JPH07159400A - メバロン酸の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 血漿、尿等からなる検体中のメバロン酸を酸
処理して、ＵＶ吸収等による検出が容易なデヒドロメバ
ロノラクトンに導いた後、該デヒドロメバロノラクトン
を液体クロマトグラフィーで分析することにより、検体
中のメバロン酸を測定する。 【効果】 検体中のメバロン酸は簡便な操作によりデヒ
ドロメバロノラクトンに効率的に変換可能であり、該デ
ヒドロメバロノラクトンは特殊な前処理（例えば、従来
のＧＣ−ＭＳ処理に必要なトリメチルシリル化、シリカ
ゲルカラムによる精製）を必須とすることなく、ＵＶ検
出器等を用いて液体クロマトグラフィーにより簡便に測
定可能であるため、高感度および良好な測定精度・安定
性でメバロン酸を測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、メバロン酸の測定方法
に関し、より詳しくは検体中のメバロン酸をＵＶ吸収等
による検出が容易なデヒドロメバロノラクトンに導いた
後、液体クロマトグラフィーで測定するメバロン酸の測
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年食事の西欧化等により、狭心症、心
筋梗塞等の虚血性心疾患は日本を始めとするアジア諸国
でも増加する傾向にあるため、その予防ないし治療の重
要性も年々増大している。これらの虚血性心疾患予防の
観点からは、その原因となる基礎疾患たる動脈硬化症の
予防ないし治療が重要である。

【０００３】今日、動脈硬化症の成因に関しては、高脂
血症、特に高コレステロール血症が重要な危険因子であ
ることは、病理学、生理学、生化学、および疫学のいず
れの面の研究からも疑いがない。したがって、高コレス
テロール血症の治療は、動脈硬化症予防の基礎として極
めて重要性が高い。

【０００４】一般に、血中に存在するコレステロール
は、食物由来のコレステロールと、体内で生合成される
コレステロールとからなる。高コレステロール血症の治
療の目的で、今日では種々のコレステロール降下薬が開
発されているが、これらの薬物の作用機序は多様（例え
ば、コレステロール生合成阻害、コレステロール吸収阻
害等）である。したがって、高コレステロール血症の治
療指針（どの薬物をどのように用いるか）を得るために
は、個々の症例においてコレステロール生合成量を評価
することが極めて重要となる。

【０００５】従来、コレステロール生合成量の評価は、
被検者に¹⁴Ｃ−コレステロールを投与して、血中の¹⁴Ｃ
の比活性を追跡するターンオーバー法（Turnover stud
y）、あるいは食物中と便および尿中の中性ステロール
を測定するバランス法（Balance study ）により算出さ
れていたが、これらの方法は被検者に著しい苦痛を与え
るのみならず、測定の労力が極めて多大であるため、こ
れらのターンオーバー法ないしバランス法を日常の臨床
に用いることは極めて困難であった。

【０００６】一方、近年コレステロール合成の中間体の
血中濃度あるいは尿中排泄量からコレステロール生合成
量を推定することが提案され、スクアレン、メチルステ
ロール、ラストステロール、およびメバロン酸の測定が
臨床上有意義であるとされている。これらのうち、構造
式を下記（化１）に示すメバロン酸（Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA,７９，３０３７−３０４１，１９８２年
を参照）は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（コレステロール
生合成経路の律速酵素）の直接反応生成物であるのみな
らず、該メバロン酸の合成はコレステロール生合成の律
速段階とされている。したがって、コレステロール生合
成量の評価において、メバロン酸を測定することは極め
て重要である。

【０００７】このメバロン酸の定量は、現在ＧＣ−ＭＳ
（ガスクロマトグラフ質量分析計）法又はラジオエンザ
イム法により行われている（医学と薬学、２７（４）、
９３９−９４５、１９９２年）が、このようにして求め
た血中メバロン酸値と、前記したバランス法により求め
たコレステロール合成量とは、良い相関を示すことが報
告されている（J. Clin. Invest., ７４、７９５−８０
４、１９８４年）。

【０００８】

【化１】

【０００９】上記ラジオエンザイム法においては、［γ
−³²Ｐ］ＡＴＰを用いて、測定すべき検体中のメバロン
酸をリン酸化して５−［γ−³²Ｐ］Phosphpomevalonate
とし、内部標準として５−Phosphpo［¹⁴Ｃ］mevalonate
を加えた後、イオン交換カラムにかけて分離した５−Ph
osphpomevalonateの³²Ｐ／¹⁴Ｃ比に基づき、検体中のメ
バロン酸を定量している（Journal of Lipid Research
、２０、７１６〜７２８、１９７９年）。

【００１０】一方、上記ＧＣ−ＭＳ法においては、検体
に特殊な内部標準物質（β−ヒドロキシ−β−エチル−
δ−バレロラクトン）を加え、リン酸緩衝液でｐＨ２．
０とした後放置してメバロノラクトン（化２）に変換
し、これを有機溶剤で抽出・乾固し、トリメチルシリル
化した後、ＧＣ−ＭＳにおけるマスフラグメントグラフ
ィーの手法を用いて測定している（医学と薬学、２７
（４）、９３９−９４５、１９９２年）。

【００１１】

【化２】

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記ラ
ジオエンザイム法においては、放射性物質を用いる点に
難点があるのみならず、前処理が煩雑であり、またグリ
コル酸の妨害により高い測定値を与える傾向がある。

【００１３】また、上記ＧＣ−ＭＳ法においては、用い
るＧＣ−ＭＳ自体への投資（１台で数千万円程度）が必
要で、しかもそのメインテナンスおよび実際の測定操作
のためには専任のオペレーターが必要となるため、実際
にＧＣ−ＭＳを設置可能な施設はかなり制限される。し
たがって、このＧＣ−ＭＳ法は、メバロン酸測定方法と
して広く一般的に利用できる方法とは言えない。

【００１４】更には、ＧＣ−ＭＳは生体成分の分析手法
としては感度不足の傾向があるばかりでなく、前処理が
煩雑であり、またその精度・安定性は充分とは言い難
い。加えて、従来のＧＣ−ＭＳ法においては、実用的な
測定精度を得ようとすると、上記した特殊な内部標準物
質（β−ヒドロキシ−β−エチル−δ−バレロラクト
ン）を用いて回収率を補正することが必須となる。

【００１５】したがって本発明の目的は、前処理が簡便
なメバロン酸の測定方法を提供することにある。

【００１６】本発明の他の目的は、感度が良好で、しか
も測定精度・安定性も良好なメバロン酸の測定方法を提
供することにある。

【００１７】本発明の更に他の目的は、広く一般的に利
用可能なメバロン酸の測定方法を提供することにある。

【００１８】本発明の更に他の目的は、装置コストおよ
びランニングコストがともに低いメバロン酸の測定方法
を提供することにある。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、検体中のメバロン酸に所定の処理を施すことによ
り、該メバロン酸を、ＵＶ吸収等による検出が容易なデ
ヒドロメバロノラクトン（化３）に簡便且つ効率的に変
換可能であることを見い出した。本発明者は更に研究を
続けた結果、このようにして得た検体中のデヒドロメバ
ロノラクトンが、液体クロマトグラフィーにより簡便に
測定可能であることを見出した。

【００２０】

【化３】

【００２１】本発明のメバロン酸の測定方法は上記知見
に基づくものであり、より詳しくは、検体中のメバロン
酸をデヒドロメバロノラクトンに導いた後、該デヒドロ
メバロノラクトンを液体クロマトグラフィーで測定する
ことを特徴とするものである。

【００２２】

【作用】本発明において、検体中のメバロン酸（化１）
は簡便な操作（例えば、酸処理）によりラクトン化、脱
水してデヒドロメバロノラクトン（化３）に効率的に変
換することが可能である。

【００２３】更には、このデヒドロメバロノラクトンは
特殊な前処理（例えば、ＧＣ−ＭＳ処理に必要なトリメ
チルシリル化、シリカゲルカラムによる精製）を必須と
することなく、例えば、ＵＶ検出器を用いる液体クロマ
トグラフィーにより簡便に測定可能であるため、本発明
によれば、良好な感度で、しかも良好な測定精度・安定
性でメバロン酸を測定することが可能となる。

【００２４】本発明のメバロン酸測定法の典型例におけ
る操作手順および従来のＧＣ−ＭＳによるメバロン酸測
定法における操作手順を、それぞれ図１のフローチャー
トに示す。図１のフローチャートに示したように、本発
明によれば、有機溶媒抽出後のシリカカラムによる精製
が必須でなくなり、クロマトグラフィー測定の前処理が
簡単なものとなる。したがって本発明によれば、従来の
ＧＣ−ＭＳ法に比べて極めて簡便なメバロン酸測定が可
能となる。

【００２５】本発明における液体クロマトグラフィーと
して高性能液体クロマトグラフィー（High-performance
liquid chromatography；ＨＰＬＣ）を用いた場合であ
っても、その装置コストはせいぜい数百万円程度であ
り、しかも上記ＧＣ−ＭＳとは異なり、メインテナンス
が簡便で、実際の測定操作に専任のオペレーターを必須
としないため、本発明によれば、装置コストおよびラン
ニングコストをともに抑制したメバロン酸の測定方法が
提供される。

【００２６】本発明において液体クロマトグラフィーに
より分析されるデヒドロメバロノラクトン（化３）の紫
外部吸収は非常に強く（モル吸光係数がメバロン酸の数
十倍から数百倍）、上記ＵＶ検出の際に（例えば波長２
１０ｎｍに比べて）妨害物質が少ない長波長側（例え
ば、２１５ｎｍ以上の波長）が使用可能となるため、よ
り高感度且つ高精度のメバロン酸測定が可能となる。

【００２７】更には、本発明においては、従来のＧＣ−
ＭＳ法におけるような特殊な内部標準物質（β−ヒドロ
キシ−β−エチル−δ−バレロラクトン）を用いる回収
率の補正が必須でないため、このような回収率の補正を
行うことなく充分に正確で安定した測定値を得ることが
できる。

【００２８】上述したように、本発明によれば、装置コ
ストおよびランニングコストがともに低く、しかも広く
一般的に利用可能なメバロン酸の測定方法が提供され
る。

【００２９】以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本
発明を詳細に説明する。

【００３０】（検体）メバロン酸が含まれる可能性を有
する検体である限り、ヒトを始めとする動物の体液（例
えば、血液、リンパ液、尿等）を特に制限なく使用する
ことができる。検体としてヒト血液を用いる場合、通常
は血漿又は血清を用いることが好ましい。本発明におい
て、検体は必要に応じて緩衝液等の液体で希釈して用い
ることができる。

【００３１】（デヒドロメバロノラクトンへの変換）上
記検体中のメバロン酸（化１）を、一定の効率（収率）
でデヒドロメバロノラクトン（化３）に変換（ラクトン
化・脱水）することが可能である限り、メバロン酸をデ
ヒドロメバロノラクトンに変換する手段は特に制限され
ないが、該変換操作が簡便な点からは、酸を検体に添加
することによりメバロン酸をデヒドロメバロノラクトン
に変換することが好ましい。

【００３２】上記酸としては、ブレンステッド酸、ルイ
ス酸、固体酸（イオン交換樹脂等）等のいずれも使用可
能であるが、後処理が容易な点からは、ブレンステッド
酸、特に強酸を用いることが好ましい。このような強酸
としては、例えば、塩酸、硫酸、過塩素酸が好適に使用
できる。脱水効力、安定性の点からは、過塩素酸が特に
好ましく使用される。

【００３３】上記酸を用いる場合、検体がｐＨ２以下
（更には０．５〜１．０）程度の酸性になる程度の量を
検体に添加することが好ましい。検体として血漿、血清
を用いる場合には、除蛋白効率を考慮してｐＨは低め
（例えば０．５程度）とすることが好ましい。一方検体
として尿を用いる場合には、ｐＨは高め（例えば１．０
程度）でよい。上記酸として過塩素酸を用いる場合、例
えば、検体（血清、尿等）１．０ｍｌに対して、１０％
過塩素酸水溶液を０．２〜１ｍｌ程度（更には０．４〜
０．５ｍｌ程度）用いることが好ましい。

【００３４】本発明者の実験によれば、このような酸処
理によりメバロン酸のラクトン化はかなり進行するが、
該ラクトンの脱水は、主に、後述するような乾固時（例
えばＮ₂ 雰囲気下）に進行することが観察されている。
また、この乾固の際に少量の酸を存在させた場合、脱水
効率が向上することが観察されている。

【００３５】（ラクトン化・脱水後の処理）上記ラクト
ン化（除蛋白）により検体中にメバロノラクトンを生成
させた後、該メバロノラクトンを溶媒により抽出して液
体クロマトグラフィー分析用の試料を作成することが、
メバロン酸測定の精度向上および液体クロマトグラフの
機器メインテナンス（試料導入口、カラムの汚染防止
等）の点から好ましい。

【００３６】この抽出操作に用いる溶媒としては、常温
（２５℃）で液体であり、且つ、水への溶解性が低い抽
出用溶媒（例えば、有機溶媒）を特に制限なく使用する
ことが可能である。沸点等の点からは、例えばジエチル
エーテル、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル等
が好ましく使用できる。溶媒の毒性および引火性の点か
らは、酢酸エチルが特に好ましく用いられる。この抽出
前に、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩を水相に
加えることが抽出率の向上の点から好ましい。本発明者
の実験によれば、硫酸ナトリウムを用いた場合（後述す
る実施例１の）、抽出率が塩無添加時の約２倍、塩化ナ
トリウム添加時の約１．５倍に向上することが観察され
た。

【００３７】本発明においては、このように抽出処理を
行った後、抽出用溶媒相を濃縮・乾固させてデヒドロメ
バロノラクトンを生成させることが好ましい。この濃縮
・乾固の際に、少量の酸を存在させることにより、メバ
ロノラクトンからデヒドロメバロノラクトンへの脱水反
応の効率が向上する。

【００３８】本発明においては、上記濃縮・乾固の後、
後述するような液体クロマトグラフィー用の移動相に再
溶解することが好ましい。測定対象物の変性を抑制する
点からは、この濃縮・乾固操作は不活性ガス（例えば、
窒素）雰囲気下で行うことが好ましい。

【００３９】上記濃縮、乾固操作の前に、必要に応じ
て、溶媒相の遠心分離処理を行ってもよい。このような
遠心分離を行うことは、メバロン酸測定の精度向上およ
び液体クロマトグラフの機器メインテナンスの点から好
ましい。この場合の遠心分離条件としては、４５０〜６
５０Ｇ程度の加速度（半径１８ｃｍ程度のローターを用
いた場合、１５００〜１８００ｒｐｍ程度の回転数）を
用いることが好ましい。

【００４０】（メバロノラクトン抽出前の遠心分離）上
記メバロノラクトンの抽出前に、必要に応じて検体に遠
心分離操作を施すことにより、上記ラクトン化・脱水処
理による副生成物（例えば、タンパク質の酸変性物）等
を除去してもよい。このような遠心分離を行うことは、
メバロン酸測定の精度向上および液体クロマトグラフの
機器メインテナンスの点から好ましい。この場合の遠心
分離条件としては、１２０００〜１４０００Ｇ程度の加
速度（半径７ｃｍ程度のローターを用いた場合、１２０
００〜１３０００ｒｐｍ程度の回転数）を用いることが
好ましい。

【００４１】（液体クロマトグラフィー測定）本発明に
おいては、液体クロマトグラフィーとして所謂オープン
カラムクロマトグラフィーを用いることも可能である
が、測定精度および測定再現性の点からは、高性能液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が好適に用いられる。

【００４２】（カラム）液体クロマトグラフィーにおい
て用いるカラムとしては、メバロン酸（化１）、メバロ
ノラクトン（化２）およびデヒドロメバロノラクトン
（化３）相互の分離が可能なものであれば、特に制限さ
れない。本発明においては、順相クロマトグラフィー用
のカラム、逆相クロマトグラフィー用カラムのいずれも
使用可能であるが、デヒドロメバロノラクトン（他の２
者より低極性）について良好な分離が得やすい点から
は、逆相クロマトグラフィー用カラムを用いることが好
ましい。

【００４３】本発明において、分析の均一性ないし再現
性の点からは、上記カラムを構成する吸着担体として
は、いわゆる化学結合型の充填剤が好ましく用いられ、
特にオクタデシルシリル（Ｃ₁₈、ＯＤＳ）基等のアルキ
ルシリル基を化学結合させたシリカゲルが特に好ましく
用いられる。

【００４４】（カラムスイッチング）本発明に用いる液
体クロマトグラフィーの手法は特に制限されないが、夾
雑物の妨害の抑制および／又は分析時間の短縮化の点か
らは、単一のカラムを用いるよりも、カラムスイッチン
グの手法により複数のカラムを切り換えて用いることが
好ましい。ここに、「カラムスイッチング」とは、複数
のカラムを用いる液体クロマトグラフィーであって、一
方のカラム（Ａ）への測定すべき成分の吸着ないし溶出
に応じて、他方のカラム（Ｂ）への移動相の流路および
上記カラム（Ａ）とこのカラム（Ｂ）との接続のうち
の、少なくとも一方を変化させる手法をいう（このカラ
ムスイッチングの詳細については、例えば、山辺武郎
「超高速液体クロマトグラフィー」、１０１〜１２０
頁、産業図書、１９８９年を参照することができる）。

【００４５】本発明において使用可能なカラムスイッチ
ングの手法は特に制限されないが、例えば、第１カラム
（プレカラム）において予備的に分離された分画のう
ち、必要な分画のみを第２カラム（メインカラム）にお
いて精密に分離するカラムスイッチングの手法が好適に
使用可能である。このような態様においては、不要な分
画は第２カラムをバイパスさせて高速に分析システムか
ら溶出させることにより、全体の分析時間を短縮でき
る。この場合、夾雑物の分析システムからの迅速な排出
を計りつつ、デヒドロメバロノラクトンを含む分画を精
密に分析することが容易な点からは、移動度の異なる複
数の移動相を用いることが好ましい。更に、必要に応じ
て、分離特性の異なる複数のメインカラムを含む３以上
のカラムを用いてもよく、また複数の切り換えバルブを
用いて溶媒組成の迅速な変化を容易としてもよい。

【００４６】本発明において、例えば尿中のメバロン酸
を測定する場合、通常のIsocratic法（単一のカラム、
単一の移動相組成）により分析する際には、検体中の夾
雑物質の存在に起因して、分析時間がやや長く（例え
ば、１検体の分析当たり３０〜６０分間程度）なる。ま
た、複数検体の連続分析においては、以前に注入した検
体に由来するピークが、次に注入した検体のピークと重
なる可能性も生じる。

【００４７】一方、分析時間の短縮化のためにグラジェ
ント法（移動相の組成を変化させる）を用いた場合に
は、デヒドロメバロノラクトン溶出後のカラム洗浄、カ
ラムコンディショニングの時間が逆に長くなる傾向があ
るため、例えば１検体当たりの分析時間が、約４０分以
上となる。

【００４８】これに対して、前述したカラムスイッチン
グの手法を用い、複数のカラムに対応させて複数種類の
移動相組成を用いた場合には、夾雑物質を迅速に分離し
つつデヒドロメバロノラクトンを精密に分析することが
容易となるため、例えば１検体当たりの分析時間が１６
〜２０分程度となる。特に複数検体の連続分析において
は、前の検体の未同定成分の影響を次の検体の分析にお
いて著しく小さくできるため、短い分析時間で安定した
ルーチン分析が可能となる。

【００４９】本発明においては、夾雑物の妨害の抑制お
よび分析時間の短縮の点からは、例えば、２種類のカラ
ムおよび２種類の移動相を用いて、以下のようなカラム
スイッチングを行うことが好ましい。

【００５０】図２のブロック図を参照して、オートサン
プラー１からサンプルを注入する前には、切り換えバル
ブ２はバルブ位置Ａに設定されている。この場合、第１
の移動相は、第１のポンプ３から、オートサンプラー
１、プレカラム（第１のカラム）４、および切り換えバ
ルブ２を通って、ドレインへと送液される。この場合、
第２の移動相は、第２のポンプ５から送液され、メイン
カラム（第２のカラム）６、および検出器７を通ってそ
のままドレインへと送液される。

【００５１】オートサンプラー１にサンプルが注入され
た後、所定の時点（プレカラム４からデヒドロメバロノ
ラクトンを含む分画の溶出が始まる時点）に至るまで
は、切り換えバルブ２は上記バルブ位置Ａのままであ
る。すなわち、上記サンプルはプレカラム４によって粗
分離されて、デヒドロメバロノラクトンを含む分画より
前にプレカラム４から溶出する分画は、切り換えバルブ
２を通った後ドレインに送られる。

【００５２】一方、オートサンプラー１にサンプルが注
入された後、所定の時点（プレカラム４からデヒドロメ
バロノラクトンを含む分画の溶出が始まる時点）におい
て、切り換えバルブ２はバルブ位置Ｂに設定され（図
３）、プレカラム４から溶出したデヒドロメバロノラク
トンを含む分画は、切り換えバルブ２を通って更にメイ
ンカラム６で精密に分離され、検出器７で検出された後
ドレインに送られる。

【００５３】デヒドロメバロノラクトンを含む分画がメ
インカラム６に移り終えた後に、切り換えバルブ２はバ
ルブ位置Ａに戻され（図２）、デヒドロメバロノラクト
ンを含む分画より後にプレカラム４から溶出する分画
は、切り換えバルブ２を通った後ドレインに送られる。

【００５４】（検出器）本発明においては、液体クロマ
トグラフィーの検出器として、公知のものを特に制限な
く使用することが可能である。より具体的には例えば、
吸光光度検出器（紫外および／又は可視）、蛍光検出器
（ＦＬ）、示差屈折検出器（ＲＩ）、赤外吸光光度検出
器（ＩＲ）、質量分析（ＭＳ）検出器等を使用すること
ができる。

【００５５】簡便性および感度のバランスの点からは、
本発明においては、吸光光度検出器を用いることが好ま
しい。この吸光光度検出における測定波長は特に制限さ
れないが、検出の選択性の点からは、２１５ｎｍ以上の
波長を用いることが好ましく、２２０〜２４０ｎｍ（特
に２３０ｎｍ附近）の波長を用いることが更に好まし
い。

【００５６】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明する。

【００５７】

【実施例】実施例１ （デヒドロメバロノラクトンの構造確認）市販のメバロ
ン酸標準品（化１）に対して、後述するような検体と同
様の処理を施し、デヒドロメバロノラクトン（化３）が
生成することを確認した。

【００５８】すなわち、市販のメバロン酸標準品（試薬
特級、Ｓｉｇｍａ社製）１．０ｍｌに１０％過塩素酸水
溶液を０．４ｍｌ加え、室温（２２〜２５℃）で１０分
間撹拌して反応させた。反応生成物に１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ＝２．０）を５ｍｌ加え、無水硫酸ナトリウム約
３ｇを加えた後、１０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。こ
のようにして得られた有機相を、窒素気流下５０℃で乾
固させた。

【００５９】得られた残渣を０．３ｍｌのプレカラム移
動相に溶解した後、下記の条件下でＨＰＬＣにより精製
した。

【００６０】ＨＰＬＣ装置：商品名Intelligent PumpＬ
−６２００、日立製作所製 カラム：逆相クロマトグラフィー用カラム（商品名：In
tersil−８０Ａ、ジーエルサイエンス社製、Ｃ₁₈−ＯＤ
Ｓシリカゲルを含む化学結合型カラム）、 直径
４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ カラム温度：２５℃ 移動相：８ｍＭリン酸緩衝液（１．３％のテトラヒドロ
フランを含む） 流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：紫外／可視吸光光度検出器（ＳＰＤ−１０Ａ、
島津製作所製）、測定波長：２３０ｎｍ 注入量：５０μｌ 上記により精製した試料を重クロロホルム（ＣＤＣ
ｌ₃ ）に溶解した後、プロトンＮＭＲ（商品名：ＸＬ−
３００、Ｖａｒｉａｎ社製）により分析した。得られた
ＮＭＲスペクトルを図４に示す。

【００６１】上記図４のスペクトルには、メチル
（ａ）、メチレン（ｂおよびｃ）、メチン（ｄ）に対応
するピークがそれぞれ認められる。これらのピークの化
学シフトは、文献（Ajit Sanghivi ら、Biochem. Bioph
ys. Acta.,４４４，７２７−７３３，１９７６年）記載
の副生成物Δ² −３−ＣＨ₃ −Mevalonic acid lactone
（デヒドロメバロノラクトン；化３）と良く一致してい
る。

【００６２】上記各ピークの積分値は、図４に示したよ
うに、それぞれ４５．０：３０．７：３１．５：１５．
０であった。（化３）に示した構造（ａ：ｂ：ｃ：ｄ＝
３：２：２：１）は、これらの積分値からも支持され
る。

【００６３】実施例２ （メバロン酸標準品および検体の分析）検体（血漿又は
尿）中のメバロン酸をデヒドロメバロノラクトンに導い
た後、ＨＰＬＣにより分析した。

【００６４】すなわち、検体（血漿又は尿）（ないし上
記したメバロン酸標準品の所定量）１．０ｍｌに１０％
過塩素酸水溶液を０．４ｍｌ加え、振盪機（商品名：Mi
croTube MixerＭＴ−３６０、株式会社トミー精工製）
を用いて室温で１０分間振盪して反応させた後、遠心分
離機（商品名：マイクロ冷却遠心機１７００、久保田社
製、ローター半径：７．３ｃｍ）を用いて４℃、１１７
５０Ｇ（１２０００ｒｐｍ）の条件で１５分間遠心処理
した。

【００６５】上記遠心処理後の上清１．０ｍｌに、１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ＝２．０）を５ｍｌ加え、無水硫酸
ナトリウム３ｇを加えた後、振盪機（特注品、池田理化
社製）を用いて１０ｍｌの酢酸エチルと振盪して、検体
中のメバロノラクトンを酢酸エチルで抽出した。次い
で、遠心分離機（商品名：Ｈ−１０７Ｓ、国産遠心機社
製、ローター半径：１８ｃｍ）を用いて４５０Ｇ（１５
００ｒｐｍ）の条件で遠心分離して有機相を回収した。
この有機相９ｍｌを窒素気流下５０℃で乾固させた。こ
の乾固操作の際、乾固に用いた試験管内壁を０．１％の
過塩素酸を含有する酢酸エチルで２〜３回程度洗浄し
て、未反応のメバロン酸の脱水・ラクトン化を完了させ
た。

【００６６】このようにして得られた残渣を０．２５ｍ
ｌの下記移動相１（２．５％ＣＨ₃ＣＮを含有する８ｍ
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝２．２）に溶解した後、下記の
条件下でＨＰＬＣにより分析した。

【００６７】ＨＰＬＣ装置：商品名Intelligent PumpＬ
−６２００、日立製作所製 プレカラム：逆相クロマトグラフィー用カラム（商品
名：ＬＱ−Ｄ Type 、ラボコーテック社製、Ｃ₁₈−ＯＤ
Ｓシリカゲルを含む化学結合型カラム） 直
径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍ メインカラム：逆相クロマトグラフィー用カラム（商品
名：Intersil−８０Ａ、ジーエルサイエンス社製、Ｃ₁₈
−ＯＤＳシリカゲル）、直径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍ
ｍ カラム温度：２５℃ 第１の移動相：２．５％アセトニトリル（ＣＨ₃ ＣＮ）
を含有する８ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝２．２） 第２の移動相：１．３％テトラヒドロフランを含有する
８ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝２．２） 流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ 検出器：紫外／可視吸光光度検出器（測定波長：２３０
ｎｍ） 注入量：５０μｌ 上記ＨＰＬＣ分析においては、上述した２種類のカラム
および２種類の移動相を用いて、以下のようなカラムス
イッチングによる分析を行った。

【００６８】図２を参照して、オートサンプラー１にサ
ンプルが注入される前、およびサンプルが注入された後
３．５分未満では、切り換えバルブ２をバルブ位置Ａに
設定し、上記サンプルをプレカラム４によって粗分離し
て、デヒドロメバロノラクトンを含む分画より前に溶出
する分画を、切り換えバルブ２を通過させた後ドレイン
に送液した。

【００６９】一方、オートサンプラー１にサンプルが注
入された後、３．５分の時点で切り換えバルブ２をバル
ブ位置Ｂに設定し（図３）、プレカラム４から溶出した
デヒドロメバロノラクトンを含む分画を、切り換えバル
ブ２を通過させ、メインカラム６で精密に分離して、検
出器７で検出した後ドレインに送液した。

【００７０】上記デヒドロメバロノラクトンを含む分画
がメインカラム６に移り終えた後（オートサンプラー１
にサンプルが注入された後、４．５分の時点）、切り換
えバルブ２をバルブ位置Ａに戻し（図２）、デヒドロメ
バロノラクトンを含む分画より後にプレカラム４から溶
出する分画を、切り換えバルブ２を通過させた後ドレイ
ンに送液した。

【００７１】メバロン酸（標準品）１００ｎｇ／ｍｌお
よび１ｎｇ／ｍｌをそれぞれ上記サンプルとして用いた
場合に、得られたＨＰＬＣクロマトグラム（デヒドロメ
バロノラクトンのピーク）を図５に示す。図５中、「In
te. ATT 」は、検出器感度のアテニュエーション（atte
nuation ）を示す（Inte. ATT が小さい程、検出器の感
度が高い）。

【００７２】更に、検体たる血漿２種類（Ａおよび
Ｂ）、および尿２種類（ＡおよびＢ）をそれぞれ上記サ
ンプルとして用いた場合に、得られたＨＰＬＣクロマト
グラムをそれぞれ図６および図７に示す。これらの図中
においては、デヒドロメバロノラクトンのピークがＤ−
ＭＶＬの記号で示されている。

【００７３】実施例３ （検量線の直線性）上記メバロン酸（標準品）の濃度と
して、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍ
ｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎ
ｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、および４０００ｎｇ／
ｍｌの８種類のサンプルを用いた以外は、実施例１と同
様にしてＨＰＬＣ分析を行った。

【００７４】このようにして得られたデヒドロメバロノ
ラクトンのＨＰＬＣピーク高さ（縦軸；μＶ）と、メバ
ロン酸標準品濃度（横軸；ｎｇ／ｍｌ）との関係を、下
記（表１）および図８のグラフ（検量線）に示す。

【００７５】

【表１】

【００７６】上記表１および図８に示したように、本発
明の測定法により、メバロン酸標準品濃度とＨＰＬＣピ
ーク高さとの関係について、原点を通る良好な直線関係
が得られた。

【００７７】実施例４ （標準品測定値の再現性）上記メバロン酸（標準品）の
濃度として、５０ｎｇ／ｍｌのサンプルを用い、同様の
測定を８回繰り返した（Ｎ＝８）以外は、実施例１と同
様にしてＨＰＬＣで分析を行った。

【００７８】このようにして得られたＨＰＬＣピーク高
さ（μＶ）の測定値を下記（表２）に示す。

【００７９】

【表２】

【００８０】上記した８回の測定により、Ｘ（平均値）
＝１３９４．６μＶ、ＳＤ（標準偏差）＝４０．４μ
Ｖ、ＣＶ＝ＳＤ／Ｘ（平均値）＝２．９０％と良好な再
現性が得られた。

【００８１】実施例５ （血漿測定値の同時再現性）上記サンプルとして、血漿
検体ＣおよびＤを用い、同様の測定を８回繰り返した
（Ｎ＝８）以外は、実施例１と同様にしてＨＰＬＣで分
析を行った。

【００８２】このような測定で得られたＨＰＬＣピーク
高さ（μＶ）の測定値を、実施例３で得られた検量線を
用いてメバロン酸濃度に換算した。このようにして得ら
れたメバロン酸濃度値を下記（表３）に示す。

【００８３】

【表３】

【００８４】上記表３に示したように、前記８回の測定
により、血漿ＣおよびＤのいずれについても良好な再現
性が得られた。

【００８５】＜血漿Ｃ＞ Ｘ（平均値）＝６．２ｎｇ／ｍｌ ＳＤ（標準偏差）＝０．２０ｎｇ／ｍｌ ＣＶ＝ＳＤ／Ｘ（平均値）＝３．２％ ＜血漿Ｄ＞ Ｘ（平均値）＝１５．９ｎｇ／ｍｌ ＳＤ（標準偏差）＝０．４９ｎｇ／ｍｌ ＣＶ＝ＳＤ／Ｘ（平均値）＝３．１％実施例６ （尿測定値の同時再現性）上記サンプルとして、尿検体
ＣおよびＤを用い、同様の測定を８回繰り返した（Ｎ＝
８）以外は、実施例１と同様にしてＨＰＬＣで分析を行
った。

【００８６】このような測定で得られたＨＰＬＣピーク
高さ（Ｖ）の測定値を、実施例３で得られた検量線を用
いてメバロン酸濃度に換算した。このようにして得られ
たメバロン酸濃度値を下記（表４）に示す。

【００８７】

【表４】

【００８８】上記した表４に示したように、前記８回の
測定により、測定した尿ＣおよびＤのいずれについても
良好な再現性が得られた。

【００８９】＜尿Ｃ＞ Ｘ（平均値）＝１０１．３ｎｇ／ｍｌ ＳＤ（標準偏差）＝２．７９ｎｇ／ｍｌ ＣＶ＝ＳＤ／Ｘ（平均値）＝２．７５％ ＜尿Ｄ＞ Ｘ（平均値）＝４５５．５ｎｇ／ｍｌ ＳＤ（標準偏差）＝１２．０１ｎｇ／ｍｌ ＣＶ＝ＳＤ／Ｘ（平均値）＝２．６４％実施例７ （血漿サンプルを用いた添加回収試験）上記サンプルと
して、血漿検体ＥおよびＦを用い、それぞれのサンプル
９容（容量部）にメバロン酸水溶液１容を加えて、添加
されたメバロン酸の濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ、５ｎ
ｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および５０ｎｇ／ｍｌとな
るようにした後、実施例１と同様の測定を行った以外
は、実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析を行い、それぞ
れのサンプルの定量値を求めた。

【００９０】これらの測定においては、得られたデヒド
ロメバロノラクトンのＨＰＬＣピーク高さ（μＶ）を、
実施例３で得られた検量線を用いてメバロン酸濃度に換
算した。このようにして得られたメバロン酸定量値を下
記（表５）および図９のグラフに示す。

【００９１】

【表５】

【００９２】上記した表５において示した「回収率」
は、以下のように定義される数値である。

【００９３】回収率(%) ＝１００×｛( 定量値) −( 添
加量０ng/ml の場合の定量値) ｝／添加量 上記表５および図９に示したように、測定した血漿Ｅお
よびＦのいずれについても、良好な回収率が得られた。

【００９４】実施例８ （尿サンプルを用いた添加回収試験）上記サンプルとし
て、尿検体ＥおよびＦを用い、それぞれのサンプル９容
（容量部）にメバロン酸水溶液１容を加えて、添加され
たメバロン酸の濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ
／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および５００ｎｇ／ｍｌと
なるようにした後、実施例１と同様の測定を行った以外
は、実施例１と同様にしてＨＰＬＣ分析を行い、それぞ
れのサンプルの定量値を求めた。

【００９５】これらの測定においては、得られたデヒド
ロメバロノラクトンのＨＰＬＣピーク高さ（μＶ）を、
実施例３で得られた検量線を用いてメバロン酸濃度に換
算した。このようにして得られたメバロン酸定量値を下
記（表６）および図１０のグラフに示す。

【００９６】

【表６】

【００９７】上記表６および図１０に示したように、測
定した尿ＥおよびＦのいずれについても、良好な回収率
が得られた。

【００９８】実施例９ （ＨＰＬＣ法とＧＣ−ＭＳ法との比較）以下の（表７）
に示す１０種類のサンプル（血漿６種類、尿４種類）を
用いた以外は実施例１と同様にして本発明のＨＰＬＣ法
によりメバロン酸を測定した。

【００９９】一方、上記した１０種類のサンプルを用
い、従来のＧＣ−ＭＳ法（測定条件は、前述した文献：
医学と薬学、２７（４）、９３９−９４５、１９９２年
と同様）によりメバロン酸を測定して、上記したＨＰＬ
Ｃ法のデータと比較した。上記測定により得られた測定
値を下記（表７）および図１１のグラフに示す。

【０１００】下記表７において、「＋５ｎｇ／ｍｌ」等
の記載は、血漿又は尿９容にそれぞれ所定の濃度のメバ
ロン酸標準品水溶液１容を添加して、添加されたメバロ
ン酸の濃度が「表に記載された濃度」となるようにした
後、測定用のサンプルとして用いたことを示す。

【０１０１】

【表７】

【０１０２】上記図１０のグラフに示したように、ＨＰ
ＬＣ法による測定値（ｘ）と、ＧＣ−ＭＳによる測定値
（ｙ）とに関して、以下のような良好な相関関係（相関
係数γ＝０．９９７）が得られた。

【０１０３】ｙ＝０．８６４ｘ−１．２７

【０１０４】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、検体中
のメバロン酸をデヒドロメバロノラクトンに導いた後、
該デヒドロメバロノラクトンを液体クロマトグラフィー
で測定するメバロン酸の測定方法が提供される。

【０１０５】本発明において、検体中のメバロン酸は簡
便な操作によりデヒドロメバロノラクトンに効率的に変
換可能であるのみならず、該デヒドロメバロノラクトン
は特殊な前処理（例えば、ＧＣ−ＭＳ処理に必要なトリ
メチルシリル化、シリカゲルカラムによる精製）を必須
とすることなく、液体クロマトグラフィー（例えば、Ｕ
Ｖ検出器を用いる）により簡便に測定可能である。した
がって本発明によれば、良好な感度で、しかも良好な測
定精度・安定性でメバロン酸を測定することが可能とな
る。

【０１０６】更に、本発明によれば、有機溶媒抽出後の
シリカカラムによる精製（従来のＧＣ−ＭＳ法では必
須）が必須でなくなり、全体としてクロマトグラフィー
の前処理が簡便となるため、従来のＧＣ−ＭＳ法に比べ
て極めて簡便なメバロン酸測定が可能となる。

【０１０７】本発明における液体クロマトグラフィーと
して高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い
たとしても、その装置コストはせいぜい数百万程度であ
り、しかも上記ＧＣ−ＭＳとは異なり、メインテナンス
が簡便で、実際の測定操作に専任のオペレーターを必要
としない。したがって本発明によれば、装置コストおよ
びランニングコストがともに低いメバロン酸の測定方法
が提供される。

【０１０８】更には、本発明において液体クロマトグラ
フィーにより検出すべきデヒドロメバロノラクトンの紫
外部吸収は非常に強く（モル吸光係数がメバロン酸の数
十倍から数百倍）、上記ＵＶ検出の際に（例えば波長２
１０ｎｍに比べて）妨害物質が少ない長波長側（例えば
２１５ｎｍ以上）が使用可能となるため、より高感度且
つ高精度のメバロン酸測定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一態様（ＨＰＬＣ法）と、従来のＧＣ
−ＭＳ法とのメバロン酸分析の操作手順を示すフローチ
ャートである。

【図２】本発明において好適に使用可能なカラムスイッ
チングの手法を説明するための模式図であり、２種類の
カラムにそれぞれ別個に移動相が送液する状態が示され
ている。

【図３】本発明において好適に使用可能なカラムスイッ
チングの手法を説明するための模式図であり、２種類の
カラムが直列に接続された状態が示されている。

【図４】本発明と同様の処理条件で得られたデヒドロメ
バロノラクトンのプロトンＮＭＲスペクトルを示すチャ
ートである。

【図５】メバロン酸の標準品を本発明の方法により前処
理した後、ＨＰＬＣ分析することにより得られたクロマ
トグラムを示すチャートである。

【図６】検体たる血漿（２種類）を本発明の方法により
前処理した後、ＨＰＬＣ分析することにより得られたク
ロマトグラムを示すチャートである。

【図７】検体たる尿（２種類）を本発明の方法により前
処理した後、ＨＰＬＣ分析することにより得られたクロ
マトグラムを示すチャートである。

【図８】種々の濃度のメバロン酸標準品の水溶液を前処
理、ＨＰＬＣ分析して得られたデヒドロメバロノラクト
ンのＨＰＬＣピーク高さ（μＶ）と、上記メバロン酸濃
度との関係を示す検量線のグラフである。

【図９】血漿を測定用サンプルとして用いた場合の、メ
バロン酸添加回収試験の結果を示すグラフである。

【図１０】尿を測定用サンプルとして用いた場合の、メ
バロン酸添加回収試験の結果を示すグラフである。

【図１１】本発明のＨＰＬＣ法によるメバロン酸濃度測
定値（ｎｇ／ｍｌ）と、従来のＧＣ−ＭＳ法によるメバ
ロン酸濃度測定値（ｎｇ／ｍｌ）との相関関係を示すグ
ラフである。

【符号の説明】

１…オートサンプラー、２…切り換えバルブ、３…第１
のポンプ、４…プレカラム（第１のカラム）、５…第２
のポンプ、６…メインカラム（第２のカラム）、７…検
出器。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中のメバロン酸をデヒドロメバロノ
   ラクトンに導いた後、該デヒドロメバロノラクトンを液
   体クロマトグラフィーで測定することを特徴とするメバ
   ロン酸の測定方法。
2. 【請求項２】 前記メバロン酸を、酸の存在下でラクト
   ン化、脱水することにより前記デヒドロメバロノラクト
   ンに導く請求項１記載のメバロン酸の測定方法。
3. 【請求項３】 前記酸がブレンステッド酸である請求項
   ２記載のメバロン酸の測定方法。
4. 【請求項４】 前記酸が強酸である請求項３記載のメバ
   ロン酸の測定方法。
5. 【請求項５】 前記酸が過塩素酸である請求項４記載の
   メバロン酸の測定方法。
6. 【請求項６】 前記メバロン酸を変換したメバロノラク
   トンを含む検体に対して溶媒による抽出操作を行うこと
   により、検体中の該メバロノラクトンを抽出した後、前
   記デヒドロメバロノラクトンに導く請求項１記載のメバ
   ロン酸の測定方法。
7. 【請求項７】 前記メバロン酸を変換したメバロノラク
   トンを含む検体に対して遠心分離処理を行った後、溶媒
   による抽出操作を行う請求項６記載のメバロン酸の測定
   方法。
8. 【請求項８】 前記液体クロマトグラフィーにおいて、
   紫外部における吸光度測定によりメバロン酸を検出する
   請求項１記載のメバロン酸の測定方法。
9. 【請求項９】 前記紫外部における吸光度測定におい
   て、測定波長として２１５ｎｍ以上の波長を用いる請求
   項８記載のメバロン酸の測定方法。
10. 【請求項１０】 前記液体クロマトグラフィーにおいて
    第１および第２のカラムを含む複数のカラムを用い、該
    第１のカラムからのデヒドロメバロノラクトンを含む分
    画の溶出に対応させて、該第１のカラムの下流側に第２
    のカラムを直列に接続する請求項１記載のメバロン酸の
    測定方法。
11. 【請求項１１】 前記デヒドロメバロノラクトンを含む
    分画の第１のカラムから第２のカラムへの移動が終了し
    た後、該第２のカラムを第１のカラムから切り放し、第
    １および第２のカラムにそれぞれ別個に移動相を流す請
    求項１０記載のメバロン酸の測定方法。
12. 【請求項１２】 前記液体クロマトグラフィーにおいて
    第１および第２の移動相を含む複数の移動相を用い、前
    記第１のカラムに第１の移動相を流し、前記第２のカラ
    ムに第２の移動相を流す請求項１０記載のメバロン酸の
    測定方法。
13. 【請求項１３】 前記デヒドロメバロノラクトンを含む
    分画が第１のカラムから溶出している際にのみ、直列に
    接続した前記第１および第２のカラムに第１の移動相を
    流す請求項１２記載のメバロン酸の測定方法。