JPH07140141A

JPH07140141A - 生体成分精製装置および遺伝子検査装置

Info

Publication number: JPH07140141A
Application number: JP28855593A
Authority: JP
Inventors: Hideichiro Yamaguchi; 秀一郎山口; Yukihiko Matsuura; 行彦松浦; Hiroshi Shimane; 博島根; Katsuaki Kikuchi; 克明菊地; Sadayuki Sakuma; 貞行佐久間
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1993-11-18
Filing date: 1993-11-18
Publication date: 1995-06-02

Abstract

(57)【要約】【目的】操作が簡単で、熟練を要せず、かつ効率のよ
いＤＮＡの抽出・精製・検査が可能であり、かつ細胞を
含む溶液を注入すると自動的に細胞からＤＮＡを取り出
し、目的のＤＮＡを分離分画してＤＮＡ検査を行うシス
テムを提供することを目的とする。【構成】第１分離手段１０によって細胞成分を分離し
た後、電場発生手段２０により高電圧パルスを印加して
細胞を破壊し、細胞破壊と同時に遺伝子を細胞核外にま
で飛び出させ、飛び出した遺伝子を第２分離手段３０に
て膜分離したのち、さらに高電圧パルスを印加して遺伝
子を小断片に切断する。小断片遺伝子は、電気泳動によ
り少量づつ分離しながら遺伝子検出手段に導かれて、Ｄ
ＮＡ測定がおこなわれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検査試料、特にヒトお
よび動物の細胞から、遺伝子、タンパク質、酵素等の生
体成分、特にゲノムＤＮＡを効率的に抽出・精製する装
置に関する。また、本発明は、検査試料、特にヒトおよ
び動物の細胞からゲノムＤＮＡを効率的に抽出・精製
し、得られたゲノムＤＮＡを同定するのに用いる遺伝子
検査装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子操作技術の目覚ましい発展
に伴い、種々の疾患を遺伝子レベルで解析することが可
能になりつつある。例えばフィコル（Ficoll）法のよう
な複雑な方法で抹消血管から採取された血液中の白血球
からゲノムＤＮＡを抽出した後、Dot blot 法、in situ
Hybridization 法、Southern blotting 法等の手法を
用いて解析し、遺伝子疾患等の診断を行うなどである。

【０００３】しかしながら、上記フィコル法は、「ヘパ
リン等の抗凝固剤を添加した血液に等量のリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ、ｐＨ 7.4）を加えて十分混和し、これを
分離剤を収容したスピッツ管に静かに注入して、希釈し
た血液試料を分離剤の上に重層し、４００ｇ３０分遠心
した後、白血球を含む中間層を採取してこれを別のスピ
ッツ管に採りＰＢＳを加えて混和し洗浄を行い、これを
今度は１６０ｇ１０分遠心し、さらに、上清を取り除き
ＰＢＳを加えて混和し１００ｇ１０分遠心するという操
作を２回繰り返した後、上清を取り除き必要とする溶媒
に浮遊させ、最後に顕微鏡で数を算定し、白血球の数を
必要数に調整する。」というものであり、操作が非常に
複雑であり、長時間を要し、また操作者の熟練を要する
ものであった。

【０００４】また、Dot blot 法およびin situ Hybridi
zation法は、測定操作が簡単で、操作時間が比較的短い
特長があるが、検出感度が低い問題がある。 Southern
blotting 法は、検出感度が高いが、操作が煩雑で長時
間かかる問題があり、十分な感度を得るためにＰＣＲ
法、ＬＣＲ法により被検査部位のＤＮＡを１０万〜１０
０万倍に増幅することがなされている。ＰＣＲ法は極め
て感度が高いが、コンタミネーション及び操作条件が複
雑である問題がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の遺伝子精製方法では、操作が複雑、煩雑であ
り、時間がかかるという問題があり、遺伝子検査装置に
あっては、多くの装置と複雑な操作、条件を必要とする
ため、コンタミネーションや読み取りミスが発生する問
題もあった。

【０００６】本発明は上記の事情に鑑みてなされたもの
で、操作が簡単で、熟練を要せず、かつ効率のよい生体
成分、特に遺伝子の抽出・精製・検査のための装置を提
供することを目的とし、細胞を含む溶液を注入すると自
動的に細胞からＤＮＡを取り出し、目的のＤＮＡを分離
分画してＤＮＡ検査を行うシステムを提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の解決すべき課題
は、検査試料から細胞成分を分離する第１分離手段と、
得られた細胞成分中の細胞を高電場で破砕し、前記細胞
から生体成分を抽出するための電場発生手段と、抽出さ
れた生体成分を前記細胞から分離するための第２分離手
段とを有し、前記電場発生手段は抽出された生体成分が
前記第２分離手段を通過するように導くことを特徴とす
る生体成分精製装置によって達成される。前記生体成
分精製装置の精製する生体成分としては、遺伝子（特に
ゲノムＤＮＡ）、タンパク質、酵素等が適用できる。

【０００８】また、本発明の解決すべき課題は、検査試
料から細胞成分を分離する第１分離手段と、得られた細
胞成分中の有核細胞を高電場で破砕し、前記有核細胞か
ら遺伝子を抽出するための電場発生手段と、抽出された
遺伝子を前記有核細胞から分離するための第２分離手段
と、切断された遺伝子を測定する遺伝子検出手段を有
し、前記電場発生手段の発生する電場によって抽出され
た遺伝子を小断片に切断することを特徴とする遺伝子検
査装置によっても達成される。

【０００９】また、本発明の解決すべき課題は、検査試
料から細胞成分を分離する第１分離手段と、得られた細
胞成分中の有核細胞を高電場で破砕し、前記有核細胞か
ら遺伝子を抽出するための電場発生手段と、抽出された
遺伝子を前記有核細胞から分離するための第２分離手段
と、抽出された遺伝子を小断片に切断する切断手段と、
切断された遺伝子を測定する遺伝子検出手段を有し、前
記電場発生手段は抽出された遺伝子が前記第２分離手段
を通過するように導くことを特徴とする遺伝子検査装置
によっても達成される。

【００１０】上記第１分離手段は、中空糸膜等の透析膜
を用いた透析を行うか、または細胞吸着性の膜を用いて
細胞成分のみを分画させた後、電解質をほとんど含まな
い溶液にて細胞成分のみを分離することが好ましい。

【００１１】また、上記電場発生手段は、高電圧パルス
を発生する２つの電極からなり、両極は上記第２分離手
段を挟むように設置されることが好ましく、前記第２分
離手段は前記第１分離手段の膜よりも孔径の大きい中空
糸からなり、前記電場発生手段の１極が該第２分離手段
の中空糸の中に設置され、多極は該第２分離手段の中空
糸の外に設置されるものとしても良く、２つの電極が電
気刺激によって孔が開く、電気刺激応答性膜を挟んで設
置されても良い。

【００１２】上記切断手段は、前記電場発生手段が高電
圧パルスを印加することによって兼用することが好まし
いが、制限酵素を投入することによって遺伝子を切断し
ても良い。

【００１３】上記遺伝子検出手段としては放射線標識や
酵素、蛍光色素で標識したプローブとハイブリダイズさ
せて、電気泳動法を用いて分離検査する方法を用いるこ
とができるが、水素振動子マイクロバランス検出装置を
用いることが最も好ましい。

【００１４】また、切断された遺伝子を前記遺伝子検出
手段まで導く搬送手段としては、２枚のガラス板の間に
設けた溝などの微小流路やキャピラリー内を、前記微小
流路またはキャピラリーの遺伝子流入口から前記遺伝子
検出手段にかけて電圧発生装置を設け、該電圧発生装置
の発生するパルス電圧により遺伝子を電気泳動させ、他
の物質と分離しながら搬送することが好ましい。このと
き、前記微小流路またはキャピラリーの中には遺伝子が
分画しやすいようにゲルを満たしていることが好まし
い。

【００１５】

【作用】本発明は、上記の構成により、前記第１分離手
段によって白血球、リンパ球等の有核細胞を含む細胞成
分を分離した後、前記電場発生手段により高電圧パルス
を印加して細胞を破壊する。このとき電場の大きさ及び
電場をかける時間を特定のものとすることによって、細
胞破壊と同時に遺伝子を細胞核外にまで飛び出させ、飛
び出した遺伝子を前記第２分離手段にて膜分離したの
ち、さらに高電圧パルスを印加して遺伝子を小断片に切
断する。小断片遺伝子は、電気泳動により少量づつ分離
しながら遺伝子検出手段に導かれて、ＤＮＡ測定がおこ
なわれる。遺伝子の切断は制限酵素を用いて切断しても
よい。

【００１６】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を参照にして具
体的に説明する。

【００１７】（実施例１）図１は、本発明の１実施例に
よる生体成分精製装置を含む遺伝子検査装置の構成を示
したものである。図１において、１０は第１分離手段、
１１は中空糸膜、１２は該中空糸膜１１に透析液を投入
するための透析液流入口、１３は透析液流出口、２０は
電場発生手段を示している。２１は該電場発生手段の負
電極であり、後述する第２分離手段３０の中空糸膜３１
内に設置される。２２は正電極であり、前記中空糸膜３
１の外に設置される。３０は第２分離手段であり、前記
第１分離手段１０の中空糸膜１１よりも孔径の大きい中
空糸膜３１と、遺伝子を収集觜、ｐＨ調整するための遺
伝子緩衝液を投入する遺伝子緩衝液流入口３２とからな
る。以上に示した各構成要素によって、本発明の生体成
分精製装置は構成されている。また、４０は遺伝子検出
手段、４１はＤＮＡ検出センサ、４１は共振周波数測定
手段、５０は精製された遺伝子の通過する微小流路、５
１は前記微小流路内で遺伝子を導く電圧発生装置、５２
は切断された遺伝子を前記微小流路５１へ導入するため
の導入手段を示しており、前記遺伝子精製装置とこれら
を連続的に組むことにより、検査試料から遺伝子を精製
し、該遺伝子を測定するまでの一連の作業を連続的に行
うことのできる遺伝子検査装置となる。

【００１８】以上のように構成された遺伝子検査装置の
動作を、図１を用いて説明する。血液などの有核細胞を
含む検査試料１０１を約１ｍｌ、第１分離手段１０にお
ける中空糸膜１１の中に注入し、透析液流入口１２より
流入した透析液により、精製の妨げとなる血液中の電解
質および蛋白質等を分離する。ここで、中空糸膜１１
は、平均孔径０．１〜１μｍ、直径０．１〜２ｍｍの単
一の中空糸膜を用いたが、平均孔径０．１〜１μｍ、直
径０．１〜２ｍｍの中空糸膜を１〜１万本束ねたもので
も良く、多段に積まれた平膜でも良い。このようにして
電解質をほとんど含まなくなった細胞成分１０２を含む
溶液が、平均孔径１〜１０μｍと前記第１分離手段１０
における中空糸膜１１より孔径が大きく、直径０．１〜
２ｍｍの単一の中空糸膜３１によって構成される第２分
離手段３０内に輸送される。輸送された細胞成分１０２
に対して、電場発生装置２０の負電極２１および正電極
２２が、前記中空糸膜３１の孔３３を通して中空糸膜３
１の内外に高電圧パルスを印加すると、孔に電界が集中
するため、比較的小さな電圧で有核細胞を破砕すること
ができる。前記負電極２１としては、直径２５μｍ〜１
ｍｍ程度の円柱状白金電極が好ましく、正電極２２は前
記中空糸膜を取り囲む様に筒状の白金電極とすることが
好ましい。また、本第１実施例においては中空糸膜を用
いたために電極の形状は上述のようなものを採用した
が、後述の第２実施例に示すような平膜を用いる場合、
正電極、負電極ともに板状電極を用いることもできる。
電場発生手段２０によって発生させる高電圧パルスは、
電場の大きさと印加時間を好適なものとすることによ
り、細胞破壊と同時に遺伝子としてＤＮＡ１０３を細胞
膜の外に、さらに孔の外まで飛び出させることができ
る。好適な電場の大きさと印加時間は、電場の大きさが
１００〜１０００Ｖ程度、印加時間が１０μ秒〜１ミリ
秒である。１０００Ｖ以上の電圧や１ミリ秒以上の長時
間では、温度が上昇し、遺伝子を含む細胞成分に悪影響
を生じ、正確な遺伝子測定が行えない虞れがあり、１０
０Ｖ以下の電圧や１０μ秒以下の短い電圧では有核細胞
の破砕が起こらず、ＤＮＡ１０３を抽出できない虞れが
ある。さらに、中空糸膜３１の外に遺伝子抽出液とし
て、ｐＨ６〜８程度のトリス塩酸バッファからなる緩衝
液を遺伝子緩衝液流入口３２から注入することによっ
て、前記緩衝液の圧力で、飛び出したＤＮＡ１０３を還
流させ、遺伝子検出手段４０の方向へ集める。前記緩衝
液は、プロティナーゼＫ等の除蛋白剤を含むＥＤＴＡ緩
衝液である事が好ましい。正電極２２の付近ではさらに
高電圧パルスが印加されるため、ＤＮＡ１０３は小断片
に切断される。切断が不十分な場合には、前記遺伝子抽
出液流入口３２から制限酵素を注入することによって、
補うこともできるし、前述の細胞破砕とＤＮＡ１０３の
抽出を重視して電場の大きさと印加時間を設定すること
が好ましい場合には、制限酵素のみで切断されるよう調
整しても良い。小断片ＤＮＡは導入手段５１の発生する
陰圧によって、２枚のガラス板に間に形成された微小流
路５０に注入されて、微小流路５０の両端に印加される
電圧発生装置５１に電圧により、微小流路５０内のゲル
中を、電気泳動により分離しながら、水晶振動子による
遺伝子検出手段４０に導かれて、ＤＮＡ測定として共振
周波数の変化測定がおこなわれる。

【００１９】（実施例２）図２は、本発明の第２実施例
における生体成分精製装置を含む遺伝子検査装置の構成
を示したものである。図２において、１０は第１分離手
段、１３は細胞吸着性膜、１４は該細胞吸着性膜１３の
上流に洗浄溶液を投入するための溶液流入口、２０は電
場発生手段、２１は該電場発生手段の負電極であり、後
述する第２分離手段３０の電気刺激応答性膜３４の上流
に設置される。２２は正電極であり、前記電気刺激応答
性膜３４の下流に設置される。３０は第２分離手段であ
り、前記電場発生手段２０の発生する電場の刺激によっ
て孔が開孔する電気刺激応答性膜３４と、遺伝子を収集
し、ｐＨ調整するための遺伝子緩衝液を投入する遺伝子
緩衝液流入口３２とからなる。以上に示した各構成要素
によって、本発明の遺伝子精製装置は構成されている。
また、４０は遺伝子検出手段、５０は精製された遺伝子
の通過する微小流路、５１は前記微小流路内で遺伝子を
導く電圧発生装置を示しており、前記遺伝子精製装置と
これらを連続的に組むことにより、検査試料から遺伝子
を精製し、該遺伝子を測定するまでの一連の作業を連続
的に行うことのできる遺伝子検査装置となる。

【００２０】以上のように構成された遺伝子検査装置の
動作は、基本的には図１に示した本発明の第１実施例と
同様であるため、同一箇所には同一番号を付与して説明
を省略し、異なる点のみ説明する。本第２実施例の遺伝
子検査装置の特徴は、細胞吸着性の膜１３を用いること
によって、血液などの有核細胞を含む検査試料１０１か
ら有核細胞を選択的に固着させて容易に分離することが
できる点である。前記細胞吸着性膜１３によって有核細
胞を吸着させると、次に電解質をほとんど含まない洗浄
溶液を溶液流入口１４から注入して洗浄することによ
り、有核細胞のみが第２分離手段３０へ流送される。第
２分離手段３０では、電場発生手段２０によって高電圧
パルスを印加して、有核細胞を破砕する。このときも高
電圧パルスも実施例１と同様、細胞破壊と同時にＤＮＡ
１０３を細胞膜の外にまで飛び出させるようにするよう
電場の大きさと印加時間を好適なものに設定する。高電
圧パルスの発生に伴い、電気刺激応答性膜３４の孔が開
き、飛び出したＤＮＡ１０３が分離される。電気刺激応
答性膜３４は、電場が無いときは孔が塞がった状態にあ
るため、ＤＮＡ１０３以外の不要な物質を通過させる可
能性が低くなる。その後、さらにＤＮＡ１０３が小断片
に切断され、微小流路５０内を電気泳動により分離しな
がら、遺伝子検出手段４０に導かれ、ＤＮＡ測定が行わ
れる過程は、実施例１と同様である。

【００２１】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の遺伝子精製装置および遺伝子検査装置は、システムが
一体化されているので、取扱いが簡単で、コンタミネー
ションや読み取りミスなどが発生し難く、また、システ
ムを小型化することができので検体量が少なくてよい。
更に、操作が簡単であるので、従来法に比較して迅速な
測定が可能であると、同時に多種類検査に用いることが
できる。

【００２２】また、本発明の分離手段には膜を使うこと
により費用を安く押さえることができ、さらに検出部分
は、再生可能なので、繰り返し使用して検査コストを低
くできる。

【００２３】また、医学的に見ると、本発明によれば、
ヒト遺伝子の解明が加速され、遺伝子レベルで病因診断
や難病治療に貢献し、人類の福祉に役立つことが期待さ
れる。

【００２４】また、癌遺伝子や癌抑制遺伝子を効率よく
解明できるので、再発や発症の予防への手法の選択の幅
が広がる。また、ＨＩＶウイルス、ＨＣＶウイルス等の
感染症を遺伝子レベルで精確にかつ迅速に診断して、初
期の段階で根本治療を実行することができるようになる
効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例における遺伝子精製装置を
含む遺伝子検査装置を説明する図面である。

【図２】本発明の第１実施例における遺伝子精製装置を
含む遺伝子検査装置を説明する図面である。

【符号の説明】１０第１分離手段１１，３３中空糸膜１２透析液流入口１４溶液流入口２０電場発生手段２１、２２電極３０第２分離手段３４電気刺激応答性膜４０遺伝子検出手段５０微小流路

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 1/28 (72)発明者菊地克明神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地テルモ株式会社内 (72)発明者佐久間貞行神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地テルモ株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検査試料から細胞成分を分離する第１分
離手段と、得られた細胞成分中の細胞を高電場で破砕
し、前記細胞から精製すべき生体成分を抽出するための
電場発生手段と、抽出された生体成分を前記細胞から分
離するための第２分離手段とを有し、前記電場発生手段
は抽出された生体成分が前記第２分離手段を通過するよ
うに導くことを特徴とする生体成分精製装置。
【請求項２】検査試料から細胞成分を分離する第１分
離手段と、得られた細胞成分中の有核細胞を高電場で破
砕し、前記有核細胞から遺伝子を抽出するための電場発
生手段と、抽出された遺伝子を前記有核細胞から分離す
るための第２分離手段と、切断された遺伝子を測定する
遺伝子検出手段を有し、前記電場発生手段の発生する電
場によって抽出された遺伝子を小断片に切断することを
特徴とする遺伝子検査装置。