性の充填剤を充填したカラムを用
いるカラムクロマトグラフイーで使用する極性の高い溶
離液を直接蒸留、濃縮することなく容易に目的とする成
分を得ることができ、しかも使用する溶離液の組成を変
化させることなく効果的に循環して使用することができ
る。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制
限されるものではない。

実施例１スチレンとビニルベンゼンの共重合物を母体とする三菱
化成（株）製の非極性吸着樹脂セパビーズSP−207を、
直径3cm、高さ50cmのガラス製カラムに30cmの高さまで
充填した。

メタノールを溶離液として上記非極性吸着樹脂充填層に
流し込み、充填層の気泡を取り除き、充填層最上部がわ
ずかに露出するまで、このカラム下部から溶離液を流し
て止め、目的とするエイコサペンタエン酸エチルを42.6
％含有する脂肪酸エチル混合物2.1gを負荷した。このも
のはガスクロマトグラフイー（以下、GLCという）によ
る分析の結果、エイコサペンタエン酸エチルの他に20種
類ほどの脂肪酸エチルが含まれていた。

カラム下部から溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合物
を完全に樹脂層にしみ込ませて溶離液の流出を止めた。
カラムの充填層上部の空間に溶離液を流し込みながら溶
離液をこのカラム下部から毎分1.8mlの流速で流出さ
せ、初めの50mlを三角フラスコに取り、続けて流出して
くる溶離液を別の三角フラスコに取つた。そして初めの
50mlの溶離液を分液ロートに入れ、溶離液量の約1/3の
量である16mlのｎ−ヘキサンで３回、合計48mlのｎ−ヘ
キサンで溶質の抽出を行ない、この48mlのｎ−ヘキサン
を蒸留、濃縮して第１画分の溶質を得た。一方、溶質が
抽出された後の溶離液は再びカラム上部に流し込み、カ
ラムクロマトグラフイーを続け、このようにして第８画
分までの溶質を得た。これらの画分をGLCによつて分析
した結果、目的とするエイコサペンタエン酸エチルは、
第５画分と第６画分に分画されており、それぞれの含有
率は82.3％および84.2％、また収量は0.23gおよび0.20g
であつた。

なお、上記実施例中のGLCの分析は下記の条件で行な
い、面積百分率で含有率を表示した。

GLC分析条件充填剤：液相DEGS−ST〔ガスクロ工業（株）製〕10％担体UniportHP〔ガスクロ工業（株）製〕60〜80メツシ
ユカラム:3mmφ×2mガラスカラムカラム温度:200℃ キヤリアガス：窒素検出器：水素炎イオン化検出器（F.I.D）実施例２直径3cm、高さ50cmのガラス製カラムに30cmの高さまで
スチレンとジビニルベンゼンの共重合物である三菱化成
（株）製の非極性吸着樹脂ダイヤイオンHP−20を充填し
た。

85％メタノール水1000mlと100mlのｎ−ヘキサンを２
の分液ロートに入れ、振とう、分配したところ、ｎ−ヘ
キサン飽和の85％メタノール水1038mlが得られた。

このｎ−ヘキサン飽和の85％メタノール水を溶離液とし
て上記非極性吸着樹脂層に流し込み、充填層の気泡を取
り除き、充填層最上部がわずかに露出するまで上記カラ
ムの下部から溶離液を流して止め、目的とするエイコサ
ペンタエン酸エチルを40％含有する脂肪酸エチル混合物
6.4gを負荷した。このものは、GLCによる分析の結果、
エイコサペンタエン酸エチル40％の他に、20種類ほどの
脂肪酸エチルを合計60％含んでいた。カラムの下部から
溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合物を完全に樹脂層
にしみ込ませて溶離液の流出を止めた。ついでカラムの
充填層上部の空間に溶離液を流し込みながら溶離液をこ
のカラムの下部から毎分18mlの流速で流出させ、初めの
500mlを三角フラスコに取つた。続けて流出してくる溶
離液を別の三角フラスコに取つた。そして、初めの500m
lの溶離液を１の分液ロートに入れ、溶離液量の1/10
の量である50mlのｎ−ヘキサンで３回、合計150mlのｎ
−ヘキサンで溶質の抽出を行ない、この150mlのｎ−ヘ
キサンを蒸留、濃縮して第１画分の溶質を得た。

一方、溶質が抽出された後の溶離液は、再びカラムの上
部に流し込みカラムクロマトグラフイーを続け、上記と
同様にして第12画分までの溶質を得た。このようにして
得られた画分をそれぞれGLCによつて分析した結果、目
的とするエイコサペンタエン酸エチルは、第11と12画分
に分画されており、それぞれの含有率は96.3％および9
8.1％、また収量は1.3gおよび0.8gであつた。

なお、上記実施例中のGLC分析は実施例１と同じ条件で
行なつた。

実施例３アセトニトリル180ml、メタノール90ml、水30mlを分液
ロートに入れ、振とう、混合した後、これにｎ−ペンタ
ン30mlを加えて分配したところ、ｎ−ペンタン飽和のア
セトニトリル、メタノール、水の混合溶媒約310mlが得
られ、これを溶離液とした。

直径2.2cm、高さ50cmの中圧液体クロマトグラフイー用
ガラスカラムにオクタデシル基を化学結合により保持し
たシリカゲル系のカラムクロマトグラフイー用充填剤で
あるMERCK社製のLi Chroprep RP−18（15〜25μｍ）190
mlを上記の溶離液とともに湿式充填した。

目的とするエイコサペンタエン酸エチルを44.6％、ドコ
サヘキサエン酸エチルを24.1％含有し、その他に20種類
程度の脂肪酸エチルを合計31％含有することがGLC分析
によつて確認された脂肪酸エチル混合物3.8gを、上記カ
ラムの充填層最上部に負荷し、定量ポンプで3.5Kg/cm²
ほどの定圧で溶離液を送り込みながら、カラムの下部か
ら毎分1.8mlの流速で溶離液を流出させ、これを直径2c
m、高さ150cmの液々向流抽出装置のカラムの上部から下
部に向かつて流し、抽出のための溶媒であるｎ−ペンタ
ンを上記の液々向流抽出装置のカラムの下部から上部に
向かつて毎分0.6mlの流速で流して溶離液から溶質の抽
出を行なつた。

溶質がｎ−ペンタンによつて抽出され液々向流抽出装置
のカラムの下部から流出した溶離液は、再び上記のカラ
ムクロマトグラフイーの溶離液として使用し、溶質を抽
出して液々向流抽出装置のカラムの上部から流出するｎ
−ペンタンは、15mlずつでフラクシヨン１〜10まで分画
し、それぞれ蒸留し、溶媒を留去した後、GLC分析を行
なつた。GLC分析の結果、フラクシヨン７を蒸留、濃縮
して得られた画分は1.07gでエイコサペンタエン酸エチ
ルの含有率93.6％であり、またフラクシヨン９を蒸留、
濃縮して得られた画分は0.48gで、ドコサヘキサエン酸
エチルの含有率は96.2％であつた。

実施例４ 90％エタノール水400mlとシクロヘキサン200mlを分液ロ
ートに入れ、振とう、分配したところ、シクロヘキサン
飽和のエタノール水約512mlが得られ、これを溶離液と
した。

実施例３で使用したものと同じカラムに実施例３で使用
したものと同じカラムクロマトグラフイー用充填剤190m
lを上記溶離液とともに湿式充填して、コンデイシヨニ
ングを行なつた。

α−トコフエロルを30.5％、γ−トコフエロールを41.3
％、δ−トコフエロールを28.2％含有することをGLC分
析によつて確認したトコフエロール混合物5.7gを上記カ
ラムの充填層最上部に負荷し、定量ポンプで2.5Kg/cm²
ほどの定圧でカラムへの溶離液を送り込みながら、カラ
ムの下部から毎分1.0mlの流速で溶離液を流出させ50ml
で１分画とした。分画した溶離液は、１分画分ずつ分液
ロートに入れ、5mlずつのシクロヘキサンで３回、溶質
の抽出を行ない、溶質が抽出された後の溶離液は、再び
カラムクロマトグラフイーの溶離液として使用した。溶
質を抽出したシクロヘキサンは、蒸留、濃縮して溶質を
得た。

以上のようにして１〜20までの溶質画分、すなわちトコ
フエロール画分を得、それぞれGLC分析を行なつたとこ
ろ、第８画分ではα−トコフエロール含有率93.9％のも
のが1.3g、第11画分ではγ−トコフエロール含有率95.3
％のものが1.9g、第14画分ではδ−トコフエロール含有
率93.4％のものが1.2g得られた。

上記実施例中のGLC分析は、下記の条件で行ない、面積
百分率で含有率を表示した。

GLC分析条件充填剤：液相Silicone GE SE−30〔信和化工（株）製〕
1.5％担体Shimalite W〔信和化工（株）製〕80〜100メツシユカラム:3mmφ×2.1mガラスカラムカラム温度:260℃ キヤリアガス：窒素検出器：水素炎イオン化検出器（F.I.D.）実施例５ 80％ｎ−プロパノール水８とイソオクタン２を分配
したところ、9.2のイソオクタン飽和のｎ−プロパノ
ール水が得られ、これを溶離液とした。

直径5cm、高さ1mのガラス製カラムに、スチレンとジビ
ニルベンゼンの共重合物を母体とした三菱化成（株）製
の非極性吸着樹脂セパビーズSP−207を55cmの高さまで
充填し、上記の溶離液をこのカラムに流し込み、セパビ
ーズSP−207の充填層を溶離液で満たし、充填層中の気
泡を取り除いた後、充填層の最上部がわずかに露出する
までカラムの下部から溶離液を流出させた。

ブラシカステロール9.2％、カンペステロール28.3％、
スチグマステロール13.2％、β−シトステロール49.3％
を含有することがGLC分析によつて確かめられた植物ス
テロール混合物からβ−シトステロールを分離すること
を目的としてこの植物ステロール混合物9.8gを150mlの
ｎ−プロパノールに溶解し、カラムの内壁を伝わらせな
がらゆるやかに上記充填層上に注ぎ入れた。カラムの下
部から溶離液を毎分10mlの速度で流出させ、上記の植物
ステロール混合物のｎ−プロパノール溶液が、充填層に
完全に浸透したところで、溶離液の流出を止めた。この
充填層上に溶離液を注ぎ入れカラムの下部から毎分50ml
ずつ溶離液を流出させ、１分画分を２として、初めの
２を三角フラスコに取つた。続けて流出してくる溶離
液を別の三角フラスコに取つた。そして初めの２を分
液ロートに入れ、200mlずつのイソオクタンで３回、合
計600mlのイソオクタンで溶質の抽出を行なつた。

溶質の抽出が終了した溶離液は、再びカラムの上部に注
ぎ入れ、カラムの溶離液として使用し、このようにして
第１〜23番目までの分画を行なつた。これらは蒸留、濃
縮してイソオクタンを留去した後、それぞれGLC分析を
行なつた。GLC分析の結果、第20番目の画分はβ−シト
ステロール含有率が92.7％であることがわかつた。この
ものの収量は2.8gであつた。

GLC分析条件充填剤：液相Silicone OV−17〔西尾工業（株）製〕２
％担体Chromosorb W−HP〔西尾工業（株）製〕100〜120メ
ツシユカラム:3mmφ×2.1mガラスカラムカラム温度:270℃ キヤリアガス：窒素検出器：水素炎イオン検出器（F.I.D.）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフ
ィー用カラムを用い、１種類または２種類以上の極性溶
媒に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添加したものを
溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーにおい
て、上記カラムの下部から流出する溶質を含んだ溶離液
に、これと二相に分離する状態となるように非極性溶媒
を添加、接触させることにより溶離液中の溶質を非極性
溶媒に移行、抽出させた後、この非極性溶媒と溶離液と
を分離し、溶質を抽出させた後の溶質を含まない溶離液
を再び上記カラムの上部に注ぎ、このカラム中の溶質を
溶離させることを特徴とする、疎水性の充填剤を使用す
るカラムクロマトグラフィーの溶離液の循環使用方法。