JPH07157487A - ビオチン化標識化合物及びそれを利用した蛍光標識化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 化学発色検出よりも優れた検出感度を有し、
ストレプトアビジン又はアビジンと、ビオチン化蛍光化
合物を別々に使用・保存可能であるため、安定性に優れ
ており、使用操作も簡便であり、再現性の高い結果が得
られ、合成法も簡便であるため安価に大量調製が可能に
なるビオチン化標識化合物、及びそれを利用した蛍光標
識化方法を提供する。 【構成】 下記式（Ｉ） （式中、Ｒ₁乃至Ｒ₃は水素、低級アルキル基又はハロゲ
ンを表す）で表わされるビオチン化標識化合物であり、
又この蛍光標識化方法は、（１）ビオチンによりＤＮＡ
又はＲＮＡを標識する工程；（２）ビオチンにより標識
したＤＮＡ又はＲＮＡと、ストレプトアビジン又はアビ
ジンとを反応させる工程；（３）（２）で得た複合体
と、上記式（Ｉ）ビオチン化標識化合物とを反応させる
工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ塩基配列を解析す
るための蛍光ラベルＤＮＡプローブ法や蛍光ラベルＲＮ
Ａプローブ法に用いて有用な新規なビオチン化標識化合
物、及び、このビオチン化標識化合物を利用した蛍光標
識化方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝情報を担う核酸は、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ
（又はＵ）の塩基を持ち、これら塩基の配列にり個々の
遺伝子情報が特定され、ＧとＣ、ＡとＴ（又はＵ）の水
素結合により核酸は二本鎖を形成する。従って、この性
質を利用すると、核酸の一方の鎖に、化学的又は物理的
に検出可能な標識物質を結合した標識プローブは、標識
プローブが結合しうる特定の塩基配列を有する核酸との
み二本鎖を形成するため、解析対象の塩基配列のみに結
合するようにした前記標識プローブによって、目的の核
酸を検出することができる。

【０００３】このような方法の内、ラジオアイソトープ
（ＲＩ）を標識物質として使用する方法は、高感度の検
出が可能であるものの、使用操作の安全性、経済性、廃
棄物処理などに問題があった。

【０００４】このため、ＲＩに代るべき標識物質又は標
識方法の探索が従来から進められており、その代表的な
ものに、ビオチンと、ストレプトアビジン又はアビジン
の結合特異性を利用する方法がある。即ち、酵素又は蛍
光物質で標識したストレプトアビジン又はアビジン使用
して、特定の塩基配列を有する核酸に結合したビオチン
と結合させるものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記酵
素標識の場合は、基質の酵素分解物が色素沈着するとい
う化学発色検出であり、検出感度が蛍光検出に比べて劣
るため、解析対象の核酸を大量に確保しなければならな
かった。

【０００６】一方、蛍光物質の場合、蛍光色素の励起光
を照射して発する蛍光により、複合体が間接的に結合し
た核酸を検出するものであるが、ストレプトアビジン又
はアビジンと蛍光色素との化合物が安定性に欠けるた
め、溶液状態での長期保存ができず、核酸の解析におい
て再現性の良い結果を得るのは困難であり、しかも、こ
の化合物を安価に大量に調製することは困難であった。

【０００７】本発明の発明者らは、核酸の検出法につい
て永年に亘り鋭意研究を行なった結果、本願の新規なビ
オチン化標識化合物を用いることにより、安定性良く、
安価かつ簡便に実施できることを見出し、本発明を完成
した。

【０００８】即ち、本発明の発明者らは、ビオチンと、
ストレプトアビジン又はアビジンの結合特異性を利用し
た標識及び標識方法について鋭意研究を行ない、ビオチ
ン標識したプローブのビオチン部分に結合したストレプ
トアビジン又はアビジンに、更にビオチンが結合するこ
とができることから、蛍光化合物を結合したビオチンを
用いればプローブに蛍光標識をすることができ、これに
より、 （１）化学発色検出よりも優れた検出感度を有し、 （２）ストレプトアビジン又はアビジンと、ビオチン化
蛍光化合物を別々に使用・保存可能であるため、安定性
に優れており、使用操作も簡便であり、再現性の高い結
果が得られる。 （３）合成法も簡便であるため安価に大量調製が可能に
なることを見出し、本発明を完成させたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の新規なビオチン
化標識化合物は、式

【化６】 （式中、Ｒ₁乃至Ｒ₃は水素、低級アルキル基又はハロゲ
ンを表す）で表わされることを特徴とするものであり、
又、このビオチン化標識化合物による蛍光標識化方法
は、（１）ビオチンによりＤＮＡ又はＲＮＡを標識する
工程；（２）ビオチンにより標識したＤＮＡ又はＲＮＡ
と、ストレプトアビジン又はアビジンとを反応させる工
程；（３）（２）で得た複合体と、式

【化７】 （式中、Ｒ₁乃至Ｒ₃は水素、低級アルキル基又はハロゲ
ンを表す）で表わされるビオチン化標識化合物とを反応
させる工程を含むことを特徴とするものである。

【００１０】次に本発明を詳細に説明する。

【００１１】本発明のビオチン化標識化合物は、上記式
（Ｉ）に明らかなように、フルオレセインアミン誘導体
とビオチンとが結合したものであり、フルオレセインア
ミン誘導体におけるアミノ基の位置により、例えば式
（Ｉ−１）

【化８】 で表わされるものや、式（Ｉ−２）

【化９】 で表わされるものが包含される。

【００１２】更に、本発明のビオチン化標識化合物にお
いては、フルオレセインに異性体が存在するのと同様、
上記式（Ｉ）で表されるもののほかに、例えば式（Ｉ
Ｉ）

【化１０】 で表わされるものも存在する。

【００１３】上記各式における置換基Ｒ₁乃至Ｒ₃は、水
素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルのような
炭素数１乃至６の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又は、ハ
ロゲン原子、即ち弗素原子、塩素原子、臭素原子又は沃
素原子を表している。

【００１４】尚、本発明のビオチン化標識化合物は、分
子内に不斉炭素を有し、各々がＲ配位、Ｓ配位である立
体異性体が存在するが、その各々、或いはそれらの混合
物のいずれも本発明に包含される。

【００１５】一方、本発明のビオチン化標識化合物は、
次のような方法によって製造することができる。即ち、
フルオレセインアミン誘導体とビオチンとを、ペプチド
結合を生成する公知の方法によって反応させるのであ
る。

【００１６】ペプチド結合を生成する反応としては、エ
ステル−アミド交換反応、ビオチンのカルボン酸部分を
活性化された酸残基（例えば、酸ハライド、酸無水物
等）に変換し、フルオレセインアミン誘導体と反応させ
る方法や縮合剤を使用する方法を適宜に採用することが
できる。

【００１７】縮合剤を使用する方法では、化合物を非プ
ロトン性極性溶媒に溶解し、縮合剤を使用し、有機塩基
の存在又は非存在下に反応させればよい。

【００１８】上記縮合剤を使用する反応の際に使用され
る非プロトン性極性溶媒としては、反応を阻害せず、出
発物質をある程度溶解するものであれば特に限定はない
が、好適には、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ア
セトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル
類；ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロ
リドン、Ｎ−メチルピロリジノン、ヘキサメチルホスホ
ロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシ
ド、スルホランのようなスルホキシド類を挙げることが
でき、更に好適には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで
ある。

【００１９】又、使用される縮合剤としては、ペプチド
結合を生成する方法に通常使用されているものであれば
よいが、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C)のようなカルボジイミド類や２−（１Ｈ−ベンゾトリ
アゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を
挙げることができ、好適には、ＨＢＴＵである。

【００２０】使用される有機塩基としては、通常の反応
において塩基として使用されるものであれば、特に限定
はないが、好適には、トリエチルアミン、トリプロピル
アミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミ
ン、ジシクロヘキシルアミンのような有機塩基類を挙げ
ることができ、更に好適には、トリエチルアミンのよう
な第３級アミンである。

【００２１】反応温度及び時間は、主に反応温度、原料
化合物、反応試薬又は使用される溶媒の種類によって異
なるが、通常は、室温において数日間程度である。

【００２２】反応終了後、本発明のビオチン化標識化合
物は、常法に従って、反応混合物から単離される。

【００２３】

【発明の効果】本発明のビオチン化標識化合物は、簡便
に合成できるので安価であり、又、経時的に安定な化合
物であるので蛍光検出の再現性は良好で、保存性に優れ
ている。

【００２４】

【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を更に具体的
に説明する。

【００２５】実施例１ ビオチン０．２４ｇ及び５−アミノフルオレセイン０．
３５ｇを、乾燥したジメチルホルムアミド１６ｍｌに溶
解した。２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）
−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロホスフェート０．５７ｇの乾燥ジメチルホルムアミ
ド（８ｍｌ）溶液を加え、更に、トリエチルアミン０．
１４ｍｌを加えて、室温で３日間反応させた。反応液に
飽和食塩水を加えて析出した結晶を濾別し濾液を酢酸エ
チルで抽出し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（流出溶媒：塩
化メチレン／メタノール＝５／１、次に、クロロホルム
／メタノール＝２／１）で精製し、以下の式（１）で表
わされる目的化合物（以下、化合物（１）のようにも表
わす）０．２３ｇを得た（収率４０％）。

【化１１】 融点：２３８℃（分解）¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ6、ｐｐｍ，
δ）：ｌ．３５〜ｌ．７５（６Ｈ，ｍ）、２．３９（２
Ｈ，ｔ）、２．５９（１Ｈ，ｄ）、２．８４（１Ｈ、ｄ
ｄ）、３．ｌ６（１Ｈ，ｍ）、４．１６（１Ｈ，ｍ）、
４．３１（１Ｈ，ｍ）、６．３７（１Ｈ，ｓ）、６．４
６（１Ｈ，ｓ）、６．５０〜６．６４（６Ｈ，ｍ）、
７．１８（１Ｈ，ｄ）、７．８１（１Ｈ，ｄ）、８．３
４（１Ｈ，ｓ）、１０．１５（１Ｈ，ｂｓ）、１０．３
５（１Ｈ，ｓ）赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃ
ｍ^-1）：３３００、１６８５、１６３６、１６０５、１
５９ｌ、１４５９、１２９４、１２７２

【００２６】［核酸の検出］マウス顎下腺ＮＧＦ（神経
成長因子）のｃＤＮＡ（０．３５Ｋｂ）をテンプレート
として、ランダムプライマー法でビオチン標識ＤＮＡプ
ローブを合成した。このプローブを用い、マウス顎下腺
組織切片に対して、ハイブリダイゼーション（insitu）
を行なった。ハイブリダイズした後、スキムミルクでブ
ロッキングし、ストレプトアビジン１μｇを添加し、
０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ食塩水、
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で洗浄した。遮光
下、上記合成したビオチン化フルオレセイン（１）を１
％含む３０％ジメチルホルムアミド−２５ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液５μｌを添加し、１時間放置した後、５
０％メタノール、０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐ
Ｈ７．５）で洗浄した。８０％グリセロールで組織切片
を封入し、蛍光顕微鏡で観察してマウス顎下腺組織に特
異的なシグナルを得た。合成した化合物の溶液を、遮光
下室温で３０日放置した後、同様な操作でマウス顎下腺
組織に特異的なシグナルを同様に得た。

【００２７】実施例２ 実施例１において、６−アミノフルオレセインを、５−
アミノフルオレセインの代わりに用いて実施し、以下の
式（２）で表わされる目的化合物を２００ｍｇ得た。

【化１２】 融点：１９５℃（分解）¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ6、ｐｐｍ，
δ）：ｌ．３５〜ｌ．７５（６Ｈ，ｍ）、２．４０（２
Ｈ，ｔ）、２．５８（１Ｈ，ｄ）、２．８２（１Ｈ、ｄ
ｄ）、３．２０（１Ｈ，ｍ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、
４．３２（１Ｈ，ｍ）、６．３８（１Ｈ，ｓ）、６．４
７（１Ｈ，ｓ）、６．５０〜６．７０（６Ｈ，ｍ）、
７．４２（１Ｈ，ｓ）、７．７４（１Ｈ，ｄ）、８．１
０（１Ｈ，ｄ）、１０．３２（１Ｈ，ｓ）、１０．７０
（１Ｈ，ｂｓ） 赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃｍ^-1）：３３００、１
６８９、１６３５、１６０７、１５９３、１４６０、１
２９５、１２７２

【００２８】［核酸の検出］マウス顎下腺ＮＧＦの特異
的抗体をウサギより調整し、これにストレプトアビジン
を結合させた。マウス生体内から取り出した顎下腺をサ
ッカローズ等で固定後、マウス顎下腺のパラフィン切片
を作製し、キシレンによる脱パラフィン、アルコールに
よる脱水などの組織切片前処理をした。次いで、１０％
スキムミルクで、組織切片への抗体の非特異的吸着を防
ぐためにブロッキングし、ＮＧＦ抗体−ストレプトアビ
ジンを標識した。過剰のＮＧＦ抗体−ストレプトアビジ
ンを洗浄除去し、上記合成した化合物（２）を１％含
む、３０％ジメチルホルムアミド−２５ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液５μｌで標識し、組織に特異的なシグナル
を得た。合成した化合物の溶液を、遮光下室温で３０日
放置した後、同様な操作でマウス顎下腺組織に特異的な
シグナルを同様に得た。

【００２９】実施例３ 実施例１において、５’−アミノ−２，７−ジメチルフ
ルオレセインを、５−アミノフルオレセインの代わりに
用いて実施し、以下の式（３）で表わされる目的化合物
を１８０ｍｇ得た。

【化１３】 融点：２２０℃（分解）¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ6、ｐｐｍ，
δ）：ｌ．３４〜ｌ．７３（６Ｈ，ｍ）、２．３５（６
Ｈ，ｓ）、２．４０（２Ｈ，ｔ）、２．５８（１Ｈ，
ｄ）、２．８０（１Ｈ，ｄｄ）、３．２０（１Ｈ，
ｍ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、４．３２（１Ｈ，ｍ）、
６．３８（１Ｈ，ｓ）、６．４４（１Ｈ，ｓ）、６．６
０（２Ｈ，ｓ）、６．８８（２Ｈ，ｓ）、７．２０（１
Ｈ，ｄ）、７．９０（１Ｈ，ｄ）、８．３２（１Ｈ，
ｓ）、１０．１５（１Ｈ，ｂｓ）、１０．４０（１Ｈ，
ｓ） 赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃｍ^-1）：３３１２、１
６９０、１６３２、１６１０、１５９０、１４５５、１
２９１

【００３０】［核酸の検出］ショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の卵を回
収し、Ｄ．Ｔａｕｔｚらの方法（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｄ．ＴＡＵＴＺ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９２，６１−７３， ＩＲＬ．Ｐｒｅｓ
ｓ）によって胚に前処理を行い、プレハイブリダイゼー
ションを行った。ｆｔｚ遺伝子を含むベクターよりｆｔ
ｚ遺伝子断片のみを回収し、これをテンプレートにして
ランダムプライマー法で作製したビオチン標識したＤＮ
Ａプローブで、上記胚に対してホールマウント法でハイ
ブリダイゼーションを行った。洗浄操作後、アビジン１
ｍｌを添加し、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、
０．１Ｍ食塩水で洗浄した。遮光下、０．１Ｍトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ食塩水、２ｍＭ塩化マグネ
シウム、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液１ｍｌ
に、上記合成した化合物（３）を１％含む３０％ジメチ
ルホルムアミド−２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５μ
ｌを加えた溶液で標識し、暗所で１時間放置後９０％エ
タノール、７０％エタノール、５０％エタノール、０．
１Ｍトリス−塩酸−０．１Ｍ食塩で洗浄した。蛍光顕微
鏡で観察して組織に特異的なシグナルを得た。合成した
化合物の溶液を、遮光下室温で３０日放置した後、同様
な操作でマウス顎下腺組織に特異的なシグナルを同様に
得た。

【００３１】実施例４ 実施例１において、５’−アミノ−２，７−ジブロモ−
９、１２−ジイオドフルオレセインを５−アミノフルオ
レセインの代わりに用いて実施し、以下の式（４）で表
わされる目的化合物を１２５ｍｇ得た。

【化１４】 融点：２２０℃（分解）¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ6、ｐｐｍ，
δ）：ｌ．３５〜ｌ．７２（６Ｈ，ｍ）、２．４０（２
Ｈ，ｔ）、２．６０（１Ｈ，ｄ）、２．８５（１Ｈ，ｄ
ｄ）、３．１２（１Ｈ，ｍ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、
４．３０（１Ｈ，ｍ）、６．３７（１Ｈ，ｓ）、６．４
６（１Ｈ，ｓ）、７．４０（１Ｈ，ｓ）、７．４５（１
Ｈ，ｄ）、７．８０（１Ｈ，ｄ）、８．３５（１Ｈ，
ｓ）、１０．１５（１Ｈ，ｂｓ）、１０．３５（１Ｈ，
ｓ） 赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃｍ^-1）：３３０８、１
６９５、１６４０、１６０８、１５９０、１４６５、１
２９５、１２７１

【００３２】［核酸の検出］マウスＮＧＦ−ｃＤＮＡを
テンプレートにしてランダムプライマー法でディゴギシ
ゲニン標識したＤＮＡプロープを調整した。マウス頭下
腺組織切片を、上記ＤＮＡでハイブリダイゼーション
（insitu）を行なった。ハイブリダイズした後、スキム
ミルクでプロッキングし、ディゴギシゲニン抗体−スト
レプトアビジンで標識した。０．１Ｍトリス塩酸−０．
１Ｍ食塩で洗浄し、上記合成した化合物（４）１％を含
む、３０％ジメチルホルムアミド−２５ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液５μｌで標識し、組織に特異的なシグナル
を得た。合成した化合物の溶液を、遮光下室温で３０日
放置した後、同様な操作でマウス顎下腺組織に特異的な
シグナルを同様に得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹崎 和久 東京都足立区西新井栄町１−18−１ 日清 紡績株式会社東京研究センター内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁乃至Ｒ₃は水素、低級アルキル基又はハロゲ
   ンを表す）で表わされることを特徴とするビオチン化標
   識化合物。
2. 【請求項２】 式（Ｉ−１） 【化２】 で表わされることを特徴とする請求項１に記載のビオチ
   ン化標識化合物。
3. 【請求項３】 式（Ｉ−２） 【化３】 で表わされることを特徴とする請求項１に記載のビオチ
   ン化標識化合物。
4. 【請求項４】 式（ＩＩ） 【化４】 で表わされることを特徴とする請求項１に記載のビオチ
   ン化標識化合物：
5. 【請求項５】 次の工程を含むことを特徴とする蛍光標
   識化方法；（１）ビオチンによりＤＮＡ又はＲＮＡを標
   識する工程；（２）ビオチンにより標識したＤＮＡ又は
   ＲＮＡと、ストレプトアビジン又はアビジンとを反応さ
   せる工程；（３）（２）で得た複合体と、式（Ｉ） 【化５】 （式中、Ｒ₁乃至Ｒ₃は水素、低級アルキル基又はハロゲ
   ンを表す）で表わされるビオチン化標識化合物とを反応
   させる工程。