JPH07155103A - 乳酸菌発酵液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 乳酸菌を利用して得た発酵乳を、乳酸菌が分
泌した菌体外酵素を利用して更に熟成させ、乳の熟成過
程において生成される生理活性物質を得ることを目的と
する。 【構成】 複数種の乳酸菌、必要に応じてビフィズス菌
を個別的に乳に接種し、この接種したものを各菌の生育
最適温度環境下で各々個別的に適当時間培養後、得られ
た各培養菌液を個別的に適当量採取し、必要には応じて
酵母液と共に一括して乳に接種したものを異なる温度環
境下で適当時間培養したる後、各温度別に得られたスタ
ーターを所定の割合で乳に添加し恒温環境下で一定時間
培養後、得られた発酵カードから発酵液を抽出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、完全食といわれる乳を
利用した抗癌作用、免疫賦活作用、整腸作用、抗菌作
用、抗変異原効果がある人体に対して有用な乳酸菌発酵
液の製造方法に関するもので、更に詳しく説明すれば複
数種の乳酸菌と酵母を共生培養し、その代謝産物である
生理活性物質に富んだ乳酸菌発酵液の製造方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】近年人類の癌死亡率は急速に増加してい
る。癌の原因となる化学発癌物質はそれ自体若しくはそ
の代謝活性物質がＤＮＡを修飾する変異原物質である。
この変異原物質の作用を抑制する抗変異原物質が食品中
に含まれていることが近年明らかになり、抗癌作用を有
する物質の研究開発が盛んになっている。

【０００３】従来、癌に対する治療効果のある物質とし
て制癌作用を有するインクマリン系化合物として知られ
ている抗生物質ＭＩ４３−３７Ｆ１１の類縁体であるイ
ンクマリン誘導体に関するもの（例えば、特開平５−９
７８４１号）や、抗癌作用のある喜樹という植物エキス
を原料に用いている塩酸イリノテカン等が存在する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、原材料
が天然物であると否とを問わず、現存する全ての抗癌剤
は、癌細胞に限らず正常な細胞をも破壊し、白血球減少
等の副作用を招来しているという問題点がある。

【０００５】そこで、本発明は、食品に備わる機能を微
生物を利用して有用な生理活性物質を引き出し、身体に
副作用等を及ぼさない抗癌、抗菌、抗変異原効果のある
乳酸菌発酵液の製造方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は完全食といわ
れる乳にはカゼイン、ラクトアルブミン等の乳蛋白質が
存在し、該乳蛋白質のアミノ酸配列の中には種々の生理
活性を有するペプチドと同一若しくは極めてこれに近い
分子配列を有するものがあり、乳蛋白質が特定の蛋白分
解酵素により分解されれば生理活性物質が遊離すること
に着目し、本発明を創案するに至った。即ち、ペプチド
等の生理活性物質を乳蛋白質より遊離する特定の酵素は
乳酸菌が分泌した菌体外酵素が好適であるという発想の
下に、乳酸菌による発酵乳を生成し、該生成物をさらに
熟成させ、この熟成過程において乳中の蛋白質、脂質等
が分解されて、人体に対して有用な生理活性物質である
ペプチド、脂肪酸等の低分子の有機酸を得るものであ
る。

【０００７】その手段として、本発明乳酸菌発酵液の製
造方法は大別して前培養、本培養、乳酸菌発酵液の抽出
という３工程より構成される。前培養としては、複数種
の乳酸菌、必要に応じてビフィズス菌を各々個別的に単
菌で乳に接種し、この接種したものを各菌の生育最適温
度環境下で個別的に培養する。一方、酵母を乳に接種
し、至適温度環境下で適当時間培養する。この酵母は乳
中に培養することなく、ビタミン、アミノ酸等を含有す
る栄養液に添加したものであってもよい。

【０００８】次に、前記前培養により得られた各培養菌
液を各々個別的に採取し、一括して乳に接種したものを
異なる温度環境下で適当時間培養する本培養を行う。

【０００９】前記本培養により各温度別に得られたスタ
ーターを所定の割合で乳に添加し、さらに恒温環境下で
適当時間培養する。この培養により得られた発酵カード
から発酵液を抽出する。

【００１０】

【作用】乳酸菌を単菌で乳に接種し、最適温度で培養す
ると、乳酸菌が増殖し、乳酸菌の代謝産物に富んだ発酵
乳を生成する。

【００１１】複数種の乳酸菌と酵母を共生培養すると、
構成菌種間には複雑な共生関係が生じる。菌はその自己
増殖性により、代謝産物を菌体外に産生する。菌体外酵
素としては、蛋白分解酵素、脂質分解酵素、糖質分解酵
素等を生成し、乳酸菌にとって最適な環境を形成する。
そのため乳酸菌が一層活性化し、菌にとって有利な物質
をより一層生成する。このような乳酸菌にとっての最適
環境下において、乳酸菌はその機能を充分に発揮し、菌
にとって有利な産生物を産生する。産生物は例えばダイ
アセチル、アセトイン、クエン酸等の香気成分やナイシ
ン等の抗菌成分、低分子のアミノ酸や有機酸等、構成菌
により決定される。この共生培養を異なる温度環境下で
行うと、その温度が至適温度である菌が増殖活性し、代
謝産物を一層多量に産生する。このように本発明が乳酸
菌が分泌した菌体外酵素を利用するのは、バランスのと
れた生理活性物質の混合物を得るためであり、外来性の
酵素では本発明の如くバランスのとれた生理活性物質の
混合物を得ることが出来ないためである。

【００１２】各温度別に得られたスターターを所定の割
合で乳に添加し、培養すると、生成された乳酸により発
酵液のｐＨが低下し、等電点付近で発酵カードを形成す
る。即ち、乳酸菌により分泌された蛋白分解酵素が、カ
ゼインを生成してカゼインを含む発酵カードを生成する
ものである。そして、発酵カードより抽出した発酵液は
菌の共生培養により産生したペプチド等の生理活性物質
を含むものである。

【００１３】

【実施例１】以下、本発明の好適な実施例について説明
する。ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・
ラクチス（Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔ
ｉ−ｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシス
・クレモリス（Ｌｃ．ｌａ−ｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス・サ
ブスピーシス・ダイアセチラクチス（Ｓｔｒ．ｌａｃｔ
ｉｓ ｓｕｂｓｐ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ロ
イコノストック・クレモリス（Ｌｅｕ．ｃｒ−ｅｍｏｒ
ｉｓ）を各々個別的に約２５％（Ｗ／Ｗ） 濃度以下の
獣乳に接種し、前記各菌の最適温度による恒温環境下で
各々４８時間を限度として培養する。これらの乳酸菌を
最適温度環境下で培養すると、これらの乳酸菌が個別的
に獣乳中で増殖し、その産生乳酸により酸度約０．９％
（Ｗ／Ｗ）程度の弱い発酵乳が各別に生成される。スト
レプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシス・テル
モフィルス（Ｓｔｒ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ．ｓｕｂｓ
ｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ−ｕｓ）、ラクトバチルス・
デルブリッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブ
スピーシス・ラクチス（Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ−ｃｋｉ
ｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ヘ
ルベティクス（Ｌｂ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）を各々個
別的に２５％（Ｗ／Ｗ）以下の濃度の獣乳に接種し、こ
れらの菌の最適温度による恒温環境下で４８時間を限度
として培養する。前記条件下で培養すると、これらの乳
酸菌が獣乳中で増殖し、酸度が約１．０％（Ｗ／Ｗ）程
度の発酵乳が個別的に生成される。ラクトバチルス・ア
シドフィラス（Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラク
トバチルス・カゼイ（Ｌｂ．ｃａｓｅｉ）ビヒィズス菌
（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ｌｏｎｇｕｍ）を
各々個別的に０．５％（Ｗ／Ｗ）の大豆ペプチドを含有
する約２５％（Ｗ／Ｗ）以下の濃度の獣乳に接種し、こ
れらの菌の最適温度である恒温環境下で４８時間を限度
として培養する。この培養により、前記菌株の活性化を
高める。サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を酵母エキス及
びぶどう糖を含有する獣乳に接種し、約３０〜３２℃で
約４８時間を限度として培養する。サッカロマイセスセ
レビジエは乳に培養することなく、ビタミン、アミノ酸
を含有する水溶液に添加した酵母液であってもよい。酵
母は、サッカロマイセスセレビジエに限定することな
く、サッカロマイセス・デルブリッキー（Ｓａｃｃ．ｄ
ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トルロプシィス・ケフィール
（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｋｅｆｉｒ）、乾燥酵母等を
使用することもできる。

【００１４】上記前培養により得た各培養菌液を濃度約
２５％（Ｗ／Ｗ）以下の獣乳に各々同量宛接種する。接
種量は、獣に対し、夫々０．０１〜４．００％（Ｖ／
Ｖ）程度であるが、２．００％（Ｖ／Ｖ）以下であるこ
とが好ましい。接種後、２２〜４０℃の範囲内で高温、
中温、低温の各温度を選択し、各恒温環境下で夫々約２
４〜６０時間培養した。高温環境下で培養したものをス
ターター１、中温環境下で培養したものをスターター
２、低温環境下で培養したものをスターター３とする。
スターター１、スターター２、スターター３を４００倍
率で顕微鏡観察を行った結果、スターター１には、酵母
が１視野に１個、乳酸菌は桿菌と球菌が８対２の割合で
存在し、全体としては長桿菌が多く観察された。スター
ター２には、酵母が１視野に３個、乳酸菌は桿菌と球菌
が同一割合で存在し、長桿菌、短桿菌、単球菌、双球
菌、連鎖球菌が共にバランスよく生育していることが判
明した。スターター３には、酵母が１０視野に１個、乳
酸菌は桿菌と球菌が３対７の割合で全体的に球菌が多
く、とりわけ双球菌が多いことが判明した。前記スター
ター１、スターター２、スターター３を下記に示す表１
の組成に従って獣乳へ添加し、約２２〜４０℃で各時間
培養した。培養時間が長時間であるのは、乳酸菌と酵素
の共生により、一層生理活性物質に富んだ代謝産物を得
るためである。

【００１５】

【表１】

【００１６】得られた発酵カードのｐＨ、乳酸菌数、酵
母数は下記に示す表２の通りであった。

【００１７】

【表２】

【００１８】得られた発酵カードを個別的に約７０℃迄
加熱しながら攪拌する。この攪拌加熱処理により、発酵
カードは固形物と液体に分離される。攪拌終了後、放置
し室温迄冷却せしめた後、固形物の排除を行う。排除方
法は如何なる方法であってもよいが、本実施例ではメリ
タフィルタペーパー（メリタジャパン株式会社の商品
名）で濾過し、得られた濾液を約８０℃の加熱殺菌処理
後冷却し、乳酸菌発酵液を得る。この加熱殺菌処理は行
わなくてもよい。後述の試験例に示す通り、発酵カード
から排除された乳酸菌発酵液自体が極めて強い抗菌作用
を有するためである。

【００１９】

【実施例２】前述の実施例１と同様に、ラクトコッカス
・ラクティス・サブスピーシズ・ラクチス、ラクトコッ
カス・ラクチス・サブスピーシズ・クレモリス、ストレ
プトコッカス・ラクチス・サブスピーシズ・ダイアセチ
ラクチス、ロイコノストック・クレモリスを各々個別的
に約２５％（Ｗ／Ｗ）以下の濃度の獣乳に接種し、前記
各菌の最適温度による恒温環境下で各々４８時間を限度
として培養する。これらの乳酸菌を最適温度環境下で培
養すると、これらの乳酸菌が個別的に獣乳中で活性化
し、増殖する。ストレプトコッカス・サリバリウス・サ
ブスピーシズ・テルモフィルス、ラクトバチルス、デル
ブリッキー・サブスピーシズ・ブルガリクス、ラクトバ
チルス・デルブリッキー・サブスピーシズ・ラクチス、
ラクトバチルス・ヘルベティクスを個別的に濃度約２５
％（Ｗ／Ｗ）以下の獣乳に接種し、これら各菌の最適温
度による恒温環境下で４８時間を限度として培養する。
ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・カ
ゼイを各々個別的に０．５％（Ｗ／Ｗ）の大豆ペプチド
を含有する濃度約２５％（Ｗ／Ｗ）以下の獣乳に接種
し、これら各菌の最適温度環境下で約４８時間を限度と
して培養する。サッカロマイセスセレビジエを酵母エキ
ス及びぶどう糖を含有する乳に接種し、約３０〜３２℃
で約２０〜２５時間培養する。この酵母サッカロマイセ
スセレビジエは乳に培養することなく、ビタミン、アミ
ノ酸を含有する水溶液に溶解した酵母液であってもよ
い。前述の実施例１と同様に乾燥酵母を使用してもよ
い。

【００２０】上記前培養により得た各培養菌液を濃度約
２５％（Ｗ／Ｗ）以下の獣乳に各々同量宛接種する。接
種量は獣乳に対し、夫々０．０１〜４．００％（Ｖ／
Ｖ）で特に２．００％（Ｖ／Ｖ）以下であることが好ま
しい。接種後、２２〜４０℃の範囲内で高温、中温、低
温の各温度を選択し、各恒温環境下で夫々約２４〜６０
時間培養した。高温環境下で培養したものをスターター
１、中温環境下で培養したものをスターター２、低温環
境下で培養したものをスターター３とする。前記スター
ター１、スターター２、スターター３を終濃度で０．１
％になるように獣乳に添加した。約３１℃で１２０時間
静置培養し、発酵カードを得た。得られた発酵カードの
ｐＨは３．５、乳酸菌数１．３×１０^９／ｍｌ、酵母数
８．８×１０^６個／ｍｌであり、１２０時間の培養によ
っても乳酸菌の生存率が高いことが判明した。この発酵
カードを攪拌しながら約７０℃まで加熱し、固形物分と
その浸出液とを分離後、放置して室温まで冷却し、前述
の実施例１と同様に濾過等の手段により濾液を得る。得
られた濾液は、約８０℃の加熱殺菌処理後冷却し、乳酸
菌発酵液を得る。前述の実施例１と同様に濾液の殺菌処
理は、その強い抗菌作用ゆえに必ずしも必要ではない。
本実施例により得た乳酸菌発酵液は、ｐＨ３．５、乳酸
酸度１．８％（Ｗ／Ｗ）｛糖度６．７％ （Ｗ／Ｗ）、
窒素（Ｎ）含有量０．０７％（Ｗ／Ｗ）であり、窒素含
有量を乳蛋白質に換算すると０．４６％（Ｗ／Ｗ）であ
った。

【００２１】上述の実施例１、２においては、連鎖球菌
属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅ
ｕ−ｃｏｎｏｓｔｏｃ）のものを乳酸菌として使用した
が、本発明はこれに限定されるものではなく、他の属に
該当するあらゆる種類の乳酸菌を使用する場合も本発明
に含まれる。又、培養時間、温度、本培養における接種
比率等も上述の実施例１、２に示される値に限定され
ず、これら以外の値によるものも本発明に含まれる。得
られた乳酸菌液が味等において変化は見られる場合はあ
るものの、その作用効果は同じであるからである。

【００２２】又、上記実施例に示す如く、食品に備わる
機能を微生物を使用して菌体外酵素を引き出し、生理活
性物質を得る方法は、乳と乳酸菌により生理活性物質を
得る製造方法のみならず、例えば納豆等からでも調整可
能である。

【００２３】

【試験例１】６種類の菌株大腸菌エシェリヒィア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ−ｌｉ）、腸炎ビブリ
オ菌（Ｖｉｂｒｉｏ Ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕ
ｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）、ブィフィドバクテリウム・ブフィダ
ム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄ−ｕ
ｍ）、クロストリディウム・スポロジェネェス（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バクテロ
イデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｖｕｌｇ
ａｔｕｓ）を試験菌として使用し抗菌活性の測定をし
た。抗菌活性の測定はペーパーディスク法で行った。寒
天平板培地１０ミリリットルに乳酸菌発酵液５０マイク
ロリットルを含浸させたペーパーディスクをのせ、４８
時間培養した。ディスクの周囲に形成した円形透明な阻
止円（溶菌班）の直径を測定し、コントロールディスク
（ｐＨ３．５の乳酸水溶液５０マイクロリットル）と比
較した。その結果は下記の表３に示す通り、乳酸菌発酵
液はＮｏ．５を除いて腸炎ビブリオ菌及びサルモネラ菌
に対して抗菌活性が認められたが、Ｎｏ．１では大腸菌
とクロストリディウム・スポロジェネェスに対し、Ｎ
ｏ．３は大腸菌に対し、Ｎｏ．４は大腸菌とバクテロイ
デス・ブルガタスに対して抗菌活性が検出された。表３
中、試料１、２、３は前記表２に示す乳酸菌発酵液１、
乳酸菌発酵液２、乳酸菌発酵液３、試料４は実施例２で
得た乳酸菌発酵液、５はビフィズス菌Ｂｉｆｉｄｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を単菌で培養して得た
乳酸菌発酵液、６はラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌ−ａｃｔｉｓ）を単菌で培養
して得た乳酸菌発酵液、７はラクトバチルス・ブルガリ
カス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ）を単菌で培養して得た乳酸菌発酵液、８はラクト
バチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａ−ｃｉｌｌ
ｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を単菌で培養して得た
乳酸菌発酵液、９はストレプトコッカス・テルモフィラ
ス（Ｓｔｒｅｐｔ−ｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）を単菌で培養した乳酸菌発酵液１０はコント
ロールである。＋＋は溶菌班の直径が１５ｍｍ以上、＋
は溶菌班の直径が１０ｍｍ以上、±は溶菌班の直径が１
０ｍｍ未満、−は溶菌班が観察されないことを示すもの
である。

【００２４】

【表３】

【００２５】

【試験例２】７種類の菌株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐ
ａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、サルモネラ菌（Ｓ
ａ−ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビ
フィドバクテリウム ブフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリディウム
スポロジェネェス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス・ブルガタス（Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、スタフィロ
コッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）を試験菌として使用し抗菌活性の測定
をした。抗菌活性の測定はペーパーディスク法で行っ
た。寒天平板培地１０ミリリットル上に乳酸菌発酵液５
０マイクロリットルを含浸させたペーパーディスクをの
せ、４８時間培養した。ディスクの周囲に形成した円形
透明な阻止円（溶菌班）の直径を測定し、コントロール
ディスク（ｐＨ３．５の乳酸水溶液５０マイクロリット
ル）と比較した。試料は、乳酸菌発酵液５ミリリットル
を凍結乾燥し、凍結乾燥標品を蒸留水に溶解した。水酸
化ナトリウム水溶液でｐＨを３．６に調整し、最終の容
量を１ミリリットルとして乳酸菌発酵液の５倍濃縮液と
した。その結果は、下記の表４に示す通り、５倍濃縮液
の抗菌活性はＮｏ．５を除いて、用いたすべての試験菌
に対して抗菌活性が認められた。特にＮｏ．１とＮｏ．
４は大腸菌とクロストリディウム スポロジェネェスに
対し強い抗菌活性が認められた。試料１〜１０は前記試
験例１と同一の物で、結果を示す記号も同一意味を示
す。

【００２６】

【表４】

【００２７】

【試験例３】７種類の菌株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐ
ａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｅｕｓ）、サルモネラ菌（Ｓ
ａ−ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓ）、ビ
ヒィドバクテリウム ブフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、クロストリディウム
スポロジェネェス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏ
ｒｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス ブルガタス（Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、スタフィロ
コッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）を試験菌として使用し、乳酸菌発酵液
のアセトン分画と抗菌活性の測定をした。抗菌活性の測
定はペーパーディスク法で行った。寒天平板培地１０ミ
リリットル上に乳酸菌発酵液５０マイクロリットルを含
浸させたペーパーディスクをのせ、４８時間培養した。
ディスクの周囲に形成した円形透明な阻止円（溶菌班）
の直径を測定し、コントロールディスク（ｐＨ３．５の
乳酸水溶液５０マイクロリットル）と比較した。アセト
ン分画の方法は乳酸菌発酵液１ミリリットルに６．７倍
量の冷アセトン（−２０℃）を加え、遠心分離（３００
０ｒｐｍ×５ｍｉｎ）によって上清と沈殿区分を減圧下
で乾燥し、蒸留水に溶解してｐＨを３．５に調整した。
最終の溶解容量を１ミリリットルとし、その５０マイク
ロリットルを抗菌活性の測定に用いた。上清区分につい
てはアセトン臭がなくなるまで減圧下で濃縮し、蒸留水
を加え溶解してｐＨを３．５に調整した。最終の容量を
１ミリリットルとし５０マイクロリットルを抗菌活性の
測定に用いた。その結果は、下記の表５に示す通り、ア
セトン沈殿区分の抗菌活性サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）に対して試料１、２、３及び６に抗菌活性が認
められた。この活性成分は比較的分子量の大きいペプチ
ドまたはタンパク質であると考えられる。試料１〜１０
は前記試験例１及び２と同一物で、結果を示す符号も同
一意味を示す。

【００２８】

【表５】

【００２９】アセトン上清区分の抗菌活性は下記の表６
に示す通りである。表６に示すように、乳酸菌発酵液の
抗菌活性は主としてアセトン分画上清区分に認められ
た。またアセトン分画することによりＮｏ．３とＮｏ．
４にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍに対する抗菌活性が検出さ
れてくる。これはアセトン沈殿区分にその活性を中和す
る成分が含まれているため、分画により除去されたこと
を示すのであろう。試料１〜１０は前記試験例１、２及
び３と同一物で、結果を示す符号も同一意味を示す。

【００３０】

【表６】

【００３１】

【試験例４】腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａ
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を試験菌として、前述の実
施例２で得た乳酸菌発酵液の腸炎ビブリオ菌に対する抗
菌活性のｐＨ依存性について試験測定をした。抗菌活性
の測定はペーパーディスク法で行った。寒天平板培地１
０ミリリットル上に乳酸菌発酵液５０マイクロリットル
を含浸させたペーパーディスクをのせ、４８時間培養し
た。ディスクの周囲に形成した円形透明な阻止円（溶菌
班）の直径を測定し、コントロールディスク塩酸水溶液
５０マイクロリットル、酢酸水溶液５０マイクロリット
ル並びに乳酸水溶液５０マイクロリットル）と比較し
た。上述の実施例２の乳酸菌発酵液はｐＨを６．９に調
整した後、遠心分離によって沈殿を除去し、上清を回収
し、塩酸水溶液で個々のｐＨに調整し抗菌活性を測定し
た。対照として、蒸留水に塩酸、酢酸並びに乳酸を加
え、同様のｐＨに調整したものについても抗菌活性を測
定した。その結果は下記の表７に示す通りである。乳酸
菌発酵液の腸炎ビブリオ菌に対する抗菌活性はｐＨ５．
０以下で認められ、特にｐＨ３．６以下では極めて強
い。またｐＨ３．０の酢酸水溶液に抗菌活性が認められ
るが、同じｐＨの塩酸水溶液及び乳酸水溶液には抗菌活
性は認められない。表７中の結果を示す符号は前記表１
〜表６に示されるものと同一意味を示す。

【００３２】

【表７】

【００３３】

【試験例５】前記実施例１及び２で得た乳酸菌発酵液の
抗変異原活性に関する試験を行った。化学発癌物質の多
くは、それ自身が、またはその代謝活性物質がＤＮＡを
修飾する変異原物質である。抗変異原物質とはこの変異
原物質の作用を阻害する物質のことで、発癌を防止する
ものを意味する。材料として供試菌株には、ヒスチジン
要求性、アンピシリン耐性、フレームシフト型突然変異
を有するサルモネラ菌ＴＡ９８（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＴＡ９８）を使用する。変
異原剤として３−アミノ−１−メチル−５Ｈ−ピリド
［４、３−ｂ］ｉｎｄｏｌｅ（Ｔｒｐ〜Ｐ２）は０．５
μｇ／ｍｌの濃度で、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）は１０μｇ／ｍｌの濃
度で使用した。抗変異原活性の測定方法は、サルモネラ
変異原試験法（エームステスト）を応用した方法で、１
００マイクロリットルのＴｒｐ−ｐ２（またはＭＮＮ
Ｇ）、１００マイクロリットルの乳酸菌発酵液及び１０
０マイクロリットルのＳ−９ミックス（ミクロソーム標
品）を混合し、次に１００マイクロリットルのサルモネ
ラ培養液を加え、３６℃で２０分間保持する２ミリリッ
トルのビオチン−ヒスチジンを含む寒天溶液と混合し、
ボグル−ボンナー（Ｖｏｇｌｅ−Ｂｏｎｎｅｒ）Ｅ培地
３０ミリリットルに重層する。３７℃で４８時間培養
し、コロニーを計数する。試験は三連で行った。その結
果は、Ｔｒｐ−ｐ２に対しては下記の表８に示すように
Ｎｏ．４は最も強い抗変異原性（７３％）を示した。

【００３４】

【表８】

【００３５】ＭＮＮＧに対しては下記の表９に示すよう
にＮｏ１とＮｏ４が強い抗変異原性（７５％）を示し
た。

【００３６】

【表９】

【００３７】上記表８及び９中試料１〜１０は前記試験
例１〜４と同一物である。

【００３８】全体的に単菌で培養した乳酸菌発酵液より
も酵母菌を含む各種乳酸菌を共生させた培養液に、高い
抗変異原性が認められる。即ち本発明の目的である得ら
れた乳酸菌発酵液の抗菌作用、抗ガン作用、抗コレステ
ロール作用など人間の健康維持に関係する生理活性因子
が本発酵液（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４）に存在することが表
８及び表９により実証されている。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、化学的添加物を一切使用する
ことなく、多種の乳酸菌と酵母の共生培養を特殊なスタ
ーターと共に行うため、乳酸菌及び酵母の代謝産物に富
んだ生理活性物質を生成し、前記の試験例１〜５の結果
が示す通り本発明により得られた乳酸菌発酵液は抗菌作
用、抗癌作用、免疫賦活作用、発癌物質の発現を抑制す
る抗変異原効果整腸作用等があり、人の健康を保持する
のに顕著な効果がある。

【００４０】又本発明は食品が元来有する機能を、微生
物を使用し、菌体外酵素を引き出し、生理活性物質を抽
出するという方法であるので身体に副作用を与えること
なく、身体に作用するので安全であるという効果があ
る。そのため、得られた乳酸菌発酵液は医薬品のみなら
ず、食品素材等、幅広い用途があるという効果がある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数種の乳酸菌、必要に応じてビフィズ
   ス菌を個別的に乳に接種し、この接種したものを各菌の
   生育最適温度環境下で各々個別的に適当時間培養後、得
   られた各培養菌液を個別的に適当量採取し、必要に応じ
   て酵母液と共に一括して乳に接種したものを異なる温度
   環境下で適当時間培養したる後、各温度別に得られたス
   ターターを所定の割合で乳に添加し恒温環境下で一定時
   間培養後、得られた発酵カードから発酵液を抽出したこ
   とを特徴とする乳酸菌発酵液の製造方法。