JPH07155189A - リコピンシクラーゼ遺伝子 - Google Patents
リコピンシクラーゼ遺伝子Info
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- JPH07155189A JPH07155189A JP6028793A JP2879394A JPH07155189A JP H07155189 A JPH07155189 A JP H07155189A JP 6028793 A JP6028793 A JP 6028793A JP 2879394 A JP2879394 A JP 2879394A JP H07155189 A JPH07155189 A JP H07155189A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 除草剤に対して耐性であるリコピンシクラー
ゼの遺伝子をコードするＤＮＡ配列から本質的になる、
精製、単離及びクローン化されたＤＮＡ。 【効果】 適当な宿主細胞内にピロリン酸ゲラニルゲラ
ニルからβ−カロチンへの生合成経路を発現して、生物
の栄養価、薬学的性質及び外観的価値を向上させる。ま
た、除草剤の作用に対して耐性であるトランスジェニッ
ク植物の構築が可能となる。
ゼの遺伝子をコードするＤＮＡ配列から本質的になる、
精製、単離及びクローン化されたＤＮＡ。 【効果】 適当な宿主細胞内にピロリン酸ゲラニルゲラ
ニルからβ−カロチンへの生合成経路を発現して、生物
の栄養価、薬学的性質及び外観的価値を向上させる。ま
た、除草剤の作用に対して耐性であるトランスジェニッ
ク植物の構築が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ｌｃｙと称するリコピ
ンシクラーゼの遺伝子及びその調節配列の単離、及びβ
−カロチン及び他のカロチノイドの産生が該遺伝子の存
在によって制御される天然又はトランスジェニック生物
の調製において又はｌｃｙと相同な天然遺伝子の発現を
加減するために該遺伝子又は該調節配列を使用すること
に関する。
ンシクラーゼの遺伝子及びその調節配列の単離、及びβ
−カロチン及び他のカロチノイドの産生が該遺伝子の存
在によって制御される天然又はトランスジェニック生物
の調製において又はｌｃｙと相同な天然遺伝子の発現を
加減するために該遺伝子又は該調節配列を使用すること
に関する。
【０００２】
【従来の技術】カロチノイドは天然における色素の最大
の種類である。それらは、光合成生物内で及び幾つかの
細菌と菌類内でのみ新たに合成される。植物内でのそれ
らの本質的な機能は、光合成器官内のクロロフィルによ
り敏感になった光酸化性損傷に対して保護する機能であ
るが1,2 、それらは他の種々の役目も果たしている。そ
れらは、光合成用の採光において補助色素として役立
ち、そしてそれらは光合成反応中心の内部成分である。
カロチノイドは、採光アンテナにより捕獲された光エネ
ルギーの熱散逸に関与しており3 、植物成長調節アブシ
シン酸(abscisic acid) の生合成のための基質であり
4,5 、そして多くの花、果物及び動物の着色物質であ
る。β−カロチンを含む一定の環状カロチノイドはヒト
及び動物の食物中におけるビタミンＡの前駆体であっ
て、今日では抗癌剤として興味の対象となってい
る6,7 。
の種類である。それらは、光合成生物内で及び幾つかの
細菌と菌類内でのみ新たに合成される。植物内でのそれ
らの本質的な機能は、光合成器官内のクロロフィルによ
り敏感になった光酸化性損傷に対して保護する機能であ
るが1,2 、それらは他の種々の役目も果たしている。そ
れらは、光合成用の採光において補助色素として役立
ち、そしてそれらは光合成反応中心の内部成分である。
カロチノイドは、採光アンテナにより捕獲された光エネ
ルギーの熱散逸に関与しており3 、植物成長調節アブシ
シン酸(abscisic acid) の生合成のための基質であり
4,5 、そして多くの花、果物及び動物の着色物質であ
る。β−カロチンを含む一定の環状カロチノイドはヒト
及び動物の食物中におけるビタミンＡの前駆体であっ
て、今日では抗癌剤として興味の対象となってい
る6,7 。
【０００３】植物内でのカロチノイド生合成の一般に認
められている経路では、２０の炭素を有する可溶性化合
物であるピロリン酸ゲラニルゲラニル２分子の頭−頭縮
合で始まって、無色の膜結合カロチノイドであるフィト
エンが生成する（図１）。植物及び青緑色細菌における
この２段階反応は、単一の可溶性酵素、つまりフィトエ
ンシンターゼにより触媒される9,10,11,12。フィトエン
の逐次脱飽和により、まずフィトフルエンが生成し、次
いでζ−カロチンが生成する。これら反応の両方は、植
物及び青緑色細菌内の単一の酵素、つまりフィトエン脱
飽和酵素により行われる13,14,15。この酵素及び該経路
におけるその後の工程を触媒する酵素は、膜結合性であ
ると考えられる16。更に２つ脱飽和すると、対称の赤色
カロチノイド色素であるリコピンが生成し、次いでこの
分子のそれぞれの末端で環化反応を行うことによって黄
色のβ−カロチンに転化される（図１）。該経路におけ
るその後の反応には、キサントフィル又は酸素添加カロ
チノイドを形成するための種々の酸素官能基の付加が含
まれる。
められている経路では、２０の炭素を有する可溶性化合
物であるピロリン酸ゲラニルゲラニル２分子の頭−頭縮
合で始まって、無色の膜結合カロチノイドであるフィト
エンが生成する（図１）。植物及び青緑色細菌における
この２段階反応は、単一の可溶性酵素、つまりフィトエ
ンシンターゼにより触媒される9,10,11,12。フィトエン
の逐次脱飽和により、まずフィトフルエンが生成し、次
いでζ−カロチンが生成する。これら反応の両方は、植
物及び青緑色細菌内の単一の酵素、つまりフィトエン脱
飽和酵素により行われる13,14,15。この酵素及び該経路
におけるその後の工程を触媒する酵素は、膜結合性であ
ると考えられる16。更に２つ脱飽和すると、対称の赤色
カロチノイド色素であるリコピンが生成し、次いでこの
分子のそれぞれの末端で環化反応を行うことによって黄
色のβ−カロチンに転化される（図１）。該経路におけ
るその後の反応には、キサントフィル又は酸素添加カロ
チノイドを形成するための種々の酸素官能基の付加が含
まれる。
【０００４】多くの努力が払われたにも拘らず、該カロ
チノイド生合成経路の酵素又は遺伝子は、酸素生成光合
成生物において殆ど同定及び単離されていない。これら
固く膜結合した酵素の精製中の触媒活性の維持が驚くほ
ど困難であることは明らかにされており、また酵素分析
のための標識基質の入手が困難であることも１つの障害
となっている。光合成細菌であるロードバクター・カプ
スレータス (Rhodobacter capsulatus) 17及び非光合成
細菌であるエレウィニア・ウレドボラ (Erwinia uredov
ora)18及びエレウィニア・ヘルビコラ (Erwinia herbic
ola)19内での完全カロチノイド生合成経路のための遺伝
子がクローン化され配列決定されている。当初、かかる
遺伝子は酸素生成光合成生物（青緑色細菌、藻類、及び
植物）内の相同遺伝子の同定を可能にする分子プローブ
を提供するであろうと考えられた。しかしながら、該ロ
ードバクター及びエレウィニアの遺伝子は酸素生成光合
成生物内の対応する酵素の遺伝子に殆ど又は全く似てい
ないので、このアプローチは良い結果をもたらさなかっ
た。
チノイド生合成経路の酵素又は遺伝子は、酸素生成光合
成生物において殆ど同定及び単離されていない。これら
固く膜結合した酵素の精製中の触媒活性の維持が驚くほ
ど困難であることは明らかにされており、また酵素分析
のための標識基質の入手が困難であることも１つの障害
となっている。光合成細菌であるロードバクター・カプ
スレータス (Rhodobacter capsulatus) 17及び非光合成
細菌であるエレウィニア・ウレドボラ (Erwinia uredov
ora)18及びエレウィニア・ヘルビコラ (Erwinia herbic
ola)19内での完全カロチノイド生合成経路のための遺伝
子がクローン化され配列決定されている。当初、かかる
遺伝子は酸素生成光合成生物（青緑色細菌、藻類、及び
植物）内の相同遺伝子の同定を可能にする分子プローブ
を提供するであろうと考えられた。しかしながら、該ロ
ードバクター及びエレウィニアの遺伝子は酸素生成光合
成生物内の対応する酵素の遺伝子に殆ど又は全く似てい
ないので、このアプローチは良い結果をもたらさなかっ
た。
【０００５】他のアプローチを用いて、２つの遺伝子、
つまりフィトエンシンターゼ10,20及びフィトエン脱飽
和酵素14,15,21の遺伝子が酸素生成光合成生物からクロ
ーン化されている。青緑色細菌のフィトエン脱飽和酵素
及び真核藻類と高等植物の該相同遺伝子産物のアミノ酸
配列は高い保存率であったが14,22 、既知の細菌又は菌
類のフィトエン脱飽和酵素との類似性は殆どなかった。
本発明においては形質転換可能な青緑色細菌であるシネ
ココッカスｓｐ．(Synechococcus sp.) ＰＣＣ７９４２
をモデル生物として用いて、酸素生成光合成生物内での
カロチノイド生合成経路を研究した。本発明者らは、先
にこの生物内でフィトエンシンターゼ（ｐｓｙ，前はｐ
ｙｓと呼称した）及びフィトエン脱飽和酵素（ｐｄｓ）
の遺伝子をクローン化し10,21 、続いて該青緑色細菌の
遺伝子をプローブとして使用して植物及び藻類の遺伝子
を同定、クローン化し配列決定した14,21,22,23 。遺伝
子ｐｄｓは、フィトエン脱飽和酵素と相互作用すること
によってフィトエンの脱飽和を特異的に阻害する漂白除
草剤のノルフルラゾン(norflurazon) を使用して同定し
た24。該酵素をコードする遺伝子における点突然変異
は、該ポリペプチドにおけるアミノ酸置換を導くもので
あるが、これにより該除草剤に対する耐性を与えること
ができると推定した。ノルフルラゾンに対して耐性であ
る化学誘発突然変異体を選択し、次いで野生型株での該
耐性の遺伝子相補性によってこれら突然変異の位置を調
べることにより、本発明者らはフィトエン脱飽和酵素の
該遺伝子を突き止めた。
つまりフィトエンシンターゼ10,20及びフィトエン脱飽
和酵素14,15,21の遺伝子が酸素生成光合成生物からクロ
ーン化されている。青緑色細菌のフィトエン脱飽和酵素
及び真核藻類と高等植物の該相同遺伝子産物のアミノ酸
配列は高い保存率であったが14,22 、既知の細菌又は菌
類のフィトエン脱飽和酵素との類似性は殆どなかった。
本発明においては形質転換可能な青緑色細菌であるシネ
ココッカスｓｐ．(Synechococcus sp.) ＰＣＣ７９４２
をモデル生物として用いて、酸素生成光合成生物内での
カロチノイド生合成経路を研究した。本発明者らは、先
にこの生物内でフィトエンシンターゼ（ｐｓｙ，前はｐ
ｙｓと呼称した）及びフィトエン脱飽和酵素（ｐｄｓ）
の遺伝子をクローン化し10,21 、続いて該青緑色細菌の
遺伝子をプローブとして使用して植物及び藻類の遺伝子
を同定、クローン化し配列決定した14,21,22,23 。遺伝
子ｐｄｓは、フィトエン脱飽和酵素と相互作用すること
によってフィトエンの脱飽和を特異的に阻害する漂白除
草剤のノルフルラゾン(norflurazon) を使用して同定し
た24。該酵素をコードする遺伝子における点突然変異
は、該ポリペプチドにおけるアミノ酸置換を導くもので
あるが、これにより該除草剤に対する耐性を与えること
ができると推定した。ノルフルラゾンに対して耐性であ
る化学誘発突然変異体を選択し、次いで野生型株での該
耐性の遺伝子相補性によってこれら突然変異の位置を調
べることにより、本発明者らはフィトエン脱飽和酵素の
該遺伝子を突き止めた。
【０００６】植物の栄養価、薬学的性質及び外観を向上
させるためにカロチノイド合成を加減できることは有用
なことである。そうするに際して、可能な場合にはその
天然遺伝子を使用するのが望ましいと考えられる。細菌
起源の遺伝子を植物内に直接組み込むには、例えば、光
合成経路の調節に用いることができるように該遺伝子を
更に修飾することが必要であるといえる。更に、生物工
学的に作った植物は、外界に出す前に規制に対して承認
を得なければならない。外来遺伝子が存在する場合に
は、承認を受ける手続きはより難しくなる。例えば、β
−カロチン合成経路の制御に天然遺伝子を使用するのが
より効率的である。更に、リコピンシクラーゼの作用を
標的にする除草剤に耐性を有する役立つ作物を有するこ
とは有用である。カロチノイド合成経路を標的にする除
草剤は、この経路がヒト、動物又は昆虫には存在しない
ので毒性が低いといえる。更に、カロチノイド合成経路
内の２地点で除草剤耐性である植物は、２種類の除草剤
を交互に使用するのを可能にし、それによって除草剤耐
性雑草種の出現を最小限に抑える。
させるためにカロチノイド合成を加減できることは有用
なことである。そうするに際して、可能な場合にはその
天然遺伝子を使用するのが望ましいと考えられる。細菌
起源の遺伝子を植物内に直接組み込むには、例えば、光
合成経路の調節に用いることができるように該遺伝子を
更に修飾することが必要であるといえる。更に、生物工
学的に作った植物は、外界に出す前に規制に対して承認
を得なければならない。外来遺伝子が存在する場合に
は、承認を受ける手続きはより難しくなる。例えば、β
−カロチン合成経路の制御に天然遺伝子を使用するのが
より効率的である。更に、リコピンシクラーゼの作用を
標的にする除草剤に耐性を有する役立つ作物を有するこ
とは有用である。カロチノイド合成経路を標的にする除
草剤は、この経路がヒト、動物又は昆虫には存在しない
ので毒性が低いといえる。更に、カロチノイド合成経路
内の２地点で除草剤耐性である植物は、２種類の除草剤
を交互に使用するのを可能にし、それによって除草剤耐
性雑草種の出現を最小限に抑える。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明に従い、ｌｃｙと
称するリコピンシクラーゼの遺伝子をコードするＤＮＡ
配列を精製及び単離した。更に、本発明は、天然遺伝子
の発現を加減する方法を含み、それによって生物内での
外来遺伝子の存在を必要としない。更に、本発明は、ピ
ロリン酸ゲラニルゲラニルからβ−カロチンへの生合成
経路を制御するｌｃｙを含む酵素をコードする遺伝子を
組み込むことにより、真核及び原核細胞から選ばれる適
当な宿主細胞内に該経路を発現する方法を含む。この方
法は、β−カロチンを産生しない生物内でβ−カロチン
を産生するのに用いることができ、それによって該生物
の栄養価、薬学的性質及び目に見える外観的価値を向上
させることができる。
称するリコピンシクラーゼの遺伝子をコードするＤＮＡ
配列を精製及び単離した。更に、本発明は、天然遺伝子
の発現を加減する方法を含み、それによって生物内での
外来遺伝子の存在を必要としない。更に、本発明は、ピ
ロリン酸ゲラニルゲラニルからβ−カロチンへの生合成
経路を制御するｌｃｙを含む酵素をコードする遺伝子を
組み込むことにより、真核及び原核細胞から選ばれる適
当な宿主細胞内に該経路を発現する方法を含む。この方
法は、β−カロチンを産生しない生物内でβ−カロチン
を産生するのに用いることができ、それによって該生物
の栄養価、薬学的性質及び目に見える外観的価値を向上
させることができる。
【０００８】本発明は、更に、トランスジェニック生物
内でリコピンシクラーゼの遺伝子を構成的に又は組織特
異的様式で過剰発現させて該生合成経路においてβ−カ
ロチン又は他のカロチノイドの含量を増やす方法を含
む。本発明は、天然遺伝子又は相同遺伝子のいずれかの
ｌｃｙ遺伝子のアンチセンス発現をゲノムＤＮＡ内に導
入し、それによってリコピンシクラーゼの合成を阻害し
て赤色色素であるリコピンを蓄積するトランスジェニッ
ク生物も含む。この方法は、赤くなかった生物を赤くす
るか又は現に赤い生物の外観をより赤くすることができ
る。最後に、本発明は、除草剤ＭＰＴＡ及びトリアルキ
ルアミンの他の関連化合物及びリコピンシクラーゼ酵素
と相互作用する他の除草剤の如き除草剤の作用に対して
耐性であるトランスジェニック植物の構築をも含む。本
発明の他の効果は、添付の図面と関連させながら以下の
詳細な説明を参照することにより本発明をより充分に理
解できるので、容易に認識されるであろう。
内でリコピンシクラーゼの遺伝子を構成的に又は組織特
異的様式で過剰発現させて該生合成経路においてβ−カ
ロチン又は他のカロチノイドの含量を増やす方法を含
む。本発明は、天然遺伝子又は相同遺伝子のいずれかの
ｌｃｙ遺伝子のアンチセンス発現をゲノムＤＮＡ内に導
入し、それによってリコピンシクラーゼの合成を阻害し
て赤色色素であるリコピンを蓄積するトランスジェニッ
ク生物も含む。この方法は、赤くなかった生物を赤くす
るか又は現に赤い生物の外観をより赤くすることができ
る。最後に、本発明は、除草剤ＭＰＴＡ及びトリアルキ
ルアミンの他の関連化合物及びリコピンシクラーゼ酵素
と相互作用する他の除草剤の如き除草剤の作用に対して
耐性であるトランスジェニック植物の構築をも含む。本
発明の他の効果は、添付の図面と関連させながら以下の
詳細な説明を参照することにより本発明をより充分に理
解できるので、容易に認識されるであろう。
【０００９】本発明は、酵素リコピンシクラーゼ（ＬＣ
Ｙ）をコードする遺伝子及び配列番号：１に最も良く示
されている該遺伝子のＤＮＡフランキング配列を含むＤ
ＮＡ配列からなる。ｌｃｙと称する該遺伝子を精製し、
単離しそしてクローン化した。更に、リコピンシクラー
ゼの遺伝子のプロモーター領域において修飾されたＤＮ
Ａ配列であってＭＰＴＡに対する耐性を与える配列も、
本発明を実施するに際して、精製し、単離しそしてクロ
ーン化した（図２及び７）。除草剤は、一般に、選択し
た生化学的経路を途絶することによって効果を発揮す
る。カロチノイド生合成経路を妨害する除草剤は特に効
果がある。これら除草剤には、環状カロチノイドの生成
を阻害して、植物、藻類、及び青緑色細菌内でのリコピ
ンの蓄積をもたらす数種の置換トリエチルアミン化合物
が含まれる26。特に効果的なこの種の阻害剤は、化合物
２−（４−メチルフェノキシ）トリエチルアミン塩酸塩
（ＭＰＴＡ）である27,28 。ＭＰＴＡ及び関連化合物の
標的部位は、酵素リコピンシクラーゼであると考えられ
ている26。
Ｙ）をコードする遺伝子及び配列番号：１に最も良く示
されている該遺伝子のＤＮＡフランキング配列を含むＤ
ＮＡ配列からなる。ｌｃｙと称する該遺伝子を精製し、
単離しそしてクローン化した。更に、リコピンシクラー
ゼの遺伝子のプロモーター領域において修飾されたＤＮ
Ａ配列であってＭＰＴＡに対する耐性を与える配列も、
本発明を実施するに際して、精製し、単離しそしてクロ
ーン化した（図２及び７）。除草剤は、一般に、選択し
た生化学的経路を途絶することによって効果を発揮す
る。カロチノイド生合成経路を妨害する除草剤は特に効
果がある。これら除草剤には、環状カロチノイドの生成
を阻害して、植物、藻類、及び青緑色細菌内でのリコピ
ンの蓄積をもたらす数種の置換トリエチルアミン化合物
が含まれる26。特に効果的なこの種の阻害剤は、化合物
２−（４−メチルフェノキシ）トリエチルアミン塩酸塩
（ＭＰＴＡ）である27,28 。ＭＰＴＡ及び関連化合物の
標的部位は、酵素リコピンシクラーゼであると考えられ
ている26。
【００１０】本発明者らは、シネココッカスｓｐ．ＰＣ
Ｃ７９４２のＭＰＴＡ耐性突然変異体を単離して該突然
変異の１つを含有する遺伝子をクローン化した（図７を
参照のこと）。大腸菌のリコピン蓄積株内でのこの遺伝
子の発現は、該ＭＰＴＡ耐性遺伝子がリコピンシクラー
ゼをコードすることを明白に示した。ＤＮＡハイブリダ
イゼーション分析は、この遺伝子の配列が他の光合成真
核細胞の中に保存されていることを示している。除草剤
耐性を付与する突然変異は、点突然変異、欠失又は挿入
であってもよい。該突然変異は、得られるアミノ酸配列
が除草剤耐性を付与できるように変化するような、ｌｃ
ｙのヌクレオチド配列内で起こるものであっても、また
ｌｃｙの調節が除草剤耐性を付与できるように変化する
ような、ｌｃｙのフランキング配列内で起こるものであ
ってもよい。後者の突然変異の例は、図７に示す突然変
異体５の突然変異である。この突然変異体においては、
開始コドンの１０４塩基対上流のｌｃｙのプロモーター
領域内での一箇所の塩基変換（配列番号：１の塩基番号
１９２５）によりＣがＴに変換しており、それを含むシ
ネココッカスの細胞に高度の除草剤耐性を付与している
（図２を参照のこと）。これは、おそらく酵素の生合成
が大きく増加したことによると考えられる。
Ｃ７９４２のＭＰＴＡ耐性突然変異体を単離して該突然
変異の１つを含有する遺伝子をクローン化した（図７を
参照のこと）。大腸菌のリコピン蓄積株内でのこの遺伝
子の発現は、該ＭＰＴＡ耐性遺伝子がリコピンシクラー
ゼをコードすることを明白に示した。ＤＮＡハイブリダ
イゼーション分析は、この遺伝子の配列が他の光合成真
核細胞の中に保存されていることを示している。除草剤
耐性を付与する突然変異は、点突然変異、欠失又は挿入
であってもよい。該突然変異は、得られるアミノ酸配列
が除草剤耐性を付与できるように変化するような、ｌｃ
ｙのヌクレオチド配列内で起こるものであっても、また
ｌｃｙの調節が除草剤耐性を付与できるように変化する
ような、ｌｃｙのフランキング配列内で起こるものであ
ってもよい。後者の突然変異の例は、図７に示す突然変
異体５の突然変異である。この突然変異体においては、
開始コドンの１０４塩基対上流のｌｃｙのプロモーター
領域内での一箇所の塩基変換（配列番号：１の塩基番号
１９２５）によりＣがＴに変換しており、それを含むシ
ネココッカスの細胞に高度の除草剤耐性を付与している
（図２を参照のこと）。これは、おそらく酵素の生合成
が大きく増加したことによると考えられる。
【００１１】リコピンシクラーゼの遺伝子のクローニン
グでは、先にシネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２中の
フィトエン脱飽和酵素の遺伝子を同定するのに用いた戦
略を用いた。このアプローチは、酵素リコピンシクラー
ゼが漂白除草剤ＭＰＴＡの標的部位であるという推定、
及びリコピンシクラーゼの主要構造における微妙な変換
が、ＭＰＴＡ耐性であって依然として適度な触媒活性を
保持する酵素をもたらすであろうという推測に基づくも
のである。本発明者らは、特定の突然変異体の耐性表現
型がリコピンシクラーゼの遺伝子内での損傷から誘導さ
れるかどうか分からなかった。その上、選択した該表現
型は、該阻害剤の分解若しくは解毒の速度が増加したこ
とによるか又は除草剤取り込み量が減少した結果による
ものであると考えた。突然変異体Ｍr −５のＭＰＴＡ耐
性突然変異を含む遺伝子の大腸菌内での機能発現によ
り、ｌｃｙと称するこの遺伝子こそが実際に酵素リコピ
ンシクラーゼをコードすることが証明された。他の幾つ
かのＭＰＴＡ耐性突然変異がｌｃｙ遺伝子に認められ
た。野生型遺伝子産物（配列番号：２）及びこれら他の
突然変異体の遺伝子産物も大腸菌内で良好に機能する。
グでは、先にシネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２中の
フィトエン脱飽和酵素の遺伝子を同定するのに用いた戦
略を用いた。このアプローチは、酵素リコピンシクラー
ゼが漂白除草剤ＭＰＴＡの標的部位であるという推定、
及びリコピンシクラーゼの主要構造における微妙な変換
が、ＭＰＴＡ耐性であって依然として適度な触媒活性を
保持する酵素をもたらすであろうという推測に基づくも
のである。本発明者らは、特定の突然変異体の耐性表現
型がリコピンシクラーゼの遺伝子内での損傷から誘導さ
れるかどうか分からなかった。その上、選択した該表現
型は、該阻害剤の分解若しくは解毒の速度が増加したこ
とによるか又は除草剤取り込み量が減少した結果による
ものであると考えた。突然変異体Ｍr −５のＭＰＴＡ耐
性突然変異を含む遺伝子の大腸菌内での機能発現によ
り、ｌｃｙと称するこの遺伝子こそが実際に酵素リコピ
ンシクラーゼをコードすることが証明された。他の幾つ
かのＭＰＴＡ耐性突然変異がｌｃｙ遺伝子に認められ
た。野生型遺伝子産物（配列番号：２）及びこれら他の
突然変異体の遺伝子産物も大腸菌内で良好に機能する。
【００１２】リコピンは、植物及び青緑色細菌内での環
状カロチノイド形成の主要な基質である。β−カロチン
へのリコピンの転化は、対称リコピンの両端で環化反応
が起こることを必要とする。本発明は、単一の青緑色細
菌の酵素が両端の環化を効率的に触媒することを明らか
にするものである。以下に記載するように、相当量のリ
コピンがこれら細胞内に蓄積されていたが、単環種であ
るγ−カロチンの蓄積は培養液中に認められなかった。
このことは、一端でのみ環化されたあらゆるリコピン分
子は、他端でも同じく環化される非常に高い可能性を有
していることを示すものである。リコピンシクラーゼが
ホモダイマー性錯体として働くという可能性が、これら
結果に対する１つの説明である。単離操作の一部として
及び形質転換操作で使用するために、新規なプラスミド
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥを構築し本明細書に記載した。プ
ラスミドｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦ及びｐＬＣＹＢ−Ｍ５
ＳＰは、ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥのトランケート型であり
本明細書に記載した。以下の原料及び方法の節に記載す
るように種々のプラスミドを構築した。
状カロチノイド形成の主要な基質である。β−カロチン
へのリコピンの転化は、対称リコピンの両端で環化反応
が起こることを必要とする。本発明は、単一の青緑色細
菌の酵素が両端の環化を効率的に触媒することを明らか
にするものである。以下に記載するように、相当量のリ
コピンがこれら細胞内に蓄積されていたが、単環種であ
るγ−カロチンの蓄積は培養液中に認められなかった。
このことは、一端でのみ環化されたあらゆるリコピン分
子は、他端でも同じく環化される非常に高い可能性を有
していることを示すものである。リコピンシクラーゼが
ホモダイマー性錯体として働くという可能性が、これら
結果に対する１つの説明である。単離操作の一部として
及び形質転換操作で使用するために、新規なプラスミド
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥを構築し本明細書に記載した。プ
ラスミドｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦ及びｐＬＣＹＢ−Ｍ５
ＳＰは、ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥのトランケート型であり
本明細書に記載した。以下の原料及び方法の節に記載す
るように種々のプラスミドを構築した。
【００１３】本発明を使用すれば、ＭＰＴＡに対して耐
性であるリコピンシクラーゼのためのＤＮＡ配列又はリ
コピンシクラーゼのためのＤＮＡの突然変異配列のいず
れかを保持するような適当なベクターを用いて、大腸
菌、青緑色細菌、藻類及び植物を含む宿主細胞を形質転
換することが可能である。かかる形質変換細胞は、ｌｃ
ｙ遺伝子の調節の研究及びＬＣＹの触媒機能の研究を可
能にする。本発明者らは、ζ−カロチンを蓄積する大腸
菌の細胞内でｌｃｙを発現してもζ−カロチンの環化が
起こらないことを認めた。この結果は、シネココッカス
ｌｃｙ遺伝子産物によって触媒される環化反応は、該線
状分子が充分に脱飽和されていることを必要とすること
を意味している。ノイロスポレンはその半分がリコピン
のレベルまで脱飽和されたその半分の部分においてのみ
環化を受け得ることが藻菌類において示された16。本発
明は、ＭＰＴＡ及びリコピンの環化を妨げる他の除草剤
に対して耐性のトランスジェニック生物を構築すること
を含む。除草剤耐性作物を用いることの農学的利点は、
ブラシカ・ナプス (Brassica naous) を含むアブラナ属
において証明されており、そこでは同属の雑草との該作
物の遺伝的交雑によりアトラジン (atrazine) 耐性を導
入している29。
性であるリコピンシクラーゼのためのＤＮＡ配列又はリ
コピンシクラーゼのためのＤＮＡの突然変異配列のいず
れかを保持するような適当なベクターを用いて、大腸
菌、青緑色細菌、藻類及び植物を含む宿主細胞を形質転
換することが可能である。かかる形質変換細胞は、ｌｃ
ｙ遺伝子の調節の研究及びＬＣＹの触媒機能の研究を可
能にする。本発明者らは、ζ−カロチンを蓄積する大腸
菌の細胞内でｌｃｙを発現してもζ−カロチンの環化が
起こらないことを認めた。この結果は、シネココッカス
ｌｃｙ遺伝子産物によって触媒される環化反応は、該線
状分子が充分に脱飽和されていることを必要とすること
を意味している。ノイロスポレンはその半分がリコピン
のレベルまで脱飽和されたその半分の部分においてのみ
環化を受け得ることが藻菌類において示された16。本発
明は、ＭＰＴＡ及びリコピンの環化を妨げる他の除草剤
に対して耐性のトランスジェニック生物を構築すること
を含む。除草剤耐性作物を用いることの農学的利点は、
ブラシカ・ナプス (Brassica naous) を含むアブラナ属
において証明されており、そこでは同属の雑草との該作
物の遺伝的交雑によりアトラジン (atrazine) 耐性を導
入している29。
【００１４】ＭＰＴＡ及び関連化合物の作用の標的部位
については幾つかの議論がある。以前、ＭＰＴＡはグレ
ープフルーツ内でのリコピンの蓄積を誘発すること及び
単離したミドリムシの葉緑体内でリコピンの環化を妨害
することが示された28。構造的に関連する化合物である
２−（４−クロロフェニルチオ）トリエチルアミン塩酸
塩（ＣＰＴＡ）26でより多くの研究がなされ、リコピン
がin vivo で蓄積するという類似の結果が得られた。し
かしながら、in vivo で得られたその結果に反して、Ｃ
ＰＴＡは、トマトプラスチドのアセトン抽出物30、スイ
セン属有色体31及びトウガラシ属有色体32から誘導した
無細胞系におけるカロチノイド生合成には殆ど又は全く
作用しないということが報告された。ＣＰＴＡ及び関連
化合物は、酵素機能に直接影響するというよりもむしろ
遺伝子発現のレベルで作用するという示唆がなされた
30,33,34。青緑色細菌であるアファノカプサ(Aphanocap
sa) からの無細胞系を用いたより最近の研究では、ＣＰ
ＴＡが in vitro でのリコピン環化の有効な阻害剤であ
り得ること、及びサンドマン (Sandmann) ら26によって
吟味されているようにそれが非競合的様式で環化反応を
阻害することが示されている。他の多くの無細胞系でＣ
ＰＴＡによる阻害が認められないことは、効果的な除草
作用のためには膜の物理的結合性及び／又はカロチノイ
ド生合成酵素の順序だった構造的関連が重要であること
を示唆している。無細胞系におけるカロチノイド生合成
機構の微妙な性質は周知である35。
については幾つかの議論がある。以前、ＭＰＴＡはグレ
ープフルーツ内でのリコピンの蓄積を誘発すること及び
単離したミドリムシの葉緑体内でリコピンの環化を妨害
することが示された28。構造的に関連する化合物である
２−（４−クロロフェニルチオ）トリエチルアミン塩酸
塩（ＣＰＴＡ）26でより多くの研究がなされ、リコピン
がin vivo で蓄積するという類似の結果が得られた。し
かしながら、in vivo で得られたその結果に反して、Ｃ
ＰＴＡは、トマトプラスチドのアセトン抽出物30、スイ
セン属有色体31及びトウガラシ属有色体32から誘導した
無細胞系におけるカロチノイド生合成には殆ど又は全く
作用しないということが報告された。ＣＰＴＡ及び関連
化合物は、酵素機能に直接影響するというよりもむしろ
遺伝子発現のレベルで作用するという示唆がなされた
30,33,34。青緑色細菌であるアファノカプサ(Aphanocap
sa) からの無細胞系を用いたより最近の研究では、ＣＰ
ＴＡが in vitro でのリコピン環化の有効な阻害剤であ
り得ること、及びサンドマン (Sandmann) ら26によって
吟味されているようにそれが非競合的様式で環化反応を
阻害することが示されている。他の多くの無細胞系でＣ
ＰＴＡによる阻害が認められないことは、効果的な除草
作用のためには膜の物理的結合性及び／又はカロチノイ
ド生合成酵素の順序だった構造的関連が重要であること
を示唆している。無細胞系におけるカロチノイド生合成
機構の微妙な性質は周知である35。
【００１５】リコピンシクラーゼの遺伝子内での突然変
異がＭＰＴＡに対する耐性を付与するという本発明の知
見は、この酵素がＭＰＴＡ及び関連化合物の作用の標的
部位であるという強力な証拠である。この結論は、本物
の青緑色細菌のカロチン生成器官がないと推定される大
腸菌の細胞内でＭＰＴＡがリコピンシクラーゼ活性を阻
害するという結果によって更に支持される。ＭＰＴＡ処
理大腸菌細胞内でのγ−カロチンの蓄積は、リコピンシ
クラーゼにより行われる第２環化段階が除草剤による阻
害に対してより敏感であることを示唆している。これら
知見は、本発明者らの多くの異なったＭＰＴＡr 突然変
異リコピンシクラーゼ遺伝子のどれかを挿入することに
よって、ＭＰＴＡ耐性であるように作物植物を形質転換
するのを可能にするものである。より重要なことは、本
発明は、ＭＰＴＡ及び他の除草剤に対する耐性を与える
ための天然の植物及び藻類の生物工学を先導するのに使
用することができることである。青緑色細菌のｌｃｙ配
列を分子プローブとして用いたサザーンハイブリダイゼ
ーション分析は、この遺伝子が相同ＤＮＡ配列と共に真
核性藻類内に保存されていることを示しており、そして
藻類及び高等植物からリコピンシクラーゼをクローン化
するのにｌｃｙを分子プローブとして用いることの可能
性を示している。それは、更に、本発明の遺伝子を保持
するトランスジェニック植物が機能性があることも示し
ている。高等植物がｌｃｙと相同性であるリコピンシク
ラーゼ遺伝子を含有しているという事実は、フィトエン
シンターゼ及びフィトエン脱飽和酵素の遺伝子の場合の
ように、植物におけるリコピン環化の酵素化学が青緑色
細菌に類似していて他の微生物とは全く異なっているこ
とを示している。このことは、ｌｃｙがトランスジェニ
ック藻類又は植物内で発現されるときには、ｌｃｙは植
物中の相当物と類似していることにより機能性であるこ
とを意味している。
異がＭＰＴＡに対する耐性を付与するという本発明の知
見は、この酵素がＭＰＴＡ及び関連化合物の作用の標的
部位であるという強力な証拠である。この結論は、本物
の青緑色細菌のカロチン生成器官がないと推定される大
腸菌の細胞内でＭＰＴＡがリコピンシクラーゼ活性を阻
害するという結果によって更に支持される。ＭＰＴＡ処
理大腸菌細胞内でのγ−カロチンの蓄積は、リコピンシ
クラーゼにより行われる第２環化段階が除草剤による阻
害に対してより敏感であることを示唆している。これら
知見は、本発明者らの多くの異なったＭＰＴＡr 突然変
異リコピンシクラーゼ遺伝子のどれかを挿入することに
よって、ＭＰＴＡ耐性であるように作物植物を形質転換
するのを可能にするものである。より重要なことは、本
発明は、ＭＰＴＡ及び他の除草剤に対する耐性を与える
ための天然の植物及び藻類の生物工学を先導するのに使
用することができることである。青緑色細菌のｌｃｙ配
列を分子プローブとして用いたサザーンハイブリダイゼ
ーション分析は、この遺伝子が相同ＤＮＡ配列と共に真
核性藻類内に保存されていることを示しており、そして
藻類及び高等植物からリコピンシクラーゼをクローン化
するのにｌｃｙを分子プローブとして用いることの可能
性を示している。それは、更に、本発明の遺伝子を保持
するトランスジェニック植物が機能性があることも示し
ている。高等植物がｌｃｙと相同性であるリコピンシク
ラーゼ遺伝子を含有しているという事実は、フィトエン
シンターゼ及びフィトエン脱飽和酵素の遺伝子の場合の
ように、植物におけるリコピン環化の酵素化学が青緑色
細菌に類似していて他の微生物とは全く異なっているこ
とを示している。このことは、ｌｃｙがトランスジェニ
ック藻類又は植物内で発現されるときには、ｌｃｙは植
物中の相当物と類似していることにより機能性であるこ
とを意味している。
【００１６】カロチノイド生合成の“植物型”経路にお
いて、本発明者らは、リン酸ゲラニルゲラニルからβ−
カロチンまでの、対称ζ−カロチンをリコピンに転化す
る２つの脱飽和段階を除く全ての段階のための遺伝子を
同定した。ζ−カロチン脱飽和酵素の推定上の遺伝子の
クローニングが最近報告された36。植物及び藻類におけ
るζ−カロチンの脱飽和は、幾つかの実験漂白除草剤に
よって阻害され26、これら化合物の幾つかはシネココッ
カスＰＣＣ７９４２におけるζ−カロチンの脱飽和を効
果的に阻害する26。当該技術分野で既知の技術を用いる
ｐｓｙ、ｐｄｓ、及び本発明、つまりｌｃｙのクローニ
ングの本発明者らの成功は、本発明の範囲内で引き出し
た除草剤耐性突然変異の誘発及び選択と同じ戦略が、適
当な阻害剤でζ−カロチン脱飽和酵素をクローニングす
るのを可能にすることを意味している。このことから、
本発明は、ｐｓｙ、ｐｄｓ、ｚｄｓ及びｌｃｙをコード
するＤＮＡ配列を組み込むことによって、適当な宿主細
胞内でのリン酸ゲラニルゲラニルからβ−カロチンへの
生合成経路の構築を可能にするものである。
いて、本発明者らは、リン酸ゲラニルゲラニルからβ−
カロチンまでの、対称ζ−カロチンをリコピンに転化す
る２つの脱飽和段階を除く全ての段階のための遺伝子を
同定した。ζ−カロチン脱飽和酵素の推定上の遺伝子の
クローニングが最近報告された36。植物及び藻類におけ
るζ−カロチンの脱飽和は、幾つかの実験漂白除草剤に
よって阻害され26、これら化合物の幾つかはシネココッ
カスＰＣＣ７９４２におけるζ−カロチンの脱飽和を効
果的に阻害する26。当該技術分野で既知の技術を用いる
ｐｓｙ、ｐｄｓ、及び本発明、つまりｌｃｙのクローニ
ングの本発明者らの成功は、本発明の範囲内で引き出し
た除草剤耐性突然変異の誘発及び選択と同じ戦略が、適
当な阻害剤でζ−カロチン脱飽和酵素をクローニングす
るのを可能にすることを意味している。このことから、
本発明は、ｐｓｙ、ｐｄｓ、ｚｄｓ及びｌｃｙをコード
するＤＮＡ配列を組み込むことによって、適当な宿主細
胞内でのリン酸ゲラニルゲラニルからβ−カロチンへの
生合成経路の構築を可能にするものである。
【００１７】本発明は、ｌｃｙ遺伝子のアンチセンス発
現をゲノムＤＮＡ内に導入し、それによってリコピンシ
クラーゼの合成を阻害して赤色色素リコピンを蓄積する
トランスジェニック生物も含む。この方法は、赤くなか
った生物を赤くするか又は現に赤い生物の外観をより赤
くすることができる。植物の表現型を変化させるために
遺伝子発現を変化させるアンチセンス技術を用いること
は報告されている。この技術は、カロチノイド生合成経
路を有するトマトで利用されている12,37,38。以下の実
施例は、それぞれのｌｃｙ配列の単離、精製及びクロー
ニングの方法並びにプローブ／ベクター構築の方法及び
それらの使用方法を説明するものである。更に、これら
実施例は、該ベクターを用いる細菌、藻類及び植物の如
き適当な宿主細胞の形質転換、並びに除草剤耐性の部位
の確認を明示している。適当な宿主細胞には、ｌｃｙだ
けが使用される場合のカロチン生成生物、又はフィトエ
ン、ｐｄｓの前駆体若しくはｃｒｔＩ遺伝子産物を含有
する細胞が含まれる。
現をゲノムＤＮＡ内に導入し、それによってリコピンシ
クラーゼの合成を阻害して赤色色素リコピンを蓄積する
トランスジェニック生物も含む。この方法は、赤くなか
った生物を赤くするか又は現に赤い生物の外観をより赤
くすることができる。植物の表現型を変化させるために
遺伝子発現を変化させるアンチセンス技術を用いること
は報告されている。この技術は、カロチノイド生合成経
路を有するトマトで利用されている12,37,38。以下の実
施例は、それぞれのｌｃｙ配列の単離、精製及びクロー
ニングの方法並びにプローブ／ベクター構築の方法及び
それらの使用方法を説明するものである。更に、これら
実施例は、該ベクターを用いる細菌、藻類及び植物の如
き適当な宿主細胞の形質転換、並びに除草剤耐性の部位
の確認を明示している。適当な宿主細胞には、ｌｃｙだ
けが使用される場合のカロチン生成生物、又はフィトエ
ン、ｐｄｓの前駆体若しくはｃｒｔＩ遺伝子産物を含有
する細胞が含まれる。
【００１８】原料及び方法 生物及び成育条件 シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２（アナキスチス・
ニデュランス (Anacystis nidulans) Ｒ２）の培養を以
前に記載されたようにして39ＢＧ１１培地中で３５℃で
行った。ＭＰＴＡ耐性突然変異体（ＭＰＴＡr ）及び形
質転換体の選択用に、1.５％寒天（バクト）及び２０又
は３０μＭのＭＰＴＡを含有する固体ＢＧ１１培地上に
該培養液を塗布した。ＭＰＴＡは、ペトリ皿に注ぎ入れ
る直前に２０ｍＭメタノール貯蔵溶液から５０℃で溶融
寒天に添加したものであった。必要な場合に、該ＢＧ１
１寒天プレートにカナマイシンを１０μｇ／ｍｌの濃度
で加えた。大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、プラスミドベ
クターｐＢＲ３２９Ｋ25内のシネココッカスのゲノムラ
イブラリーの宿主として選択用の３０μｇ／ｍｌのカナ
マイシンと共に、及びプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＫＳ+ （ストラタジェン）及び他のプラスミドの
宿主として１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／又は
５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと共に用いた。
大腸菌の培養は暗所で３７℃でＬＢ培地中で行った40。
ニデュランス (Anacystis nidulans) Ｒ２）の培養を以
前に記載されたようにして39ＢＧ１１培地中で３５℃で
行った。ＭＰＴＡ耐性突然変異体（ＭＰＴＡr ）及び形
質転換体の選択用に、1.５％寒天（バクト）及び２０又
は３０μＭのＭＰＴＡを含有する固体ＢＧ１１培地上に
該培養液を塗布した。ＭＰＴＡは、ペトリ皿に注ぎ入れ
る直前に２０ｍＭメタノール貯蔵溶液から５０℃で溶融
寒天に添加したものであった。必要な場合に、該ＢＧ１
１寒天プレートにカナマイシンを１０μｇ／ｍｌの濃度
で加えた。大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、プラスミドベ
クターｐＢＲ３２９Ｋ25内のシネココッカスのゲノムラ
イブラリーの宿主として選択用の３０μｇ／ｍｌのカナ
マイシンと共に、及びプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＫＳ+ （ストラタジェン）及び他のプラスミドの
宿主として１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／又は
５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと共に用いた。
大腸菌の培養は暗所で３７℃でＬＢ培地中で行った40。
【００１９】ＭＰＴＡ耐性突然変異体の選択 シネココッカスの培養液を以前に記載されたようにして
39化学突然変異誘発物質であるエタンメチルスルホネー
ト（ＥＭＳ、シグマ・ケミカル・カンパニー，セントル
イス，ミズーリ州）で処理し、液体培養液中で２４時間
成育させた後、２０又は３０μＭのＭＰＴＡを含有する
ＢＧ１１寒天プレート上での選択した。３μｌの希釈培
養液をＢＧ１１寒天のマスターペトリ皿上にスポッテイ
ングすることにより、選択した突然変異体における除草
剤耐性を試験した。２週間成育した後、異なる濃度のＭ
ＰＴＡを含有するプレート上にレプリカを作製して、更
に２週間成育させた。突然変異体を４μＭのＭＰＴＡを
含有するＢＧ１１寒天プレート上に維持した。このＭＰ
ＴＡは、カリフォリニア州（９１１０６）パサディーナ
にある合衆国農務省農業調査局内の果物及び野菜化学研
究室のヘンリー・ヨコヤマ博士から譲り受けたものであ
る。
39化学突然変異誘発物質であるエタンメチルスルホネー
ト（ＥＭＳ、シグマ・ケミカル・カンパニー，セントル
イス，ミズーリ州）で処理し、液体培養液中で２４時間
成育させた後、２０又は３０μＭのＭＰＴＡを含有する
ＢＧ１１寒天プレート上での選択した。３μｌの希釈培
養液をＢＧ１１寒天のマスターペトリ皿上にスポッテイ
ングすることにより、選択した突然変異体における除草
剤耐性を試験した。２週間成育した後、異なる濃度のＭ
ＰＴＡを含有するプレート上にレプリカを作製して、更
に２週間成育させた。突然変異体を４μＭのＭＰＴＡを
含有するＢＧ１１寒天プレート上に維持した。このＭＰ
ＴＡは、カリフォリニア州（９１１０６）パサディーナ
にある合衆国農務省農業調査局内の果物及び野菜化学研
究室のヘンリー・ヨコヤマ博士から譲り受けたものであ
る。
【００２０】分子クローニング ＭＰＴＡ耐性シネココッカス突然変異体５（Ｍr −５）
からゲノムＤＮＡを抽出し41、ＥｃｏＲＩで完全に消化
し、そしてｐＢＲ３２９Ｋ25のＥｃｏＲＩ部位内にゲノ
ムライブラリーを構築した。親野生型株をこのＭr −５
ライブラリーのＤＮＡで形質転換し41、そして該形質転
換体をＭＰＴＡ（２０又は３０μＭ）及びカナマイシン
（１０μＭ）の両方を含有するＢＧ１１寒天プレート上
で選択した。カモビッツ(Chamovitz) ら25に記載された
戦略を用いてプラスミドベクターをフランキングゲノム
ＤＮＡと一緒に回収した。このようにして回収した2.１
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩゲノムＤＮＡ断片をサザー
ンＤＮＡ分析の分子プローブとして用いた。32Ｐ標識化
をランダムプライミング法42により行った。このプロー
ブを用いてコロニーハイブリダイゼーション40により同
定した8.５ｋｂのゲノムクローンをプラスミドｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+ （ストラタジェン）内にサブ
クローン化し、ｐＭ５ＥＥと称した。このクローンの種
々の断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+
内にサブクローン化して、シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ
７９４２の野生型株をＭＰＴＡ耐性に形質転換するそれ
らの能力を試験した。デル・サル(Del Sal) らの操作43
を用いてプラスミドＤＮＡの小試料 (miniprep) を調製
した。
からゲノムＤＮＡを抽出し41、ＥｃｏＲＩで完全に消化
し、そしてｐＢＲ３２９Ｋ25のＥｃｏＲＩ部位内にゲノ
ムライブラリーを構築した。親野生型株をこのＭr −５
ライブラリーのＤＮＡで形質転換し41、そして該形質転
換体をＭＰＴＡ（２０又は３０μＭ）及びカナマイシン
（１０μＭ）の両方を含有するＢＧ１１寒天プレート上
で選択した。カモビッツ(Chamovitz) ら25に記載された
戦略を用いてプラスミドベクターをフランキングゲノム
ＤＮＡと一緒に回収した。このようにして回収した2.１
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩゲノムＤＮＡ断片をサザー
ンＤＮＡ分析の分子プローブとして用いた。32Ｐ標識化
をランダムプライミング法42により行った。このプロー
ブを用いてコロニーハイブリダイゼーション40により同
定した8.５ｋｂのゲノムクローンをプラスミドｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+ （ストラタジェン）内にサブ
クローン化し、ｐＭ５ＥＥと称した。このクローンの種
々の断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ+
内にサブクローン化して、シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ
７９４２の野生型株をＭＰＴＡ耐性に形質転換するそれ
らの能力を試験した。デル・サル(Del Sal) らの操作43
を用いてプラスミドＤＮＡの小試料 (miniprep) を調製
した。
【００２１】大腸菌のリコピン蓄積株の構築 リコピンシクラーゼ（ＬＣＹ）の活性を確認するには、
大腸菌の細胞を酵素ＬＣＹの基質であるリコピンを産生
するように遺伝子工学により修飾することが必須であっ
た。エレウィニア種からの遺伝子を利用して大腸菌で行
う数例のかかる技術が、過去において公表されている
18,19,44,45,46,47 。簡単に説明すると、エレウィニア
・ウレドボラからクローン化したカロチノイド生合成酵
素をコードする遺伝子のクラスターからベクターを構築
したのである18。プラスミドｐＣＡＲから2.２６ｋｂの
ＢｓｔＥII−ＳｎａＢＩ断片を欠失させ（ミサワら, 19
90）、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、及びｃｒｔＩを保持する3.
７５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミド
ベクターｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏＲＶ部位内にサブク
ローン化した。次いで、ｐＣＡＲ−ＡＤＥ18と称する該
組み換えプラスミドと同じ挿入体を有する得られたベク
ターを用いて大腸菌のリコピン蓄積株を構築した。
大腸菌の細胞を酵素ＬＣＹの基質であるリコピンを産生
するように遺伝子工学により修飾することが必須であっ
た。エレウィニア種からの遺伝子を利用して大腸菌で行
う数例のかかる技術が、過去において公表されている
18,19,44,45,46,47 。簡単に説明すると、エレウィニア
・ウレドボラからクローン化したカロチノイド生合成酵
素をコードする遺伝子のクラスターからベクターを構築
したのである18。プラスミドｐＣＡＲから2.２６ｋｂの
ＢｓｔＥII−ＳｎａＢＩ断片を欠失させ（ミサワら, 19
90）、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、及びｃｒｔＩを保持する3.
７５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミド
ベクターｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏＲＶ部位内にサブク
ローン化した。次いで、ｐＣＡＲ−ＡＤＥ18と称する該
組み換えプラスミドと同じ挿入体を有する得られたベク
ターを用いて大腸菌のリコピン蓄積株を構築した。
【００２２】大腸菌内でのリコピンシクラーゼの機能発
現 ＭＰＴＡ耐性突然変異を含む7.２ｋｂのＸｂａｌＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫ
Ｓ+ （ストラタジェン）の複数のクローニング部位でク
ローン化し、次いでＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片として切
り取った。次いで、このＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＩ
ＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）誘
導性発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インビトロゲン）
内にクローン化し、ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥと称する得ら
れたプラスミドを用いてｐＣＡＲ−ＡＤＥを含有するＸ
Ｌ１−Ｂｌｕｅの大腸菌株のコンピテント細胞を形質転
換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラ
ムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天
プレート上に形質転換した細胞をプレートし、細胞をプ
レートする１時間前にＩＰＴＧの１００ｍＭ水溶液１０
μｌを塗布した。
現 ＭＰＴＡ耐性突然変異を含む7.２ｋｂのＸｂａｌＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫ
Ｓ+ （ストラタジェン）の複数のクローニング部位でク
ローン化し、次いでＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片として切
り取った。次いで、このＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＩ
ＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）誘
導性発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インビトロゲン）
内にクローン化し、ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥと称する得ら
れたプラスミドを用いてｐＣＡＲ−ＡＤＥを含有するＸ
Ｌ１−Ｂｌｕｅの大腸菌株のコンピテント細胞を形質転
換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラ
ムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天
プレート上に形質転換した細胞をプレートし、細胞をプ
レートする１時間前にＩＰＴＧの１００ｍＭ水溶液１０
μｌを塗布した。
【００２３】カロチノイド色素分析 １ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中、３７℃で１８
時間大腸菌の培養を行った。５０ｍｌの該懸濁培養液か
ら遠心分離により細菌細胞を採取し、該沈澱を９０％ア
セトンに溶解することによってカロチノイド色素を抽出
した。以前に記載されたようにして10、スフェリソルブ
(Spherisorb) ＯＤＳ１ ２５ｃｍ逆相カラムでのＨＰ
ＬＣによりカロチノイドを分析した。アセトニトリル／
メタノール／イソプロパノール（８５：１０：５）のイ
ソクラチック(isocratic) 溶媒系を用いて、Ｌ６２００
ポンプ、Ｄ６０００中間相を有するＬ３００マルチチャ
ンネル光検出器からなるメルク／日立ＨＰＬＣ装置を使
用した。日立ＤＡＤマネージャーソフトウェアーによ
り、フィトエン及び着色カロチノイドの同時検出が可能
であった。個々のカロチノイドは、リコピン及びβ−カ
ロチンの対照標準と比較してオンライン式吸収スペクト
ル及び代表的保持時間に基づいて同定した。
時間大腸菌の培養を行った。５０ｍｌの該懸濁培養液か
ら遠心分離により細菌細胞を採取し、該沈澱を９０％ア
セトンに溶解することによってカロチノイド色素を抽出
した。以前に記載されたようにして10、スフェリソルブ
(Spherisorb) ＯＤＳ１ ２５ｃｍ逆相カラムでのＨＰ
ＬＣによりカロチノイドを分析した。アセトニトリル／
メタノール／イソプロパノール（８５：１０：５）のイ
ソクラチック(isocratic) 溶媒系を用いて、Ｌ６２００
ポンプ、Ｄ６０００中間相を有するＬ３００マルチチャ
ンネル光検出器からなるメルク／日立ＨＰＬＣ装置を使
用した。日立ＤＡＤマネージャーソフトウェアーによ
り、フィトエン及び着色カロチノイドの同時検出が可能
であった。個々のカロチノイドは、リコピン及びβ−カ
ロチンの対照標準と比較してオンライン式吸収スペクト
ル及び代表的保持時間に基づいて同定した。
【００２４】
１．ＭＰＴＡ耐性突然変異体の選択及び遺伝子存在の確
認 青緑色細菌シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生
型細胞は、２μＭを超える漂白除草剤ＭＰＴＡを含有す
るＢＧ１１寒天プレート上では成育しなかった。ＥＭＳ
での野生型株の突然変異誘発及び３０μＭのＭＰＴＡを
含有する寒天プレート上での成育についての選択後に、
本発明者らは幾らかの除草剤耐性突然変異体を選択し
た。突然変異体５（Ｍr −５）は最高の耐性を示し、５
０μＭのＭＰＴＡを含有する寒天プレート上で成育した
（図２）。本明細書に記載したこの後の全実験にこの突
然変異体を用いた。Ｍr −５におけるＭＰＴＡ耐性の遺
伝的根拠を、形質転換実験によって得た。Ｍr −５から
ゲノムＤＮＡを抽出し、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
で消化してシネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生
型細胞に形質移入した。３０μＭのＭＰＴＡを含有する
寒天プレート上での高頻度でのコロニーの出現（非形質
転換コントロールの約１０4 倍）により、ＭＰＴＡに対
する耐性の遺伝的形質が証明され、そして１箇所の損傷
又は密接に関連した複数の突然変異のいずれかが該耐性
形質の原因であることが示された。
認 青緑色細菌シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生
型細胞は、２μＭを超える漂白除草剤ＭＰＴＡを含有す
るＢＧ１１寒天プレート上では成育しなかった。ＥＭＳ
での野生型株の突然変異誘発及び３０μＭのＭＰＴＡを
含有する寒天プレート上での成育についての選択後に、
本発明者らは幾らかの除草剤耐性突然変異体を選択し
た。突然変異体５（Ｍr −５）は最高の耐性を示し、５
０μＭのＭＰＴＡを含有する寒天プレート上で成育した
（図２）。本明細書に記載したこの後の全実験にこの突
然変異体を用いた。Ｍr −５におけるＭＰＴＡ耐性の遺
伝的根拠を、形質転換実験によって得た。Ｍr −５から
ゲノムＤＮＡを抽出し、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
で消化してシネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生
型細胞に形質移入した。３０μＭのＭＰＴＡを含有する
寒天プレート上での高頻度でのコロニーの出現（非形質
転換コントロールの約１０4 倍）により、ＭＰＴＡに対
する耐性の遺伝的形質が証明され、そして１箇所の損傷
又は密接に関連した複数の突然変異のいずれかが該耐性
形質の原因であることが示された。
【００２５】２．ＭＰＴＡ耐性遺伝子のクローニング 突然変異体Ｍr −５のゲノムライブラリーをプラスミド
ベクターｐＢＲ３２９Ｋ25のＥｃｏＲＩ部位に構築し
た。このライブラリーのＤＮＡを閉環状プラスミドとし
て野生型株の細胞に形質移入し、ＭＰＴＡ及びカナマイ
シンの両方を含有するＢＧ１１寒天プレート上での成育
について形質転換体を選択した。シネココッカスｓｐ．
ＰＣＣ７９４２における安定な形質転換は、相同的組み
換えの後に該細菌の染色体内に外来ＤＮＡを組み込むこ
とによって起こる48,49 。二重耐性形質転換体が、ＭＰ
ＴＡ耐性（ＭＰＴＡr ）のための突然変異を有するゲノ
ムＤＮＡを含有するプラスミドと該染色体内のその相同
配列の間の１つの交叉現象の結果として生じた。結局、
ｐＢＲ３２９ＫプラスミドＤＮＡは、ＭＰＴＡ耐性遺伝
子に隣接する青緑色細菌染色体内に組み込まれた（１９
９０年のカモビッツらの参考文献25の図２に詳細に説明
されている）。二重耐性形質転換体のゲノムＤＮＡをＳ
ａｌＩ又はＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのいずれかで
消化してから、ＤＮＡ連結反応を行い、大腸菌の細胞に
形質移入し、そしてカナマイシン耐性（Ｋａｎr ）につ
いて選択することによって、ｐＢＲ３２９Ｋベクターの
一部分を、該隣接するゲノムＤＮＡの断片と共に回収し
た。かかる１つのＫａｎr −ＭＰＴＡr 形質転換体か
ら、本発明者らは青緑色細菌ゲノムＤＮＡの2.１ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を回収した。この断片を分子
プローブとして用いて元のＭr −５ゲノムＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングし、8.５ｋｂのＥｃｏＲＩゲノ
ム挿入体を含有するプラスミドを同定した。シネココッ
カスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生型株の細胞内へのこの
8.５ｋｂＤＮＡ断片の形質移入により、高頻度の除草剤
耐性コロニーがもたらされ、かくしてこの断片がＭＰＴ
Ａr を付与する突然変異を含有していることが確認され
た。同様な試験により、該突然変異は4.６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ断片内に位置していることが示され、
続いて、それをＰｓｔＩ及びＳａｌＩ制限部位によって
区切った0.２ｋｂの領域に割当てた（図３）。
ベクターｐＢＲ３２９Ｋ25のＥｃｏＲＩ部位に構築し
た。このライブラリーのＤＮＡを閉環状プラスミドとし
て野生型株の細胞に形質移入し、ＭＰＴＡ及びカナマイ
シンの両方を含有するＢＧ１１寒天プレート上での成育
について形質転換体を選択した。シネココッカスｓｐ．
ＰＣＣ７９４２における安定な形質転換は、相同的組み
換えの後に該細菌の染色体内に外来ＤＮＡを組み込むこ
とによって起こる48,49 。二重耐性形質転換体が、ＭＰ
ＴＡ耐性（ＭＰＴＡr ）のための突然変異を有するゲノ
ムＤＮＡを含有するプラスミドと該染色体内のその相同
配列の間の１つの交叉現象の結果として生じた。結局、
ｐＢＲ３２９ＫプラスミドＤＮＡは、ＭＰＴＡ耐性遺伝
子に隣接する青緑色細菌染色体内に組み込まれた（１９
９０年のカモビッツらの参考文献25の図２に詳細に説明
されている）。二重耐性形質転換体のゲノムＤＮＡをＳ
ａｌＩ又はＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのいずれかで
消化してから、ＤＮＡ連結反応を行い、大腸菌の細胞に
形質移入し、そしてカナマイシン耐性（Ｋａｎr ）につ
いて選択することによって、ｐＢＲ３２９Ｋベクターの
一部分を、該隣接するゲノムＤＮＡの断片と共に回収し
た。かかる１つのＫａｎr −ＭＰＴＡr 形質転換体か
ら、本発明者らは青緑色細菌ゲノムＤＮＡの2.１ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を回収した。この断片を分子
プローブとして用いて元のＭr −５ゲノムＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングし、8.５ｋｂのＥｃｏＲＩゲノ
ム挿入体を含有するプラスミドを同定した。シネココッ
カスｓｐ．ＰＣＣ７９４２の野生型株の細胞内へのこの
8.５ｋｂＤＮＡ断片の形質移入により、高頻度の除草剤
耐性コロニーがもたらされ、かくしてこの断片がＭＰＴ
Ａr を付与する突然変異を含有していることが確認され
た。同様な試験により、該突然変異は4.６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ断片内に位置していることが示され、
続いて、それをＰｓｔＩ及びＳａｌＩ制限部位によって
区切った0.２ｋｂの領域に割当てた（図３）。
【００２６】３．ＭＰＴＡ耐性遺伝子はリコピンシクラ
ーゼをコードする ＭＰＴＡがリコピンの環化を阻害することから、本発明
者らは、株Ｍr −５におけるＭＰＴＡ耐性はリコピンシ
クラーゼの変化によるものであって、該突然変異の位置
を調べればこの酵素の遺伝子に辿り着くであろうと考え
た。従って、本発明者らは、リコピンを産生する大腸菌
内で該突然変異を含む青緑色細菌ゲノム断片を発現させ
ることにより、この遺伝子の存在を試験した。前に記載
したようにして18構築したプラスミドを用いた。これ
は、酵素ＧＧＰＰシンターゼ（ｃｒｔＥ）、フィトエン
シンターゼ（ｃｒｔＢ）及びフィトエン脱飽和酵素（ｃ
ｒｔＩ）をコードする細菌エレウィニア・ウレドボラか
らの遺伝子を含有する。このプラスミドを保持する大腸
菌の細胞はリコピンを蓄積し（図６）寒天プレート上に
桃色のコロニーを生成する。
ーゼをコードする ＭＰＴＡがリコピンの環化を阻害することから、本発明
者らは、株Ｍr −５におけるＭＰＴＡ耐性はリコピンシ
クラーゼの変化によるものであって、該突然変異の位置
を調べればこの酵素の遺伝子に辿り着くであろうと考え
た。従って、本発明者らは、リコピンを産生する大腸菌
内で該突然変異を含む青緑色細菌ゲノム断片を発現させ
ることにより、この遺伝子の存在を試験した。前に記載
したようにして18構築したプラスミドを用いた。これ
は、酵素ＧＧＰＰシンターゼ（ｃｒｔＥ）、フィトエン
シンターゼ（ｃｒｔＢ）及びフィトエン脱飽和酵素（ｃ
ｒｔＩ）をコードする細菌エレウィニア・ウレドボラか
らの遺伝子を含有する。このプラスミドを保持する大腸
菌の細胞はリコピンを蓄積し（図６）寒天プレート上に
桃色のコロニーを生成する。
【００２７】既にｐＣＡＲ−ＡＤＥを含有する大腸菌の
細胞内に7.２ｋｂのゲノム挿入体を含有するプラスミド
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（図５）を導入した。ＩＰＴＧの
存在下又は不存在下で、両方のプラスミドを含有する細
胞のコロニー及び培養液は黄色であり、ＨＰＬＣ分析に
より明らかなようにリコピンに加えてβ−カロチンを含
有した（図６）。最小のものがベクターｐＴｒｃＨｉｓ
Ｂ（プラスミドｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦ）中の1.５ｋｂ
のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片である、該突然変異を含む他
の幾つかのゲノム断片から、図６に示した結果と類似の
結果が得られた（図４も参照のこと）。ｐＴｒｃＨｉｓ
ベクターの３つ全てのフレーム内でクローン化された1.
５ｋｂのＰｓｔＩ断片で酵素活性が認められ、それはＩ
ＰＴＧ誘発に依存していなかった。該断片を逆向きでク
ローン化した場合には、活性は認められなかった。該ベ
クターのプロモーターへの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの
結合は、融合タンパク質よりはむしろ青緑色細菌プロモ
ーター及び本物の青緑色細菌酵素の認識及び利用を促進
するという結論が得られた。ＭＰＴＡ耐性突然変異を含
む0.２ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部分だけを欠いている
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦのトランケート型は、大腸菌細
胞内でリコピンシクラーゼ活性を維持しなかった。ＤＮ
Ａ配列分析により、リコピンシクラーゼ活性の割り当て
位置に完全に一致する単一のオープンリーディングフレ
ームが明らかとなった（図７）。本発明者らは、このｌ
ｃｙと称する推定上の遺伝子が酵素リコピンシクラーゼ
をコードし、かつこの単一の遺伝子産物がリコピンから
β−カロチンを生成するのに必要な両端の環化段階を充
分に触媒すると結論した。
細胞内に7.２ｋｂのゲノム挿入体を含有するプラスミド
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（図５）を導入した。ＩＰＴＧの
存在下又は不存在下で、両方のプラスミドを含有する細
胞のコロニー及び培養液は黄色であり、ＨＰＬＣ分析に
より明らかなようにリコピンに加えてβ−カロチンを含
有した（図６）。最小のものがベクターｐＴｒｃＨｉｓ
Ｂ（プラスミドｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦ）中の1.５ｋｂ
のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片である、該突然変異を含む他
の幾つかのゲノム断片から、図６に示した結果と類似の
結果が得られた（図４も参照のこと）。ｐＴｒｃＨｉｓ
ベクターの３つ全てのフレーム内でクローン化された1.
５ｋｂのＰｓｔＩ断片で酵素活性が認められ、それはＩ
ＰＴＧ誘発に依存していなかった。該断片を逆向きでク
ローン化した場合には、活性は認められなかった。該ベ
クターのプロモーターへの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの
結合は、融合タンパク質よりはむしろ青緑色細菌プロモ
ーター及び本物の青緑色細菌酵素の認識及び利用を促進
するという結論が得られた。ＭＰＴＡ耐性突然変異を含
む0.２ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部分だけを欠いている
ｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＰＰＦのトランケート型は、大腸菌細
胞内でリコピンシクラーゼ活性を維持しなかった。ＤＮ
Ａ配列分析により、リコピンシクラーゼ活性の割り当て
位置に完全に一致する単一のオープンリーディングフレ
ームが明らかとなった（図７）。本発明者らは、このｌ
ｃｙと称する推定上の遺伝子が酵素リコピンシクラーゼ
をコードし、かつこの単一の遺伝子産物がリコピンから
β−カロチンを生成するのに必要な両端の環化段階を充
分に触媒すると結論した。
【００２８】４．リコピンシクラーゼはＭＰＴＡ阻害の
標的部位である ＭＰＴＡとリコピンシクラーゼ活性の相互作用を試験す
るために、形質転換した大腸菌細胞の懸濁培養液を１０
０μＭのＭＰＴＡ存在下で成育させた。図６に示したカ
ロチノイドのＨＰＬＣ分析により、これら細胞はリコピ
ン及びβ−カロチンに加えて相当量の単環γ−カロチン
を蓄積するが、ＭＰＴＡ不存在下ではγ−カロチンが検
出されないことが示された。本発明者らは、ＭＰＴＡが
リコピンシクラーゼの阻害剤として直接作用すると結論
した。
標的部位である ＭＰＴＡとリコピンシクラーゼ活性の相互作用を試験す
るために、形質転換した大腸菌細胞の懸濁培養液を１０
０μＭのＭＰＴＡ存在下で成育させた。図６に示したカ
ロチノイドのＨＰＬＣ分析により、これら細胞はリコピ
ン及びβ−カロチンに加えて相当量の単環γ−カロチン
を蓄積するが、ＭＰＴＡ不存在下ではγ−カロチンが検
出されないことが示された。本発明者らは、ＭＰＴＡが
リコピンシクラーゼの阻害剤として直接作用すると結論
した。
【００２９】５．ＭＰＴＡ耐性のための突然変異の同定
（図７） リコピンシクラーゼ活性を付与する領域におけるＤＮＡ
配列分析（図４）により、単一のオープンリーディング
フレーム、つまりｌｃｙが明らかとなった。このオープ
ンリーディングフレームは、予測分子量の４6,０９３ｇ
／モル（配列番号：２）を有する４１１アミノ酸のタン
パク質をコードする大きさである。突然変異体５は、Ｍ
ＰＴＡに対する耐性を与えるｌｃｙのプロモーター領域
内の該遺伝子の開始コドンと考えられる位置から１０４
塩基対上流の一箇所（配列番号：１の位置１９２５）に
おいてその野生型と相違している。該突然変異は、オー
プンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）によりコード
されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。野生
型におけるＣのＭr −５におけるＴへの変換は、大腸菌
プロモーター領域の−１０についてのコンセンサス配列
又はプリブノーボックス（ＴＡＴＡＡＴ）により近似す
る６塩基配列（ＴＡＣＡＡＴ）をもたらす。大腸菌コン
センサスプロモーターの位置６におけるこのＴ残基は高
度に保存されている（９６％）が、３番目の位置におけ
る残基は最も少なく保存された塩基である（４４
％）50。Ｍr −５におけるＴへの突然変異は、ＤＮＡ鎖
分離を促進し、それによってｍＲＮＡ生成を高めると考
えられる。このメッセージの過剰生成、延いては酵素自
体の過剰生成により、突然変異体５のＭＰＴＡ耐性が大
きく高められたことについての最も相応しい説明であ
る。この突然変異体は、リコピンシクラーゼ活性を妨げ
ることによって作用する他のあらゆる除草剤に対して耐
性であると考えられる。
（図７） リコピンシクラーゼ活性を付与する領域におけるＤＮＡ
配列分析（図４）により、単一のオープンリーディング
フレーム、つまりｌｃｙが明らかとなった。このオープ
ンリーディングフレームは、予測分子量の４6,０９３ｇ
／モル（配列番号：２）を有する４１１アミノ酸のタン
パク質をコードする大きさである。突然変異体５は、Ｍ
ＰＴＡに対する耐性を与えるｌｃｙのプロモーター領域
内の該遺伝子の開始コドンと考えられる位置から１０４
塩基対上流の一箇所（配列番号：１の位置１９２５）に
おいてその野生型と相違している。該突然変異は、オー
プンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）によりコード
されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。野生
型におけるＣのＭr −５におけるＴへの変換は、大腸菌
プロモーター領域の−１０についてのコンセンサス配列
又はプリブノーボックス（ＴＡＴＡＡＴ）により近似す
る６塩基配列（ＴＡＣＡＡＴ）をもたらす。大腸菌コン
センサスプロモーターの位置６におけるこのＴ残基は高
度に保存されている（９６％）が、３番目の位置におけ
る残基は最も少なく保存された塩基である（４４
％）50。Ｍr −５におけるＴへの突然変異は、ＤＮＡ鎖
分離を促進し、それによってｍＲＮＡ生成を高めると考
えられる。このメッセージの過剰生成、延いては酵素自
体の過剰生成により、突然変異体５のＭＰＴＡ耐性が大
きく高められたことについての最も相応しい説明であ
る。この突然変異体は、リコピンシクラーゼ活性を妨げ
ることによって作用する他のあらゆる除草剤に対して耐
性であると考えられる。
【００３０】ジェンバンク及びスイスプロットＤＮＡ及
びタンパク質配列データバンクの調査では、ｌｃｙと明
らかな相同性を有する遺伝子又はタンパク質は見つから
なかった。ｌｃｙによりコードされるタンパク質の推定
アミノ酸配列と他の既知の又は報告されたタンパク質と
の唯一の類似点は、ＬＣＹのアミノ末端に存在する。ヌ
クレオチド結合モチーフ（配列番号：３）は、ＬＣＹに
おいてこの場所に存在し、この酵素が補助因子ＦＡＤに
結合してそれを利用することを示している（図８）。カ
ロチノイド生合成経路の研究のためのモデル生物として
青緑色細菌シネココッカスＰＣＣ７９４２を使用したこ
とにより、この遺伝子的に単純で便利な生物から、あら
ゆる酸素生成光合成生物（植物、藻類及び青緑色細菌）
に広く適用できる知見が得られた。即ち、一旦、シネコ
コッカス属においてカロチノイド生合成遺伝子を同定す
ると、あらゆる植物又は藻類から相同遺伝子を単離する
ことが可能である。このことは、本発明者らが植物及び
藻類から相同遺伝子をクローン化するためにフィトエン
脱飽和酵素のシネココッカス遺伝子を用いたことにより
証明された。植物又は藻類遺伝子が同定されていない場
合には、本発明者らの青緑色細菌遺伝子の最初の同定に
より、フィトエン脱飽和酵素の植物及び藻類遺伝子の同
定及びクローニングを可能にする必要かつ充分な手段が
提供された。本発明においても同じように、シネココッ
カスＰＣＣ７９４２からのリコピンシクラーゼ遺伝子の
同定により、相同な藻類及び植物遺伝子を同定及びクロ
ーン化する必要かつ充分な手段が提供された。それ以前
のｐｄｓ及びｐｓｙの遺伝子のように、シネココッカス
リコピンシクラーゼ遺伝子は、エレウィニア属からの２
種の既知細菌遺伝子にも主要データベース（ジェンバン
ク及びスイスプロット）の他の如何なる遺伝子にも殆ど
類似していない。
びタンパク質配列データバンクの調査では、ｌｃｙと明
らかな相同性を有する遺伝子又はタンパク質は見つから
なかった。ｌｃｙによりコードされるタンパク質の推定
アミノ酸配列と他の既知の又は報告されたタンパク質と
の唯一の類似点は、ＬＣＹのアミノ末端に存在する。ヌ
クレオチド結合モチーフ（配列番号：３）は、ＬＣＹに
おいてこの場所に存在し、この酵素が補助因子ＦＡＤに
結合してそれを利用することを示している（図８）。カ
ロチノイド生合成経路の研究のためのモデル生物として
青緑色細菌シネココッカスＰＣＣ７９４２を使用したこ
とにより、この遺伝子的に単純で便利な生物から、あら
ゆる酸素生成光合成生物（植物、藻類及び青緑色細菌）
に広く適用できる知見が得られた。即ち、一旦、シネコ
コッカス属においてカロチノイド生合成遺伝子を同定す
ると、あらゆる植物又は藻類から相同遺伝子を単離する
ことが可能である。このことは、本発明者らが植物及び
藻類から相同遺伝子をクローン化するためにフィトエン
脱飽和酵素のシネココッカス遺伝子を用いたことにより
証明された。植物又は藻類遺伝子が同定されていない場
合には、本発明者らの青緑色細菌遺伝子の最初の同定に
より、フィトエン脱飽和酵素の植物及び藻類遺伝子の同
定及びクローニングを可能にする必要かつ充分な手段が
提供された。本発明においても同じように、シネココッ
カスＰＣＣ７９４２からのリコピンシクラーゼ遺伝子の
同定により、相同な藻類及び植物遺伝子を同定及びクロ
ーン化する必要かつ充分な手段が提供された。それ以前
のｐｄｓ及びｐｓｙの遺伝子のように、シネココッカス
リコピンシクラーゼ遺伝子は、エレウィニア属からの２
種の既知細菌遺伝子にも主要データベース（ジェンバン
ク及びスイスプロット）の他の如何なる遺伝子にも殆ど
類似していない。
【００３１】今や、植物及び藻類の天然遺伝子の修飾が
可能になった。例えば、青緑色細菌遺伝子で得られた結
果により除草剤耐性突然変異の部位を捜し出すことがで
き、これを除草剤耐性になるように天然遺伝子を変化さ
せる場所を決定するのに用いることができる。新たに出
現するあらゆる除草剤については、酵素のアミノ酸配列
又は調節ＤＮＡ配列のどのような修飾が耐性を付与でき
るかを決定するために耐性突然変異体を選択する。同じ
ようにしてあらゆる植物の天然酵素又は調節配列を変化
させて類似の突然変異体を作ることができる。加えて、
該遺伝子の発現を組織特異的様式で加減及び操ることが
でき、天然遺伝子でのアンチセンス技術を用いることも
可能である。例を挙げながら本発明を説明してきたが、
用いた専門用語は本発明を限定するものではなく説明の
ためのものである。上記の技術に基づいて本発明を修飾
しまた変化させることが可能であるのは明らかである。
従って、特許請求の範囲に記載の各請求項の範囲内で、
具体的に記載してきた方法とは別の方法で本発明を実施
することができると理解されるべきである。
可能になった。例えば、青緑色細菌遺伝子で得られた結
果により除草剤耐性突然変異の部位を捜し出すことがで
き、これを除草剤耐性になるように天然遺伝子を変化さ
せる場所を決定するのに用いることができる。新たに出
現するあらゆる除草剤については、酵素のアミノ酸配列
又は調節ＤＮＡ配列のどのような修飾が耐性を付与でき
るかを決定するために耐性突然変異体を選択する。同じ
ようにしてあらゆる植物の天然酵素又は調節配列を変化
させて類似の突然変異体を作ることができる。加えて、
該遺伝子の発現を組織特異的様式で加減及び操ることが
でき、天然遺伝子でのアンチセンス技術を用いることも
可能である。例を挙げながら本発明を説明してきたが、
用いた専門用語は本発明を限定するものではなく説明の
ためのものである。上記の技術に基づいて本発明を修飾
しまた変化させることが可能であるのは明らかである。
従って、特許請求の範囲に記載の各請求項の範囲内で、
具体的に記載してきた方法とは別の方法で本発明を実施
することができると理解されるべきである。
【００３２】参考文献 １．コヤマ (Koyama, Y.), (1991) Photochem. Photobi
ol B 9: 265-280 ２．シーフェルマン−ハームス (Siefermann-Harms,
D.), (1987) Physiol. Plant., 69: 265-280 ３．デミッグ−アダムス (Demmig-Adams, B.) ら, (199
2) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:
599-626 ４．ゼーバールト (Zeevaart, J.) ら, (1988) Ann. Re
v. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39: 439-473 ５．ロック (Rock, C.D.) ら, (1991) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 88: 7496-7499 ６．マテウス−ロス (Mathews-Roth, M.) ら, (1991) O
ncology, 48: 177-179 ７．パロッツァ (Palozza, P.)ら, (1992) Methods Enz
ymol., 213: 403-420 ８．ブリットン (Britton, G.) (1988) Plant Pigments
(グッドウィン (T. Goodwin) 編, Academic Press, N
Y) pp. 133-180 ９．ドグボ (Dogbo, O) ら, (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85: 7054-7058 10. カモビッツ(Chamovitz, D.) ら, (1992) FEBS Let
t., 296: 305-310 11. バートレイ (Bartley, G. E.) ら, (1992) J. Bio
l. Chem., 267: 5036-5039 12. ブラムレイ(Bramley, P.) ら, (1992) Plant J.,
2: 343-349 13. リンデン (Linden, H.) ら, (1991) Z. Naturforsc
h., 46c: 1045-1051 14. ペッカー (Pecker, I.) ら, (1992) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 89: 4962-4966 15. ヒュグエニイ (Hugueney, P.) ら, (1992) Eur. J.
Biochem., 209: 399-407 16. ブラムレイ(Bramley, P. M.), (1985) Adv. Lipid
Res., 21: 243-279 17. アームストロング (Armstrong, G. A.) ら, (1989)
Mol. Gen. Genet., 216: 254:268 18. ミサワ (Misawa, N.) ら, (1990) J. Bacteriol.,
172: 6704-6712 19. フンドル(Hundle, B. S.) ら, (1993) FEBS Lett.,
315: 329-334 20. レイ (Ray, J. A.) ら, (1987) Nucleic Acids Re
s., 15: 10587-10588 21. カモビッツら, (1991) Plant Mol. Biol., 16: 967
-974 22. ペッカーら, (1993) Research in Photosynthesis,
Vol III (ムラタ(N. Murata) 編, Kluwer Academic Pu
blishers, Dordrectht) pp. 11-18 23. バートレイら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 88: 6532-6536 24. サンドマン (Sandmann, G.) ら, (1989) Z. Naturf
orsch., 44c: 787-790 25. カモビッツら, (1990) Z. Naturforsch., 45c: 482
-486 26. サンドマンら, (1989) Target sites of herbicide
action(ボガー (Boger)及びサンドマン編) CRC Press,
Florida, pp. 25-44 27. ヨコヤマ (Yokoyama, H.) ら, (1982) Carotenoid
Chem. and Biochem. (ブリットン及びグッドウィン編)
Pergamon Press, Oxford, pp. 371-385 28. クニングハム・ジュニア (Cunningham, F. X., J
r.), (1985) "Carotenoidof Euglena gracilis Klebs v
ar bacillaris Cori: photoisomerization, biosynthes
is localization and assoc. with cholorphyllis...",
(Ph. D. Thesis,Brandeis Univ.) Chap. 4, pp. 5-17 29. ビーバースドルフ(Beaversdorf, W. D) ら, (1980)
Crop Science, 20: 289 30. ブコルツ(Bucholtz, M. L.) ら, (1977) Chem. Bio
l. Interactions, 17: 359-362 31. ベイアー(Beyer, P.) ら, (1980) Planta, 150: 43
5-438 32. カマラ (Camara, B.) ら, (1982) Physiol. Veg. 2
0: 757-773 33. フォスケット(Fosket, D. E.) ら, (1983) Plant S
ci. Lett., 30: 165-175 34. シュ (Hsu, W. J.) ら, (1972) Phytochemistry, 1
1: 2985-2990 35. ベイアー, (1989) Physiology, Biochemistry and
Genetics of Nongreen Plastids ( ボイアー (Boyer),
シャノン (Shanon) 及びハーディソン (Hardison) 編)
American Society of Plant Physiology, pp. 157-170 36. リンデンら, (1993) FEMS Microbiol. Lett., 106:
99-104 37. バード(Bird, C. R.) ら, (1991) Biotechnology,
9: 635-639.37.22 38. ハリ (Hali, L.N.) ら, (1993) Plant J., 3: 121-
129 39. ヒルシュベルグ (Hirschberg, J.) ら, (1987) Z.
Naturforsch., 42c: 102-112 40. サムブルーク(Sambrook, J. F.) ら, (1989) Molec
ular Cloning: A Lab. Manual, 2nd, Cold Spring Lab.
Press, Cold Spring Harbor, pp. 316-317, 326-328 41. ウィリアムス (Williams, J.), (1988) Methods En
zymol., 167: 766-778 42. ファインベルグ(Feinberg, A. P.) ら, (1983) Ana
l. Biochem., 132: 6:13 43. デル・サル(Del Sal, G.) ら, (1988) Nucleic Aci
ds Res., 16: 9878 44. フンドルら, (1991) Photochem. Photobiol 54: 89
093 45. ミサワら, (1991) Appl. Environ. Microbiol., 5
7: 1847-1849 46. サンドマンら, (1990) FEMS Microbiol. Lett., 7
1: 77-82 47. シュヌール (Schnurr G.) ら, (1991) FEMS Microb
iol. Lett., 78: 157-162 48. ウィリアムス, (1988) Methods Enzymol., 167: 76
6-778 49. ゴールデン (Golden, S. S.), (1988) Methods Enz
ymol., 167: 714-7277 50. ハウレイ (Hawley) ら, (1983) Nucleic Acids Re
s., 11: 2244
ol B 9: 265-280 ２．シーフェルマン−ハームス (Siefermann-Harms,
D.), (1987) Physiol. Plant., 69: 265-280 ３．デミッグ−アダムス (Demmig-Adams, B.) ら, (199
2) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:
599-626 ４．ゼーバールト (Zeevaart, J.) ら, (1988) Ann. Re
v. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39: 439-473 ５．ロック (Rock, C.D.) ら, (1991) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 88: 7496-7499 ６．マテウス−ロス (Mathews-Roth, M.) ら, (1991) O
ncology, 48: 177-179 ７．パロッツァ (Palozza, P.)ら, (1992) Methods Enz
ymol., 213: 403-420 ８．ブリットン (Britton, G.) (1988) Plant Pigments
(グッドウィン (T. Goodwin) 編, Academic Press, N
Y) pp. 133-180 ９．ドグボ (Dogbo, O) ら, (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85: 7054-7058 10. カモビッツ(Chamovitz, D.) ら, (1992) FEBS Let
t., 296: 305-310 11. バートレイ (Bartley, G. E.) ら, (1992) J. Bio
l. Chem., 267: 5036-5039 12. ブラムレイ(Bramley, P.) ら, (1992) Plant J.,
2: 343-349 13. リンデン (Linden, H.) ら, (1991) Z. Naturforsc
h., 46c: 1045-1051 14. ペッカー (Pecker, I.) ら, (1992) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 89: 4962-4966 15. ヒュグエニイ (Hugueney, P.) ら, (1992) Eur. J.
Biochem., 209: 399-407 16. ブラムレイ(Bramley, P. M.), (1985) Adv. Lipid
Res., 21: 243-279 17. アームストロング (Armstrong, G. A.) ら, (1989)
Mol. Gen. Genet., 216: 254:268 18. ミサワ (Misawa, N.) ら, (1990) J. Bacteriol.,
172: 6704-6712 19. フンドル(Hundle, B. S.) ら, (1993) FEBS Lett.,
315: 329-334 20. レイ (Ray, J. A.) ら, (1987) Nucleic Acids Re
s., 15: 10587-10588 21. カモビッツら, (1991) Plant Mol. Biol., 16: 967
-974 22. ペッカーら, (1993) Research in Photosynthesis,
Vol III (ムラタ(N. Murata) 編, Kluwer Academic Pu
blishers, Dordrectht) pp. 11-18 23. バートレイら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 88: 6532-6536 24. サンドマン (Sandmann, G.) ら, (1989) Z. Naturf
orsch., 44c: 787-790 25. カモビッツら, (1990) Z. Naturforsch., 45c: 482
-486 26. サンドマンら, (1989) Target sites of herbicide
action(ボガー (Boger)及びサンドマン編) CRC Press,
Florida, pp. 25-44 27. ヨコヤマ (Yokoyama, H.) ら, (1982) Carotenoid
Chem. and Biochem. (ブリットン及びグッドウィン編)
Pergamon Press, Oxford, pp. 371-385 28. クニングハム・ジュニア (Cunningham, F. X., J
r.), (1985) "Carotenoidof Euglena gracilis Klebs v
ar bacillaris Cori: photoisomerization, biosynthes
is localization and assoc. with cholorphyllis...",
(Ph. D. Thesis,Brandeis Univ.) Chap. 4, pp. 5-17 29. ビーバースドルフ(Beaversdorf, W. D) ら, (1980)
Crop Science, 20: 289 30. ブコルツ(Bucholtz, M. L.) ら, (1977) Chem. Bio
l. Interactions, 17: 359-362 31. ベイアー(Beyer, P.) ら, (1980) Planta, 150: 43
5-438 32. カマラ (Camara, B.) ら, (1982) Physiol. Veg. 2
0: 757-773 33. フォスケット(Fosket, D. E.) ら, (1983) Plant S
ci. Lett., 30: 165-175 34. シュ (Hsu, W. J.) ら, (1972) Phytochemistry, 1
1: 2985-2990 35. ベイアー, (1989) Physiology, Biochemistry and
Genetics of Nongreen Plastids ( ボイアー (Boyer),
シャノン (Shanon) 及びハーディソン (Hardison) 編)
American Society of Plant Physiology, pp. 157-170 36. リンデンら, (1993) FEMS Microbiol. Lett., 106:
99-104 37. バード(Bird, C. R.) ら, (1991) Biotechnology,
9: 635-639.37.22 38. ハリ (Hali, L.N.) ら, (1993) Plant J., 3: 121-
129 39. ヒルシュベルグ (Hirschberg, J.) ら, (1987) Z.
Naturforsch., 42c: 102-112 40. サムブルーク(Sambrook, J. F.) ら, (1989) Molec
ular Cloning: A Lab. Manual, 2nd, Cold Spring Lab.
Press, Cold Spring Harbor, pp. 316-317, 326-328 41. ウィリアムス (Williams, J.), (1988) Methods En
zymol., 167: 766-778 42. ファインベルグ(Feinberg, A. P.) ら, (1983) Ana
l. Biochem., 132: 6:13 43. デル・サル(Del Sal, G.) ら, (1988) Nucleic Aci
ds Res., 16: 9878 44. フンドルら, (1991) Photochem. Photobiol 54: 89
093 45. ミサワら, (1991) Appl. Environ. Microbiol., 5
7: 1847-1849 46. サンドマンら, (1990) FEMS Microbiol. Lett., 7
1: 77-82 47. シュヌール (Schnurr G.) ら, (1991) FEMS Microb
iol. Lett., 78: 157-162 48. ウィリアムス, (1988) Methods Enzymol., 167: 76
6-778 49. ゴールデン (Golden, S. S.), (1988) Methods Enz
ymol., 167: 714-7277 50. ハウレイ (Hawley) ら, (1983) Nucleic Acids Re
s., 11: 2244
【００３３】配列番号：１ 配列の長さ：４９２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：２０２９．．３２６１ 配列
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：４１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００４２】
【表７】
【００４３】
【図１】青緑色細菌及び植物におけるカロチノイド生合
成経路の概略図である。ＩＰＰ＝ピロリン酸イソペンテ
ニル；ＧＰＰ＝ピロリン酸ゲラニル；ＦＰＰ＝ピロリン
酸ファルネシル；ＧＧＰＰ＝ピロリン酸ゲラニルゲラニ
ル；ＰＰＰＰ＝ピロリン酸プレフィトエン。
成経路の概略図である。ＩＰＰ＝ピロリン酸イソペンテ
ニル；ＧＰＰ＝ピロリン酸ゲラニル；ＦＰＰ＝ピロリン
酸ファルネシル；ＧＧＰＰ＝ピロリン酸ゲラニルゲラニ
ル；ＰＰＰＰ＝ピロリン酸プレフィトエン。
【図２】青緑色細菌シネココッカスｓｐ．ＰＣＣ７９４
２の突然変異体（番号を付した）及び２つの野生型株
（Ｃ及びＳ）におけるＭＰＴＡ耐性を示すペトリ皿の写
真。Ｃにより示される野生型株は該突然変異体の親株で
ある。各ペトリ皿の右上部にマイクロモルで表したＭＰ
ＴＡの濃度が示してある。生存への位置的影響を小さく
するために、各株を各ペトリ皿の数カ所にスポッティン
グした。
２の突然変異体（番号を付した）及び２つの野生型株
（Ｃ及びＳ）におけるＭＰＴＡ耐性を示すペトリ皿の写
真。Ｃにより示される野生型株は該突然変異体の親株で
ある。各ペトリ皿の右上部にマイクロモルで表したＭＰ
ＴＡの濃度が示してある。生存への位置的影響を小さく
するために、各株を各ペトリ皿の数カ所にスポッティン
グした。
【図３】ＭＰＴＡr −５（突然変異体５）の突然変異部
位を示す遺伝子地図を表す概略図である。4.６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩゲノム断片（以下の制限酵素地図
に示した）の種々の小断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＫＳ+ 内にクローン化し、シネココッカスｓｐ．
ＰＣＣ７９４２の野生型株の細胞に形質移入し、そして
ＭＰＴＡ含有培地上に該形質転換体をプレートすること
により除草剤耐性を与えるそれらの能力（＋で示した）
を確認した。Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｃ＝ＣｌａＩ；Ｅ＝Ｅｃ
ｏＲＩ；Ｋ＝ＫｐｎＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄIII ；Ｐ＝Ｐｓｔ
Ｉ；Ｓ＝ＳａｌＩ；Ｘ＝ＸｂａＩ。
位を示す遺伝子地図を表す概略図である。4.６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩゲノム断片（以下の制限酵素地図
に示した）の種々の小断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＫＳ+ 内にクローン化し、シネココッカスｓｐ．
ＰＣＣ７９４２の野生型株の細胞に形質移入し、そして
ＭＰＴＡ含有培地上に該形質転換体をプレートすること
により除草剤耐性を与えるそれらの能力（＋で示した）
を確認した。Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｃ＝ＣｌａＩ；Ｅ＝Ｅｃ
ｏＲＩ；Ｋ＝ＫｐｎＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄIII ；Ｐ＝Ｐｓｔ
Ｉ；Ｓ＝ＳａｌＩ；Ｘ＝ＸｂａＩ。
【図４】リコピンシクラーゼ活性がＭＰＴＡ耐性損傷を
含む領域にあることを示す遺伝子地図を表す概略図であ
る。各略号は図３と同じである。
含む領域にあることを示す遺伝子地図を表す概略図であ
る。各略号は図３と同じである。
【図５】プラスミドｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ及びｐＬＣＹ
Ｂ−Ｍ５ＰＰＦ構造の概略図である。突然変異体５内の
ｌｃｙ遺伝子の推定上の位置は発現実験に基づいて特定
したものである。
Ｂ−Ｍ５ＰＰＦ構造の概略図である。突然変異体５内の
ｌｃｙ遺伝子の推定上の位置は発現実験に基づいて特定
したものである。
【図６】大腸菌のリコピン蓄積株（パネルＡ）、大腸菌
のリコピン蓄積株とｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（パネル
Ｂ）、ＭＰＴＡ存在下での大腸菌のリコピン蓄積株とｐ
ＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（パネルＣ）の細胞から抽出したカ
ロチノイド色素のＨＰＬＣ分析を表すグラフ。１００ｍ
Ｍ ＭＰＴＡでの大腸菌細胞の処理の効果を示してい
る。下方のパネルにピーク１、３及び５の吸収スペクト
ルを示している。（─）ピーク１がリコピン；（・・・・）
ピーク３がγ−カロチン；（──）ピークがβ−カロチ
ンである。
のリコピン蓄積株とｐＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（パネル
Ｂ）、ＭＰＴＡ存在下での大腸菌のリコピン蓄積株とｐ
ＬＣＹＢ−Ｍ５ＸＥ（パネルＣ）の細胞から抽出したカ
ロチノイド色素のＨＰＬＣ分析を表すグラフ。１００ｍ
Ｍ ＭＰＴＡでの大腸菌細胞の処理の効果を示してい
る。下方のパネルにピーク１、３及び５の吸収スペクト
ルを示している。（─）ピーク１がリコピン；（・・・・）
ピーク３がγ−カロチン；（──）ピークがβ−カロチ
ンである。
【図７】リコピンシクラーゼ遺伝子内のＭＰＴＡ耐性の
ための突然変異の同定を示す概略図。
ための突然変異の同定を示す概略図。
【図８】ＦＡＤがリコピンシクラーゼにより利用されて
いることを示す、ＬＣＹのアミノ末端におけるジヌクレ
オチド結合モチーフを示す概略図である。ａは酸性アミ
ノ酸、つまりＤ又はＥであり、ｐは極性又は荷電したア
ミノ酸、つまりＤ，Ｅ，Ｋ，Ｒ，Ｈ，Ｓ，Ｔ，Ｑ，Ｎで
あり、ｓは小さいか又は疎水性アミノ酸、つまりＡ，
Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｍ，Ｃであり、そして星印はいずれかのア
ミノ酸である。
いることを示す、ＬＣＹのアミノ末端におけるジヌクレ
オチド結合モチーフを示す概略図である。ａは酸性アミ
ノ酸、つまりＤ又はＥであり、ｐは極性又は荷電したア
ミノ酸、つまりＤ，Ｅ，Ｋ，Ｒ，Ｈ，Ｓ，Ｔ，Ｑ，Ｎで
あり、ｓは小さいか又は疎水性アミノ酸、つまりＡ，
Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｍ，Ｃであり、そして星印はいずれかのア
ミノ酸である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ｃ１２Ｎ 9/04 9359−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ジョセフ ヒルシュベルグ イスラエル エルサレム 93714 ブルラ ストリート 26 (72)発明者 フランシス ザヴィエル カニンガム ジ ュニア アメリカ合衆国 メリーランド州 20815 チェヴィ チェス ワシントン アベニ ュー 2727 (72)発明者 エリザベス バント アメリカ合衆国 メリーランド州 20814 ベセスダ ベルヴィュー 9603
Claims (67)
- 【請求項１】 ｌｃｙと称するリコピンシクラーゼの遺
伝子をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１，ｂｐ２０
２９〜３２６１）から本質的になる、精製、単離及びク
ローン化されたＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 除草剤に対して耐性であるリコピンシク
ラーゼの遺伝子をコードする修飾されたＤＮＡ配列から
なる、精製、単離及びクローン化されたＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 前記耐性が、ＣＰＴＡ及びＭＰＴＡを含
むトリアルキルアミンファミリーの漂白除草剤に対する
耐性を含むことを特徴とする、請求項２記載の修飾され
たＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 リコピンシクラーゼのためのＤＮＡ配列
を保持する形質転換された大腸菌。 - 【請求項５】 除草剤に対して耐性であるリコピンシク
ラーゼのためのＤＮＡ配列を保持する形質転換された大
腸菌。 - 【請求項６】 前記耐性が、ＣＰＴＡ及びＭＰＴＡを含
むトリアルキルアミンファミリーの漂白除草剤に対する
耐性を含むことを特徴とする、請求項５記載の形質転換
された大腸菌。 - 【請求項７】 請求項１記載のＤＮＡを含むベクター。
- 【請求項８】 請求項７記載のベクターで形質転換され
た宿主細胞であって、適当な真核細胞及び原核細胞の群
から選ばれる宿主細胞。 - 【請求項９】 大腸菌である、請求項８記載の宿主細
胞。 - 【請求項１０】 青緑色細菌である、請求項８記載の宿
主細胞。 - 【請求項１１】 シネココッカスＰＣＣ７９４２及びシ
ネコキスチス(Synechocystis) ＰＣＣ６８０３を含む群
から選ばれる、請求項１０記載の宿主細胞。 - 【請求項１２】 藻類である、請求項８記載の宿主細
胞。 - 【請求項１３】 植物細胞である、請求項８記載の宿主
細胞。 - 【請求項１４】 請求項２記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項１５】 請求項１４記載のベクターで形質転換
された宿主細胞であって、適当な真核細胞及び原核細胞
の群から選ばれる宿主細胞。 - 【請求項１６】 大腸菌である、請求項１５記載の宿主
細胞。 - 【請求項１７】 青緑色細菌である、請求項１５記載の
宿主細胞。 - 【請求項１８】 シネココッカスＰＣＣ７９４２及びシ
ネコキスチスＰＣＣ６８０３を含む群から選ばれる、請
求項１７記載の宿主細胞。 - 【請求項１９】 藻類である、請求項１５記載の宿主細
胞。 - 【請求項２０】 植物細胞である、請求項１５記載の宿
主細胞。 - 【請求項２１】 請求項３記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項２２】 請求項２１記載のベクターで形質転換
された宿主細胞であって、適当な真核細胞及び原核細胞
の群から選ばれる宿主細胞。 - 【請求項２３】 大腸菌である、請求項２２記載の宿主
細胞。 - 【請求項２４】 青緑色細菌である、請求項２２記載の
宿主細胞。 - 【請求項２５】 シネココッカスＰＣＣ７９４２及びシ
ネコキスチスＰＣＣ６８０３を含む群から選ばれる、請
求項２４記載の宿主細胞。 - 【請求項２６】 藻類である、請求項２２記載の宿主細
胞。 - 【請求項２７】 植物細胞である、請求項２２記載の宿
主細胞。 - 【請求項２８】 ピロリン酸ゲラニルゲラニルからβ−
カロチンへの生合成経路を制御する酵素をコードする遺
伝子を適当な宿主細胞内に組み込むことにより該経路を
発現する方法。 - 【請求項２９】 ｐｓｙと称するフィトエンシンターゼ
の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を組み込む工程；ｐｄ
ｓと称するフィトエン脱飽和酵素の遺伝子をコードする
ＤＮＡ配列を組み込む工程；ｚｄｓと称するζ−カロチ
ン脱飽和酵素の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を組み込
む工程；及びｌｃｙと称するリコピンシクラーゼの遺伝
子をコードするＤＮＡ配列を組み込む工程を含むことを
特徴とする、請求項２８記載の方法。 - 【請求項３０】 ｐｓｙと称するフィトエンシンターゼ
の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を組み込む工程；ｃｒ
ｔＩと称するエレウィニア属におけるフィトエン脱飽和
酵素の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を組み込む工程；
及びｌｃｙと称するリコピンシクラーゼの遺伝子をコー
ドするＤＮＡ配列を組み込む工程を含むことを特徴とす
る、請求項２８記載の方法。 - 【請求項３１】 適当な宿主細胞が大腸菌である、請求
項２８記載の方法。 - 【請求項３２】 ＬＣＹポリペプチドをコードするｌｃ
ｙのヌクレオチド配列及びそのフランキングＤＮＡ配列
を包含する、配列番号：１に記載の精製、単離及びクロ
ーン化されたＤＮＡ配列。 - 【請求項３３】 得られる配列が除草剤耐性を付与でき
るように点突然変異、欠失又は挿入がなされていること
を特徴とする、請求項３２記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３４】 得られる配列が除草剤耐性を付与でき
るようにｌｃｙのヌクレオチド配列内で点突然変異、欠
失又は挿入がなされていることを特徴とする、請求項３
３記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３５】 ｌｃｙの調節が除草剤耐性を付与でき
るようにｌｃｙのフランキング配列内で点突然変異、欠
失又は挿入がなされていることを特徴とする、請求項３
３記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３６】 該配列内で、配列番号：１の塩基番号
１９２５においてＣがＴに変換していることを特徴とす
る、請求項３５記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３７】 ＬＣＹポリペプチドをコードする相同
な配列であることを特徴とする、請求項３２記載のＤＮ
Ａ配列。 - 【請求項３８】 得られる配列が除草剤耐性を付与でき
るように点突然変異、欠失又は挿入がなされていること
を特徴とする、請求項３７記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３９】 該点突然変異、欠失又は挿入を包含す
る配列の有効断片であることを特徴とする、請求項３３
記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項４０】 請求項３２記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項４１】 請求項４０記載のベクターで形質転換
された宿主細胞であって、適当な真核細胞及び原核細胞
の群から選ばれる宿主細胞。 - 【請求項４２】 大腸菌である、請求項４１記載の宿主
細胞。 - 【請求項４３】 青緑色細菌である、請求項４１記載の
宿主細胞。 - 【請求項４４】 シネココッカスＰＣＣ７９４２及びシ
ネコキスチスＰＣＣ６８０３を含む群から選ばれる、請
求項４１記載の宿主細胞。 - 【請求項４５】 藻類である、請求項４１記載の宿主細
胞。 - 【請求項４６】 植物細胞である、請求項４１記載の宿
主細胞。 - 【請求項４７】 請求項３３記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項４８】 請求項４７記載のベクターで形質転換
された宿主細胞であって、適当な真核細胞及び原核細胞
の群から選ばれる宿主細胞。 - 【請求項４９】 大腸菌である、請求項４８記載の宿主
細胞。 - 【請求項５０】 青緑色細菌である、請求項４８記載の
宿主細胞。 - 【請求項５１】 シネココッカスＰＣＣ７９４２及びシ
ネコキスチスＰＣＣ６８０３を含む群から選ばれる、請
求項４８記載の宿主細胞。 - 【請求項５２】 藻類である、請求項４８記載の宿主細
胞。 - 【請求項５３】 植物細胞である、請求項４８記載の宿
主細胞。 - 【請求項５４】 ｌｃｙ遺伝子のアンチセンス発現がゲ
ノムＤＮＡ内に導入され、それによってリコピンシクラ
ーゼの合成が阻害されて赤色色素リコピンが蓄積するト
ランスジェニック生物。 - 【請求項５５】 ｌｃｙ遺伝子がゲノムＤＮＡ内に導入
され、それによってリコピンシクラーゼが過剰産生さ
れ、β−カロチンが過剰であるトランスジェニック生
物。 - 【請求項５６】 請求項２記載のＤＮＡ配列がゲノムＤ
ＮＡ内に導入され、それによって除草剤耐性生物になっ
たトランスジェニック生物。 - 【請求項５７】 請求項３３記載のＤＮＡ配列がゲノム
ＤＮＡ内に導入され、それによって除草剤耐性生物にな
ったトランスジェニック生物。 - 【請求項５８】 請求項３記載のＤＮＡ配列がゲノムＤ
ＮＡ内に導入され、それによってＣＰＴＡ及びＭＰＴＡ
を含むトリアルキルアミンファミリーの漂白除草剤に対
して耐性のある生物になったトランスジェニック生物。 - 【請求項５９】 請求項３５記載のＤＮＡ配列がゲノム
ＤＮＡ内に導入され、それによって除草剤耐性生物にな
ったトランスジェニック生物。 - 【請求項６０】 請求項３６記載のＤＮＡ配列がゲノム
ＤＮＡ内に導入され、それによって除草剤耐性生物にな
ったトランスジェニック生物。 - 【請求項６１】 ＬＣＹポリペプチドをコードするｌｃ
ｙのヌクレオチド配列及びそのフランキングＤＮＡ配列
を包含する配列番号：１に記載のＤＮＡ配列の適当なベ
クターを調製し；そして前記ベクターを細菌、藻類及び
植物の細胞内に挿入し、それによってトランスジェニッ
ク生物を形成することにより、細菌、藻類、及び植物内
のカロチノイド生合成、含量又は組成を変化させる方
法。 - 【請求項６２】 得られる配列が除草剤耐性を付与でき
るように該ＤＮＡ配列内で点突然変異、欠失又は挿入が
なされていることを特徴とする、請求項６１記載の方
法。 - 【請求項６３】 該ＤＮＡ配列が、除草剤に対して耐性
であるリコピンシクラーゼの遺伝子をコードする、該ベ
クターのために修飾したＤＮＡ配列からなる、請求項６
１記載の方法。 - 【請求項６４】 該ベクターがｌｃｙ遺伝子のアンチセ
ンス発現からなる、請求項６１記載の方法。 - 【請求項６５】 該ベクターがｌｃｙ遺伝子及びそのプ
ロモーター又は変性したプロモーターからなる、請求項
６１記載の方法。 - 【請求項６６】 ｐＬＹＣＢ−Ｍ５ＸＥと称するプラス
ミド。 - 【請求項６７】 除草剤に対して耐性のクローンについ
て青緑色細菌をスクリーニングし；除草剤耐性リコピン
シクラーゼ酵素の産生を制御する変性ＤＮＡ配列を精製
及び単離し；該除草剤耐性酵素の産生に必要な該ＤＮＡ
配列の修飾を決定し；そして天然の植物又は藻類のＤＮ
Ａ配列において類似の修飾をもたらすように植物又は藻
類を変性させることにより、リコピンシクラーゼ酵素と
相互作用する除草剤の作用に対して耐性である植物又は
藻類を構築する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14219593A | 1993-10-25 | 1993-10-25 | |
| US08/142195 | 1993-10-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07155189A true JPH07155189A (ja) | 1995-06-20 |
Family
ID=22498939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6028793A Pending JPH07155189A (ja) | 1993-10-25 | 1994-02-01 | リコピンシクラーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07155189A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996036717A3 (en) * | 1995-05-17 | 1996-12-27 | Centre Nat Rech Scient | Dna sequences encoding a lycopene cyclase, antisense sequences derived therefrom and their use for the modification of carotenoids levels in plants |
| EP0820221A4 (en) * | 1995-03-07 | 2000-09-27 | Yissum Res Dev Co | GENE OF LYCOPENE CYCLASE |
| CN117757834A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-26 | 浙江大学 | 低温敏感型水稻斑马叶基因OsLSZ1在调控水稻叶色中的应用 |
-
1994
- 1994-02-01 JP JP6028793A patent/JPH07155189A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0820221A4 (en) * | 1995-03-07 | 2000-09-27 | Yissum Res Dev Co | GENE OF LYCOPENE CYCLASE |
| WO1996036717A3 (en) * | 1995-05-17 | 1996-12-27 | Centre Nat Rech Scient | Dna sequences encoding a lycopene cyclase, antisense sequences derived therefrom and their use for the modification of carotenoids levels in plants |
| CN117757834A (zh) * | 2023-12-21 | 2024-03-26 | 浙江大学 | 低温敏感型水稻斑马叶基因OsLSZ1在调控水稻叶色中的应用 |
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