JPH07147986A

JPH07147986A - ヒトパルボウイルス遺伝子、それによってコ−ドされるポリペプチド及び用途

Info

Publication number: JPH07147986A
Application number: JP4281017A
Authority: JP
Inventors: Osamichi Yamazaki; 修道山崎; Yasuko Matsunaga; 泰子松永; Naokazu Takeda; 直和武田; Zenji Matsuura; 善治松浦; Hiroyuki Ogawa; 博之小川; Hideharu Shimizu; 英晴清水; Kunio Kamata; 公仁夫鎌田; Daisuke Kurosawa; 大介黒沢
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd; Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1995-06-13

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒトパルボウイルス抗原蛋白の大量培養を可
能にし、また、高感度に検体中のヒトパルボウイルス又
は抗ヒトパルボウイルス抗体を測定することを可能たら
しめる手段を提供すること。【構成】式（１）で示される新規ヒトパルボウイルス
遺伝子、それがコードするポリペプチド及びこれを利用
するヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイルス抗体
の測定系を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、急性赤芽球ろう、慢性
骨髄不全、流産、胎児水腫、肝障害、出血熱、関節炎や
リウマチなど種々の疾患の病因にかかわる新規なヒトパ
ルボウイルスの遺伝子、それがコードするポリペプチド
及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】パルボウイルスは、一本鎖の直鎖ＤＮＡ
ゲノムを有し、ゲノムの各末端はパリンドロミック（Pa
llindromic）ＤＮＡ配列の存在により、特徴的なヘアピ
ンループ構造を持つ最小のウイルス群（Parvoviridae
科）に属する。

【０００３】Parvoviridae科ウイルスの粒子は立方対称
形で、Cubic symmetry を示し、32個のキャプソメア
（capsomere ）を持ち、直径約20〜25nm の小型のウイ
ルスで、エンベロープを保有せず、エーテル抵抗性であ
る。また熱、乾燥などに比較的耐性のウイルスである
〔Intervirology,23,61-73(1985)〕。ウイルスの複製と
カプシッドの形成は感染細胞の核内で行われる。

【０００４】脊椎動物のパルボウイルスは自律性及び欠
損性の群に分類される。

【０００５】自律性のパルボウイルス＜パルボウイルス
属（Parvovirus）＞は、宿主細胞に複製を継続しうる
が、欠損性のパルボウイルス＜デペンドウイルス（Depe
ndovirus）＞はヘルパーウイルスによるコインフェクシ
ョンが必要となる。自律性の動物パルボウイルスには、
ウシ（BPV ）、ブタ（PPV ）、イヌ（CPV）、ネコ（FPL
V）、ラット（H-1 ）、ミンク（ADV ）、及びヒト（HPV
）が知られており、一般に病原性は似ているがこれら
のウイルス間で免疫学的な交叉性は見出されていない。
そこで、ヒトパルボウイルスの診断や疫学調査さらに
ワクチンの開発を行う場合、そのウイルスがヒトパルボ
ウイルス由来であることが重要である。

【０００６】ヒトパルボウイルスは、1975年に輸血用血
液中に偶然発見された〔Lancet,i:72-73(1975)〕が、病
原性は不明であった。その後、鎌状赤血球貧血に生じた
急性赤芽球ろうがヒトパルボウイルスによるものである
ことが報告された〔Lancet,i:664-665(1981)〕。また、
小児に流行する伝染性紅斑症の病因ウイルスであること
が確認され〔Lancet,i:1378(1983) 〕、それが感染源と
なり成人にも感染が及び、関節炎を主症状とする病気が
起こることが分かった。さらに伝染性紅斑流行後に胎児
水腫で流産した症例が報告され〔Lancet,ii:1033-1034
(1984) 〕、妊婦のヒトパルボウイルス感染が死産や胎
児水腫の原因となることが証明され、わが国においても
ヒトパルボウイルス感染による胎児死亡例が報告された
〔日本産婦人科学会誌,40:99-100(1988)〕。そして、健
常成人においても、不定の発疹症、出血熱様疾患、関節
炎の原因となるところが知られ〔医学の歩み,142:530-5
32(1987)〕、最近ではリウマチとの関係も推測されてい
る〔Arch.Intern.Med.148:2587-2589(1988) 〕。

【０００７】以上のように、ヒトパルボウイルスは、臨
床的にきわめて興味深いウイルスであり、人の生命に影
響を与えることもありうることから、治療や予防対策の
必要性が明確となってきている。

【０００８】しかしながら、ヒトパルボウイルスは、人
の初代骨髄細胞を用いインビトロでの培養からはじま
り、慢性骨髄性白血病の患者から得られた赤血球細胞や
胎児肝細胞中の赤芽細胞を用いた培養が可能であるが、
産業上利用するに充分な培養系はまだ見つかっていな
い。そのため、ヒトパルボウイルス抗原の取得が困難で
あり、診断系の一般化が遅れており、臨床検査が容易に
行えないのが現状である。

【０００９】一般的にヒトパルボウイルスは経鼻感染に
より起こるが、非日常的には輸血と血液製剤の注入によ
り感染する。感染標的細胞は赤芽球系の前駆細胞である
ことがインビトロの造血幹細胞培養系で証明された
〔Nature,302:426-429(1983)〕。

【００１０】ヒトパルボウイルスが感染した場合、１周
間後にウイルス血症となるが発熱、筋肉痛、倦怠感が現
れるだけで、感染後約２〜３週間目から紅斑や関節痛等
の症状が観察される。これらの症状はウイルス抗体によ
る免疫複合体によるものであると考えられている。その
ため、症状が現れる頃にはウイルスは殆ど駆逐されてい
るため、ウイルス抗原の検出は困難である。

【００１１】従ってヒトパルボウイルス感染の証明は、
ウイルス抗原の検出が困難であるため、血清中に抗ヒト
パルボウイルス抗体を検出することによって行われてい
る。

【００１２】ヒトパルボウイルスの診断は、伝染性紅斑
流行時のウイルス血症の血清より、ウイルス粒子を精製
し、それを抗原として、抗原抗体反応系を用いた以下の
方法により限られた施設で行われているにすぎない。免
疫電気向流法〔医学の歩み,135:317-318(1985)〕、エン
ザイムイムノアッセイ法〔医学の歩み,134:909-910(198
5)〕、ラジオイムノアッセイ法〔感染症学雑誌,58:1213
-1220(1985) 〕。しかし、免疫電気向流法は検出感度が
低く、エンザイムイムノアッセイ法やラジオイムノアッ
セイ法を用いた場合ウイルス抗原量の不足が問題にな
る。

【００１３】このような状況から、有用かつ大量のウイ
ルス抗原の取得がヒトパルボウイルスの診断系の開発に
有用かつ不可欠である。

【００１４】一般的にウイルス抗原の取得方法は、細胞
培養でウイルスを増殖させる方法、もしくは、遺伝子組
換え法、たとえばウイルス遺伝子をクローニングして、
抗原蛋白や非感染性のウイルス粒子を大量に発現させる
方法に大別される。

【００１５】細胞培養系は、慢性骨髄性白血病の患者か
ら得られた赤芽球系細胞〔J.Infect.Dis.160:548(198
9)〕、胎児肝細胞中の赤芽球細胞〔J.Virol.63:2422-24
26(1989)〕など限定的な細胞系のみで培養が可能であ
る。しかしウイルスの回収率はきわめて低く、また、通
常の骨髄中にはウイルス標的細胞がきわめて少なく、新
鮮初代培養以外の培養が困難であり、細胞培養系は使用
範囲に制限がある。最近、株化細胞の１つに感受性が確
認されたが、この系ではウイルスの増殖率はきわめて低
い〔臨床と微生物,16:177-186(1989) 〕。この様に、ヒ
トパルボウイルスの細胞培養系を用いた方法で、ヒトパ
ルボウイルス抗原を有用かつ大量に取得することは不可
能である。

【００１６】一方、遺伝子組換え法によってウイルス抗
原を有用かつ大量に発現させて取得するためには、ヒト
パルボウイルスの遺伝子が必要である。現在、ヒトパル
ボウイルスに感染した鎌形赤血球貧血患者血清由来のヒ
トパルボウイルスＢ１９株遺伝子の全配列が報告されて
いる〔J.Virol.,58:921-936(1986) 〕。この米国でクロ
ーン化されたヒトパルボウイルス遺伝子の塩基配列の解
析から、ウイルス構造蛋白質としてウイルス粒子を構成
するのは、ＶＰ−１（分子量約84KDa ）及びＶＰ−２
（分子量約58KDa ）の２種類の蛋白質のみであり、ヒト
パルボウイルスに感染した宿主がこれらＶＰ−１及びＶ
Ｐ−２を標的として抗原抗体反応を惹起することが確か
められている〔J.Virol.,61:2627(1987)〕。

【００１７】そこで、伝染性紅斑患者血清からＰＣＲ法
によりヒトパルボウイルス構造蛋白遺伝子の一部を増幅
し、クローニングした報告例〔特開平４−８８９８５〕
やヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子の一部の遺
伝子領域から、大腸菌で発現させた抗原によるエンザイ
ムイムノアッセイを用いた報告例〔J.Clin.Microbiol.,
30:305-311(1992)〕がある。

【００１８】しかし、これらはヒトパルボウイルス構造
遺伝子の一部分の報告例であり、ヒトパルボウイルス構
造タンパク質の一部分を利用したにすぎない。そして、
このエンザイムイムノアッセイを用いたヒトパルボウイ
ルス抗体検出は、伝染性紅斑患者血清より精製したヒト
パルボウイルス粒子を抗原として用いたＲＩＡよりも検
出率が低くかった。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ヒトパルボウイルス抗原蛋白の大量培養を可能に
し、また、高感度に検体中のヒトパルボウイルス又は抗
ヒトパルボウイルス抗体を測定することを可能たらしめ
る手段を提供することである。

【００２０】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子をコ
ードする遺伝子領域を得るため検討した結果、従来公知
のヒトパルボウイルス遺伝子と、アミノ酸レベル及びＤ
ＮＡレベルでいくつか構造の異なる新規な、また診断系
の開発に有用な、たとえばヒトパルボウイルスのウイル
ス粒子様構造物（Empty particle) の作製も可能な、非
構造遺伝子及び構造遺伝子を含むヒトパルボウイルス遺
伝子領域を得ることができ、かつこの遺伝子領域から発
現させた完全長の構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２に
よるエンザイムイムノアッセイを用いた検討の結果、ヒ
トパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ−１とＶＰ−２
の免疫学的反応の違いを見出し、さらに Empty particl
e を用いたエンザイムイムノアッセイが、ヒトパルボウ
イルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイと同等な
検出感度及び特異性であることを見いだし、さらに昆虫
細胞Ｓｆ９よりＴｎ５の方がヒトパルボウイルス蛋白の
発現量が多いことを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【００２１】すなわち、本発明は、上記式（１）で表さ
れるヒトパルボウイルス遺伝子を提供する。また、本発
明は、上記式（２）のアミノ酸配列をコードするヒトパ
ルボウイルスＶＰ―１構造遺伝子を提供する。さらに、
本発明は、上記式（３）のアミノ酸配列をコードするヒ
トパルボウイルスＶＰ―２構造遺伝子を提供する。ま
た、本発明は、上記式（４）のアミノ酸配列をコードす
るヒトパルボウイルス非構造（ＮＳ）遺伝子を提供す
る。さらに本発明は、上記本発明のいずれかの遺伝子を
含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現することができる組
換えベクターを提供する。さらにまた、本発明は、上記
本発明の組換えベクターにより形質転換された形質転換
体を提供する。また、本発明は、前記式（２）ないし
（４）のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを提供する。さらに、本発明は、これらのポリ
ペプチドから構成されるヒトパルボウイルスのウイルス
粒子様構造物を提供する。また、本発明は、上記本発明
のいずれかのポリペプチド又は上記本発明のウイルス粒
子様構造物を免疫原として用いて抗体を作製し、該抗体
を用いる免疫測定により検体中のヒトパルボウイルスを
検出する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発
明のいずれかのポリペプチド又は上記本発明のウイルス
粒子様構造物を抗原として用い、免疫測定法により検体
中の抗ヒトパルボウイルス抗体を検出する方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記式（１）で示される遺伝子
の一部とそれぞれハイブリダイズする１対のオリゴヌク
レオチドを用いてＰＣＲ法により式（１）で示される遺
伝子又はその一部を増幅し、該増幅された遺伝子又はそ
の一部を検出することから成る、検体中のヒトパルボウ
イルスの検出方法を提供する。

【００２２】後でより詳細に説明するが、上記式（１）
ないし（４）で示される遺伝子の塩基配列は従来から公
知のヒトパルボウイルス遺伝子の塩基配列とは異なって
おり、新規なものである。この完全長遺伝子を利用して
ポリペプチドを発現させ、それを利用した免疫測定によ
り検体中のヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイル
ス抗体の検出を感度良く行うことができる。なお、これ
らの遺伝子は、各式に記載した完全長のものを用いるこ
とが好ましいが、これらの一部を欠いていても同程度に
高感度の検出が可能と成ることがあろうことは当業者に
よって議論の余地なく認識されることである。従って、
これらの遺伝子の一部が欠失し、置換し又は挿入があっ
たとしても、式（１）ないし（４）の遺伝子と同様に用
いることができるものは式（１）ないし（４）に記載さ
れたものと実質的に同一であり、本発明の範囲内に入る
ものと解釈する。

【００２３】上述のように、本発明は、上記本発明の遺
伝子を含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現することがで
きる組換えベクターを提供する。このような組換えベク
ターは、市販のベクターのクローニング部位に上記遺伝
子を常法により挿入することにより容易に調製すること
ができる。ベクターとしては、ｐＵＣ１９のような大腸
菌用ベクターを用いることもできるし、また、後述の実
施例で明らかになるように、バキュロウイルスベクター
（J. General Virology, Vol.68, pp.1233-1250, 1987)
を用いることも好ましい。

【００２４】本発明の形質転換体は、上記本発明の組換
えベクターで宿主細胞を常法により形質転換することに
より得られる。宿主細胞は、構築した組換えベクターの
宿主を利用する。すなわち、大腸菌用ベクターに遺伝子
を挿入して組換えベクターを構築した場合には大腸菌が
宿主となる。また、バキュロウイルスベクターを用いて
組換えベクターを構築した場合には昆虫細胞を好ましく
用いることができる。昆虫細胞としては特にＴｎ５（In
vitrogen社製High Five （商品名））が好ましく用いら
れる。

【００２５】上述のように、本発明は、前記式（２）な
いし（４）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供
する。なお、上記と同様に、式（２）ないし（４）に記
載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部が欠
失し、置換し又は挿入があったとしても、式（２）ない
し（４）に記載されたアミノ酸を有するポリペプチドと
同様に用いることができるものは式（２）ないし（４）
に記載されたアミノ酸を有するポリペプチドと実質的に
同一であり、本発明の範囲内に入るものと解釈する。下
記実施例で具体的に述べるように、これらのポリペプチ
ドからヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構造物を構
築することができ、このウイルス粒子様構造物も本発明
の範囲に含まれる。

【００２６】これらのポリペプチド又はウイルス粒子様
構造物を抗原として用いて、検体中の抗ヒトパルボウイ
ルス抗体を免疫測定により検出することができる。免疫
測定方法自体はこの分野において周知であり、本発明に
おいては、従来より周知の種々の免疫測定方法、すなわ
ち、用いる標識に基づいて分類すれば酵素免疫分析法、
放射免疫分析法、蛍光抗体分析法その他を採用すること
ができ、また、測定形式で分類すれば競合法、サンドイ
ッチ法その他を採用することができる。なお、本願発明
者らは、ヒトパルボウイルスに感染した患者の体内にお
いて、抗ＶＰ−２抗体が感染初期に多く存在し、感染後
期に急速に減少するのに対し、抗ＶＰ−１抗体は感染初
期には少ないが感染後期に多く存在し、抗体価が下がる
のが遅いことを見出した。従って、ＶＰ−１とＶＰ−２
ポリペプチドの混合物を抗原として用いて免疫測定を行
えば、感染の初期でも後期でも抗ヒトパルボウイルス抗
体を検出することができ、検出率を高めることができ
る。この場合、ＶＰ−１とＶＰ−２の混合比率は１０：
１ないし１：１０が好ましく、さらには１：２ないし
１：４が好ましい。なお、上記ウイルス粒子様構造物は
ＶＰ−１とＶＰ−２ポリペプチドの両方を含むので、こ
れを抗原として用いることにより上記検出率向上効果を
もたらすことができる。また、抗ＶＰ−１ＩｇＧ抗体と
抗ＶＰ−２ＩｇＧ抗体の反応性及び抗体量に差があるの
で、ＶＰ−１抗原固相プレート及びＶＰ−２抗原固相プ
レートを用いたＩｇＧ抗体検出により、ＩｇＧ抗体検出
のみで感染の時期を推測することが可能となった。

【００２７】また、上記ポリペプチド又はウイルス粒子
様構造物を免疫原として用いて常法によりこれらのポリ
ペプチド又はウイルス粒子様構造物に体する抗体を作製
し、この抗体を用いて免疫測定法により検体中のヒトパ
ルボウイルスを検出することもできる。免疫測定法とし
ては、上記と同様周知のいずれのものをも採用すること
ができる。

【００２８】また、上述のように、本発明は、上記式
（１）で示される遺伝子の一部とハイブリダイズする１
対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により式
（１）で示される遺伝子又はその一部を増幅し、増幅さ
れた遺伝子又はその一部を検出することから成る、検体
中のヒトパルボウイルスの検出方法を提供する。この方
法に用いられるＤＮＡプライマー（オリゴヌクレオチ
ド）としては、特に限定されないが、下記のＤＮＡプラ
イマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中からそれぞれ
少なくとも１種ずつ選ばれるもの好ましく用いることが
できる。ＤＮＡプライマー群１ D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC ＤＮＡプライマー群２ U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC

【００２９】以下、本発明を、より具体的に詳細に説明
するが、本発明は下記に記載のものに限定されるもので
はない。

【００３０】１．ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及
び構造遺伝子を含む遺伝子領域ヒトパルボウイルスは、長さ約 5.4 ｋｂの直鎖の一本
鎖ＤＮＡゲノムを有するウイルスで、ゲノムの各末端は
パリンドロミック（Pallindromic）ＤＮＡ配列により、
特徴的なヘアピンループ構造で終わっている。

【００３１】ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構
造遺伝子を含む遺伝子領域を得るには、例えば、伝染性
紅斑（ＥＩ）患者の血清より、ショ糖密度勾配遠心によ
って精製したウイルス粒子から常法によってヒトパルボ
ウイルスＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。

【００３２】また、次の方法も可能である。それは、欧
米で報告されたヒトパルボウイルスＢ１９のＡｕ株遺伝
子配列〔J.Virol.58:921-936(1986)〕やＷｉ株〔Virolo
gy,157:534-538(1987)〕に基づき合成したＤＮＡプライ
マーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応〔ＰＣＲ法；Na
ture,324:163(1986)〕によって目的とするヒトパルボウ
イルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域
を増幅することができる。

【００３３】具体的には、たとえば、精製したヒトパル
ボウイルスＤＮＡに、該遺伝子の部分配列から成るＤＮ
Ａプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から成るＤ
ＮＡプライマーの２種のＤＮＡプライマーをアニーリン
グさせ、常法に従って、該ＤＮＡプライマー間のＤＮＡ
を増幅させる。

【００３４】最も好ましいプライマーは、上記した通り
である。このプライマーを用いてＰＣＲを行うとヒトパ
ルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝
子領域を増幅することができる。得られたＤＮＡ断片
を、たとえばｐＵＣ１９（宝酒造社製）などの様な一般
的なクローニングベクター等に組み込んで、得られたク
ローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、該ベクターに組
み込まれているＤＮＡ配列をジデオキシ法等により決定
することにより、目的とするヒトパルボウイルスの非構
造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域の全塩基配列
を決めることが出来る。

【００３５】本発明によれば、ヒトパルボウイルスの非
構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、前記式
（１）で示される塩基配列を有しており、また構造遺伝
子ＶＰ−１は前記式（２）で示される塩基配列及びアミ
ノ酸配列を、また構造遺伝子ＶＰ−２は前記式（３）で
示される塩基配列及アミノ酸配列を、また非構造遺伝子
ＮＳは、前記式（４）で示される塩基配列及びアミノ酸
配列を有していた。これら前記式（１）〜前記式（４）
で表される塩基配列中、塩基レベルで４１箇所、アミノ
酸レベルで１０〜１３箇所が、公知のヒトパルボウイル
スＢ１９株（Ａｕ株、Ｗｉ株）の配列と異なっていた。

【００３６】２．ヒトパルボウイルス構造タンパク質Ｖ
Ｐ−１やＶＰ−２及び非構造タンパク質ＮＳの作製及び
それを用いた抗原、抗体検出系の構築ウイルス構造タンパク質としてウイルス粒子に存在して
いるのは、量的に少ないＶＰ−１（８４ＫＤａ）と量的
に多くウイルス粒子の主体をなしているＶＰ−２（５８
ＫＤａ）であり、ＶＰ−１、ＶＰ−２に対して宿主は抗
体を産生する。よって、このＶＰ−１、ＶＰ−２抗原を
用いることによりヒトパルボウイルスに対する抗体を検
出することが出来る。

【００３７】ヒトパルボウイルスのＶＰ−１，ＶＰ−２
抗原を得るためには、ヒトパルボウイルス抗原を確保し
なければならない。しかし、現在までヒトパルボウイル
スの細胞培養系は、特殊な遺伝的疾患患者の骨髄細胞を
用いた報告例がある［Blood.70:384-391(1987)］にすぎ
ず、またウイルスの回収率はきわめて悪いため、実際に
はその使用範囲にも限度があった。

【００３８】そこで、本発明のヒトパルボウイルス非構
造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を用いて以下
のようにして完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク
質ＶＰ−１、ＶＰ−２を作製した。

【００３９】ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造
遺伝子を含む遺伝子領域、前記式（１）やヒトパルボウ
イルス構造遺伝子ＶＰ−１、前記式（２）及びヒトパル
ボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２、前記式（３）をタンパ
ク質発現させるのに最も都合がよい制限酵素等により切
断し、原核細胞（例えば大腸菌など）発現ベクターや真
核細胞（例えばＣＨＯ細胞など）発現ベクター、昆虫細
胞（例えばＳｆ９，Ｔｎ５など）発現ベクターに再クロ
ーニングを行い発現させる。

【００４０】発現された完全長のヒトパルボウイルス構
造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２は、不溶性になってお
り精製には困難を要していた。そこで、尿素バッファー
で可溶化し、適当な吸着、イオン交換、分子ふるい、疎
水、等電点、クロマトグラフィーを組み合わせて発現蛋
白を精製し、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク
質ＶＰ−１、ＶＰ−２を得た。

【００４１】発現させ、精製した完全長のヒトパルボウ
イルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を炭酸バッフ
ァー（pH9.5 ）で至適濃度に希釈してから、ＥＬＩＳＡ
用ポリスチレンマイクロプレートに固相して、ヒトパル
ボウイルス抗体検出エンザイムイムノアッセイ試薬を試
作した。

【００４２】この試作したエンザイムイムノアッセイ試
薬を用いて、伝染性紅斑患者の抗ヒトパルボウイルスＩ
ｇＧ抗体の経時変化を調べ以下の事が分かった。完全長
のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−
２に対するＩｇＧ抗体は共に出現するが、完全長のヒト
パルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１に対するＩｇＧ
抗体の方が、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク
質ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体より抗体量の持続性は長
いことが分かった。

【００４３】ここで、完全長のヒトパルボウイルス構造
遺伝子ＶＰ−２のタンパク質のコード領域は、完全長の
ヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−１のＣ末端部分に
完全に含まれている。そこで、以前よりヒトパルボウイ
ルスの抗体検出には、ヒトパルボウイルス構造タンパク
質ＶＰ−１のみで十分可能であると思われていた。

【００４４】しかし、完全長のヒトパルボウイルス構造
タンパク質ＶＰ−１とＶＰ−２の免疫学的な反応性に違
いがあることが分かったので、ヒトパルボウイルスのよ
り確実な診断には、完全長のヒトパルボウイルス構造タ
ンパク質ＶＰ−１のみではなく完全長のヒトパルボウイ
ルス構造タンパク質ＶＰ−２も必要であることが分かり
本発明に至った。

【００４５】３．バキュロウイルスを用いた Empty par
ticle の発現、精製及び Emptyparticle を用いた抗体
検出系の構築ヒトパルボウイルスの粒子は、構造タンパク質ＶＰ−
１、ＶＰ−２で構成されていることが知られている。
〔J.Virol.,58:921-936(1986) 〕そして、構造タンパク
質ＶＰ−１、ＶＰ−２をそれぞれ単独に同一細胞で発現
させると、構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２が同一細
胞内でウイルス粒子様構造物（Empty particle）を作る
ことが分かった。〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7601-7
605(1989) 〕

【００４６】そこで、バキュロウイルスによる発現系を
用いて、ウイルス粒子様構造物の発現を行った。Empty
particleの発現は、本発明のヒトパルボウイルス非構造
遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を用いて以下の
方法で行った。

【００４７】ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造
遺伝子を含む遺伝子領域、前記式（１）やヒトパルボウ
イルス構造遺伝子ＶＰ−１、前記式（２）及びヒトパル
ボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２、前記式（３）を完全長
のＶＰ−１及び完全長のＶＰ−２タンパク質の発現に最
も都合がよい制限酵素等により切断し、真核細胞（例え
ばＣＨＯ細胞など）発現ベクター、昆虫細胞（例えばＳ
ｆ９、Ｔｎ５など）発現ベクターに再クローニングして
発現させる。

【００４８】次いで、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｔｎ５）を用
いたヒトパルボウイルス蛋白の発現検討より、Ｔｎ５細
胞を用いた方がＳｆ９細胞を用いるより発現量が多いこ
とを確認した。

【００４９】発現された Empty particle は、ウイルス
粒子様構造を取っているため、ウイルス粒子の精製法が
適用できる。例えば、ショ糖密度勾配遠心法や塩化セシ
ウム密度勾配遠心法等で精製できる。

【００５０】発現させ、精製した Empty particle を炭
酸バッファー（pH9.5 ）及びＰＢＳ等で至適濃度に希釈
してから、ＥＬＩＳＡ用ポリスチレンマイクロプレート
に固相して、ヒトパルボウイルス抗体検出エンザイムイ
ムノアッセイ試薬を作製した。

【００５１】また、発現させ、精製した Empty particl
e をＰＢＳ等により至適濃度まで希釈して、Empty part
icle キャプチャー法によるエンザイムイムノアッセイ
試薬を作製した。

【００５２】この試作したエンザイムイムノアッセイ試
薬により、伝染性紅斑流行時の血清を用いたヒトパルボ
ウイルス抗体検出を行った。その結果、患者血清中から
精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたエンザイムイ
ムノアッセイとほぼ同等な検出感度及び特異性が得られ
た。従って、本発明であるバキュロウイルス発現蛋白Em
pty particleを用いたエンザイムイムノアッセイ試薬
は、最も検出感度及び特異性が高いので、従来よりも確
実でかつ臨床学的に有意義なヒトパルボウイルス抗体検
出試薬であることが分かった。

【００５３】

【発明の効果】本発明のヒトパルボウイルス非構造遺伝
子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、その全配列ある
いはＰＣＲ法で得られるＤＮＡ断片を公知の発現ベクタ
ーに導入し、該発現ベクターで形質転換した宿主細胞内
で発現させることにより、ラジオイムノアッセイ法、エ
ンザイムイムノアッセイ法等の診断に使用し得る組換え
抗原を得ることができる。また、ヒトパルボウイルス構
造遺伝子ＶＰ−１に対するＩｇＧ抗体は、ヒトパルボウ
イルス構造遺伝子ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体に比べ、
抗体量の持続性が長いことに基づいて、ＩｇＧ抗体だけ
でも感染時期の推測が可能なヒトパルボウイルス抗体検
出系の開発を行うことが出来る。また、感染初期におい
てはヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２に対す
る抗体の方がヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−
１に対する抗体より抗体量が多い場合が多々あることに
基づいて、ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−
１、ＶＰ−２を混合することにより、従来の抗ヒトパル
ボウイルス抗体検出系よりも検出率が高いヒトパルボウ
イルス抗体検出試薬を開発することが出来る。また、バ
キュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いたエン
ザイムイムノアッセイが、ヒトパルボウイルス粒子を用
いたエンザイムイムノアッセイと同等な検出感度及び特
異性を示していることから、従来よりも確実でかつ臨床
学的に有意義なヒトパルボウイルス抗体検出試薬を開発
することが出来る。また、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｔｎ５）
を用いた発現量の検討から、Ｔｎ５細胞を用いた方がＳ
ｆ９細胞を用いるより発現量が多いことを見い出し、ヒ
トパルボウイルス抗原の高収量な大量発現系を確立する
ことが出来る。

【００５４】以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００５５】

【実施例】実施例１ヒトパルボウイルス遺伝子のクローニング（１）ヒトパルボウイルスゲノムＤＮＡの調製伝染性紅斑流行時にヒトパルボウイルスに感染した患者
二人の血清（血清No.8及びNo.10 ）各々約200 μl をリ
ン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕(pH7.2) で１０倍に希釈
した。希釈した血清に最終濃度１００μｇ／ｍｌのプロ
テインネースＫと最終濃度１％のドデシル硫酸ナトリウ
ム〔ＳＤＳ〕を加え、３７℃で約１時間反応させた。次
いで、この反応液を等量に分け、ＴＥ飽和フェノール、
クロロホルム及びイソアミルアルコール（２５：２４：
１）を等量加えて混合した。混合後、１５，０００ｒｐ
ｍ、約１０分間遠心分離して上清を回収した。回収した
上清に最終濃度1 μg/mlのグリコーゲンを加え、さらに
上清の1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた後、全溶液
の２．５倍量のエタノールを加えて、−２０℃で一晩静
置してエタノール沈澱を行った。

【００５６】エタノール沈澱溶液を１５，０００ｒｐ
ｍ、約１０分間遠心分離した。沈澱を７０％エタノール
で洗浄後、乾固させた。乾固後、ＴＥバッファー（10mM
Tris-HCl(pH7.5)-1mM EDTA ）２０μｌに溶解した。

【００５７】（２）ヒトパルボウイルス遺伝子の増幅及
び塩基配列の決定実施例１−（１）で得たヒトパルボウイルスゲノムＤＮ
Ａ溶液1 μl を用いて、Saiki らの方法［Nature,324:1
63(1986)］に従い、Gene Amp PCR Reagent Kit（宝酒造
社製）を用いたＰＣＲ法で、ヒトパルボウイルス非構造
遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を増幅した。即
ち、５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３），５ｍＭＭｇＣｌ2 ，０．１％ゼラチ
ンを含む反応液中にヒトパルボウイルスＤＮＡ溶液１μ
ｌと下記の２種類のＤＮＡプライマーそれぞれ１００ｐ
ｍｏｌｅｓ及びＴａｑポリメラーゼ５ユニットを加え、
最終量１００μｌとした。 D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 図１に２種類のＤＮＡプライマー位置を示した。増幅断
片はヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を
含む遺伝子領域（Ｆ）、ヒトパルボウイルス構造伝子を
含む遺伝子領域（ＶＰ）、ヒトパルボウイルス非構造遺
伝子を含む遺伝子領域（ＮＳ）を含む。

【００５８】この反応液を（９５℃、１分）−（５５
℃、２分）−（７２℃、３分）のサイクルで増幅反応を
３０サイクル行った後、さらに７２℃、５分ポリメラー
ゼ反応を行わせ、ＤＮＡの伸長反応を完全にした。反応
終了液を１％アガロースゲル電気泳動で分画した結果、
約４．７ＫｂのＰＣＲ増幅産物を確認した。この約４．
７ＫｂのＰＣＲ増幅産物をGeneclean II［BIO101社製］
でＤＮＡを回収した後、さらにDNA Blunting Kit（宝酒
造製）を用いて平滑化した。

【００５９】次にpUC19 ５μｇを制限酵素SmaI ５ユニ
ットで３７℃、２時間消化後、アルカリフォスファター
ゼ（BRL 社製）で５’末端を脱リン酸化した。

【００６０】上記ＰＣＲ増幅断片とpUC19 断片をLigati
on Kit（宝酒造社製）を用いて結合させ、ＣａＣｌ₂ 法
〔Molecular Cloning,p250 Cold Spring Harbar Labora
tory〕によって大腸菌XL1-Blueに導入した。得られた形
質転換体を適当に１０個選択、Birnboimらのアルカリ―
ＳＤＳ法〔Nucleic Acids Res.,7:1513(1979) 〕でＤＮ
Ａを精製し、制限酵素マッピングによりＰＣＲ増幅断片
を有するクローン（血清No.10 由来：pUC19/F8、血清N
o.8由来：pUC19/C2と命名）を得た。なお、これらの形
質転換体（Escherichia coli XL1-Blue(pUC19/F8) 及び
Escherichia coliXL1-Blue(pUC19/C2) とそれぞれ命名
した）は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ており、その受託番号は、それぞれ微工研菌寄第１３１
２５号及び微工研菌寄第１３１２４号である。

【００６１】得られたクローンからプラスミドＤＮＡを
精製し、各ＰＣＲ増幅断片について、Sequenase Versio
n 2.0 DNA Sequencing Kit（United State Biochemical
Corporation 製）或いはＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサ
ー３７３Ａで塩基配列を決定した（図２〜図１０）。そ
の結果、非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域
は、4,677 bp、構造遺伝子を含む遺伝子領域は、2,756
bp、非構造遺伝子を含む遺伝子領域は、3,383 bpであっ
た。そこで、アメリカ及びヨーロッパで解析された既知
のヒトパルボウイルス遺伝子配列（前述）との比較を行
った（表１〜３）。

【００６２】

【表１】

【００６３】

【表２】

【００６４】

【表３】

【００６５】表１〜３より、式（１）〜（４）で表され
る塩基配列及びアミノ酸配列中、塩基レベルで４１箇
所、アミノ酸レベルで１０〜１３箇所が、公知のヒトパ
ルボウイルスＢ１９株（Ａｕ株、Ｗｉ株）と異なってい
た。またこの結果より、ヒトパルボウイルスは欧米と日
本との間で地域差の存在が示唆され、本発明である式
（１）〜式（４）は、新規なヒトパルボウイルス遺伝子
であることが見いだされた。

【００６６】実施例２大腸菌を用いたＶＰ−１及びＶ
Ｐ−２抗原の発現（１）マルチクローニング部位を有する発現ベクターの
作成特開平４―８２９００に記載のＰL プロモーター発現ベ
クター pPLN-CSF214C△９５μg を制限酵素NdeI及びH
indIII それぞれ5unitsで３７℃、２時間消化後、１％
アガロースゲル電気泳動で3.5Kb のＤＮＡ断片を分画
し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。次にpUC19 を同
様に制限酵素NdeI及びHindIII で消化後、１％アガロー
スゲル電気泳動を行ない、0.27Kbの断片を回収した。3.
5Kb の断片と0.27Kbの断片をLigation Kit（宝酒造社
製）を用いて結合させ、大腸菌JM109に導入した。

【００６７】得られた形質転換体を適当に１０個選択、
アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素NdeI及
びHindIII によるマッピングにより目的のプラスミドpP
LN-MCSを取得した（図１１）。

【００６８】（２）ＶＰ−２抗原発現ベクターの作製実施例１で得られたプラスミドpUC19/F8 5μg を制限酵
素HindIII 5unitsで３７℃、２時間消化後、１％アガロ
ースゲル電気泳動で5.1Kb のＤＮＡ断片を分画し、Gene
clean IIでＤＮＡを回収した。この断片を自己結合さ
せ、大腸菌JM109に導入した。得られた形質転換体を適
当に１０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製
し、制限酵素PstI及びHindIII によるマッピングにより
目的のプラスミドpVP を取得した。

【００６９】プラスミドpVP 10μg を制限酵素EcoRI 10
units で３７℃、２時間消化し、フェノール抽出―エタ
ノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素PstI
1unitで３７℃、１０分間部分消化し、１％アガロース
ゲル電気泳動を行なった。1.8Kb の断片を分画し、Gene
clean IIでＤＮＡを回収した。次にプラスミドpPLN-MCS
5μg を制限酵素NdeI及びEcoRI それぞれ10units で３
７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で3.
5Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回
収した。さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、以下に
示すオリゴヌクレオチドを合成した。 5'-TATGACTTCAGTGAATTCTGCA-3' 5'-GAATTCACTGAAGTCA-3' 上記オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造
社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リン酸化オ
リゴヌクレオチドをアニールした。

【００７０】1.8Kb の断片、3.5Kb の断片及びアニール
したオリゴヌクレオチドを結合させ、大腸菌N4830-1 に
導入した。得られた形質転換体を適当に２４個選択、ア
ルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素NdeI,Pst
I 及びEcoRI によるマッピングにより目的のプラスミド
pVP200を取得した（図１２）。

【００７１】（３）ＶＰ−１抗原発現ベクターの作製プラスミドpVP 10μg を制限酵素HindIII とBamHI でそ
れぞれ10units で３７℃、２時間消化後、１％アガロー
スゲル電気泳動で1.5Kb のＤＮＡ断片を分画し、Genecl
ean IIでＤＮＡを回収した。次にプラスミドM13mp19 RF
5μg も同様に制限酵素HindIII と BamHIで１％アガロ
ースゲル電気泳動を行ない、7.2Kb の断片を回収した。
1.5Kb 及び7.2Kb の断片を結合させた後、大腸菌JM109
に感染させた。組換えファージの選択はXgal存在下、La
cZを指標として行った。White plaqueを適当に１２個選
択、大腸菌JM109 に再感染させた。アルカリ―ＳＤＳ法
でＲＦ型ＤＮＡを精製し、制限酵素HindIII 及びBamHI
によるマッピングにより目的のプラスミドp19-VPを取得
した。

【００７２】次にプラスミドp19-VPを大腸菌JM109 に感
染させ、ファージを取得した。これより一本鎖ファージ
ＤＮＡを精製した。また変異導入プライマーとして以下
の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。 5'- TTACTCATATGCTACAAAGCTTGGCG -3' 一本鎖ファージＤＮＡと変異導入プライマーをアニール
した後、T7-GEN（UnitedStates Biochemical Corporati
on(USB) 社製）を用いて部位特異的変異（site-directe
d mutagenesis ）を行った。site-directed mutagenesi
s の方法はUSB 社のプロトコールに従った。変異導入部
位は図１３に示す通りである。得られたファージを適当
に２４個選択し、大腸菌JM109 を再感染させた。アルカ
リ―ＳＤＳ法でＲＦ型ＤＮＡを精製し、制限酵素NdeIに
よるマッピング及びDNA sequencingにより目的のプラス
ミドmp19-VP1を取得した。

【００７３】プラスミドmp19-VP1 20 μg を制限酵素Nd
eIとBglIでそれぞれ20units で３７℃、２時間消化後、
１％アガロースゲル電気泳動で0.6Kb のＤＮＡ断片を分
画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。プラスミドpV
P 10μg を制限酵素BstXI 10units で５５℃、２時間消
化後、さらに制限酵素BglI 10unitsで３７℃、２時間消
化し１％アガロースゲル電気泳動で1.7Kb のＤＮＡ断片
を分画し、GenecleanIIでＤＮＡを回収した。さらにプ
ラスミドpVP200 10 μg を制限酵素BstXI 20units で５
５℃、２時間消化後、さらに制限酵素NdeI 20unitsで３
７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で3.
8Kb のＤＮＡ断片を分画し、GenecleanIIでＤＮＡを回
収した。上記0.6Kb 、1.7Kb 及び3.8Kb のＤＮＡ断片を
結合させ、大腸菌N4830-1 に導入した。得られた形質転
換体を適当に２０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡ
を精製し、制限酵素NdeI、BstXI 及びPvuII によるマッ
ピングにより目的のプラスミドpVP100を取得した（図１
４）。

【００７４】（４）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の発現大腸菌N4830-1[pVP100] 及び大腸菌N4830-1[pVP200] を
50μg/ml Ampicilinを含むＬＢ培地１ｍｌで３０℃、１
６時間培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１０
０ｍｌに接種した。３０℃、約３時間培養後、予め６５
℃に暖めたＬＢ培地１００ｍｌを加え、４２℃でさらに
３時間培養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。

【００７５】菌体の一部をPhosphate Buffered-Saline
(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemm
li の方法〔Nature,227:680(1970)〕に従ってＳＤＳ―
ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
を行った。泳動後、伝染性紅斑患者血清を用いてウエス
タンブロッティング〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76:311
6-3120(1979)〕を行った。その結果、分子量84,000及び
58,000の位置に反応した。従ってＶＰ−１及びＶＰ−２
抗原の発現が確認された。

【００７６】また超音波破砕処理した菌体を5,500gで１
０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離した。そ
れぞれの画分をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳
動しコマシュー・ブリリアント・ブルー(CBB) で染色し
た結果、ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原は沈澱画分に見ら
れ、インクルージョン・ボディを形成していた。

【００７７】（５）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原発現大腸
菌の培養大腸菌N4830-1[pVP100] を50μg/ml Ampicilinを含むＬ
Ｂ培地２ｍｌで３０℃、７時間培養した。次に２Ｌ発酵
槽を用いて１ＬのJAR 培地（0.7% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO
₄, 0.5% (NH₄)₂SO₄, 0.1% クエン酸ナトリウム、 0.02%
MgSO₄・7H₂O,2.5%グルコース、 0.4% 酵母抽出物、 0.
4% カザミノ酸, 0.4%ヒスチジン, 0.4%イソロイシン,
0.4%バリン, 50μg/mlアンピシリン）で３０℃、約１６
時間培養した。さらに７０Ｌ発酵槽を用いてJAR 培地
（４０Ｌ）で３５℃で培養した。O.D.₅₅₀=5 に達した
時、カザミノ酸を終濃度2%、ヒスチジン、イソロイシン
及びバリンをそれぞれ終濃度0.4%になるように添加した
後、４２℃、３時間培養した。

【００７８】培養液は限外ろ過装置で濃縮後、菌体を５
Ｌの破砕buffer（50mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA, 30
mM NaCl ）に懸濁した。Manton Gaulin ホモジナイザー
を用いて菌体を破砕した（7,500PSI × ３回）。次に
5,500gで３０分間遠心分離し沈澱を集めた。この沈澱を
２．５ＬのDetergent buffer（50mM Tris-HCl(pH8.0),
50mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Triton X-100 ）に懸濁、
４℃、３０分間攪はんの後、5,500gで１５分間遠心分離
し沈澱を集めた。このDetergent bufferによる懸濁−遠
心分離操作を３回行った。得られた沈殿（インクルージ
ョン・ボディ;IBs）は−２０℃に保存した。

【００７９】大腸菌N4830-1[pVP200] についても同様に
行い、インクルージョン・ボディを得た。

【００８０】（６）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の精製実施例２−（５）で得たＶＰ−１のインクルージョン・
ボディ、湿重量50mgを1ml のIBs 溶解バッファー（8M尿
素,10mM DTT,1mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH7.0)）に溶解
した。この溶液を1ml のSDS サンプルbuffer（130mM Tr
is-HCl(pH6.8),4% SDS, 15% Ficoll Type400 （Pharmac
ia 社製）, 10% β−メルカプトエタノール, 0.002%ブ
ロムフェノール）と混合し、80℃、20分間の熱処理を行
なった。このサンプルからProSieve Gel System （FMC
社製）を用いてＶＰ−１抗原を精製した。使用説明書に
従って、電気泳動を行い分子量ごとにサンプル中のタン
パクを分画し、ＶＰ−１抗原を含む部分のみを切り出
し、抽出バッファー（8M尿素, 10mM DTT, 1mM EDTA, 20
mM Tris-HCl(pH7.0)）でゲル中より抽出した。なおゲル
板は14.5cm x 16.5cm x 2mm のものを用いた。抽出した
タンパクをPharst System （Pharmacia 社製）を用い電
気泳動を行い銀染色した結果、ＶＰ−１抗原の分子量位
置(84、000)にのみバンドを認めた。ＶＰ−２抗原につい
ても同様に精製し、ＶＰ−２抗原の分子量位置(58、000)
にのみバンドを認めた。

【００８１】実施例３ＶＰ−１抗原誘導体の作製（１）ＶＰ−１抗原誘導体ベクターの作製本発明の式（２）のＶＰ−１抗原（７８１アミノ酸）の
Ｎ末端側４６アミノ酸及びＣ末端側９８アミノ酸欠失さ
せたＶＰ−１抗原誘導体（６３７アミノ酸）を作製し
た。

【００８２】実施例１−（２）で得たpUC19/F8 20 μg
を制限酵素Ssp I 20単位で３７℃、２時間消化後、１％
アガロースゲル電気泳動で約1.9Kb のＶＰ−１ＤＮＡ断
片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。

【００８３】次にプラスミドpKK233-2（ファルマシア
製） 5μg を制限酵素Nco I ５単位で３７℃、２時間消
化後、末端をBlunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端と
した。

【００８４】約1.9Kb の断片とベクターをLigation Kit
を用いて結合させ、大腸菌XL1-Blueに導入した。得られ
た形質転換体を適当に１０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法
でＤＮＡを精製し、制限酵素PstI及びHindIII によるマ
ッピングにより目的のプラスミドpVP300を取得した（図
１５）。

【００８５】（２）ＶＰ−１抗原誘導体の発現大腸菌XL1-Blue[pVP300]を50μg/mlアンピシリンを含む
ＬＢ培地１ｍｌで３７℃、１６時間培養した。前培養液
１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３７
℃、約２時間培養後、終濃度1mM IPTGになるように添加
後、３７℃でさらに３時間培養した。培養後、実施例２
−（４）で示した方法で発現状況を調べた結果、ＶＰ−
１抗原誘導体（ＶＰ−１／ＳｓｐＩ抗原と命名）もイン
クルージョン・ボディを形成していることが確認され
た。さらにウエスタンブロッティング及び蛍光抗体間接
法により、分子量70,000の位置に反応した。従ってＶＰ
−１／ＳｓｐＩ抗原もＶＰ−１、ＶＰ−２抗原と同じく
抗原性を有することがわかった。

【００８６】実施例４バキュロウイルスを用いたＶＰ
−１及びＶＰ−２抗原の発現（１）組換え転移ベクターの作製実施例１−（２）で得たpUC19/F4 20 μg を制限酵素Hi
ndIII 20units で３７℃、２時間消化後、１％アガロー
スゲル電気泳動で2.5Kb のＶＰ−１ＤＮＡ断片を分画
し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。回収したＶＰ−
１断片をBluntingKitで平滑末端とした。

【００８７】同様にpUC19/F8 20 μg を制限酵素HpaII
とSalIでそれぞれ20units で３７℃、２時間消化後、１
％アガロースゲル電気泳動で1.8Kb のＶＰ−２ＤＮＡ断
片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。ＶＰ−
２断片をBlunting Kitで平滑末端とした。

【００８８】一方転移ベクターpAcYM1[J.Gen.Virol.,6
8:1233(1987)] 5μg を制限酵素BamHI で３７℃、２時
間消化後、Blunting Kitで平滑末端とした。さらにアル
カリフォスファターゼ（BRL 社製）で５’末端の脱リン
酸化を行った。

【００８９】ＶＰ―１及びＶＰ―２断片をそれぞれpAcY
M1を結合させた後、大腸菌XL1-Blueに感染させた。得ら
れた形質転換体を適当に２０個選択、アルカリ―ＳＤＳ
法でＤＮＡを精製し、制限酵素によるマッピングにより
目的のプラスミドpAcVP1、pAcVP2 を取得した（図１
６）。

【００９０】（２）組換えウイルスの作製 φ３５ｍｍディッシュ（住友ベ−クライト社製）を用
い、夜蛾幼虫由来株化細胞:Sf9(Spodopterd frugiperd
a) 細胞は、10% 牛胎児血清(FCS) を含む培地（TC-10
0、またはGrace's 培地）で、夜蛾幼虫由来株化細胞:Tn
5:(Trichoplusia ni)細胞は、無血清培地（TC-100、ま
たはGrace's 培地）で３〜４日培養した。次いで、φ３
５ｍｍディッシュ（住友ベ−クライト社製）を用い、１
×１０⁶ ／ディッシュ、培地量約1.5ml になる様に前記
述の培養細胞を調整した。この状態で３０〜４０分静置
した後、無菌的に上記培地を取り去り1.5ml 無血清培地
（EX-CELL 400 またはGrace's 培地）に交換した。

【００９１】ここにAcNPV （キンウラバ亜科、Autograp
ha californica nuclear polyhedorosis virus）ＤＮＡ
約20ng/ μl を1 μl 、転移ベクター2-3 μg/μl 濃度
を1μl 、滅菌蒸留水6 μl の計8 μl 及びリポフェク
チン（ＢＲＬ社製）5 μl 、滅菌蒸留水3 μl の計8 μ
l をエッペンドルフチューブ内でおだやかに混和した
後、上記無血清培地中に１滴ずつ静かに全体に滴下した
（コ・トランスフェクション）。そしてモイスチャーチ
ャンバー内へ収納し、２６〜２６．５℃で３日間培養し
た。

【００９２】コ・トランスフェクション後、３日目の培
養上清約1ml をチューブに移しそれらの各20μl を用い
て10^-1〜10^-3まで希釈しそれらの100 μl を１×１０⁶
／ディッシュ（φ３５mm）に調整した細胞に接種し約１
時間静置して吸着させる。その後、ウイルス液を捨て１
％低融点寒天（ＳｅａＰｌａｑｕｅ：宝酒造社製）2m
l を重層し、凝固した後更に1ml の培地（Ｓｆ９細胞の
場合は10%FCSを含むTC-100またはGrace's 培地を用い、
Ｔｎ５細胞の場合はTC-100またはGrace's の無血清培地
を用いる。）を重層し２６〜２６．５℃で３〜４日培養
後、10mMリン酸緩衝塩溶液(10mM PBS)中0.01%(W/V)ニュ
ートラルレッドを1ml 加えプラークを染色し透明な組換
え体を選択した。

【００９３】プラ−クアッセイによって得た組換え体と
思われるプラークをパスツールピペットによってゲルご
と採取し、それらを細胞培養用培地400 μl に浮遊し十
分攪拌を行った後、約３０００ｒｐｍ、約５分間の条件
でアガロ−スゲルを沈澱させ、上清をプラ−クアッセイ
時同様10^-1〜10^-3までそれぞれの培地（Ｓｆ９細胞の場
合は10%FCSを含むTC-100またはGrace's 培地を用い、Ｔ
ｎ５細胞の場合はTC-100またはGrace's の無血清培地を
用いる。）で希釈し、低融点寒天を用いて同様にプラ−
クアッセイを行い組換えウイルスを純化した。

【００９４】プラ−ク純化（ｐｌａｑｕｅｐｕｒｉｆ
ｙ）によって得られた組換え体の力価を細胞に感染させ
ることで上昇させた。この時も同様にφ３５mmディッシ
ュに約１×１０⁶ ／ディッシュのＳｆ９細胞及びＴｎ５
細胞を用意し、約３０分間静置後培地の大部分を捨てそ
こに得られた組換え体を約100 μl 加え、更に約１５分
間隔でおだやかに振盪混和を行い計４回、約１時間にわ
たってこの操作を行った。

【００９５】次に、Ｓｆ９細胞の場合は 10% FCSを含む
培地（TC-100またはGrace's ）を、Ｔｎ５細胞の場合は
無血清培地（TC-100またはGrace's ）を1.5ml 加え、３
〜４日間培養を行う。この時得られた上清を用いて７５
ｃｍ² 培養ビン２本を用いて、同様に細胞を用意し、既
に１度力価を上げてある組換えウイルス液1ml を接種
し、３〜４日間の培養の後、得られた上清を構造遺伝子
発現用の高力価組換え体とした。

【００９６】φ３５mmディッシュに約１×１０⁶ ／ディ
ッシュで細胞数を調整し培地の大部分を吸引し、そこに
高力価組換え体（約1x10⁷pfu/ml ）をM.0.I.５〜１０に
なる様に接種し約１５分間隔で穏やかに振盪しながら計
４回、１時間にわたりこの操作を続けた。

【００９７】その後、培地（Ｓｆ９細胞の場合は10%FCS
を含むTC-100またはGrace's 培地を用い、Ｔｎ５細胞の
場合はTC-100またはGrace's の無血清培地を用いる。）
を0.5-1ml 加え３〜４日間、２６〜２６．５℃で培養し
ヒトパルボウイルス構造遺伝子（ＶＰ−１、ＶＰ−２及
びＶＰ−１＋ＶＰ−２）の発現を行った。

【００９８】発現蛋白は、伝染性紅斑患者血清より精製
したヒトパルボウイルス粒子を対照として、１０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ用い２０ｍＡで約２時間電気泳動後、CB
B 染色を行い、その分子量と発現量の確認を行った。そ
の結果、ヒトパルボウイルスのＶＰ−１、ＶＰ−２と同
分子量の発現蛋白が確認された。またＴｎ５細胞を用い
た方がＳＦ−９細胞を用いるよりも発現量が多いことが
分かった。

【００９９】抗原性の確認は、伝染性紅斑患者血清を用
いたウエスタンブロッティング及び蛍光抗体間接法で行
った。その結果、発現蛋白質と特異的に反応するバンド
の存在と蛍光発色が確認され、発現蛋白がヒトパルボウ
イルス構造蛋白質ＶＰ−１、ＶＰ−２であることを確認
した。

【０１００】（３）ヒトパルボウイルス発現蛋白質 Emp
ty particle の精製と電子顕微鏡を用いた Empty parti
cle の確認昆虫細胞Ｓｆ９、Ｔｎ５等を用いて、好ましくはＴｎ５
細胞を用いて、表面積７５ｃｍ2 のプラスティック製細
胞培養用ボトル（住友ベ−クライト社製）により大量に
ヒトパルボウイルス構造蛋白質を発現させ精製に供し
た。大量発現させた発現蛋白質（７５ｃｍ² プラスティ
ック製細胞培養用ボトル２０本分）はピペッティングに
よって細胞培養液を用いて培養細胞ごとハ−ベストし容
量５００ｍｌの遠心沈澱用ボトル（日立社製）２本に移
し（約３００ｍｌ）これらを１０００〜３０００ｒｐｍ
，２０℃，１５分間の遠心条件で細胞成分を沈澱させ
上清は廃棄した。沈澱細胞はＰＢＳ（−）（りん酸緩衝
食塩液、日水製薬社製）またはHanks'BSS （ハンクス緩
衝塩類液，自家製）１０ｍｌに浮遊させ充分混和した後
−８０℃の超低温冷凍庫を用いて２〜３回の凍結融解操
作を行った。次に凍結融解後の細胞浮遊液を５本のプラ
スティック製スピッツ管（栄研器材社製）に各々２ｍｌ
分注し１００〜５００Ｗ，０℃，５〜２０分間の条件で
超音波処理（オリンパス社製）を合計２〜４回行った。
この際、各細胞浮遊液から約５０μｌずつ各々採取し、
スライドグラス上に滴下した後カバ−グラスを置き倍率
２００倍にて光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）により観察
し細胞の破砕状態を確認した。ここで細胞浮遊液から細
胞成分を分離する為に約１００００ｒｐｍ，２０℃，１
５分間の遠心沈澱を行った。この操作によって得られた
上清約１０ｍｌをサンプルとして次の精製操作を行っ
た。まず、超遠心用１３ＰＡチュ−ブ（日立工機社製）
に４０％シュクロ−ス（W/V ）（PBS(-)またはHanks'BS
S に浮遊）（ナカライテスク社製）を２〜３ｍｌ分注し
これらシュクロ−スクッションの上へ上記サンプルを
重層し約３５０００ｒｐｍ，２０℃，１６〜２０時間超
遠心を行い微量雑蛋白質を除外すると共にヒトパルボウ
イルス発現蛋白質を沈澱させた。沈澱させたヒトパルボ
ウイルス発現蛋白質は１３ＰＡチュ−ブ管底に接着して
いる為PBS(-)各２ｍｌを滴下しピペッティング及び振と
うにより充分混和した。更にこの時肉眼で大分子が確認
されるため１００〜５００Ｗ，０℃，２〜１０分間の超
音波処理を行い浮遊溶液とした。次に、予め超純水（mi
li-Q ミリポア社）に密度１．２，１．３，１．４（ｇ
／cm³ ）となる様調製したCsCl溶液（ナカライテスク社
製）を密度の大きい順にチュ−ブの管底から２，５，２
ｍｌ各々重層しグラジエントをプレフォ−ミングした後
サンプル２ｍｌを２本の超遠心チュ−ブに重層し約３５
０００ｒｐｍ，２０℃，４０〜４５時間の条件下で一度
目の超遠心による精製を行った。超遠心後、各サンプル
をおよそ２０本のフラクションにペリスタポンプ等を用
いて分離し、抗ＶＰ１モルモット抗体（１．５μｇ／ｍ
ｌ）固相化プレ−ト及び抗ＶＰ１モルモットＰＯＤ標識
抗体（自家製）を用いて抗原検索を行った。その結果、
横軸にフラクションNO. を縦軸にＯ．Ｄ．４９２／６３
０ｎｍでの測定結果をグラフ化した場合１峰性のカ−ブ
が得られた為ピ−クの存在するフラクションを用いて同
様に二回目の超遠心操作及び抗原検索を行った。この
際、各フラクションに於けるCsClの重量パ−セントを糖
度計（ATAGO 社製）により測定しレファレンスとなる密
度１．２，１．３，１．４（g/cm³ ）の各CsCl溶液の重
量パ−セントの値から各フラクション溶液の密度を換算
しグラフ化した。この時、横軸にはフラクションNo. を
縦軸には各フラクションの密度値をとった。その結果、
チュ−ブの管底から管口に向かって密度が低下する関係
が確認された。更にこれらの関係から抗原を含むフラク
ション溶液の密度は、約１．３g/cm³ であることが確認
された。次にこのサンプルを１３ＰＡチュ−ブ内でPBS
(-)によって１５〜２０倍に希釈し約３５０００ｒｐ
ｍ，２０℃, １０〜２０時間超遠心を行いヒトパルボ
ウイルス精製発現蛋白質を沈澱させた。これらの発現蛋
白質は最終的に１〜２ｍｌPBS(-)に浮遊し発現蛋白質原
液とした。電子顕微鏡による確認は、上記発現蛋白液を
試料とし、４％ Uranic acetate により陰性染色を行
い、倍率５００００倍にして透過型電子顕微鏡（日立
製）で検鏡した。その結果、図１７に示したような約２
３ｎｍの中空円型のウイルス様構造物いわゆる”Empty
particle”の存在を確認した。

【０１０１】実施例５大腸菌発現抗原ＶＰ−１、ＶＰ
−２抗原を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出（１）ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原固相プレートの作製実施例２−（６）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−
１、ＶＰ−２抗原を50mM炭酸バッファー(pH9.5) で各々
1-10μg/ml濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプ
レート（ヌンク社製）に100 μl/ウェルで分注し、４℃
で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレー
トを最終濃度0.05% Tween20 を含むPBS200 μl/ウェル
で３〜４回洗浄後、最終濃度0.05% 牛血清アルブミン(B
SA) と0.05% Tween20 を含む10mM PBS 200μl/ウェル加
えて４℃一晩静置し、ＶＰ−１、ＶＰ−２固相マイクロ
プレートを作製した。

【０１０２】（２）伝染性紅斑患者血清を用いた抗ヒト
パルボウイルスＩｇＧ抗体検出前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中のプレート
保存液を除いた後、伝染性紅斑患者血清を0.05% BSA と
0.05% Tween20 を含む10mM PBSで２００倍に希釈し、そ
の100 μl を抗原固相マイクロプレートのウエルに加
え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反
応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３
〜４回洗浄した。ついで、0.05% Tween20 含む5mM PBS
で約４００００倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキ
シダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を100 μl/ウェル加え、
室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含
む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄
後、3.3mg/ml Ｏ−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.0)に、0.02% 過酸化水素
水を加えた基質液を100 μl/ウェル加えて室温で約３０
分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を100 μl/ウェ
ル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を
用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエ
ルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表５）。

【０１０３】

【表５】ウイルス粒子は患者血清より精製。

【０１０４】この結果より完全長ヒトパルボウイルス構
造タンパク質ＶＰ−１を用いたエンザイムイムノアッセ
イの方が完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ
−２を用いたエンザイムイムノアッセイよりもＩｇＧ抗
体検出率が高かった。

【０１０５】しかし、完全長ヒトパルボウイルス構造タ
ンパク質ＶＰ−１に対する反応性よりも、完全長ヒトパ
ルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２に対する反応性の
強い血清が存在することが分かったので、ヒトパルボウ
イルス構造タンパク質ＶＰ−１のみでなくヒトパルボウ
イルス構造タンパク質ＶＰ−２を至適濃度に加え、好ま
しくはＶＰ−１を1 〜10μg/ml、ＶＰ−２を1 〜20μg/
ml加え、実施例５−（１）の方法でＥＬＩＳＡ用マイク
ロプレートに固相した。そこで、ＶＰ−１抗原を用いた
エンザイムイムノアッセイでは陰性、ＶＰ−２抗原を用
いたエンザイムイムノアッセイでは陽性になる血清を用
い、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原を混合固相したマイクロプ
レートを用いたＩｇＧ抗体検出を行った（表６）。

【０１０６】

【表６】その結果、ＶＰ−１またはＶＰ−２抗原のどちらか一方
にしか強く反応しない血清も効率よく検出することが出
来た。即ちＶＰ−１（またはＶＰ−２）抗原を用いたエ
ンザイムイムノアッセイは陽性で、完全長ヒトパルボウ
イルス構造タンパク質ＶＰ−２（またはＶＰ−１）抗原
を用いたエンザイムイムノアッセイは陰性であった血清
が、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原を混合したエンザイムイム
ノアッセイでは、すべて陽性になることが判明した。

【０１０７】（３）ＶＰ−１抗原誘導体を用いた抗パル
ボウイルスＩｇＧ抗体検出実施例３−（２）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−１
抗原誘導体を50mM炭酸バッファー(pH9.5) で各々1-10μ
g/ml濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート
（ヌンク社製）に100 μl/wellで分注し、４℃で一晩静
置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終
濃度0.05% Tween20 を含むPBS 200μl/wellで３〜４回
洗浄後、最終濃度0.05% 牛血清アルブミン(BSA) と0.05
% Tween20 を含む10mM PBS 200μl/well加えて４℃一晩
静置し、ＶＰ−１抗原誘導体固相マイクロプレートを作
製した。

【０１０８】次いで伝染性紅斑流行時の血清を用い、前
記マイクロプレートによる抗パルボウイルスＩｇＧ抗体
検出を行った。はじめにＶＰ−１抗原誘導体固相マイク
ロプレートウエル中のプレート保存液を除き、その後伝
染性紅斑患者血清を0.05% BSA と0.05% Tween20 を含む
10mM PBSで２００倍に希釈し、その100 μl を抗原固相
マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５
℃）で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含
む5mM PBS 200 μl/wellで３〜４回洗浄した。ついで、
0.05% Tween20 含む5mM PBS で約４００００倍に希釈し
た抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ
社）を100 μl/well加え、室温で約１時間反応させた。
反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/wellで３
〜４回洗浄した。洗浄後、3.3mg/ml Ｏ−フェニレンジ
アミン含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.0)
に、0.02% 過酸化水素水を加えた基質液を100 μl/well
加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ
硫酸を100 μl/well加えて反応を停止させ、マイクロプ
レート用比色計を用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６
３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表４）。

【０１０９】

【表４】ウイルス粒子は患者血清より精製。

【０１１０】この結果よりウイルス粒子を用いたエンザ
イムイムノアッセイよりも抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ
抗体検出率がかなり低いことが分かった。また、実施例
５−（２）の結果から、完全長ヒトパルボウイルス構造
タンパク質ＶＰ−１を用いたエンザイムイムノアッセイ
の方が部分発現であるＶＰ−１抗原誘導体を用いたエン
ザイムイムノアッセイより抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ
抗体検出率が高く、かつウイルス粒子を用いたエンザイ
ムイムノアッセイとの一致率も高いことが分かった。こ
のことは同じ発現抗原、例えばＶＰ−１抗原とＶＰ−１
抗原誘導体の場合、抗原部位の数及び立体構造が抗ヒト
パルボウイルスＩｇＧ抗体検出率の差の原因であると思
われた。よって、エンザイムイムノアッセイに用いる発
現抗原としては、抗原部位の数及び立体構造がウイルス
粒子の抗原部位の数及び立体構造に近いという条件が重
要となる。従って、同じ発現抗原でも部分発現抗原よ
り、完全長発現抗原の方が前記条件を満たしていると思
われた。

【０１１１】（４）伝染性紅斑患者血清を用いた抗ヒト
パルボウイルスＩｇＧ抗体の経時的変化の検討実施例５−（１）記載の抗原固相マイクロプレートを用
い、実施例５−（２）記載のエンザイムイムノアッセイ
法で、伝染性紅斑患者血清の抗ヒトパルボウイルスＩｇ
Ｇ抗体の経時的変化を調べた（図１８）。なお、ＶＰ−
１は５μｇ／ｍｌで、ＶＰ−２は１０μｇ／ｍｌで、Ｍ
ｉｘはＶＰ−１を５μｇ／ｍｌ、ＶＰ−２を１０μｇ／
ｍｌで固相した。

【０１１２】その結果、ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対す
るＩｇＧ抗体は共に出現するが、ＶＰ−１抗原に対する
ＩｇＧ抗体の方が、ＶＰ−２抗原に対するＩｇＧ抗体よ
り抗体量の持続性は長いことが分かった。

【０１１３】ところで、ＶＰ−２抗原のタンパク質のコ
ード領域は、ＶＰ−１抗原のＣ末端部分に完全に含まれ
ている。そこで、以前よりヒトパルボウイルスの抗体検
出には、ＶＰ−１抗原のみで十分可能であると思われて
いた。しかし、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原は免疫学的な反
応性に違いがあることが分かり、かつＩｇＧ抗体量の持
続性にも違いがあることが分かり、ヒトパルボウイルス
のより確実な診断には、ＶＰ−１抗原のみを用いたエン
ザイムイムノアッセイではなく、ＶＰ−２抗原も加えた
エンザイムイムノアッセイが必要であることが分かっ
た。即ちＶＰ−１及びＶＰ−２抗原混合系の方がＶＰ−
１またはＶＰ−２抗原単独系よりもヒトパルボウイルス
に対するＩｇＧ抗体の検出率は高くなることが判明し
た。

【０１１４】実施例６大腸菌発現抗原ＶＰ−１、ＶＰ
−２抗原を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出（１）抗ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、
ＶＰ−２抗体に対するパーオキシダーゼ標識実施例２−（６）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−
１、ＶＰ−２抗原各々200 μg/ml 1mlと完全アジュバン
ト（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml を等量混合し、エマルジョン
を作製して、モルモットに免疫した。ついで不完全アジ
ュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml を前述の抗原溶液と等
量混合しエマルジョンを作製して２回追加免疫した。追
加免疫した後、モルモットを全採血した。その血液を血
清分離し、硫安分画後、50mM Tris-HCl(pH7.6)で４℃、
一晩透析した。次ぎに50mM Tris-HCl(pH7.6)で平衡化し
たＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーにかけ、Ｕ
Ｖ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ. Ｄ. のピーク
を集めて、ＤＥＡＥ精製ＩｇＧ抗体画分とした。

【０１１５】このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法
〔酵素免疫測定法,2：91(1982)〕でパーオキシダーゼ標
識した。即ちパーオキシダーゼ4mg/mlになるようによう
に蒸留水で溶解した。ついで、0.1M 過ヨーソ酸ナトリ
ウム 0.2mlを加え、室温で約２０分反応させ、1mM 酢酸
ナトリウム緩衝液(pH4.0) で一晩透析した。透析後、0.
2M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5) を0.02ml加え、pH9-
9.5 にすると同時に前記述で精製したＩｇＧ抗体を8mg
加えた。

【０１１６】室温で約２時間反応させ、4mg/ml 水酸化
ホウ素ナトリウムを0.1ml 加え、４℃で約２時間反応さ
せた。反応後、10mM リン酸バッファーを用いてセファ
クリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８
０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダーゼ標識抗体画
分を集めた。

【０１１７】（２）伝染性紅斑流行時の血清８８検体を
用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＩＬＳ社製）を50
mM 炭酸バッファー(pH9.5) で５００〜１０００倍に希
釈し、ヌンク社製ポリスチレン平型分割マイクロプレー
ト（高結合タイプ）に100 μl/ウェル分注し、４℃、
１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを0.
05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗
浄後、0.5% BSAと0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/
ウェル加えて４℃、一晩静置し、抗ヒトＩｇＭモノクロ
ーナル固相マイクロプレートを作製した。ついで、この
抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレート
を用いて、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出試薬を
試作した。

【０１１８】次に、この試作した抗ヒトパルボウイルス
ＩｇＭ抗体検出試薬を用いて、伝染性紅斑流行時の血清
８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
を行った。前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中
のプレート保存液を除き、ついで、伝染性紅斑患者血清
を0.2% BSAと0.05% Tween20 含む10mM PBSで２００倍に
希釈し、その100 μl を前記述の抗ヒトＩｇＭモノクロ
ーナル抗体固相マイクロプレートに100 μl/ウェル加
え、室温（15℃〜25℃）で約１時間反応させた。反応
後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜
４回洗浄した。ついで、前記述で精製した完全長のヒト
パルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を0.
5% BSAと0.05% Tween20 を含む5mM PBS で5 μg/ml濃度
に希釈し100μl/ウェル加え、室温で約１時間反応させ
た。反応後、0.05% Tween20 を含む5mM PBS 200 μl/ウ
ェルで３〜４回洗浄した。0.5% BSAと0.05% Tween20 を
含む5mM PBS で２０００〜５０００倍に希釈した前記
述、実施例５−（１）のＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対す
るパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を100 μl/ウェ
ル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tw
een20 を含む5mM PBS 200μl/ウェルで３〜４回洗浄し
た。洗浄後、3.3mg/ml Ｏ−フェニレンジアミンを含む
0.1M クエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、終濃度0.02
% の過酸化水素水を加えた基質液を100 μl/ウェル加え
て室温で約３０分間反応させた。反応後、1.5N硫酸を10
0 μl/ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート
用比色計で主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍを用い
て各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表７）。

【０１１９】

【表７】

【０１２０】その結果、伝染性紅斑患者血清より精製し
たヒトパルボウイルス粒子を用いた抗ヒトパルボウイル
スＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノアッセイと比較した
ところ、検出感度がやや低いものの特異性は高かった。

【０１２１】従って、本発明である大腸菌で発現させた
構造タンパク質は、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検
出に有用である事が分かった。

【０１２２】実施例７バキュロウイルス発現蛋白 Emp
ty particle を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体
検出（１）バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle 固相
プレートの作製実施例４−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白 E
mpty particle を１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で各々
０．１〜１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平
型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｇ／ウェ
ルで分注し、４℃で１〜２日間静置した。１〜２日間静
置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３〜４回
洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ
２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静置し、バキュロ
ウイルス発現抗原Empty particles 固相マイクロプレー
トを作製した。

【０１２３】（２）伝染性紅斑患者血清８８検体を用い
た抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中のプレート
保存液を除いた後、伝染性紅斑患者血清を０．５％ＢＳ
Ａと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ
（ｐＨ７．２）で２００倍に希釈し、その１００μｌを
抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５
℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウ
ェルで３〜４回洗浄した。ついで、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳで約２００００〜４００００
倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシダーゼ標識抗
体（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ウェル加え、室温で約１
時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄
した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジ
アミン含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）に、０．０２％過酸化水素水を加えた基質液を１０
０μｌ／ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反
応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を
停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて主波長
４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値
を測定した（表８）。

【０１２４】

【表８】

【０１２５】この結果より、伝染性紅斑患者血清中より
精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたＩｇＧ抗体検
出エンザイムイムノアッセイとバキュロウイルス発現蛋
白Empty particle を用いたＩｇＧ抗体検出エンザイム
イムノアッセイの成績を比較したところ、陽性一致率が
１００％で陰性一致率も１００％であった。以上より、
バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いたＩ
ｇＧ抗体検出エンザイムイムノアッセイは、検出感度及
び特異性ともに、文献など他のヒトパルボウイルスＩｇ
Ｇ抗体検出エンザイムイムノアッセイよりも高いので、
より確実なＩｇＧ抗体検出が可能と成った。

【０１２６】実施例８バキュロウイルス発現蛋白 Emp
ty particles を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗
体検出（１）抗バキュロウイルス発現蛋白 Empty particles
抗体に対するパーオキシダーゼ標識実施例４−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白 E
mpty particles 各々１０〜５００μｇ／ｍｌを１ｍｌ
と完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍｌを等量混
合し、エマルジョンを作製して、モルモットに免疫し
た。ついで不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml
を前述の抗原溶液と等量混合しエマルジョンを作製して
２回追加免疫した。追加免疫した後、モルモットを全採
血した。その血液を血清分離し、硫安分画後、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で４℃、一晩透析し
た。次に５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で
平衡化したＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーに
かけ、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ. Ｄ.
のピークを集めて、ＤＥＡＥ精製ＩｇＧ抗体画分とし
た。

【０１２７】このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法
〔酵素免疫測定法,2：91(1982)〕でパーオキシダーゼ標
識した。即ちパーオキシダーゼ４ｍｇ／ｍｌになるよう
にように蒸留水で溶解した。ついで、０．１Ｍ過ヨー
ソ酸ナトリウム０．２ｍｌを加え、室温で約２０分反
応させ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）
で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）を０．０２ｍｌ加え、ｐＨ９〜９．
５にすると同時に前記述で精製したＩｇＧ抗体を８ｍｇ
加えた。

【０１２８】室温で約２時間反応させ、４ｍｇ／ｍｌ水
酸化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃で約２時
間反応させた。反応後、１０ｍＭリン酸バッファーを
用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、
ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダー
ゼ標識抗体画分を集めた。

【０１２９】（２）伝染性紅斑流行時の血清８８検体を
用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＩＬＳ社製）を５
０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で５００〜１００
０倍に希釈し、ヌンク社製ポリスチレン平型分割マイク
ロプレート（高結合タイプ）に１００μｌ／ウェル分注
し、４℃、１８時間以上静置した。静置後、マイクロプ
レートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ
２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄後、０．５％ＢＳＡ
と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ２００
μｌ／ウェル加えて４℃、一晩静置し、抗ヒトＩｇＭモ
ノクローナル固相マイクロプレートを作製した。つい
で、この抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロ
プレートを用いて、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検
出試薬を試作した。

【０１３０】次に、この試作した抗ヒトパルボウイルス
ＩｇＭ抗体検出試薬を用いて、伝染性紅斑流行時の血清
８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
を行った。はじめに、前記述の抗ヒトＩｇＭモノクロー
ナル抗体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存
液を除いた。ついで、伝染性紅斑患者血清を０．２％Ｂ
ＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭＰＢＳ
で２００倍に希釈し、前記述の抗ヒトＩｇＭモノクロー
ナル抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウェル加
え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反
応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ２
００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。ついで、前記述
で精製したバキュロウイルス発現抗原 Empty particles
を０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍ
ＭＰＢＳで０．０５〜５．０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、
それを１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応さ
せた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ
ＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。０．
５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰ
ＢＳで２０００〜２００００倍に希釈した前記述、実施
例８−（１）のバキュロウイルス発現抗原 Empty parti
cle に対するパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を１
００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反
応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ
２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．
３ｍｇ／ｍｌＯ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、終濃度
０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ
／ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、
１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止さ
せ、マイクロプレート用比色計で主波長４９２ｎｍ、副
波長６３０ｎｍを用いて各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定
した（表９）。

【０１３１】

【表９】

【０１３２】この結果より、伝染性紅斑患者血清中より
精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたＩｇＭ抗体検
出エンザイムイムノアッセイとバキュロウイルス発現蛋
白Empty particle を用いたＩｇＭ抗体検出エンザイム
イムノアッセイの成績を比較したところ、陽性一致率が
１００％で陰性一致率も１００％であった。

【０１３３】以上より、バキュロウイルス発現蛋白 Emp
ty particle を用いたＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノ
アッセイは、検出感度及び特異性ともに、文献などのヒ
トパルボウイルス抗体検出エンザイムイムノアッセイよ
りも高いので、より確実な抗体検出が可能となった。

【０１３４】実施例９ヒトパルボウイルス抗原検出（１）ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対する抗体固相マイク
ロプレートの作製実施例６−（１）記載の抗ヒトパルボウイルスモルモッ
ト抗体を５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で、
０．１〜５．０μｌ／ｍｌに希釈した。希釈後、ポリス
チレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μ
ｌ／ウェル分注し、４℃で１８時間以上静置した。静置
後、マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄
後、０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む５ｍＭＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静
置し、抗体固相マイクロプレートを作製した。

【０１３５】（２）伝染性紅斑流行時の血清を用いたヒ
トパルボウイルス抗原検出次に、抗体固相プレートを用いて、伝染性紅斑流行時の
血清によるヒトパルボウイルス抗原検出を行った。前記
述の抗体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存
液を除き、ついで、伝染性紅斑流行時の血清を０．２％
ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭＰＢＳ
で２００倍に希釈し、前記述の抗ヒトパルボウイルス抗
体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウェル加え、室
温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ２００
μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。

【０１３６】０．０５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含む５ｍＭＰＢＳで２０００〜５０００倍に希釈
したＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対するパーオキシダーゼ
標識モルモット抗体を１００μｌ／ウェル加え、室温で
約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウェルで３〜４回
洗浄した。

【０１３７】洗浄後、３．３mg/ml Ｏ−フェニレンジア
ミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた
基質液を１００μｌ／ウェル加えて室温で約３０分間反
応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル
加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で主
波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍを用いて各ウエル
のＯ. Ｄ. 値を測定した（表１０）。

【０１３８】

【表１０】

【０１３９】抗ヒトパルボウイルスモノクローナル抗体
固相マイクロプレートを用いたエンザイムイムノアッセ
イ〔第３７回日本ウイルス学会総会抄録(1989)〕を陽性
コントロールとした。

【０１４０】その結果、ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原で免疫
した抗ヒトパルボウイルス抗体を用いたヒトパルボウイ
ルス抗原検出は有用であることが分かった。

【０１４１】実施例１０ＰＣＲ法によるヒトパルボウ
イルス遺伝子の検出伝染性紅斑流行時の血清を用い、実施例１−（１）記載
の方法によりヒトパルボウイルスＤＮＡを抽出した。次
に下記のＤＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群
２の中からヒトパルボウイルスのＰＣＲ増幅プライマー
ＤＮＡ対（D-4とU-2 及びD-1 とU-4 ）を用いて実施例
１−（２）記載の方法に従い、ヒトパルボウイルス遺伝
子領域を増幅した。なお図１に４種類のプライマーの位
置を示す。

【０１４２】ＤＮＡプライマー群１ D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC ＤＮＡプライマー群２ U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC D-4 とU-2 のプライマーで増幅させた場合、4.6Kb の増
幅断片が得られ、一方、D-1 とU-4 のプライマーで増幅
させた場合、2.6Kb の増幅断片が得られた（表１１）。

【０１４３】

【表１１】

【０１４４】表１１の結果より、ヒトパルボウイルスＤ
ＮＡ断片の増幅と実施例９−（２）のエンザイムイムノ
アッセイ抗原検出の結果が一致していた事により、ヒト
パルボウイルス遺伝子の塩基配列をもとに、ＤＮＡプラ
イマーを作製し、ＰＣＲ法で増幅させたＤＮＡ断片を検
出することで、ヒトパルボウイルス遺伝子の検出が出来
ることを見いだした。

【０１４５】以下に明細書及び図中のポリペプチド及び
塩基配列等の符号及び記号は以下の通りであるほか、慣
用的に当該分野で用いられるものである。

【０１４６】

【表１２】

【０１４７】

【表１３】

【０１４８】ＨＰＶ：ヒトパルボウイルスＤＮＡ：デオキシリボ核酸ＲＮＡ：リボ核酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＩＰＴＧ：イソプロピルβ- Ｄ- ガラクトシドＸｇａｌ：５- ブロモ−４- クロロ−３- インドリル−
β- Ｄ- ガラクトシドＰＣＲ：ポリメラーゼ・チェーン・リアクションＡｐ^r ：アンピシリン耐性遺伝子ＬａｃＺ：β- ガラクトシダーゼ遺伝子ＶＰ−１：ヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子Ｖ
Ｐ−１ＶＰ−２：ヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子Ｖ
Ｐ−２ＮＳ：ヒトパルボウイルス非構造遺伝子Ｎ’ ：Ｎタンパク質のＮ末端の３３個のアミノ酸に
対応するλファージＮタンパク質遺伝子Ｐtac ：ＴａｃプロモーターＰL ：ＰL プロモーター

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の遺伝子のクローニング領域を示した概
略図である。

【図２】本発明の遺伝子の塩基配列及びその遺伝子がコ
ードするポリペプチドのアミノ酸配列の最初の部分を示
したものである。

【図３】図２の続きの配列を示す図である。

【図４】図３の続きの配列を示す図である。

【図５】図４の続きの配列を示す図である。

【図６】図５の続きの配列を示す図である。

【図７】図６の続きの配列を示す図である。

【図８】図７の続きの配列を示す図である。

【図９】図８の続きの配列を示す図である。

【図１０】図９の続きの配列を示す図である。

【図１１】プラスミドpPLN-MCSの構築の模式図である。

【図１２】プラスミドpVP200の構築の模式図である。

【図１３】ＶＰ−１発現ベクター作製時の部位特異的変
異を示した模式図である。

【図１４】プラスミドpVP100の構築の模式図である。

【図１５】プラスミドpVP300の構築の模式図である。

【図１６】プラスミドpAcVP1、pAcVP2 の構築の模式図
である。

【図１７】バキュロウイルスによって産生されたウイル
ス粒子様構造物の電子顕微鏡写真である。

【図１８】伝染性紅斑患者のＶＰ−１、ＶＰ−２に対す
るＩｇＧ抗体の経時変化を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ 1/70 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 Ｌ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者松浦善治埼玉県上福岡市福岡１−３−５−406 (72)発明者小川博之東京都町田市森野５−25−18 電気化学町田寮 (72)発明者清水英晴東京都町田市玉川学園４−16−44 (72)発明者鎌田公仁夫新潟県五泉市南本町１丁目２番２号デンカ生研株式会社新潟工場内 (72)発明者黒沢大介新潟県五泉市南本町１丁目２番２号デンカ生研株式会社新潟工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（１）で表されるヒトパルボウイ
ルス遺伝子。【化１】式（１） 10 20 30 40 50 60 TTCCCGCCTT ATGCAAATGG GCAGCCATTT TAAGTGTTTT ACTATAATTT TATTGGTCAG 70 80 90 100 110 120 TTTTGTAACG GTTAAAATGG GCGGAGCGTA GGCGGGGACT ACAGTATATA TAGCACGGCA 130 140 150 160 170 180 CTGCCGCAGC TCTTTCTTTC TGGGCTGCTT TTTCCTGGAC TTTCTTGCTG TTTTTTGTGA 190 200 210 220 230 240 GCTAACTAAC AGGTATTTAT ACTACTTGTT AACATACTAA CATGGAGCTA TTTAGAGGGG 250 260 270 280 290 300 TTCTTCAAGT TTCTTCTAAT GTTCTGGACT GTGCTAACGA TAATTGGTGG TGCTCTTTAC 310 320 330 340 350 360 TGGATTTAGA CACTTCTGAC TGGGAACCAC TAACTCATAC TAACAGACTA ATGGCAATAT 370 380 390 400 410 420 ACTTAAGCAG TGTGGCTTCT AAGCTTGACT TTACCGGGGG GCCACTAGCA GGGTGCTTGT 430 440 450 460 470 480 ACTTTTTTCA AGTAGAATGT AACAAATTTG AAGAAGGCTA TCATATTCAT GTGGTTATTG 490 500 510 520 530 540 GGGGGCCAGG GTTAAATCCC AGAAACCTCA CTGTGTGTGT AGAGGGGTTA TTTAATAATG 550 560 570 580 590 600 TACTTTATCA CCTTGTAACT GAAAATGTGA AGCTAAAATT TTTGCCAGGM ATGACTACAA 610 620 630 640 650 660 AAGGCAAATA CTTTAGAGAT GGAGAGCAGT TTATAGAAAA CTATTTAATG AAAAAAATAC 670 680 690 700 710 720 CTTTAAATGT TGTATGGTGT GTTACTAATA TTGATGGATA TATAGATACC TGTATTTCTG 730 740 750 760 770 780 CTACTTTTAG AAGGGGAGCT TGCCATGCCA AGAAACCCCG CATTACCACA GCCATAAATG 790 800 810 820 830 840 ATACTAGTAG TGATGCTGGG GAGTCTAGCG GCACAGGGGC AGAGGTTGTG CCATTTAATG 850 860 870 880 890 900 GGAAAGGAAC TAAGGCTAGC ATAAAGTTTC AAACTATGGT AAACTGGCTG TGTGAAAACA 910 920 930 940 950 960 GAGTGTTTAC AGAGGATAAG TGGAAACTAG TTGACTTTAA CCAGTACACT TTACTAAGCA 970 980 990 1000 1010 1020 GTAGTCACAG TGGAAGTTTT CAAATTCAAA GTGCACTAAA ACTAGCAATT TATAAAGCAA 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CTAATTTAGT GCCTACTAGC ACATTTTTAT TGCATACAGA CTTTGAGCAG GTTATGTGTA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TTAAAGACAA TAAAATTGTT AAATTGTTAC TTTGTCAAAA CTATGACCCC CTATTGGTGG 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GGCAGCATGT GTTAAAGTGG ATTGATAAAA AATGTGGCAA AAAAAATACA CTGTGGTTTT 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ATGGGCCGCC AAGTACAGGA AAAACAAACT TGGCAATGGC CATTGCTAAA AGTGTTCCAG 1270 1280 1290 1300 1310 1320 TATATGGCAT GGTTAACTGG AATAATGAAA ACTTTCCATT TAATGATGTA GCAGGGAAAA 1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCTTGGTGGT CTGGGATGAA GGTATTATTA AGTCTACAAT TGTAGAAGCT GCAAAAGCCA 1390 1400 1410 1420 1430 1440 TTTTAGGCGG GCAACCTACC AGGGTAGATC AAAAAATGCG TGGAAGTGTA GCTGTGCCTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GAGTACCTGT GGTTATAACC AGCAATGGTG ATATTACTTT TGTTGTAAGC GGGAACACTA 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CAACAACTGT ACATGCTAAA GCCTTAAAAG AGCGCATGGT AAAGTTAAAC TTTACTGTAA 1570 1580 1590 1600 1610 1620 GATGCAGCCC TGACATGGGG TTACTAACAG AGGCTGATGT ACAACAGTGG CTTACATGGT 1630 1640 1650 1660 1670 1680 GTAATGCACA AAGCTGGGAC CACTATGAAA ACTGGGCAAT AAACTACACT TTTGATTTCC 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CTGGAATTAA TGCAGATGCC CTCCACCCAG ACCTCCAAAC CACCCCAATT GTCACAGACA 1750 1760 1770 1780 1790 1800 CCAGTATCAG CAGCAGTGGT GGTGAAAGCT CTGAAGAACT CAGTGAAAGC AGCTTTTTTA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACCTCATCAC CCCAGGCGCC TGGAACACTG AAACCCCGCG CTCTAGTACG CCCATCCCCG 1870 1880 1890 1900 1910 1920 GGACCAGTTC AGGAGAATCA TTTGTCGGAA GCCCAGTTTC CTCCGAAGTT GTAGCTGCAT 1930 1940 1950 1960 1970 1980 CGTGGGAAGA AGCCTTCTAC ACACCTTTGG CAGACCAGTT TCGTGAACTG TTAGTTGGGG 1990 2000 2010 2020 2030 2040 TTGATTATGT GTGGGACGGT GTAAGGGGTT TACCTGTGTG TTGTGTGCAA CATATTAACA 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ATAGTGGGGG AGGCTTGGGA CTTTGTCCCC ATTGCATTAA TGTAGGGGCT TGGTATAATG 2110 2120 2130 2140 2150 2160 GATGGAAATT TCGAGAATTT ACCCCAGATT TGGTGCGGTG TAGCTGCCAT GTGGGAGCTT 2170 2180 2190 2200 2210 2220 CTAATCCCTT TTCTGTGCTA ACCTGCAAAA AATGTGCTTA CCTGTCTGGA TTGCAAAGCT 2230 2240 2250 2260 2270 2280 TTGTAGATTA TGAGTAAAGA AAGTGGCAAA TGGTGGGAAA GTGATGATAA ATTTGCTAAA 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GCTGKGTATC AGCAATTTGT GGAATTTTAT GAAAAGGTTA CTGGWACAGA CTTAGAGCTT 2350 2360 2370 2380 2390 2400 ATTCAAATAT TAAAAGATCA TTATAATATT TCTTTAGATA ATCCCCTAGA AAACCCATCC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 TCTCTGTTTR ACTTAGTTGC TCGTATTAAA AATAACCTTA AAAACTCTCC AGACTTATAT 2470 2480 2490 2500 2510 2520 AGTCATCATT TTCAAAGTCA TGGACAGTTA TCTGACCACC CCCATGCCTT ATCATCCAGT 2530 2540 2550 2560 2570 2580 AGCAGTAATG CAGAACCTAG AGGAGAAAAT GCAGTATTAT CTAGTGAAGA CTTACACAAG 2590 2600 2610 2620 2630 2640 CCTGGGCAAG TTAGCGTACA ACTACCCGGT ACTAACTATG TTGGGCCTGG TAATGAGTTA 2650 2660 2670 2680 2690 2700 CAAGCTGGGC CCCCGCAAAG TGCTGTTGAC AGTGCTGCAA GGATTCATGA CTTTAGGTAT 2710 2720 2730 2740 2750 2760 AGCCAACTGG CTAAGTTGGG AATAAATCCA TATACTCATT GGACTGTAGC AGATGAAGAG 2770 2780 2790 2800 2810 2820 CTTTTAAAAA ATATAAAAAA TGAAACTGGG TTTCAAGCAC AAGTAGTAAA AGACTACTTT 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ACTTTAAAAG GTGCAGCTGC CCCTGTGGCC CATTTTCAAG GAAGTTTGCC GGAAGTTCCC 2890 2900 2910 2920 2930 2940 GCTTACMACG CCTCAGAAAA ATACCCAAGC ATGACTTCAG TTAATTCTGC AGAAGCCAGC 2950 2960 2970 2980 2990 3000 ACTGGTGCAG GAGGGGGGGG CAGTAATCCT GTCAAAAGCA TGTGGAGTGA GGGGGCCACT 3010 3020 3030 3040 3050 3060 TTTAGTGCCA ACTCTGTAAC TTGTACATTT TCCAGACAGT TTTTAATTCC ATATGACCCA 3070 3080 3090 3100 3110 3120 GAGCACCATT ATAARGTGTT TTCTCCCGCA GCAAGTAGCT GCCACAATGC CAGTGGAAAA 3130 3140 3150 3160 3170 3180 GAGGCAAAGG TTTGCACCAT TAGTCCCATA ATGGGATACT CAACCCCATG GAGATATTTA 3190 3200 3210 3220 3230 3240 GATTTTAATG CTTTAAATTT ATTTTTTTCA CCTTTAGAGT TTCAGCACTT AATTGAAAAT 3250 3260 3270 3280 3290 3300 TATGGAAGCA TAGCTCCTGA TGCTTTAACT GTAACCATAT CAGAAATTGC TGTTAAGGAT 3310 3320 3330 3340 3350 3360 GTTACAGACA AAACTGGAGG GGGGGTACAG GTTACTGACA GCACTACAGG GCGCCTATGC 3370 3380 3390 3400 3410 3420 ATGTTAGTAG ACCATGAATA CAAGTACCCA TATGTGTTAG GGCAAGGTCA GGATACTTTA 3430 3440 3450 3460 3470 3480 GCCCCAGAAC TTCCTATTTG GGTATACTTT CCCCCTCAAT ATGCTTACTT AACAGTAGGA 3490 3500 3510 3520 3530 3540 GATGTTAACA CACAAGGAAT TTCTGGAGAC AGCAAAAAAT TAGCAAGTGA AGAATCAGCA 3550 3560 3570 3580 3590 3600 TTTTATGTTT TGGAACACAG TTCYTTTCAG CTTTTAGGTA CAGGAGGTAC AGCAACTATG 3610 3620 3630 3640 3650 3660 TCTTATAAGT TTCCTCCAGT GCCCCCAGAA AATTTAGAGG GCTGCAGTCA ACACTTTTAT 3670 3680 3690 3700 3710 3720 GAAATGTACA ATCCCTTATA CGGATCCCGC TTAGGGGTCC CTGACACATT AGGAGGTGAC 3730 3740 3750 3760 3770 3780 CCAAAATTTA GATCTTTAAC ACATGAAGAC CATGCAATTC AGCCCCAAAA CTTCATGCCA 3790 3800 3810 3820 3830 3840 GGGCCACTAG TAAACTCAGT GTCTACAAAG GAGGGAGACA GCTCTAATAC TGGAGCTGGA 3850 3860 3870 3880 3890 3900 AAAGCCTTAA CAGGCCTTAG CACAGGTACC TCGCAAAACA CTAGAATATC CTTACGSCCT 3910 3920 3930 3940 3950 3960 GGGCCAGTGT CTCAGCCATA CCACCACTGG GACACAGATA AATATGTCAC AGGAATAAAT 3970 3980 3990 4000 4010 4020 GCCATTTCTC ATGGTCAGAC CACTTATGGT AACGCTGAAG ACAAAGAGTA TCAGCAAGGA 4030 4040 4050 4060 4070 4080 GTGGGTAGAT TTCCAAATGA AAAAGAACAG CTAAAACAGT TACAGGGTTT AAACATGCAC 4090 4100 4110 4120 4130 4140 ACCTATTTYC CCAATAAAGG AACCCAGCAA TATACAGATC AAATTGAGCG CCCCCTAATG 4150 4160 4170 4180 4190 4200 GTGGGTTCTG TATGGAACAG AAGAGCCCTT CACTATGAAA GCCAGCTGTG GAGTAAAATT 4210 4220 4230 4240 4250 4260 CCAAATTTAG ATGACAGTTT TAAAACTCAG TTTGCAGCCT TAGGAGGATG GGGTTTGCAT 4270 4280 4290 4300 4310 4320 CAGCCACCTC CTCAAATATT TTTAAAAATA TTACCACAAA GTGGGCCAAT TGGAGGTATT 4330 4340 4350 4360 4370 4380 AAATCAATGG GAATTACTAC CTTAGTTCAG TATGCTGTGG GAATTATGAC AGTAACTATG 4390 4400 4410 4420 4430 4440 ACATTTAAAT TGGGGCCCCG TAAAGCTACG GGACGGTGGA ATCCTCAACC TGGAGTATAT 4450 4460 4470 4480 4490 4500 CCCCCGCACG CAGCAGGTCA TTTACCATAT GTACTATATG ACCCCACAGC TATAGATGCA 4510 4520 4530 4540 4550 4560 AAACAACACC ACAGACATGG ATATGAAAAG CCTGAAGAGT TGTGGACAGC CAAAAGCCGT 4570 4580 4590 4600 4610 4620 GTGCGCCCAT TGTAAACACT CCCCACCGTG CCCTCAGCCA GGATGCGTAA CTAAACGCCC 4630 4640 4650 4660 4670 4680 ACCAGTACCA CCCAGACTGT ACCTGCCCCC TCCTGTACCT ATAAGACAGC CTAACAC （ただし、式中、M は A または C、R は A または
G、W は A または T、S は C または G、Y は C ま
たは T、K は G または T の塩基を示す。）
【請求項２】下記式（２）のアミノ酸配列をコードす
るヒトパルボウイルスＶＰ―１構造遺伝子。【化２】式（２） 1 10 Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe 20 30 Ala Lys Ala X₁ Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val 40 Thr Gly Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr 50 60 Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe 70 X₂ Leu Val Ala Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp 80 90 Leu Tyr Ser His His Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His 100 Pro His Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Glu Pro Arg Gly 110 120 Glu Asn Ala Val Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln 130 Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn 140 150 Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser Ala Val Asp Ser Ala Ala 160 Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu Ala Lys Leu Gly Ile 170 180 Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu Glu Leu Leu Lys 190 Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val Val Lys Asp 200 210 Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His Phe Gln 220 Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr X₃ Ala Ser Glu Lys Tyr 230 240 Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala 250 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly 260 270 Ala Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln 280 Phe Leu Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser 290 300 Pro Ala Ala Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys 310 Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg 320 330 Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu 340 Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala 350 360 Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp 370 Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg 380 390 Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu 400 Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile Trp Val 410 420 Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val Asn 430 Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu 440 450 Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly 460 Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro 470 480 Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr 490 Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly 500 510 Gly Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile 520 Gln Pro Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser 530 540 Thr Lys Glu Gly Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu 550 Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu 560 570 Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp 580 Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr 590 600 Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg 610 Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn 620 630 Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln Tyr Thr Asp 640 Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn Arg Arg 650 660 Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu 670 Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly 680 690 Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln 700 Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu 710 720 Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys 730 Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly 740 750 Val Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr 760 Asp Pro Thr Ala Ile Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr 770 780 Glu Lys Pro Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val Arg Pro 781 Leu （ただし、式中、X₁は Gly または Val、X₂は Asn ま
たは Asp、X₃は His または Asn を示す。
【請求項３】下記式（３）のアミノ酸配列をコードす
るヒトパルボウイルスＶＰ―２構造遺伝子。【化３】式（３） 1 10 Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly 20 30 Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr 40 Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu 50 60 Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala 70 Ala Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys 80 90 Thr Ile Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu 100 Asp Phe Asn Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln 110 120 His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr 130 Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr 140 150 Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys 160 Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln 170 180 Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe 190 Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val Asn Thr Gln 200 210 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu Ser Ala 220 Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr Gly 230 240 Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu 250 Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro 260 270 Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp 280 Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro 290 300 Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys 310 Glu Gly Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly 320 330 Leu Ser Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro 340 Gly Pro Val Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr 350 360 Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly 370 Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro 380 390 Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His 400 Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile 410 420 Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu 430 His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu Asp Asp 440 450 Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly Leu His 460 Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser Gly 470 480 Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln 490 Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly 500 510 Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr 520 Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 530 540 Thr Ala Ile Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys 550 554 Pro Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val Arg Pro Leu
【請求項４】下記式（４）のアミノ酸配列をコードす
るヒトパルボウイルス非構造（ＮＳ）遺伝子。【化４】式（４） 1 10 Met Glu Leu Phe Arg Gly Val Leu Gln Val Ser Ser Asn Val Leu 20 30 Asp Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp 40 Thr Ser Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala 50 60 Ile Tyr Leu Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly 70 Pro Leu Ala Gly Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys 80 90 Phe Glu Glu Gly Tyr His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly 100 Leu Asn Pro Arg Asn Leu Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn 110 120 Asn Val Leu Tyr His Leu Val Thr Glu Asn Val Lys Leu Lys Phe 130 Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu 140 150 Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys Lys Ile Pro Leu Asn Val 160 Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Asp Thr Cys Ile 170 180 Ser Ala Thr Phe Arg Arg Gly Ala Cys His Ala Lys Lys Pro Arg 190 Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Ser Asp Ala Gly Glu Ser 200 210 Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys Gly Thr 220 Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys Glu 230 240 Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn 250 Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile 260 270 Gln Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val 280 Pro Thr Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met 290 300 Cys Ile Lys Asp Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn 310 Tyr Asp Pro Leu Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp 320 330 Lys Lys Cys Gly Lys Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro 340 Ser Thr Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val 350 360 Pro Val Tyr Gly Met Val Asn Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe 370 Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu Val Val Trp Asp Glu Gly Ile 380 390 Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly 400 Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg Gly Ser Val Ala Val 410 420 Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly Asp Ile Thr Phe 430 Val Val Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala Lys Ala Leu 440 450 Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys Ser Pro 460 Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu Thr 470 480 Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile 490 Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His 500 510 Pro Asp Leu Gln Thr Thr Pro Ile Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser 520 Ser Ser Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe 530 540 Phe Asn Leu Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg 550 Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Phe Val 560 570 Gly Ser Pro Val Ser Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu 580 Ala Phe Tyr Thr Pro Leu Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val 590 600 Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys 610 Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys 620 630 Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp Tyr Asn Gly Trp Lys Phe 640 Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys Ser Cys His Val Gly 650 660 Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys Lys Cys Ala Tyr 670 671 Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu
【請求項５】請求項１ないし４のいずれか１項に記載
の遺伝子を含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現すること
ができる組換えベクター。
【請求項６】前記遺伝子が、バキュロウイルスベクタ
ー中に挿入されて成る請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】請求項５記載の組換えベクターにより形
質転換された形質転換体。
【請求項８】前記形質転換体の宿主が大腸菌である請
求項７記載の形質転換体。
【請求項９】前記形質転換体の宿主が昆虫細胞である
請求項７記載の形質転換体。
【請求項１０】前記組換えベクターが請求項６記載の
組換えベクターであり、前記形質転換体の宿主が昆虫細
胞である請求項７記載の形質転換体。
【請求項１１】前記昆虫細胞がＴｎ５細胞である請求
項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】前記式（２）で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド。
【請求項１３】前記式（３）で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド。
【請求項１４】上記式（４）で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド。
【請求項１５】請求項１３のポリペプチド単独又は請
求項１２のポリペプチドと請求項１３のポリペプチドと
から構成されるヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構
造物。
【請求項１６】請求項１２又は１３に記載のポリペプ
チド又は請求項１５記載のウイルス粒子様構造物を抗原
として用い、免疫測定法により検体中の抗ヒトパルボウ
イルス抗体を検出する方法。
【請求項１７】請求項１２に記載のポリペプチドと請
求項１３に記載のポリペプチドとの混合物を抗原として
用いる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】前記２種類のポリペプチドの混合比率
が１：１０ないし１０：１である請求項１７記載の方
法。
【請求項１９】請求項１２又は１３に記載のポリペプ
チド又は請求項１５記載のウイルス粒子様構造物を免疫
原として用いて抗体を作製し、該抗体を用いる免疫測定
により検体中のヒトパルボウイルスを検出する方法。
【請求項２０】請求項１記載の遺伝子の一部とそれぞ
れハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチドを用い
てＰＣＲ法により請求項１記載の遺伝子又はその一部を
増幅し、該増幅された遺伝子又はその一部を検出するこ
とから成る、検体中のヒトパルボウイルスの検出方法。
【請求項２１】前記オリゴヌクレオチドは、下記のＤ
ＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中から
それぞれ少なくとも１種ずつ選ばれる請求項１８記載の
検出方法。ＤＮＡプライマー群１ D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC ＤＮＡプライマー群２ U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC