JPH0716400B2

JPH0716400B2 - 新規な有機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製造方法

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Publication number: JPH0716400B2
Application number: JP58210964A
Authority: JP
Inventors: 健太郎田中
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-11-11
Filing date: 1983-11-11
Publication date: 1995-03-01
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: EP0142790A3; JPS60104016A; EP0142790A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規な有機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製
造方法に関する。更に詳しくは、生体によく吸収され且
つ化学的に安定な有機第一鉄化合物含有補血剤組成物
を、嫌気条件下、鉄化合物を含む糖類含有栄養培地中で
酵母を培養することによって効率良く産生することを特
徴とする新規な有機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製
造方法に関する。

鉄がヘモグロビンの主要構成要素であるところから、各
種の鉄化合物が補血剤として用いられている。これまで
胃腸から生体への鉄の吸収については非常に多くの研究
がなされており、Fe⁺⁺は人体によく吸収されるがFe⁺⁺⁺
は吸収されないことが知られている。アクタメディカ
ルスカンディナー（Acta Med.Scandinar）、171巻補
遣376号（suppl.376）、1962年、23〜38ページに記載さ
れたブライズ（Brise）及びホールバーグ（Hallberg）
の研究によると、各種鉄塩の人体への吸収率は硫酸第一
鉄を100とすると次のような数値となる。コハク酸第一
鉄120−157、乳酸第一鉄90−128、フマル酸第一鉄100−
105、グリシリン硫酸第一鉄87−110、グルタミン酸第一
鉄50−118、グルコン酸第一鉄68−110、くえん酸第一鉄
60−90、酒石酸第一鉄45−87、ピロ燐酸第一鉄46−80、
コリンイソくえん酸第二鉄25−50、硫酸第二鉄27−50、
くえん酸第二鉄23−47、エチレンジアミン四酢酸第二鉄
16−33。従って、硫酸第一鉄、コハク酸第一鉄のような
二価の鉄化合物が最もしばしば鉄剤として用いられてい
る。しかし鉄剤として二価鉄化合物を用いる場合は、二
価鉄化合物は容易に酸化されて三価鉄化合物になるため
特殊な被覆等の薬剤上の特別な技術が必要である。また
有機酸、キレート剤、糖、アミノ酸との鉄錯化合物等は
無機鉄化合物に比べて生体内への吸収が良いことも知ら
れている。実際にフマル酸第一鉄やコハク酸第一鉄及び
オロトン酸第一鉄等の二価鉄の有機酸塩又は二価鉄のキ
レート化合物が貧血患者の治療に用いられている。しか
しこのような第一鉄化合物は貯蔵中や患者に投与した後
の人体中で酸化して対応する三価鉄化合物になりやすい
という欠点がある。

ところで、ブドウ酒は長い間貧血の治療に効果があると
言われていたが、ブドウ酒中の鉄分が、鉄剤として真に
有効であるか否か、また仮に有効である場合いかなる状
態で補血剤としての効果を発揮しているのかについては
明確にされていない。さらに、ブドウ酒中の鉄分の由来
も明確にされていず、市販のブドウ酒中の鉄分含量も全
くまちまちであり、ブドウ酒による鉄分摂取は確実なも
のとは言い難い。

特開昭58−101686号公報に開示の如く、本発明者はブド
ウ果汁、その他の栄養培地中の発酵過程における鉄成分
の挙動、生体内における鉄成分の挙動について鋭意研究
を行ない、その結果、市販のブドウ酒中に含まれる鉄分
の原因となるべき量の鉄分は通常のブドウ酒原料には含
まれておらず、市販のブドウ酒の鉄分の大部分は醸造過
程におけるコンタミネーションに起因することを確認し
た。そして、鉄化合物を含む糖類含有栄養培地中で酵母
を培養することにより得られる新規な有機第一鉄化合物
は、従来の鉄剤、補血剤に比較し、鉄分の生体吸収率即
ち鉄分のヘモグロビンへの取込み率が抜群に改良される
ことを知見し、有機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製
造方法を確立した。しかしながら、特開昭58−101686号
公報に開示の製造方法は生産収率が低く必ずしも商業的
に有利な製造方法とは言えない。従って、本発明者は更
に鋭意研究を重ねた結果、既に確立した製造方法におい
て、培養を嫌気条件下で行なうことにより生産時間を短
縮することができ、且つ生産収率が著しく向上すること
を知見し、この新規な知見にもとづき本発明を完成する
に到った。

従って本発明の目的は、生体に効率良く吸収され且つ化
学的に安定な有機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製造
方法において、生産収率の改良された製造方法を提供す
ることである。

前記及びその他の諸目的、諸特徴及び諸利益は、添付図
面を参照して行なう次の詳細な記述より明らかになろ
う。

本発明によれば、鉄化合物を鉄として約10〜70ppm含み
糖類含量が約５〜25重量パーセントである半合成培地又
は合成培地中で、サッカロマイセスセレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）、メチュニコウィアプルチェ
リマ（Metschnikowia pulcherrima）、サッカロマイセ
スチェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッ
カロマイセスバイアナス（Saccharomyces bayanu
s）、サッカロマイセスイタリカス（Saccharomyces i
talicus）、サッカロマイセスフェルメンタチ（Sacch
aromyces fermentati）、サッカロマイセスロセイ（S
accharomyces rosei）、サッカロマイセスヘテロジェ
ニカス（Saccharomyces heterogenicus）及びキャンデ
ィダクルーゼ（Candida krusei）よりなる群から選ば
れる少なくとも一種の酵母を培養することを包含する有
機第一鉄化合物含有補血剤組成物の製造方法において、
該半合成培地又は合成培地中にリンゴ酸、くえん酸、酒
石酸及び琥珀酸から選ばれる少なくとも一種の有機酸の
ナトリウム及び／又はカリウムの塩（以下、単に「有機
酸塩」と屡々称す）を約0.1〜1.0重量パーセントの濃度
で、且つ塩化カルシウムを塩化カルシウム二水塩（CaCl
₂・2H₂O）として約0.001〜1.0重量パーセントの濃度
で、それぞれ存在せしめ、上記培養を嫌気条件で行なう
ことを特徴とする製造方法が提供される。

本発明で用いる糖類含有栄養培地としては、工業的見地
から、合成培地及び半合成培地が好ましく用いられる。
本発明でいう合成培地とは、化学的に完全に説明できる
物質（純粋な既知物質）のみで作られる培地を意味す
る。合成培地の代表的なものは第１表の（１）に示すウ
ィッカーハム（Wickerham）の合成培地である。また、
半合成培地とは、培地の主成分である炭素源、窒素源、
塩類は化学的に純粋な物質で構成されているが、その外
にビタミン類、アミノ酸類、金属類など化学的に必ずし
も純粋でないが必要な微量成分を含む有効物質たとえば
酵母エキス、麦芽エキスなどを加えて作られる培地を意
味する。本発明で用いる糖類含有栄養培地としての半合
成培地又は合成培地は、飲用できるものであれば何でも
良い。合成培地及び半合成培地の例をそれぞれ第１表及
び第２表に示す。これらの合成培地又は半合成培地（以
下、屡々「糖類含有栄養培地」とも称す）が、上記に定
義した有機酸塩を約0.1〜1.0重量パーセントの濃度及び
塩化カルシウムを塩化カルシウム二水塩として0.001〜
1.0重量パーセントの濃度で含む場合には、上記の有機
酸塩及び塩化カルシウムを添加しないで用いることがで
き、また含まない場合にはそれらを添加して本発明に規
定する条件になるようにして用いる。鉄化合物の含量及
び糖類含量についても同様である。

本発明においては嫌気条件下、鉄化合物を含む糖類含有
栄養培地中で酵母を培養し嫌気培養を行なう。本発明で
いう嫌気培養とは、培養過程において培養液が空気（特
に空気中の酸素）と直接接しない培養を意味する。酵母
を培養してその発酵生産物を生成する過程で副産物とし
て炭酸ガス等のガス体が発生する。従って培養槽に密栓
を装着させておくと加圧状態になる。そこで通常はガス
体を放出できる栓（線栓など）を使用する。本発明の一
つの特徴は嫌気条件下で発酵を行なうことであるが、具
体的な一つの方策としては、発酵栓を使用して嫌気状態
にさせる。本発明でいう発酵栓とは、培養過程において
生成するガス体は外部に排出するが、外部からの気体
（主として空気）の侵入を阻止する、即ち、外気体を培
養液に直接接触させないように作られた栓を意味する。
発酵栓は、内部に硫酸を含む槽が設けてあり、この層を
通じて培養の過程で発生するガス体を放出される。培養
槽が少々減圧になっても、発酵栓によって、空気が培養
槽に逆流することは全く無い。即ち、上述の発酵栓を使
用することにより、培養液と外部空気の直接接触を阻止
しながら、発酵を行ない発酵成生物を得ることができ
る。発酵栓を使用する場用においては、培養槽は静置さ
せておく方が操作が簡単となり好ましい。本発明におい
て嫌気状態にさせる具体的な一方法として発酵栓の使用
を例示したが、効果的に嫌気状態を達成できるものであ
れば何でも良く発酵栓に限定されることはない。

後述の実施例から明らかなように、リンゴ酸、くえん
酸、酒石酸及び琥珀酸から選ばれる少なくとも一種の有
機酸のナトリウム及び／又はカリウムの塩を約0.1〜1.0
重量パーセントの濃度で、且つ塩化カルシウムを塩化カ
ルシウム二水塩として約0.001〜1.0重量パーセントの濃
度で、それぞれ存在せしめ、上記の有機酸塩及び塩化カ
ルシウムを含む合成培地又は半合成培地中で酵母の嫌気
培養を行なうと、酵母の増殖が著しく増大し、生体吸収
率の優れた可溶性有機第一鉄化合物を高濃度で生産する
ことが可能となる。また、生産収率が著しく向上し、製
造時間を短縮できる。有機酸塩と塩化カルシウムを含む
培養系では一種の緩衝効果が見られ、培養液pH地の低下
を抑制することができる（pH値が約4.0以下に低下する
ことがない）。

本発明においては、前記したように、リンゴ酸、くえん
酸、酒石酸及び琥珀酸から選ばれる少なくとも一種の有
機酸のナトリウム及び／又はカリウムの塩（単に「有機
酸塩」と屡々称す）を用いることが必須である。

本発明において、糖類含有栄養培地中の有機酸塩濃度は
約0.1〜1.0重量パーセントの範囲内にあることが好まし
い。約0.1重量パーセント未満では上述の効果が十分に
発現せず、また、約1.0重量パーセントを超えると効果
において最早差がみられなくなるので、それ以上多量に
添加することは培養上も又経済的にも好ましくない。

本発明において、糖類含有栄養培地中の塩化カルシウム
濃度は約0.001〜1.0重量パーセント、好ましくは0.005
〜0.1重量パーセントの範囲内にあることが好ましい。
約0.001重量パーセント未満では、有機酸塩の場合と同
様に、上述の効果が十分に発現せず、約1.0重量パーセ
ントを超えると効果において最早差が見られなくなるの
で、それ以上多量に添加することは培養上好ましくな
い。

本発明により、嫌気条件下、鉄化合物を含む糖類含有栄
養培地中で酵母を培養することにより得られる有機第一
鉄化合物、アルコールおよび水を含む培養液は、貧血患
者に長期間安全に投与することができるようアルコール
含有量が1.0重量パーセント未満となるまでアルコール
を除去することができる。アルコールの除去は、一般に
水溶液よりアルコールなどの低沸点化合物を除くに適し
た方法、装置により行なうことができる。たとえば、回
転式エバポレータを用い、15〜20mmHgの圧力下、30℃を
超えない温度で上記培養液より簡易にアルコールを留去
することができる。アルコール含量量を1.0容量パーセ
ント未満とするためのアルコール濃度の追跡は、たとえ
ば、比重法により行なうことができる。該比重法におい
ては、培養液より適当量サンプリングを行い、サンプル
の比重を測定する。前もって得られたアルコール濃度と
比重の間の相関関係を示すキャリブレーショングラフよ
り、該比重に対応するアルコール濃度を求めることがで
きる。但し、アルコール濃度の追跡は上記に限定される
ことなく、クロマトグラフ法などの他の方法を用いるこ
とができる。

本発明で使用する酵母の種類は臨界的ではないが、発酵
に通常用いられる多種類の属の酵母を用いることができ
る。好ましく用いられる属はサッカロマイセス（Saccha
romyces）、メチュニコウイア（Metschnikowia）及びキ
ャンディダ（Candida）である。好ましく用いることの
できる酵母の種類を第３表中に示す。

上記酵母のうちサッカロマイセスセレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）を用いると腸からの吸収が優れた
多層のＢ分画区分（後述する）が製造できるので、サッ
カロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）が最も好ましい。

本発明を実施する場合、合成培地又は半合成培地のいず
れを用いる場合にも、酵母を培地1ml当り約３×10⁵〜約
３×10⁶の濃度で使用することができる。

本発明で使用する鉄化合物としては、鉄がイオン化し得
る化合物であればどのような鉄化合物でも用いることが
できる。例えば、塩化第二鉄、硫酸第一鉄及び硫酸第二
鉄などのような鉄の無機酸塩、そしてくえん酸鉄、酒石
酸鉄のような鉄の有機酸塩が挙げられる。鉄粉も又使え
るが、培地への溶解に時間がかかるので不利である。溶
解度、有用性及び無毒性の点から考えて上記の鉄化合物
が好ましい。このような鉄化合物は、三価の鉄である場
合、発酵の過程に変換されて第一鉄イオンが生成する。
添加する鉄化合物の量は臨界的ではないが、たとえ鉄の
添加量を増やしても、製品中の鉄量は必ずしも比例関係
で増加しない。あまり多量の鉄化合物を加えると逆に発
酵を抑制するので不利である。また一方、鉄化合物の使
用量があまり少ないと、目的とする効果が得られない。
一般に、鉄化合物はとして約10〜約70ppm、好ましくは
約30〜約50ppmの濃度で栄養培地に用いることができ
る。

発酵のための更に他の条件を下述する。添加する糖類の
種類は臨界的でないが、ショ糖、グルコース、果糖等の
糖がより好ましく用いられる。栄養培地中の糖の量は臨
界的ではないが、所望の発酵をよりよく行なうための条
件の提供という観点から、一般に栄養培地に対して５〜
25重量％、好ましくは10〜15重量％の糖を栄養培地に含
入せしめることができる。

本発明においては、約18〜30℃で培養を行なうことがで
きる。本発明の嫌気培養においては、発酵開始後２日目
頃からpH値は急速に低下し、３日目頃には約4.0とな
る。それ以後は低下がなく、約4.0を維持している。こ
のようにpH値が一定に保たれる原因は、有機酸塩と塩化
カルシウムの添加にあると考えられる。

本発明の製造方法により、嫌気条件下、鉄化合物を含む
糖類含有栄養培地中で酵母を培養することによりアルコ
ール発酵を行ない培養液の形態で有機第一鉄化合物含有
補血剤組成物を提供することができる。得られた培養液
はその後、例えば遠心分離などにより、沈澱物と上澄液
とに分離することができる。得られた上澄液もまた本発
明により製造される補血剤組成物の一形態である。培養
液、上澄液のいずれも、前述の方法により、アルコール
含有量が1.0容量パーセント未満になるまでアルコール
を除去することができる。いずれの形態中にも、二価鉄
の有機錯体と推定される水溶性有機第一鉄化合物が含有
されている。この水溶性有機第一鉄化合物は、最初に添
加された鉄化合物が培養あるいは発酵過程で化学変化を
受けて生成した発酵生成物であると信じられる。培養液
および上澄液の両方とも、そのまま服用できる。上述の
培養液および上澄液のいずれも、30℃以下の温度で約15
〜20mmHgの圧力下において減圧濃縮し、原液の10倍以上
の濃度の濃縮物とすることができる。得られた濃縮物
は、例えば薬用アルコール性飲料（エリキシル）として
提供されることができる。又濃縮物をさらに濃縮して乾
固し、乾固物をそのまま、あるいは所望によりビタミン
Ｃなどの還元性添加物とともに経口投与に適した形態、
例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒ないしは微細顆粒の
形態に製剤できる。所望により、これらの投与形態は従
来技術に準じて容易に製造することができ、通常用いら
れる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑剤などの製薬剤から成
っている。賦形剤、結合剤および／ないし崩壊剤とし
て、例えば微結晶セルロース、小麦デンプン、糖ラクト
ース、アラビアゴム、トラガカントゴム、カルボキシメ
チルセルロースなどを用いることができる。滑剤とし
て、例えばステアリン酸マグネシウムやタルクなどが用
いられることができる。又、錠剤を常法に準じて被覆し
てもよい。被覆材として、例えばシェラック、エチルセ
ルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピ
ロリドン、二酸化チタニウムなどが好ましく用いられ
る。投与量は患者の年令、疾病の程度、体重などによっ
て異なるが、本発明の方法によって得られる補血剤組成
物は通常成人に対して１日当り約5mg〜約100mg（鉄分を
基準として）を、もし必要ならば分割して、投与するこ
とができる。

本発明の方法により製造される補血剤組成物の活性成分
は、化学分析の結果、分子量が約10²〜５×10³、元素F
e,C,H,Oのみから構成される二価鉄含有有機錯化合物で
あると推定される。後述する実験例から明らかなよう
に、本発明により製造される補血剤組成物中の有機第一
鉄は従来の鉄剤に比して、人間や人間以外の動物の生体
への吸収性及びヘモグロビンへの取り込みにおいて顕著
に優れていることが判明した。しかも、本発明により製
造される補血剤組成物は、塩化第一鉄、硫酸第一鉄、フ
マル酸第一鉄、琥珀酸第一鉄、酒石酸第一鉄などに二価
鉄化合物に比して極めて安定であることも判明した。

上述した上澄液を、例えばアンバーライトXAD−２（Amb
erlite XAD−２）（米国ロームアンドハース社製）
を用いてクロマトグラフ分別を行なうと、二つの分画区
分すなわちＡ画分とＢ画分に分離される。このＢ画分は
比較的低分子量であるが、Ａ画分に比して、生体への吸
収性が高い。この事実から、本発明により製造される有
機第一鉄化合物は少くとも２種の化合物より構成されて
いると考えられる。

一方、酵母を鉄化合物の存在下で糖含有栄養培地で培養
することを特徴とする本発明により製造された有機第一
鉄含有補血剤組成物の適当量を患者に投与することによ
り、血液中の鉄含有量を増加させることができる。

嫌気条件下、鉄化合物を含む、有機酸塩及び塩化カルシ
ウムをも含む糖類含有栄養培地中で酵母を培養すること
からなる生体に効率良く吸収され且つ化学的に安定な有
機第一鉄化合物含有補血剤組成物の本発明に係る製造方
法は、従来技術に比較して、生産収率が著しく向上し商
業的に極めて有利な方法である。たとえば、従来技術で
は、400ml培溶液からのＢ画分生成量は比較例２に示す
如く3.6mgであるのに対し、本発明では、400ml培養液か
らのＢ画分生成量は実施例１に示す如く9.6mgへと大幅
に向上する。

上述したように、本発明の方法によれば、酵母の増殖が
増大し、可溶性有機第一鉄化合物が高濃度に生成する。
また、培養日数を従来に比較して半分以下の５〜６日に
短縮することができ、最大量の有機第一鉄コンプレック
スを得ることができる。

また、本発明の培養方法によれば、従来の培養方法に比
較して、生体への吸収性が最も優れたＢ画分が多量に生
合成される。

以下実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発
明の範囲は実施例に限定されるものではない。

実施例１サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）OC−２を吸光度でOD₆₆₆＝0.01になるように（即
ち、酵母濃度として約4.07×10⁵cells/ml）、第１表−
例（１）に示す有機酸塩添加合成培地に加える。発酵栓
を付して大気圧下30℃で静置培養を行なう。第１図、曲
線（１）に示すように培養開始時のpHは6.8位であるが
培養が進むにつれて逐次低下し、３〜４日後にpH4.0と
なり、以後、それ以上の低下はない。第２図、曲線
（１）に示すように、サッカロマイセスセレビシエOC
−２の増殖は順調に進行し、５日後には定常化し主発酵
は終了する。同時に可溶性の有機第一鉄化合物の濃度
は、第３図、曲線（１）に示すように最高になる。第
（１）図〜第（３）図の曲線（２）は、比較例の所で後
述するように、有機酸塩（酒石酸ナトリウム・カリウ
ム）及び塩化カルシウムを添加しない合成培地を用いる
綿栓下の培養結果を対照のため示すものである。

従って、培養開始後５〜６日で培養を止めて直ちに回転
式エバポレータを使用し15mmHg下20℃でアルコール含有
量が0.5容量パーセントになるまでアルコールを留去す
る。

更に、得られた培養液より400mlを分散し、10,000rpmで
10分間遠心分離し上澄液と沈殿物に分離する。上澄液を
30℃以下で約1/15容量に濃縮する。これを疎水性合成吸
着樹脂アンバーライト（Amberlite）XAD−２を使用する
カラムクロマトグラフイーで分離分析することにより、
第４図に示す通り、比吸着性第一鉄含有物質（Ａ画分）
と吸着性第一鉄含有物質（Ｂ画分）に分離することがで
きる。Ｂ画分,A画分ともに生体に良く吸収されるが、Ｂ
画分の方がＡ画分より生体吸収率が高い。培養液400ml
から得られたＢ画分の鉄量は9.6mgであった。

実験例１上記の方法で得られる本発明に係る有機第一鉄化合物含
有組成物の補血剤としての有効性を動物実験により示
す。

１）投与液の調整（イ）本発明に係る有機第一鉄含有補血剤組成物FeCl
₃・6H₂Oを242mg添加する代りに、⁵⁹FeCl₃を塩化第二鉄
の0.1N塩酸溶液に比放射能が6.25μCi/50μgFeとなるよ
うに加え0.1N水酸化ナトリウム水溶液でpH3とした水溶
液を第１表−例１の合成培地に鉄として50ppm添加した
以外は、実施例１と同様の操作を行ないアルコール含有
量が0.5容量パーセントの培養液を得た。この培養液を3
0℃で減圧濃縮して、10及び40μgFe/ml鉄濃度の投与液
とした。

（ロ）硫酸第一鉄溶液（対照）⁵⁹ FeCl₃溶液（比放射能:12.5μCi/μgFe）にアスコルビ
ン酸を鉄１μｇあたり0.05μmolesを加えて二価鉄とし
た後硫酸第一鉄水溶液と混ぜて５μCi/10及び40μgFe/m
l,pH3の投与液とした。

（ハ）塩化第二鉄溶液（対照）⁵⁹ FeCl₃溶液に塩化第二鉄水溶液を混ぜ水酸化ナトリウ
ム水溶液でpH3とし、５μCi/10及び40μgFe/mlの投与液
とした。

（ニ）合成培地酵母培養液−硫酸第一鉄混合溶液（対
照） FeCl₃を添加しない以外は、実施例１と同じ方法で調製
した培養液を1/4に濃縮し、上述の方法に従って調製し
た10μCi/80μgFe/mlの硫酸第一鉄の投与液に1:1の容量
で混ぜて５μCi/40μgFe/mlの投与液とした。

（ホ）オロトン酸第一鉄溶液（対照）⁵⁹ Fe標識鉄を含むオロトン酸第一鉄水溶液より５μCi/4
0μgFe/mlの投与液を調製した。

２）投与雄のスプラグ−ドウリー（Sprague−Dawly）系ラット
（日本クレア株式会社）を５週令で入手し一週間の予備
飼育を行なった。

飼料は鉄を充分含む（31.5mg/100g）CA−１（日本クレ
ア株式会社）を与え、水は水道水を与えた。予備飼育
中、体重増加をチェックし６週令の時点で体重が160g前
後のラットを使用した。動物は全実験期間を通じて代謝
ケージ中で飼育し、投与に先立ち18時間の絶食を行な
い、水は蒸留水を与えた。

このラットを一群５匹とし、上記の如く調製した投与液
を胃ゾンデを用いてラットの体重160gあたり1mlを直接
胃内に投与した。投与して６時間後から飼料CA−１を与
えた。

３）生体試料の放射能測定投与後、糞及び尿を経時的に採取し放射能測定試料とし
た。血液はヘパリン処理したキャピラリを用いて経時的
に尾静脈より50μを採決し、3,000rpmで５分間遠心分
離して血漿と血球部に分けてそれぞれの放射能を測定し
た。各鉄分の吸収率及びヘモグロビンへの取り込み率を
第４表に示す。

第４表から明らかなように、鉄濃度が低い場合には（1m
g/程度またはそれ以下）、本発明に係る有機鉄と対照
の無機鉄及び有機酸鉄との吸収率の差はあまり大きくな
いが、これは、この程度の鉄濃度では体内の還元力の範
囲内にあるためと考えられる。しかし鉄濃度が大きくな
ると、本発明に係る有機鉄の吸収率はFeSO₄,FeCl₃及び
オロトン酸第一鉄に比して抜群に高いことがわかる。ま
た、二価鉄である硫酸第一鉄とブドウ酒成分を混合した
に過ぎないもの（ニ）の吸収率は硫酸第一鉄単味（ロ）
の吸収率と差がみられない。

実験例２実施例１で得た上澄液から調製した鉄含量250μgFe/ml
の投与液をラット体重1kgあたり250μgFe投与したラッ
トについて、血漿、骨髄、赤血球、小腸における鉄濃度
の投与後の経時変化を測定した。その結果を第５図に示
す。第５図において、縦軸には全投与量に対する⁵⁹Fe含
有率（％）を対数目盛で示し、横軸には投与後の経過時
間（hr）を対数目盛で示してある。Ｐは血漿、Ｂは骨
髄、Ｅは赤血球、Ｓは小腸を意味し、⁵⁹Fe含有率の0.1
は検出限界である。本テストは前述の実験方法と同様な
方法で行い、血漿、骨髄、赤血球、小腸における体内鉄
濃度の投与後経時変化は実験例１中第２項，第３項に従
い測定した。第５図から明らかなように、まず最初、血
漿中の鉄濃度は急速に増大し、その後急速に減少して、
投与後約168時間にはおよそゼロになる。次に、血漿中
の鉄濃度の減少とともに、骨髄中の鉄濃度は増大し、投
与後約20時間で減少に転じる。ついで、赤血球中の鉄濃
度は徐々に増大しプラトー域に到る。（この時の鉄濃度
は血漿、骨髄中で見られる鉄濃度より大となる。）一度
このプラトー域に達した赤血球中の鉄含有率はおそよ50
日間変化せず一定値を示す。第５図より、血漿中に吸収
された鉄分は滑髄に移動し、さらに赤血球中に吸収され
ることが推測される。また第５図から、本願発明の方法
によって得られる補血剤組成物中の有機第一鉄化合物は
極めて安定に生体中に吸収され、鉄のヘモグロビン中へ
の吸収が極めて大きいことが認識できる。この結果、本
願発明の方法によって得られる補血剤組成物は投与回数
の減少をもたらすことができて有利である。

比較例１発酵栓の代りに綿栓を使用した以外は、実施例１と同様
の操作を繰り返した。培養液400mlから得られたＢ画分
の鉄量は4.6mgであった。

比較例２発酵栓の代りに綿栓を使用し、酒石酸ナトリウム・カリ
ウム及び塩化カルシウムを添加しない合成培地を使用し
た以外は、実施例１と同様の操作を繰り返した。培養液
400mlから得られたＢ画分の鉄量は3.6mgであった。

培養時間によるpHの変化は第１図曲線（２）に、培養時
間によるサッカロマイセスセレビシエOC−２の増殖度
は第２図曲線（２）に、培養時間による有機第一鉄化合
物濃度の変化は第３図曲線（２）に示す。

実施例２合成培地の代りに、第２表の半合成培地にくえん酸ナト
リウム4.6gを添加した培地を用いた以外は、実施例１と
同様の操作を繰り返した。培養液400mlから得られたＢ
画分の鉄量は6.4mgであった。

得られたＢ画分は、実施例１と同様、安定であり、生体
吸収性に優れていた。

実施例３サッカロマイセスセレビシエOC−２の代りにキャンデ
ィダクルーゼ（Candida krusei）Ｋ−503を使用した
以外は、実施例１と同の操作を繰り返した。培養液400m
lから得られたＢ画分の鉄量は8.4mgであった。

得られたＢ画分は、実施例１及び実施例２と同様、安定
であり、生体吸収性に優れていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養時間によるpH値の変化を示すグラフであ
り、（１）は実施例１、（２）は比較例２の培養結果を
示す。第２図は培養時間による酵母の増殖度を示すグラフであ
り、（１）は実施例１、（２）は比較例２の培養結果を
示す。第３図は培養時間による培養液中の有機第一鉄化合物鉄
濃度の変化を示すグラフであり、（１）は実施例１、
（２）は比較例２の培養結果を示す。第４図は本発明に係る有機第一鉄含有化合物をアンバー
ライト（Amberlite）XAD−２を用いて分離分析すること
によって得られるクロマトグラムである。２つの画分
（Ａ画分,B画分）に分離される。第５図は本発明の方法によって得られる補血剤組成物を
ラットに投与した時の、血漿、骨髄、赤血球、小腸にお
ける鉄濃度の投与後の経時変化を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鉄化合物を鉄として約10〜70ppm含み糖類
含量が約５〜25重量パーセントである半合成培地又は合
成培地中で、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）、メチュニコウィアプルチェリマ
（Metschnikowia pulcherrima）、サッカロマイセス
チェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロ
マイセスバイアナス（Saccharomyces bayanus）、サ
ッカロマイセスイタリカス（Saccharomyces italicu
s）、サッカロマイセスフェルメンタチ（Saccharomyc
es fermentati）、サッカロマイセスロセイ（Sacchar
omyces rosei）、サッカロマイセスヘテロジェニカス
（Saccharomyces heterogenicus）及びキャンディダ
クルーゼ（Candida krusei）よりなる群から選ばれる少
なくとも一種の酵母を培養することを包含する有機第一
鉄化合物含有補血剤組成物の製造方法において、該半合
成培地又は合成培地中にリンゴ酸、くえん酸、酒石酸及
び琥珀酸から選ばれる少なくとも一種の有機酸のナトリ
ウム及び／又はカリウムの塩を約0.1〜1.0重量パーセン
トの濃度で、且つ塩化カルシウムを塩化カルシウム二水
塩として約0.001〜1.0重量パーセントの濃度で、それぞ
れ存在せしめ、上記培養を嫌気条件で行なうことを特徴
とする製造方法。
【請求項２】鉄化合物を鉄として約10〜70ppm含み糖類
含量が約５〜25重量パーセントである半合成培地又は合
成培地中で、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）、メチュニコウィアプルチェリマ
（Metschnikowia pulcherrima）、サッカロマイセス
チェバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロ
マイセスバイアナス（Saccharomyces bayanus）、サ
ッカロマイセスイタリカス（Saccharomyces italicu
s）、サッカロマイセスフェルメンタチ（Saccharomyc
es fermentati）、サッカロマイセスロセイ（Sacchar
omyces rosei）、サッカロマイセスヘテロジェニカス
（Saccharomyces heterogenicus）及びキャンディダ
クルーゼ（Candida krusei）よりなる群から選ばれる少
なくとも一種の酵母を培養することを包含する有機第一
鉄化合物含有補血剤組成物の製造方法において、該半合
成培地又は合成培地中にリンゴ酸、くえん酸、酒石酸及
び琥珀酸から選ばれる少なくとも一種の有機酸のナトリ
ウム及び／又はカリウムの塩を約0.1〜1.0重量パーセン
トの濃度で、且つ塩化カルシウムを塩化カルシウム二水
塩として約0.001〜1.0重量パーセントの濃度で、それぞ
れ存在せしめ、上記培養を嫌気条件下で行ない、得られ
た培養液の上澄液を吸着クロマトグラフィーにかけて非
吸着性第一鉄含有物質画分と吸着性第一鉄含有物質画分
に分離し、吸着性第一鉄含有物質画分を単離することを
特徴とする製造方法。