JPH07163355A

JPH07163355A - ホスホマイシン生合成関連遺伝子及びそれらを含む遺伝子クラスター

Info

Publication number: JPH07163355A
Application number: JP28297393A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Imai; 敏今井; Tomomi Hidaka; 智美日高; Masahisa Aida; 昌央合田; Tomohisa Katsurayama; 智久葛山; Naomi Takei; なおみ武居; Haruo Seto; 治男瀬戸
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1995-06-27

Abstract

(57)【要約】【目的】ホスホマイシン生合成関連遺伝子を特定し、そ
れを含む遺伝子クラスターを採取する。【構成】ホスホマイシン生産菌であるストレプトマイセ
ス・ベデモレンシスATCC21239株よりホスホマイシン生
合成関連遺伝子を含む遺伝子クラスターをクローニング
した。遺伝子クラスターに存在するホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子とホスホノピ
ルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基
配列を決定した。【効果】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ及
びホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼは多くのＣ−
Ｐ化合物の生合成に共通した酵素であり、本発明で得た
生合成関連遺伝子の発現制御研究により、ホスホマイシ
ンやビアラホス等のＣ−Ｐ結合を有する産業上有用な抗
生物質またはその中間体の生産性向上に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗生物質ホスホマイシン
の生合成の初期段階に関与する２種の酵素、すなわちホ
スホエノールピルビン酸ホスホムターゼとホスホノピル
ビン酸デカルボキシラーゼを各々コードする２種の遺伝
子に関するものである。またこれら２種の遺伝子を含み
かつ他のホスホマイシン生合成関連遺伝子を含む遺伝子
クラスター及び遺伝子クラスターを含むプラスミドで形
質転換された微生物に関するものである。

【０００２】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
はホスホマイシンやビアラホス等のＣ−Ｐ結合を有する
抗生物質の生合成経路の第一段階に関与する酵素で、基
質となるホスホエノールピルビン酸が抗生物質等の二次
代謝物の生産とＴＣＡサイクル等の一次代謝の分岐点に
位置する物質であるため、ホスホエノールピルビン酸ホ
スホムターゼはホスホマイシン等の二次代謝物生産上重
要な酵素である。またホスホノピルビン酸デカルボキシ
ラーゼはホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼの作
用で生成したホスホノピルビン酸を脱炭酸することによ
りホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼの平衡をホ
スホマイシン等の二次代謝物の生産方向に向ける働きを
持つと推定される重要な酵素である。したがってホスホ
エノールピルビン酸ホスホムターゼとホスホノピルビン
酸デカルボキシラーゼの活性を制御・促進する事はホス
ホマイシンやビアラホス等のＣ−Ｐ結合を有する産業上
有用な抗生物質またはその中間体の生産性を向上させる
に有用である。

【０００３】ホスホマイシンは、低分子の化合物で生合
成のステップも少ない事から、本発明で提供されるホス
ホエノールピルビン酸ホスホムターゼをコードする遺伝
子、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼをコードす
る遺伝子、及びそれらホスホマイシン生合成関連遺伝子
を含む遺伝子クラスターを用いたホスホマイシン生合成
関連酵素活性の発現制御研究ひいてはホスホマイシンの
生産性向上研究に役立てる事が可能である。また、Ｃ−
Ｐ化合物の生合成の初期反応は共通である事が知られて
おり、ビアラホス等の他の産業上有用なＣ−Ｐ化合物の
生産性向上研究に役立てる事も可能である。

【０００４】

【従来の技術】ホスホマイシンは放線菌ストレプトマイ
セス・フラジエ(Streptomyces fradiae)やストレプトマ
イセス・ベデモレンシス(Streptomyces wedmorensis)の
培養液から発見された抗生物質で、ユニークな作用機作
を持ち他の抗生物質との交差耐性が無いことから各種感
染症に広く用いられている。またホスホマイシンは天然
物としては極めて稀な炭素とリンが直接結合したＣ−Ｐ
結合を有するため、ホスホマイシンがどのように生産さ
れるかという、いわゆる生合成研究が本発明者らにより
詳細に進められてきた。(S.Imai et al.: Agric.Biol.C
hem., 49, 873(1985), H.Seto et al.: J.Antibiotic
s, 44, 1286(1991), T.Hidaka et al.: J.Antibiotic
s,45, 1008(1992))

【０００５】またＣ−Ｐ結合を有する化合物としてホス
ホマイシンの他に放線菌ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス(Streptomyces hygroscopicus)が生産する除
草剤であるビアラホスがあり、その生合成についても本
発明者らによって詳細に研究されている。(T.Hidaka et
al.: Actinomycetol., 5, 112(1991)) これら生合成
研究の結果、ビアラホスの生合成経路においても初期段
階の反応はホスホマイシンと同様、ホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼの作用でホスホエノールピルビン
酸から分子内転位によってホスホノピルビン酸が生じ、
続いてホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼの作用で
ホスホノピルビン酸の脱炭酸反応がおこる事が明らかと
なっている。

【０００６】ビアラホス生産菌であるストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカスのホスホエノールピルビン酸ホ
スホムターゼ遺伝子については既に本発明者らによって
塩基配列が決定されている。（特開平5-130865）また
Ｃ−Ｐ結合を有する化合物として最初に天然から発見さ
れた２−アミノエチルホスホン酸を生産するテトラヒメ
ナのホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子に
ついても、その塩基配列が決定されており両者にかなり
のホモロジーのある事が報告されている。(T.Hidaka et
al.: J.Antibiotics,45, 1997(1992), H.M.Seidel et
al.: Biochemistry, 31, 2598(1992))

【０００７】ホスホマイシン生産菌については、本発明
者らによってホスホマイシン生合成変異株の生産性回復
を指標にしてクローニングした遺伝子上にホスホエノー
ルピルビン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子とホス
ホノピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子
が存在する事が報告されているが（日本農芸化学会1993
年度大会（仙台）講演番号3Ka3）、それら遺伝子の塩基
配列は決定されていなかった。

【０００８】また、ホスホマイシンはホスホエノールピ
ルビン酸から少なくとも４つのステップによって生合成
されると推定されているが、ホスホエノールピルビン酸
ホスホムターゼの関与するステップ１の遺伝子とホスホ
ノピルビン酸デカルボキシラーゼの関与するステップ２
の遺伝子以外のステップ３及びステップ４に関与する遺
伝子やホスホマイシン生合成制御に関する遺伝子につい
ては現在まで報告されていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題の一つは、Ｃ−Ｐ化合物の生産に極めて重要な
酵素であるホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ及
びホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼを各々コード
する２種の遺伝子の塩基配列を決定し、当該酵素活性を
人為的に制御するための基礎知見を得ることである。ま
た二つ目の課題は、これら２種の酵素遺伝子に加え別の
ホスホマイシン生合成関連遺伝子も含む遺伝子クラスタ
ーをクローニングし、ホスホマイシン生合成関連遺伝子
全体の制御のための基礎知見を得てホスホマイシン生産
性向上研究に役立てる事である。

【００１０】

【問題点を解決するための手段】ホスホエノールピルビ
ン酸ホスホムターゼとホスホノピルビン酸デカルボキシ
ラーゼを各々コードする２種の遺伝子を含む遺伝子クラ
スターは、本発明者らによって既にクローニングされて
いる。すなわちホスホマイシン生産菌のＤＮＡを制限酵
素であるBamHＩで部分消化しpIJ702のBglIIサイトに挿
入したプラスミドを作成し、ステップ２のホスホノピル
ビン酸デカルボキシラーゼ欠損株であるストレプトマイ
セス・ベデモレンシスNP7株を形質転換し、ホスホマイ
シン生産能の回復を指標にして採取された。（日本農芸
化学会1993年度大会（仙台）講演番号3Ka3）

【００１１】また両酵素遺伝子について当該酵素欠損変
異株の生産性回復を指標にしたサブクローニングによっ
て両遺伝子の存在するＤＮＡ領域が限定されているが、
本発明ではさらに、この両遺伝子が存在するＤＮＡ領域
について塩基配列を決定し、オープンリーディングフレ
ームとサブクローニングの結果を合わせてホスホエノー
ルピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子をコードする遺伝子
とホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする
遺伝子の領域を特定した。

【００１２】またホスホエノールピルビン酸ホスホムタ
ーゼ遺伝子及びホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子に加え別のホスホマイシン生合成関連遺伝子も含
む遺伝子クラスターのクローニングを実施した。両遺伝
子以外のホスホマイシン生合成関連遺伝子を採取し、そ
の存在を確認するために、次の二つの方法を用いた。一
つは、一般に放線菌の抗生物質生合成関連遺伝子はクラ
スターをなしているので長い遺伝子領域のクローニング
に適したpIJ922(John Innes研究所より入手可能。文
献：DJ.Lydiate et al.:Gene 35, 223(1985))を用い、
ステップ２のホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ欠
損株であるストレプトマイセス・ベデモレンシスNP7株
を形質転換し、ホスホマイシン生産能の回復を指標にし
て形質転換株を選別する遺伝子クローニングの方法であ
る。

【００１３】もう一つは新しい生合成変異株を採取し
て、それを利用する方法である。生合成変異株の採取で
は形質転換効率が高く取扱いの容易なストレプトマイセ
ス・ベデモレンシスNP7株を用い、NTG処理またはUV処理
後２−アミノエチルホスホン酸添加アガーピースに移植
しホスホマイシン生産能の欠損した株を選別する方法を
用い、約10000株をスクリーニングして目的とする変異
株NP15株、NP17株を採取した。

【００１４】NP15株とNP17株の特徴を明らかにするた
め、２−アミノエチルホスホン酸あるいは２−ヒドロキ
シプロピルホスホン酸の添加培養を行った。その結果、
NP17株は無添加または２−アミノエチルホスホン酸添加
ではホスホマイシン生産能が回復せず、２−ヒドロキシ
プロピルホスホン酸の添加でホスホマイシン生産能が回
復する事からステップ２の他にステップ３が欠損してい
る事が推定された。

【００１５】NP15株は無添加、２−アミノエチルホスホ
ン酸添加、２−ヒドロキシプロピルホスホン酸添加のい
ずれの場合もホスホマイシン生産能が回復しない事から
ステップ２の他にステップ４あるいは他の生産制御遺伝
子が欠損している株と推定された。変異株の特徴付けに
用いた２−アミノエチルホスホン酸はシグマ社から購入
でき、２−ヒドロキシプロピルホスホン酸は、Preisら
の方法により合成した。(S.Preis et al., J.Am.Chem.S
oc. 77, 6225(1955))

【００１６】また長い遺伝子領域を持つホスホマイシン
生合成関連遺伝子クラスターを採取するためにはBamHI
で部分消化したホスホマイシン生産菌のＤＮＡをpIJ922
中のBamHIサイトに挿入し、ストレプトマイセス・ベデ
モレンシスNP7株を形質転換した。形質転換株について
ホスホマイシン生産性を調べ、生産性の回復した形質転
換株を選別した。選別した形質転換株より採取したプラ
スミドをNP7株や、NP7株の変異処理によって得られたNP
15株、NP17株及びホスホエノールピルビン酸ホスホムタ
ーゼ欠損が確認されているビアラホス生合成変異株スト
レプトマイセス・ハイグロスコピカスNP50株（ビアラホ
ス生産菌ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスSF12
93株から採取。）に形質転換し、これら全ての変異株に
おいて変異したステップの機能を回復する遺伝子断片を
含むプラスミドpFBG23を採取する事が出来た。

【００１７】すなわちpFBG23プラスミド挿入断片ＤＮＡ
中にはホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝
子、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の
他、NP17株で欠損している生合成ステップ３に関する遺
伝子、NP15株で欠損しているステップ４または制御遺伝
子も含まれており、ホスホマイシン生合成と生産制御研
究のための重要な材料を提供する事が可能となり、本発
明を完成した。

【００１８】関連微生物の寄託ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子、ホス
ホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、NP15株およ
びNP17株で欠損している生合成関連遺伝子の全てを組み
込んだ遺伝子クラスターを含むプラスミドpFBG23は、本
発明で開示した方法によっても採取可能であるが、pFBG
23によって形質転換されたホスホマイシン生合成変異株
ストレプトマイセス・ベデモレンシスNP7/pFBG23株から
容易に採取する事が可能である。この微生物は、FERM P
-13840として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されている。また宿主であるストレプトマイセス・ベデ
モレンシスNP7株はステップ２のホスホノピルビン酸デ
カルボキシラーゼの欠損株と考えられており(T.Hidaka
et al.: J.Antibiotics,45, 1008(1992))、この微生物
はFERM P-13838として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。

【００１９】また遺伝子の供給源であるストレプトマイ
セス・ベデモレンシスATCC21239株はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC21239として寄託
されていて分譲可能な状態にある。ホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼ遺伝子の存在を確認するためにス
トレプトマイセス・ハイグロスコピカスNP50株はビアラ
ホス生産菌のホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
欠損株であり、この微生物自体はFERM P-7804（FERM-BP
-1368に移行)として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。（特開昭61-58589または特公平3-32
358公報参照）

【００２０】ホスホマイシン生合成関連遺伝子のクロー
ニングホスホマイシン生合成関連遺伝子のクローニングのため
のＤＮＡ供与体の例としては、ストレプトマイセス・ベ
デモレンシスATCC21239株及びその変異株があげられ
る。このストレプトマイセス・ベデモレンシスATCC2123
9株の染色体ＤＮＡを制限酵素BamHIで部分的に消化して
得られる本発明の約20kbの断片は

【図１】に示される制限酵素地図を与える。

【００２１】ＤＮＡ供与体であるストレプトマイセス・
ベデモレンシスATCC21239株の培養菌体より、全ＤＮＡ
を公知の方法で抽出する。抽出されたＤＮＡを制限酵素
BamHIで部分的に消化すれば、目的の遺伝子クラスター
を含むＤＮＡ断片が各種のＤＮＡ断片と共に得られる。
このようにして得られるＤＮＡ断片混合物から目的の遺
伝子クラスターを含むＤＮＡ断片を取り出し、しかもこ
れを多量に得るためには、ベクターとしての適当なウィ
ルス性または環状プラスミドへの組み込み及び生成ハイ
ブリッドプラスミドによる宿主菌への形質転換、形質導
入またはトランスフェクションを含む遺伝子組換え技術
を利用することができる。一般的な遺伝子組換え技術に
関しては、公知の方法として例えば、高木康敬著「遺伝
子操作実験法」（講談社）やホップウッドらの実験書(G
enetic Manipulation of Streptomyces, A laboratory
manual (1985))を参照することができる。

【００２２】そのような組換え技術の一例を挙げれば、
下記の通りである。すなわち、上記の供与体ＤＮＡをBa
mHIで部分的に消化する。ベクタープラスミドは別にBam
HIまたはBamHIと付着末端を同じくするBglII,BclI等の
制限酵素で切断する。これらの消化物を混合し、適当な
リガーゼたとえばＴ４リガーゼでライゲーション処理し
て、ベクタープラスミドにストレプトマイセス・ベデモ
レンシスATCC21239株のＤＮＡ断片を組み込んだキメラ
プラスミドを含むプラスミド混合物を得る。

【００２３】この場合に使用しうるベクタープラスミド
としては、BamHIの他、BglII、BclI等のBamHIと同じ付
着末端を有し、これらの制限酵素で切断されたときに増
殖可能な断片を与えるものが一般に適当である。その由
来は放線菌、大腸菌、枯草菌その他の微生物でありうる
が、具体例を挙げれば放線菌由来のものとしてpIJ702
（John Innes研究所より入手可能。文献：J.General Mi
crobiology，129, 2703-2714(1983))、及びpIJ680(John
Innes研究所より入手可能。文献：D.A.Hopwoodet al.
Genetic Manipulation of Streptomyces, A laboratory
Manual (1985))、及びpIJ922(John Innes研究所より入
手可能。文献：DJ.Lydiate et al.:Gene35, 223(1985))
等があげられる。

【００２４】宿主菌から目的プラスミドを取得するに
は、上記文献記載の技術やその他遺伝子組換えに慣用さ
れているところに従えばよい。次に、得られたプラスミ
ド混合物により宿主菌を形質転換させる。宿主菌として
は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、
枯草菌その他の微生物の中から適宜選択する事ができ
る。本発明の目的に適した宿主菌の好ましい例としては
形質転換効率がよく、形質転換によって得られた組換え
体の特徴付けが可能なストレプトマイセス・ベデモレン
シスNP7株を上げる事ができる。また同様な理由でスト
レプトマイセス・ハイグロスコピカスNP50株を使用する
事もできる。

【００２５】ストレプトマイセス・ベデモレンシスATCC
21239株のＤＮＡ断片を組み込んだベクターを宿主菌に
導入するためには、宿主菌やベクターの種類によって最
も効率のよい方法が選ばれるが、放線菌のプラスミドベ
クターを使用する場合は、宿主菌のプロトプラストを形
質転換するのが最も一般的な方法である。形質転換によ
って得られた組換え体の選別には、用いるベクターの保
有する遺伝的指標、たとえば、抗生物質耐性、ポック形
成、メラニン生産能(M.J.Bibb et al.: Molec.Gen.Gene
t.154, 155(1977), Nature 274,398(1978))等が利用で
きる。

【００２６】ホスホマイシン生合成関連遺伝子を含む遺
伝子クラスターを挿入したプラスミドは、プラスミドで
形質転換された微生物を培養し、培養菌体より公知の方
法によって単離することができる。また単離されたプラ
スミドに挿入されたホスホマイシン生合成関連遺伝子を
含む遺伝子クラスターを各種制限酵素によって切断し、
アガロースゲル電気泳動を行って各断片の大きさを分析
する事によって、制限酵素切断地図を作成する事ができ
る。さらに各断片を適当なベクターに組み込んで、スト
レプトマイセス・ベデモレンシスNP7株等に再クローニ
ングを行うことにより、遺伝子クラスター上に存在する
ホスホマイシン生合成関連遺伝子の位置関係を明らかに
し、各遺伝子の存在する範囲を限定する事が出来る。本
発明のホスホマイシン生合成関連遺伝子を含む遺伝子ク
ラスターの制限酵素切断地図が

【図１】に示す通りであることは前記したところであ
る。

【００２７】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子本発明によるホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子ＤＮＡは、後記する配列表の配列番号２の配列で
表されるアミノ酸配列をコードするホスホエノールピル
ビン酸ホスホムターゼ遺伝子またはその同効物を含んで
なるものである。ここで「ＤＮＡ」という用語は、非
環状のフラグメントとしての存在の他に、それを組み込
んだ環状体、すなわちプラスミドとしての存在を包含す
るものである。

【００２８】本発明によるホスホエノールピルビン酸ホ
スホムターゼ遺伝子ＤＮＡの典型的な配列は、後記する
配列表の配列番号１の配列中の247-1224位の978塩基対
からなるものである。タンパク質のアミノ酸配列が与え
られればそれをコードする塩基配列はいわゆる遺伝暗号
表を参照して容易に定まり、前記したアミノ酸配列をコ
ードする種々の塩基配列を適宜選択することができる。
従って、本発明による配列表の配列番号２の配列で表さ
れるアミノ酸配列をコードするホスホエノールピルビン
酸ホスホムターゼ遺伝子ＤＮＡとは、その塩基配列が前
記した配列表の配列番号１の配列中の978塩基対からな
るもの並びにその縮重異性体を包含する。ここで、「縮
重異性体」とは、縮重関係にあるコドンが使用されてい
る以外は塩基配列が同一で同一のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを意味するものとする。

【００２９】さらに本発明によるホスホエノールピルビ
ン酸ホスホムターゼ遺伝子ＤＮＡは、前記した978塩基
対の塩基配列及びその縮重異性体の他に、その「同効
物」を包含する。ここで「同効物」とは、遺伝的に等価
な改変体、すなわちいくつかの塩基の欠失、置換、付加
等がなされていても帯有遺伝情報に実質的に差のないＤ
ＮＡ、例えば前記したホスホエノールピルビン酸ホスホ
ムターゼ遺伝子ＤＮＡの同効物をコードする塩基配列、
を意味する。

【００３０】ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子本発明によるホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子ＤＮＡは、後記する配列表の配列番号３の配列で表
されるアミノ酸配列をコードするホスホノピルビン酸デ
カルボキシラーゼ遺伝子またはその同効物を含んでなる
ものである。

【００３１】ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子ＤＮＡの典型的な配列は、後記する配列表の配列番
号１の配列中の1353-2375位の1023塩基対からなるもの
である。ここで配列表の配列番号３の配列で表されるア
ミノ酸配列をコードするホスホノピルビン酸デカルボキ
シラーゼ遺伝子ＤＮＡとは、その塩基配列が前記した配
列表の配列番号１の配列中の1023塩基対からなるもの並
びにその縮重異性体を包含する。さらに本発明による
ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子ＤＮＡ
は、前記した1023塩基対の塩基配列及びその縮重異性体
の他に、その「同効物」を包含する。

【００３２】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子の取得本発明によるホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子ＤＮＡは、その塩基配列が定まっていることか
ら、その遺伝子ＤＮＡを取得するひとつの手段は、核酸
合成の方法に従って製造することである。本発明による
ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子は、ま
た、ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼの生産能
を持つ菌株（例えばストレプトマイセス・ベデモレンシ
スATCC21239株またはその変異株）の遺伝子から切り出
す方法で得る事も可能であって、この方法による方が好
ましい。この方法による当該遺伝子の取得は、遺伝子工
学の分野で慣用されている方法により行うことができ
る。最も効率的なのは、既にクローン化されているホス
ホエノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子を含む遺伝
子クラスターを挿入したプラスミドからサブクローニン
グによって遺伝子を選別する方法であり、本発明で開示
したpFBG23を用いる事ができる。

【００３３】サブクローニングした遺伝子中にホスホエ
ノールピルビン酸ホスホムターゼ遺伝子が含まれている
事を確認する方法として形質転換株のホスホエノールピ
ルビン酸ホスホムターゼの活性を測定する事も可能であ
るが、簡便な方法としてホスホエノールピルビン酸ホス
ホムターゼを欠損していることが確認されているビアラ
ホスの生合成変異株ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカスNP50株を形質転換してビアラホス生産能の回復を
見る方法が用いられる。これらの方法の詳細は、本発明
者らによって特開平5-130865に記載されている。その
他、一般的な遺伝子操作技術、例えばホップウッドらの
実験書(Genetic Manipulation of Streptomyces, A lab
oratory manual (1985))を参照することができる。

【００３４】ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子の取得本発明によるホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子ＤＮＡは、その塩基配列が定まっていることから、
その遺伝子を取得するひとつの手段は、核酸合成の方法
に従って製造することである。

【００３５】本発明によるホスホノピルビン酸デカルボ
キシラーゼ遺伝子は、また、ホスホノピルビン酸デカル
ボキシラーゼの生産能を持つ菌株（例えばストレプトマ
イセス・ベデモレンシスATCC21239株またはその変異
株）の遺伝子から切り出す方法で得る事も可能であっ
て、この方法による方が好ましい。この方法による当該
遺伝子の取得は、遺伝子工学の分野で慣用されている方
法により行うことができる。

【００３６】最も効率的なのは、既にクローン化されて
いるホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含
む遺伝子クラスターを挿入したプラスミドからサブクロ
ーニングによって遺伝子を選別する方法であり、本発明
で開示したpFBG23を用いる事ができる。サブクローニン
グした遺伝子中にホスホノピルビン酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子が含まれている事を確認する簡便な方法は、ホ
スホノピルビン酸デカルボキシラーゼを欠損しているこ
とが確認されているホスホマイシン生合成変異株ストレ
プトマイセス・ベデモレンシスNP7株を形質転換してホ
スホマイシン生産能の回復を見る方法である。詳細につ
いては以下の実施例の中で述べる。

【００３７】

【実施例１】ホスホマイシン生合成関連遺伝子クラスターを含むプラ
スミドpFBG23の採取ストレプトマイセス・ベデモレンシスATCC21239株をGPY
培地(グルコース1.0%、ポリペプトン0.5%、イーストエ
キストラクト0.4%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、K₂HPO₄ 0.1%)10m
lに植菌し、30℃で24時間培養した。これを種菌として1
00mlの同培地を分注した坂口フラスコにて30℃で24時間
振盪培養した後、10000g、10分間の遠心分離で集菌し
た。この菌体から公知の方法で全ＤＮＡを抽出精製して
供与体ＤＮＡとした。

【００３８】このようにして得た供与体ＤＮＡ10μg
を、総量100μlの10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 10
mM MgCl₂, 1mM ジチオスレイトール組成の反応液中で制
限酵素BamHI 0.4単位を加えて、30℃で15分間反応さ
せ、反応後アガロースゲル電気泳動にかけ、泳動後23kb
ー9.4kbに相当するＤＮＡをアガロースゲルから切り出し
ライゲーション用ＤＮＡとした。プラスミドpIJ922ＤＮ
Ａ１μgを総量100μlの10mMTris-HCl pH7.5, 50mM NaC
l, 10mM MgCl₂, 1mM ジチオスレイトール組成の反応液
中で制限酵素BamHI 10単位を加えて、30℃で2時間反応
させ加熱によって酵素を失活後、アルカリホスファター
ゼ(bacterial alkaline phosphatase,Takara製)によっ
て脱リン酸化を行った。供与体ＤＮＡとプラスミドＤＮ
Ａを合併し、70℃で10分間加熱処理し、ついで室温まで
徐冷し、ライゲーションキット（Takara製）を用いて15
℃で一晩反応させて、pIJ922とストレプトマイセス・ベ
デモレンシスATCC21239株ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
調製した。

【００３９】このＤＮＡによる宿主菌ストレプトマイセ
ス・ベデモレンシスNP7株の形質転換は、Bibb等の公知
の方法(M.J.Bibb et al., Nature274, 398(1978))を改
変した方法により行った。すなわち、グリシン濃度を0.
5%とした100mlのGPY培地(グルコース1.0%、ポリペプト
ン0.5%、イーストエキストラクト0.4%、MgSO₄・7H₂O 0.0
5%、K₂HPO₄0.1%)を分注した坂口フラスコにストレプト
マイセス・ベデモレンシスNP7株を接種して30℃で24時
間振盪培養を行い、10000gの遠心分離で菌糸を集めて0.3
5Mのショ糖溶液で１回洗浄した後、リゾチーム（生化学
工業製）(1mg/ml)を含む20mlのＰ培地(12%ショ糖、1.4m
M K₂SO₄, 10mM MgCl₂, 0.4mM KH₂PO₄, 25mM CaCl₂, 25m
M TES緩衝液(pH7.2), 1/500量微量元素溶液）に懸濁さ
せた。（微量元素溶液の組成（１リットル中：40mg ZnC
l₂, 200mg FeCl₃・6H₂O, 10mg CuCl₂・2H₂O, 10mg MnCl₂・
4H₂O, 10mg Na₂B₄O₇・10H₂O, 10mg (NH4)₆Mo₇O₂₄・4H₂O))

【００４０】30℃に30分間保温してプロトプラストを形
成させ、プロトプラスト化しなかった菌糸は綿濾過で除
去した。遠心分離によってプロトプラストを集め、Ｐ培
地で１回洗浄してから1mlのＰ培地に懸濁した。プロト
プラスト溶液100μlにＤＮＡ溶液10μlを加えた後、た
だちにポリエチレングリコール♯1000 25%を含むＰ培地
500μlを加え、ピペッティングしてＤＮＡを取り込ませ
た。数分放置後5mlのＰ培地を加えて反応を終了させ、
遠心分離によってプロトプラストを集め、0.6%の寒天を
含むR2YE培地10mlに懸濁し、この2mlずつをR2YE培地に
広げた。(0.3Mショ糖、1.4mM K₂SO₄, 50mM MgCl₂, 1%グ
ルコース、0.01% カザミノ酸, 1/50量微量元素溶液、0.
4mM KH₂PO₄, 20mM CaCl₂, 0.3%プロリン、25mM TES緩衝
液(pH7.2)、0.5%イーストエキストラクト、2.2%寒天)
30℃で6時間培養後、チオストレプトン溶液(200μg/ml)
１mlを重層し、さらに３日間培養して形質転換株を得
た。

【００４１】形質転換株をホスホマイシン生産確認用に
作成したアガーピース培地（スターチ0.4%、サングレイ
ン0.5%、小麦胚芽0.2%、K₂HPO₄0.01%、CoCl₂・6H₂O 0.0
001%、寒天2.2%)に植菌し5日間27℃で培養後、ホスホマ
イシン生産能の回復をプロテウス・ブルガリスに対する
阻止円の有無で判定した。ホスホマイシン生産能の回復
した形質転換株を培養して、培養菌体から公知の方法で
プラスミドを抽出した。このプラスミドにより再びスト
レプトマイセス・ベデモレンシスNP7株を形質転換させ
ホスホマイシン生産能を再確認した。ホスホマイシン生
産能が確認された形質転換株よりプラスミドを採取し、
各種制限酵素で切断して詳しく調べたところ、約20Kbの
ＤＮＡ断片がpIJ922に組み込まれたプラスミドpFBG23が
採取された。pFBG23に挿入されたホスホマイシン生合成
関連遺伝子を含む遺伝子クラスターの制限酵素地図を

【図１】に示す。

【００４２】

【実施例２】ホスホマイシン生合成変異株の採取ホスホマイシン生合成の欠損変異株を採取するために変
異処理を行った。変異処理に用いる菌株としては形質転
換効率がよく、かつ欠損点がステップ２のホスホノピル
ビン酸デカルボキシラーゼ関与反応である事が明かなス
トレプトマイセス・ベデモレンシスNP7株をプロトプラ
スト化して用いた。すなわちNP7株をグリシン濃度を0.5
%とした100mlのGPY培地(グルコース1.0%、ポリペプトン
0.5%、イーストエキストラクト0.4%、MgSO₄・7H₂O 0.05
%、K₂HPO₄0.1%)を分注した坂口フラスコに接種し30℃
で24時間振盪培養を行い、10000gの遠心分離で菌糸を集
めて0.35Mのショ糖溶液で１回洗浄した後、リゾチーム
（生化学工業製）(1mg/ml)を含む20mlのＰ培地(12%ショ
糖、1.4mM K₂SO₄, 10mM MgCl₂, 0.4mM KH₂PO₄, 25mM Ca
Cl ₂, 25mM TES緩衝液(pH7.2), 1/500量微量元素溶液）
に懸濁させた。（微量元素溶液の組成（１リットル中：
40mg ZnCl₂, 200mg FeCl₃・6H₂O, 10mg CuCl₂・2H₂O,10mg
MnCl₂・4H₂O, 10mg Na₂B₄O₇・10H₂O, 10mg (NH4)₆Mo₇O₂₄
・4H₂O))

【００４３】30℃に30分間保温してプロトプラストを形
成させ、プロトプラスト化しなかった菌糸は綿濾過で除
去した。遠心分離によってプロトプラストを集め、Ｐ培
地で１回洗浄してから1mlのＰ培地に懸濁した。プロト
プラストのNTG処理ではショ糖濃度0.35Mの50mMトリスマ
レイン酸緩衝液（pH9.0）を用いた。変異処理したもの
を経時的にサンプリングして、R2YE培地(0.3M ショ糖、
1.4mM K₂SO₄, 50mM MgCl ₂, 1%グルコース、0.01% カザ
ミノ酸, 1/50量微量元素溶液、0.4mM KH₂PO₄, 20mM CaC
l₂, 0.3%プロリン、25mM TES緩衝液(pH7.2)、 0.5% イー
ストエキストラクト、2.2%寒天)を用いてプロトプラス
トの再生を行った。生育コロニーをホスホマイシン生合
成中間体を添加したアガーピース培地（スターチ0.4%、
サングレイン0.5%、小麦胚芽0.2%、K₂HPO₄0.01%、CoCl
₂・6H₂O 0.0001%、寒天2.2%)に植菌し5日間27℃で培養
後、ホスホマイシン生産能の回復をプロテウス・ブルガ
リスに対する阻止円の有無で判定して、変異株のタイプ
分けを行った。

【００４４】NP7株はステップ２の欠損株であるため生
合成中間体無添加ではホスホマイシンを生産せず、２−
アミノエチルホスホン酸（ホスホマイシン生合成経路で
はホスホノアセトアルデヒドと等価）、２−ヒドロキシ
プロピルホスホン酸添加によってホスホマイシン生産能
を回復する。NTG変異処理によって２種の変異株NP17株
とNP15株が採取できた。NP17株は無添加、２−アミノエ
チルホスホン酸添加ではホスホマイシン生産能が回復せ
ず、２−ヒドロキシプロピルホスホン酸の添加でホスホ
マイシン生産能が回復する事からステップ２の他ステッ
プ３が欠損している事が推定された。またNP15株は無添
加、２−アミノエチルホスホン酸添加、２−ヒドロキシ
プロピルホスホン酸添加のいずれの場合もホスホマイシ
ン生産能が回復しない事からステップ２の他にステップ
４あるいは他の生産制御遺伝子が欠損している株と推定
された。ホスホマイシンの推定生合成経路と各変異株の
特徴を

【図２】の中で示した。

【００４５】

【実施例３】サブクローニングによる遺伝子クラスター上のホスホマ
イシン生合成関連遺伝子の位置の確認プラスミドpFBG23に挿入されたホスホマイシン生合成関
連遺伝子を含む遺伝子クラスター上のホスホマイシン生
合成関連遺伝子の位置関係を明らかにするためにサブク
ローニングを行った。サブクローニングの方法は実施例
１に示した方法の他、放線菌の遺伝子操作技術として公
知の方法を用いる事が出来、例えば文献としてD.A.Hopw
ood et al. Genetic Manipulation of Streptomyces, A
laboratory Manual (1985)が上げられる。サブクロー
ニングによって得られた遺伝子断片がどのホスホマイシ
ン生合成関連遺伝子を含むかは、遺伝子断片を含むプラ
スミドを形質転換し形質転換体の形質を確認することに
よって行った。

【００４６】ステップ２については実施例１に述べたス
トレプトマイセス・ベデモレンシスNP7株を形質転換し
てホスホマイシン生産能の回復で調べた。ステップ３及
びステップ４（あるいは制御遺伝子）の確認は実施例２
で採取したNP17株、NP15株を宿主に用いて解析した。ま
たステップ１についてはビアラホスの生合成変異株であ
るストレプトマイセス・ハイグロスコピカスNP50株を宿
主として用い、形質導入株のビアラホス生産能の回復を
指標とした。ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
NP50株の形質転換の方法及びビアラホス生産能の確認方
法については、本発明者らによって公開されている。
（特開平5-130865）

【００４７】すなわちストレプトマイセス・ハイグロス
コピカスNP50株をグリシン濃度を2.0%とした100mlのGPY
培地(グルコース1.0%、ポリペプトン0.5%、イーストエ
キストラクト0.4%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、K₂HPO₄0.1%)を
分注した坂口フラスコに接種し30℃で20時間振盪培養を
行い、10000gの遠心分離で菌糸を集めて0.5Mのショ糖溶
液で１回洗浄した後、リゾチーム（生化学工業製）(1mg
/ml)とアクロモペプチダーゼ（和光純薬製）(0.5mg/ml)
を含む20mlのPs培地(70mM NaCl、0.5Mショ糖、5mM MgCl
₂、5mM CaCl₂、25mM TES緩衝液(pH7.2))に懸濁させ、30
℃で30分間保温してプロトプラストを形成させ、プロト
プラスト化しなかった菌糸は綿濾過で除去した。遠心分
離によってプロトプラストを集め、Ｐ培地で１回洗浄し
てから1mlのＰ培地に懸濁した。

【００４８】プロトプラスト溶液100μlにプラスミドＤ
ＮＡ溶液20μlを加えた後、１分間室温に放置した。さ
らにPs培地５mlで希釈し、遠心分離でプロトプラストを
集め、２mlのPs培地に懸濁させた。このプロトプラスト
液をＲＭＥ寒天培地(無菌濾過したＲＭＥベース(34.8%
ショ糖、3% KCl、2%グルコース、0.05% K₂SO₄、0.4%プ
ロリン、0.4%カザミノ酸、0.4%イーストエキストラク
ト、0.2% lab lemco powder、0.01% デキストランサル
フェイト、pH7.0)500mlに別殺菌した0.5% KH₂PO₄10ml、
5M CaCl₂10ml、12%コーンスチープリィカー (pH7.0) 2
5ml、10%アスパラギン酸ナトリウム 10mlを加え、さら
に別殺菌した2%寒天450mlを加える)にそれぞれ塗布した
後、ＲＭＥ寒天培地の寒天濃度が0.5%のものをその上層
に2ml重層した。

【００４９】28℃で１日培養した後、チオストレプトン
20μg/mlを含むＮＥ培地（1%グルコース、0.2%イースト
エキストラクト、0.2%カザミノ酸、0.1% lab lemco pow
der、1.5%寒天、pH7.0)を重層しさらに５日間培養し、
形質転換株を得た。形質転換株をビアラホス生産確認用
に作成したアガーピース培地（グルコース0.7%、サング
レイン0.25%、小麦胚芽0.39%、KH₂PO₄0.01%、CoCl₂・6H
₂O 0.0001%、寒天2.2%)に植菌し5日間27℃で培養後、ビ
アラホス生産能の回復をバチルス・ズブチリスに対する
阻止円の有無で判定した。サブクローニング実験で得ら
れたホスホマイシン生合成関連遺伝子を含む遺伝子クラ
スター上のホスホマイシン生合成関連遺伝子の位置関係
を

【図１】中に示した。

【００５０】

【実施例４】塩基配列の決定プラスミドpFBG23よりpIJ702を用いてサブクローニング
して得られたプラスミドＤＮＡから約580bpのSacI断
片、約2200bpのSacI- BamHI断片をPUC118,119を用いて
両向きに組み込んだ。これらのプラスミドから制限酵素
部位を利用した欠失プラスミド及びkilo-Sequence用Del
etion Kit（宝酒造社製）を用いた欠失プラスミドを調
製した。これら欠失プラスミドで形質転換した大腸菌
（JM109）をLB培地（Bacto trypton 1%, Bacto yeast e
xtract 0.5%, NaCl 0,5% pH 7.0）で前培養後、2XYT培
地（Bacto trypton 1.6%, Bacto yeast extract 1.0%,
NaCl 0,5% pH 7.0）に植え継ぎ、37℃、1時間培養後、
ファージM13KO7を加えて更に7〜8時間培養した。培養上
清より１本鎖ＤＮＡを調製し、塩基配列の決定に用い
た。

【００５１】塩基配列の決定はApplied Biosystems社の
Taq Dye Primer Cycle Sequencingキット及びＤＮＡシ
ーケンサーABI 373Aを用いて行った。その結果、2791ベ
ースの塩基配列が決定された。決定された塩基配列は後
記する配列表の配列番号１の配列に示される通りであ
る。また塩基配列を決定した領域を

【図１】の制限酵素地図中に示した。

【００５２】決定された塩基配列をもとにオープンリー
デイングフレーム（ＯＲＦ）を調べた。Bibbらの報告(G
ene,30, 157(1984))に従って検討した結果、配列表の配
列番号１の配列に２つのＯＲＦを見い出した。既に本発
明者等によって明らかにされているサブクローニングの
結果から

【図１】で左側のＯＲＦをホスホエノールピルビン酸ホ
スホムターゼをコードする遺伝子、右側のＯＲＦをホス
ホノピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子
と決定した。ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
をコードする遺伝子は配列表の247番目のGTGから始まり
1225番目のTGAで終わる。

【００５３】その塩基配列に相当するアミノ酸配列も決
定された。その配列は配列表の配列番号１の配列中の24
7-1224位に対応するアミノ酸配列として示されており、
また、同一のアミノ酸配列は配列番号２の配列として示
されている。既に本発明者等によって塩基配列が明らか
にされているビアラホス生産菌ストレプトマイセス・ハ
イグロスコピカスのホスホエノールピルビン酸ホスホム
ターゼ遺伝子やテトラヒメナのホスホエノールピルビン
酸ホスホムターゼ遺伝子と比較するとかなりの相同性が
あることが確認された。またホスホノピルビン酸デカル
ボキシラーゼをコードする遺伝子は配列表の1353番目の
GTGから始まり2376番目のTGAで終わる。その塩基配列に
相当するアミノ酸配列も決定された。その配列は配列表
の配列番号１の配列中の1353-2375位に対応するアミノ
酸配列として示されており、また、同一のアミノ酸配列
は配列番号３の配列として示されている。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：2791 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ストレプトマイセス・ベデモレンシス（Strept
omyces wedmorensis）株名：ATCC21239株配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：247..1224 1353..2375 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GAGCTCGGCG ACATCACCAT CGGTCTGCTG ACCGATGACC GCGATCGCCA GTTACAAGCG 60 CCTGCCGCAC ATGACGTACG AGCAGCGCAA GGCGGTCGTC GAGAACCTCA AGGGCGTCGC 120 CTCCGTGGTG CCCCAGCGGA CCCTCGACTA CGCCGAGAAC CTCCGCACCG TCCGCCCCGA 180 CTTCGTCGTC CACGGCGACG ACTGGCAGAC GGGCGTGCAG CGCACACCCG CGAGCGGGTC 240 ATCGAG GTG CTG TCG GAG TGG GGC GGG AAG CTC GTC GAG ATC CCG TAC 288 Val Leu Ser Glu Trp Gly Gly Lys Leu Val Glu Ile Pro Tyr 1 5 10 ACG CCG GGC ATC TCC TCG ACC CGC CTC CAC TCG TCG GTC AAG GAG GTC 336 Thr Pro Gly Ile Ser Ser Thr Arg Leu His Ser Ser Val Lys Glu Val 15 20 25 30 GGC ACC ACG CCC AAC GTC CGG CTC TCC CGG CTC CGC CGG CTG CTC GAC 384 Gly Thr Thr Pro Asn Val Arg Leu Ser Arg Leu Arg Arg Leu Leu Asp 35 40 45 AGC AAG GAC ATC GTC CGC ATC CTC GAG GTG CAC AAC GGC TTG ACG GGC 432 Ser Lys Asp Ile Val Arg Ile Leu Glu Val His Asn Gly Leu Thr Gly 50 55 60 CTG ATC ATC GAG AAC TCC AAG GTC ACG GTG GAC AAC CAG GCC CGC GAG 480 Leu Ile Ile Glu Asn Ser Lys Val Thr Val Asp Asn Gln Ala Arg Glu 65 70 75 TTC GAC GGC ATG TGG TCC TCC TCC CTC ACC GAC TCC CTC GCC CGG GGC 528 Phe Asp Gly Met Trp Ser Ser Ser Leu Thr Asp Ser Leu Ala Arg Gly 80 85 90 AAG CCG GAC ACC GAG GCC GTC GAC GTC TCG TCC CGG CTG CAG ATG GTG 576 Lys Pro Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Ser Ser Arg Leu Gln Met Val 95 100 105 110 AAC GAG CTC TTC GAG GTC ACC ACC AAG CCG CTG GTC TTC GAC GGC GAC 624 Asn Glu Leu Phe Glu Val Thr Thr Lys Pro Leu Val Phe Asp Gly Asp 115 120 125 ACG GGC GGC AAG CCC GAG CAC TTC GGC TTC ACG GTG CGC TCC CTG GAG 672 Thr Gly Gly Lys Pro Glu His Phe Gly Phe Thr Val Arg Ser Leu Glu 130 135 140 CGG CTC GGC GTC TCC GCC GTC ATC GTC GAG GAC AAG GAG GGA CTC AAG 720 Arg Leu Gly Val Ser Ala Val Ile Val Glu Asp Lys Glu Gly Leu Lys 145 150 155 CGC AAC TCC CTC TTC GGG ACG GAC GTT CCG CAG ACC CAG TCC AGC GTC 768 Arg Asn Ser Leu Phe Gly Thr Asp Val Pro Gln Thr Gln Ser Ser Val 160 165 170 GAG GAC TTC AGC GAG CGC ATC CGG ATC GGC AAG CGC GCC CAG ATC ACC 816 Glu Asp Phe Ser Glu Arg Ile Arg Ile Gly Lys Arg Ala Gln Ile Thr 175 180 185 190 GAC GAC TTC ATG GTC ATC GCG CGC ATC GAG AGC CTC ATC CTG GAG AAG 864 Asp Asp Phe Met Val Ile Ala Arg Ile Glu Ser Leu Ile Leu Glu Lys 195 200 205 GGC ATG GCG GAC GCC GTG CAC CGC GCG GAG GCG TAC GTC GAC GCC GGC 912 Gly Met Ala Asp Ala Val His Arg Ala Glu Ala Tyr Val Asp Ala Gly 210 215 220 GCC GAC GGC ATC ATG ATC CAC AGC CGC CAG TCG GAC CCC GCG GAG ATC 960 Ala Asp Gly Ile Met Ile His Ser Arg Gln Ser Asp Pro Ala Glu Ile 225 230 235 TTC GAG TTC TGC CGC TAC TTC GAC AAG CTG CCC CGC CGC GTG CCC CTG 1008 Phe Glu Phe Cys Arg Tyr Phe Asp Lys Leu Pro Arg Arg Val Pro Leu 240 245 250 GTG GTC GTC CCG ACC AGC TAC AGC AGC GTC CGC GAG TCC GAA CTC GCC 1056 Val Val Val Pro Thr Ser Tyr Ser Ser Val Arg Glu Ser Glu Leu Ala 255 260 265 270 GAC GCC GGC GTC AAC ATG GTG ATC TAC GCG AAT CAC CTC ATG CGC GCC 1104 Asp Ala Gly Val Asn Met Val Ile Tyr Ala Asn His Leu Met Arg Ala 275 280 285 GTC TAC CCG CAG GTG ACC AAG GTC GTC CAG TCG ATC CTG CAG CAC GGC 1152 Val Tyr Pro Gln Val Thr Lys Val Val Gln Ser Ile Leu Gln His Gly 290 295 300 CGC GCC CAC GAG GCC GAG TCC ATG CTG GCC TCG ATC AAG GAC GCC CTG 1200 Arg Ala His Glu Ala Glu Ser Met Leu Ala Ser Ile Lys Asp Ala Leu 305 310 315 TCG ATC ATC CCG GAG AAC GCC GGA TGATCC GGCCCGACGT CCTCGCGGGA CACCTGGCGG Ser Ile Ile Pro Glu Asn Ala Gly *** 1260 320 325 326 CCGAAGGCGT CTCCCTGTAC TGCGGCGTTC CGGACAGCCT GCTCAAGGAG TTCAACGCGT 1320 ACGTCGGCGA CGGCGCGTCC GGCGTCGACC AC GTG ATC GCC GCG AAC GAG 1370 Val Ile Ala Ala Asn Glu 1 5 GGG AAC GCC GTC GGC CTG GCC GTC GGC CAC TAC CTG CGC ACG GGC AGC 1418 Gly Asn Ala Val Gly Leu Ala Val Gly His Tyr Leu Arg Thr Gly Ser 10 15 20 CCC GCC GTC GTC TAC CTG CAG AAC TCC GGC ATC GGC AAC GCG GTG AAC 1466 Pro Ala Val Val Tyr Leu Gln Asn Ser Gly Ile Gly Asn Ala Val Asn 25 30 35 CCC CTC ACC TCG CTC GCC GAC CCC GAG GTG TAC GGC ATC CCG ATG ATC 1514 Pro Leu Thr Ser Leu Ala Asp Pro Glu Val Tyr Gly Ile Pro Met Ile 40 45 50 CTG CTG ATC GGC TGG CGG GGG CAG CCG GGC GTG CCC GAC GAG CCC CAG 1562 Leu Leu Ile Gly Trp Arg Gly Gln Pro Gly Val Pro Asp Glu Pro Gln 55 60 65 70 CAC CGC AAG CAG GGG CGG ATC ATG CCG GCG CTC CTG GAC GCC CTC GAA 1610 His Arg Lys Gln Gly Arg Ile Met Pro Ala Leu Leu Asp Ala Leu Glu 75 80 85 CTT CCC TGG TCG GTG CTG CCC GCC GAC GAG GAG GAG GCC GGC GCC GCC 1658 Leu Pro Trp Ser Val Leu Pro Ala Asp Glu Glu Glu Ala Gly Ala Ala 90 95 100 GTA CGG AAG GCC GTC GCG CAC TCC GTC GCC ACC CGC ACC CCC TAC GCC 1706 Val Arg Lys Ala Val Ala His Ser Val Ala Thr Arg Thr Pro Tyr Ala 105 110 115 TTC CTC GTG GAG AAG GGG ACC TTC GCC CCG GCG GGC GTC CCC GCC GCC 1754 Phe Leu Val Glu Lys Gly Thr Phe Ala Pro Ala Gly Val Pro Ala Ala 120 125 130 GTC CCG GCC ACC GCG CCG GAG TCC GGC CCG CCC ACC CGG GAG GAG GCG 1802 Val Pro Ala Thr Ala Pro Glu Ser Gly Pro Pro Thr Arg Glu Glu Ala 135 140 145 150 CTG GGC GCG CTG ATC GCC GAG ATC GGC GGC GGC CAG GTC GTG GTC TCC 1850 Leu Gly Ala Leu Ile Ala Glu Ile Gly Gly Gly Gln Val Val Val Ser 155 160 165 ACG ACC GGC ATG CTC AGC CGT GAG CTG TAC GAG CAC CGG GTA CGG GCC 1898 Thr Thr Gly Met Leu Ser Arg Glu Leu Tyr Glu His Arg Val Arg Ala 170 175 180 GGA GCC GAG GCG GAG ATC GAC TTC CTC ACC GTC GGA GGC ATG GGG CAC 1946 Gly Ala Glu Ala Glu Ile Asp Phe Leu Thr Val Gly Gly Met Gly His 185 190 195 GCC AGC TCG ATC GCC CTG GGC ATC GCG CTC CGG GAG GAC GAG CGC GAG 1994 Ala Ser Ser Ile Ala Leu Gly Ile Ala Leu Arg Glu Asp Glu Arg Glu 200 205 210 GTC TGG TGC CTC GAC GGC GAC GGA GCG CTC CTC ATG CAC CTG GGC GCC 2042 Val Trp Cys Leu Asp Gly Asp Gly Ala Leu Leu Met His Leu Gly Ala 215 220 225 230 CTG CCC GTC ATC GCC GGG CAC GGC CCG TCC TCG TAC TTC CAC GTC GTG 2090 Leu Pro Val Ile Ala Gly His Gly Pro Ser Ser Tyr Phe His Val Val 235 240 245 TTC AAC AAC GGC GTG CAC GAC AGC GTC GGC GGC CAG CCC ACC TCC ATC 2138 Phe Asn Asn Gly Val His Asp Ser Val Gly Gly Gln Pro Thr Ser Ile 250 255 260 GAC CGG GTC GAC GTG CCC GCC CTC GCC CGG AAC TCC GGC TAC CGC CAC 2186 Asp Arg Val Asp Val Pro Ala Leu Ala Arg Asn Ser Gly Tyr Arg His 265 270 275 GCC GCC ACC CTG TCC TCC CTG GAG GAC CTG CCG GGC GAA CTG GCC CGG 2234 Ala Ala Thr Leu Ser Ser Leu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Leu Ala Arg 280 285 290 CTG CGC GAG ACC GGC GGC CCC GCG CTG CTC GAA CTG CGG GTC AGG CCC 2282 Leu Arg Glu Thr Gly Gly Pro Ala Leu Leu Glu Leu Arg Val Arg Pro 295 300 305 310 GGC AGC CGC GGC GAC CTC GGG CGA CCC GCC GTC ACC CCG GCG GAG AGC 2330 Gly Ser Arg Gly Asp Leu Gly Arg Pro Ala Val Thr Pro Ala Glu Ser 315 320 325 GGG GCC GCC GTC CTG CGC GCG CTG ACG GGG CGG GTG ACG CCG TCG TGA GT 2380 Gly Ala Ala Val Leu Arg Ala Leu Thr Gly Arg Val Thr Pro Ser *** 330 335 340 341 CCGCGCCGTC CCGTCGTCCG CTACGGCCGG GGTGCCATCG CGTCGCTGCC GCAGCTGGTG 2440 GAGGGGCTCG GCGCGACCCG GGTGCTCGTG GTGCACGGCG CCCACTCGTT CGAGGCCTCG 2500 GGCGCGTCCC GGATGATGGA GTCGTTCGGC CGCCGGACCC TGGTCCACCG CTGGCACGAC 2560 TTCTCGCCCA ACCCCGCCGT CGACGACGTG GCCCGCGGCC TCGACGCCGT CCGGGAACTG 2620 CGACCCGACG CCGTCGTCGG CGTGGGCGGC GGCAGCGCCA TGGACATGGC CAAGCTCCTC 2680 TGCGTCCTCG ACGGCGTGCC CCGTGCGGAC CTGGAGGACC GGGTCCGCAC GGGACCGGCG 2740 GCCGACACCC GGCGCATGAA GCTCGTCCTG GCACCCACCA CCTCGGGATCC 2791 BamHI

【００５５】

【配列表】配列番号：２配列の長さ：326 配列の型：アミノ酸トポロジー：配列の種類：タンパク質配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ配列 Val Leu Ser Glu Trp Gly Gly Lys Leu Val Glu Ile Pro Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Gly Ile Ser Ser Thr Arg Leu His Ser Ser Val Lys Glu Val Gly Thr 20 25 30 Thr Pro Asn Val Arg Leu Ser Arg Leu Arg Arg Leu Leu Asp Ser Lys 35 40 45 Asp Ile Val Arg Ile Leu Glu Val His Asn Gly Leu Thr Gly Leu Ile 50 55 60 Ile Glu Asn Ser Lys Val Thr Val Asp Asn Gln Ala Arg Glu Phe Asp 65 70 75 80 Gly Met Trp Ser Ser Ser Leu Thr Asp Ser Leu Ala Arg Gly Lys Pro 85 90 95 Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Ser Ser Arg Leu Gln Met Val Asn Glu 100 105 110 Leu Phe Glu Val Thr Thr Lys Pro Leu Val Phe Asp Gly Asp Thr Gly 115 120 125 Gly Lys Pro Glu His Phe Gly Phe Thr Val Arg Ser Leu Glu Arg Leu 130 135 140 Gly Val Ser Ala Val Ile Val Glu Asp Lys Glu Gly Leu Lys Arg Asn 145 150 155 160 Ser Leu Phe Gly Thr Asp Val Pro Gln Thr Gln Ser Ser Val Glu Asp 165 170 175 Phe Ser Glu Arg Ile Arg Ile Gly Lys Arg Ala Gln Ile Thr Asp Asp 180 185 190 Phe Met Val Ile Ala Arg Ile Glu Ser Leu Ile Leu Glu Lys Gly Met 195 200 205 Ala Asp Ala Val His Arg Ala Glu Ala Tyr Val Asp Ala Gly Ala Asp 210 215 220 Gly Ile Met Ile His Ser Arg Gln Ser Asp Pro Ala Glu Ile Phe Glu 225 230 235 240 Phe Cys Arg Tyr Phe Asp Lys Leu Pro Arg Arg Val Pro Leu Val Val 245 250 255 Val Pro Thr Ser Tyr Ser Ser Val Arg Glu Ser Glu Leu Ala Asp Ala 260 265 270 Gly Val Asn Met Val Ile Tyr Ala Asn His Leu Met Arg Ala Val Tyr 275 280 285 Pro Gln Val Thr Lys Val Val Gln Ser Ile Leu Gln His Gly Arg Ala # 290 295 300 His Glu Ala Glu Ser Met Leu Ala Ser Ile Lys Asp Ala Leu Ser Ile 305 310 315 320 Ile Pro Glu Asn Ala Gly 325 326

【００５６】

【配列表】

配列番号：３配列の長さ：341 配列の型：アミノ酸トポロジー：配列の種類：タンパク質配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ配列 Val Ile Ala Ala Asn Glu Gly Asn Ala Val Gly Leu Ala Val Gly His 1 5 10 15 Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Pro Ala Val Val Tyr Leu Gln Asn Ser Gly 20 25 30 Ile Gly Asn Ala Val Asn Pro Leu Thr Ser Leu Ala Asp Pro Glu Val 35 40 45 Tyr Gly Ile Pro Met Ile Leu Leu Ile Gly Trp Arg Gly Gln Pro Gly 50 55 60 Val Pro Asp Glu Pro Gln His Arg Lys Gln Gly Arg Ile Met Pro Ala 65 70 75 80 Leu Leu Asp Ala Leu Glu Leu Pro Trp Ser Val Leu Pro Ala Asp Glu 85 90 95 Glu Glu Ala Gly Ala Ala Val Arg Lys Ala Val Ala His Ser Val Ala 100 105 110 Thr Arg Thr Pro Tyr Ala Phe Leu Val Glu Lys Gly Thr Phe Ala Pro 115 120 125 Ala Gly Val Pro Ala Ala Val Pro Ala Thr Ala Pro Glu Ser Gly Pro 130 135 140 Pro Thr Arg Glu Glu Ala Leu Gly Ala Leu Ile Ala Glu Ile Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gln Val Val Val Ser Thr Thr Gly Met Leu Ser Arg Glu Leu Tyr 165 170 175 Glu His Arg Val Arg Ala Gly Ala Glu Ala Glu Ile Asp Phe Leu Thr 180 185 190 Val Gly Gly Met Gly His Ala Ser Ser Ile Ala Leu Gly Ile Ala Leu 195 200 205 Arg Glu Asp Glu Arg Glu Val Trp Cys Leu Asp Gly Asp Gly Ala Leu 210 215 220 Leu Met His Leu Gly Ala Leu Pro Val Ile Ala Gly His Gly Pro Ser 225 230 235 240 Ser Tyr Phe His Val Val Phe Asn Asn Gly Val His Asp Ser Val Gly 245 250 255 Gly Gln Pro Thr Ser Ile Asp Arg Val Asp Val Pro Ala Leu Ala Arg 260 265 270 Asn Ser Gly Tyr Arg His Ala Ala Thr Leu Ser Ser Leu Glu Asp Leu 275 280 285 Pro Gly Glu Leu Ala Arg Leu Arg Glu Thr Gly Gly Pro Ala Leu Leu 290 295 300 Glu Leu Arg Val Arg Pro Gly Ser Arg Gly Asp Leu Gly Arg Pro Ala 305 310 315 320 Val Thr Pro Ala Glu Ser Gly Ala Ala Val Leu Arg Ala Leu Thr Gly 325 330 335 Arg Val Thr Pro Ser 340 341

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるホスホマイシン生合成関連遺伝子
を含むＤＮＡ断片（pFBG23挿入断片ＤＮＡ）の制限酵素
地図を示す。また図中に塩基配列の決定された領域及
び、NP17株、NP15株の変異を相補する領域を示した。

【図２】ホスホマイシン生合成経路とNP17株、NP15株の
特徴を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:55） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:55）Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者葛山智久東京都文京区弥生１−１−１東京大学分子細胞生物学研究所 (72)発明者武居なおみ東京都文京区弥生１−１−１東京大学分子細胞生物学研究所 (72)発明者瀬戸治男東京都文京区弥生１−１−１東京大学分子細胞生物学研究所

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号２の配列で示されるアミ
ノ酸配列をコードするホスホエノールピルビン酸ホスホ
ムターゼ遺伝子またはその同効物を含んでなる、ＤＮ
Ａ。
【請求項２】ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ
遺伝子が、配列表の配列番号１の配列中の247-1224位の
塩基配列で表される、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列表の配列番号３の配列で示されるアミ
ノ酸配列をコードするホスホノピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ遺伝子またはその同効物を含んでなる、ＤＮＡ。
【請求項４】ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子が、配列表の配列番号１の配列中の1353-2375位の
塩基配列で表される、請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】ホスホマイシン生合成関連遺伝子を含む遺
伝子クラスター、及び遺伝子クラスターを含むプラスミ
ド
【請求項６】請求項５記載のプラスミドで形質転換され
た、形質転換体。
【請求項７】宿主が、ストレプトマイセス・ベデモレン
シスである請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】宿主が、ストレプトマイセス・ハイグロス
コピカスである請求項６記載の形質転換体。