JPH07165608A - インターロイキン６リセプター抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規な骨吸収抑制剤を提供する。 【構成】 インターロイキン６リセプターに対する抗体
を有効成分とする骨吸収抑制剤。 【効果】 インターロイキン６及びインターロイキン６
リセプターの共存下での破骨細胞の形成を抑制するため
骨吸収作用を効果的に抑制し、骨吸収が関与する種々の
疾患の治療剤として有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はインターロイキン６リセ
プターに対する抗体（以下、インターロイキン６リセプ
ター抗体と称する）を有効成分とする骨吸収抑制剤に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】骨組織
は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とに
よって基本的形状を変えることなく、新生骨と置換され
る。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼ばれ、
生体の機能維持に重要な役割を果たしている。しかしな
がら、一度、骨形成と骨吸収とのバランスが失われる
と、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈することと
なる。

【０００３】骨吸収の主役を担う破骨細胞はマクロファ
ージ系の細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介し
て破骨細胞へと分化することによって形成されるが、こ
の過程を促進する因子は骨吸収因子と呼ばれ、これまで
に活性型ビタミンＤ₃ 、副甲状腺ホルモン、インターロ
イキン１（１Ｌ−１）、プロスタグランディンなどが知
られている。これ等の骨吸収因子を過剰投与すると、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで破骨細胞数を増加、活性化させ、骨吸収
を亢進することが知られている（例えば医学のあゆみ16
5:572-576,1993を参照）。

【０００４】インターロイキン６（ＩＬ−６）はＢリン
パ球系細胞の増殖を促進させるサイトカインとして発見
され、その後Ｔリンパ球細胞の成熟化をも誘導すること
によって免疫系に影響を及ぼすことがわかった（例えば
Ｌｏｔｚ等；J. Exp. Immunol. 18:1253-1258, 1988 を
参照）。さらにはＩＬ−６は造血系幹細胞の分化誘導に
も関与している等、さまざまな細胞機能に関与している
ことおよびＩＬ−６は種々の細胞から分泌されることか
ら骨に対する影響も示唆されている。

【０００５】Ｉｓｈｉｍｉ等は骨吸収因子のＩＬ−１や
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の刺激によってマウス骨芽細胞
は多量のＩＬ−６を産生し、その結果ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で骨吸収が惹起されることを報告した（J. Immunol.,14
5:3297-3803, 1990 ）。またＩＬ−６はマウス頭頂骨に
対し骨吸収活性を示すことも知られており（J. Immuno
l.,145:3297-3803, 1990 ）、さらにはＩＬ−６遺伝子
を移入したＣＨＯ細胞をマウスに移植すると、高Ｃａ血
症を呈すると報告されている（Endocrinology, 128:265
7-2659, 1991）。

【０００６】しかしながらＡｌ−ｈｕｍｉｄａｎ等やＢ
ａｒｔｏｎ等はＩＬ−６添加によってもマウス頭頂骨の
骨吸収作用は見られなかったと報告しており（J Bone M
inerRes 6:3-8, 1991およびCytokine 2:217-220, 199
0）、さらにはＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等は副甲状腺ホル
モン（ＰＴＨ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、Ｔ
ＮＦα、またはＩＬ−１によって刺激された骨芽細胞は
ＩＬ−６を産生するが、ＩＬ−６は骨芽細胞様細胞の分
化増殖については何らの作用をも示さなかったことか
ら、骨芽細胞から産生されたＩＬ−６は骨芽細胞の増殖
や分化に影響しないと報告している（J Bone Miner Res
6:141-148, 1991）。

【０００７】さらにＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ等はＰＴＨ刺
激により骨芽細胞のＩＬ−６産生は増加したものの、Ｉ
Ｌ−６リセプター（ＩＬ−６Ｒ）のメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）量は増加しなかったと述べている（Endo
crinology, 129:1513-1520,1991）。従って、ＩＬ−６
と骨吸収の関係については使用する材料や実験系によっ
て相反する結果が報告されており、未だその関係は解明
されていない（詳細はＲｏｏｄｍａｎの総説：J Bone M
iner Res 7:475-478, 1992を参照）。

【０００８】最近、Ｍａｎｏｌａｇａｓ等はｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでエストロゲンがＩＬ−６の産生を抑制する事
（J.C.I. 89:883-891, 1992 ）、あるいは卵巣摘出（Ｏ
ＶＸ）ラットの破骨細胞数の増加をエストロゲンや抗Ｉ
Ｌ−６抗体が抑制する事（Science 257:88-91, 1992 ）
を報告している。しかしながら、これ等の報告では増加
した破骨細胞が骨吸収作用を有する程度に活性化（成熟
細胞化）されているか否かについては何らのデータもな
く、従ってＩＬ−６が生体内での骨吸収に直接関与して
いるかは依然として不明である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等はＩＬ−６の
骨吸収における役割を鋭意研究してきたがヒトＩＬ−６
を強制発現させたトランスジェニックマウスでは高Ｃａ
血症や破骨細胞形成の亢進が認められなかったことか
ら、ＩＬ−６以外の因子の寄与について研究した結果、
ＩＬ−６は単独では破骨細胞形成促進作用を殆ど示さな
いのに対しＩＬ−６Ｒの存在下では強力な破骨細胞形成
作用を持つこと、さらにはこの破骨細胞形成作用が抗Ｉ
Ｌ−６Ｒ抗体を添加することによって抑制されることを
見い出し、発明を完成させた。すなわち本願発明はイン
ターロイキン６リセプター抗体（ＩＬ−６Ｒ抗体）を有
効成分として含有する骨吸収抑制剤に関するものであ
る。

【００１０】

【具体的な説明】本願発明で使用される抗ＩＬ−６Ｒ抗
体は骨吸収抑制効果を有する限り、抗原や抗体の由来
（動物種の相異）を問わない。抗ＩＬ−６Ｒ抗体は公知
の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル
タイプの抗体として得ることができる。例えば抗ヒトＩ
Ｌ−６Ｒポリクローナル抗体の場合は欧州特許出願公開
番号ＥＰ３２５４７４号に開示された遺伝子配列を公知
の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞中で形質発
現させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的
のＩＬ−６Ｒ蛋白を精製し、次いでその蛋白を感作抗原
として、ヒト以外の哺乳動物を免疫させることによって
得ることができる。

【００１１】また抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体の場合は特開
平３−１５５７９５号に開示された遺伝子配列を使っ
て、上記と同様な方法を用いて得ることができる。一
方、ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているものと、細胞
表層より離脱している（以下、可溶性と呼ぶ）ものとの
２種類があり、可溶性ＩＬ−６Ｒは細胞膜上のＩＬ−６
Ｒ蛋白に於ける細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞
内領域のうち細胞内領域が欠損している点で構造的に相
異する。

【００１２】従って本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体のため
の抗原はこのような可溶性ＩＬ−６Ｒを含むものであ
り、これ等の可溶性ＩＬ−６Ｒは公知の手段により得る
ことができる（例えば、特開平４−９８８００号を参
照）。モノクローナル抗体の場合は、ＩＬ−６Ｒ蛋白を
感作抗原として哺乳動物を免疫した後、その形質細胞
（免疫細胞）をマウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と
融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクロ
ーン化し、その中からＩＬ−６Ｒの作用を中和させるク
ローンを選別し、これを培養して目的の抗体を回収する
ことによって得ることができる。

【００１３】感作抗原で免疫される哺乳動物としては特
に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエ
ローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般的にはマウス、ラット、ハムスター等が使用さ
れる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々
の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）
〔J. Immunol.,123:1548, 1978〕、ｐ３−Ｕ１〔Curren
t Topics in Micro-biology and Immunology, 81:1-7,
1978〕、ＮＳ−１〔Eur. J. Immunol.,6: 511-519, 197
6 〕、ＭＰＣ−１１〔Cell, 8:405-415, 1976 〕、ＳＰ
２／０〔Nature, 276,269-270, 1978 〕、ＦＯ〔J. Imm
unol. Meth.,35:1-21, 1980 〕，Ｓ１９４〔J. Exp. Me
d.,148:313-323, 1978〕、Ｒ２１０〔Nature, 277:131-
133, 1979 〕等が好適に使用される。

【００１４】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Method
s Enzymol.,73:3-46, 1981〕等に準じて行うことができ
る。より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促
進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促
進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に
所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシ
ド等の補助剤を添加使用することもできる。

【００１５】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜
１０倍程度とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる
培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に
好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、
この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能で
あり、更に、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用
することも可能である。

【００１６】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，００
０〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜
６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによっ
て行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心し
て上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とする
ハイブリドーマが形成される。

【００１７】当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、
例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン
及びチミジンを含む培地）で培養することにより選択さ
れる。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限
界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリ
ドーマのスクリーニング及び単一クローン化が実施され
る。

【００１８】さらには得られた抗体がヒト以外の動物に
由来する抗体である場合は、その抗原認識部位（ＣＤ
Ｒ）を残したまま、ＦＲ部分や定常領域部分をヒト由来
の抗体に変えた再構成ヒト型抗体とすることができ、Ｉ
Ｌ−６Ｒ抗体のヒト型抗体の例としてはＰＣＴ国際公開
Ｎｏ．ＷＯ ９２／１９７５９を挙げることができる。

【００１９】本願発明の抗ＩＬ−６Ｒ抗体は投与する対
象の動物種によって抗原であるＩＬ−６Ｒと抗体産生細
胞との間で種間の組合せを選択できる。一般的にはヒト
に対してはヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト細胞由来の抗体
が、またマウスに対してはマウスＩＬ−６Ｒに対するマ
ウス細胞由来の抗体が望ましいが、臨床上許容される限
り、異なる種間の組合せであってもよい。

【００２０】本発明の骨吸収抑制剤の活性成分である抗
ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例２の実験３に示されるごと
く、マウスＩＬ−６とマウス可溶性ＩＬ−６Ｒの共存下
での破骨細胞の形成を抑制する。また、本発明の骨吸収
抑制剤の活性成分である抗ＩＬ−６Ｒ抗体は、実施例３
に示すごとく、マウスＩＬ−６、マウス可溶性ＩＬ−６
ＲおよびヒトＩＬ−１αの共存下での骨吸収を抑制す
る。

【００２１】本願発明の骨吸収抑制剤はＩＬ−６Ｒによ
って惹起された骨吸収が抑制される限り、これ等の関与
する各種骨代謝疾患の治療に有効である。それ等の疾患
としては、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性
骨髄腫、腫瘍性高カルシウム血症、腎性骨異栄養症、ペ
ーゼット症、骨転移、骨肉腫等を挙げることができる。
本願発明の骨吸収抑制剤は常用経路、例えば錠剤もしく
はカプセル形態で経口的にまたは注射剤等の非経口的方
法で全身または局所的に投与され得る。さらには少なく
も１種の医薬用担体または希釈剤と共に医薬組成物やキ
ットの形態をとることができる。

【００２２】投与量は病態の程度や投与方法等によって
異なり、適宜適当な量を選択することが必要であるが一
般にヒトの場合、指示一日用量は約２５〜１００マイク
ログラムの範囲で４回以下の分割用量となっている。し
かしながら本願の骨吸収抑制剤はこれ等の投与量に限定
されるものではない。なお、ＩＬ−６Ｒ抗体の毒性につ
いては現在まで、何らかの影響があるとの報告はなされ
ていない。

【００２３】

【実施例】以下、実施例および参考例により本発明を具
体的に説明する。参考例１ マウスＩＬ−６の調製 約１０⁸ 個のＰ３８８Ｄ₁ （ＩＬ−１）細胞（Nordan
等、Science 233:566-569, 1986;Bazin 等、J. Immuno
l. 139:780-787, 1987 ）からＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ^TM
（Invitrogen社製）ｋｉｔを用いたランダムプライミン
グにより二本鎖のＣＤＮＡを合成した。

【００２４】さらにプライマーとして５′または３′末
端に制限酵素ＢａｍＨ１の認識部位を持つマウスＩＬ−
６遺伝子（J. Van Snick等、Eur. J. Immunol 18:193,
1988）の翻訳開始コドン（３４番目のＡＴＧ）を含む２
１〜４３番目の配列及び終止コドン（６６７番目のＴＡ
Ｇ）を含む６５８〜６８３番目の配列に相補的なオリゴ
マーを合成した。

【００２５】これ等のプライマーおよびＧｅｎｅ Ａｍ
ｐ（宝酒造）ｋｉｔを用いて、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍｏ
Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造）により、９４℃１分間、５０℃
２分間、７２℃３分間にて５０サイクルのＰＣＲを行な
った。増幅された断片（０．６６ｋｂ）を低融点アガロ
ースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨ１処理後、Ｐ
ＵＣ１９ベクターに導入し、サブクローニングした。マ
ウスＩＬ６遺伝子をＢａｍＨ１で切り出した後、予めＢ
ａｍＨ１処理したｐｄＲに組み込みＣＨＯ細胞に形質導
入した。５０ｎＭ ＭＴＸ耐性のＣＨＯ細胞を選びその
培養上清を実験に供した。

【００２６】参考例２ マウス可溶性ＩＬ６リセプター
抗体の調製 （１）Ｓａｉｔｏ等の方法（J. Immunol., 147:168-173
(1991))によって抗マウス可溶性ＩＬ−６リセプター抗
体ＲＳ１２を得た。この抗体はＩｇＧ２ａサブクラスで
あった。

【００２７】（２）上記Ｓａｉｔｏ等の文献に開示され
たマウス可溶性ＩＬ−６リセプターを産生するＣＨＯ細
胞を１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で培養し、その培
養上清をＲＳ１２抗体とＡｆｆｉｇｅｌ １０ゲル（バ
イオラッド）に固定したアフィニティーカラムを用いて
精製した。得られたマウス可溶性ＩＬ−６リセプター５
０μｇをフロイント完全アジュバントと混合しウィスタ
ーラット（日本チャールズリバー）の腹部皮下に接種し
た。２週間後からはフロイント不完全アジュバントで追
加免疫した。４５日目に屠殺し、その脾細胞約２×１０
⁸ 個を１×１０ ⁷ 個のマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と
５０％のＰＥＧ１５００（ベーリンガーマンハイム）を
用いて常法により細胞融合させた後、ＨＡＴ培地にてハ
イブリドーマを選択した。

【００２８】ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（カッペル）を
コートしたイミュノプレートにハイブリドーマ培養上清
を加えた後、マウス可溶性ＩＬ−６Ｒを反応させ、次い
でウサギ抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体およびアルカリフォス
ファターゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体によるＥＬＩ
ＳＡ法によりマウス可溶性ＩＬ−６リセプターに対する
抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
抗体の産生が確認されたものは２回のサブクローニング
を行ない単一のクローン（ＭＲ１６−１）を得た。

【００２９】このハイブリドーマが産生する抗体のマウ
スＩＬ−６に対する中和活性をＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞
(Matsuda等、Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988)を用
いた³Ｈ−チミジンの取り込みで調べた。９６穴プレー
トにＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞を１×１０⁴ 個／２００μ
ｌ／ウエルとなるよう調製し、これにマウスＩＬ−６
（１０pg／ml）とＭＲ１６−１抗体およびＲＳ１２抗体
１２．３〜１０００ng／mlを加えて、３７℃、５％ＣＯ
₂ で４４時間培養した後、 ³Ｈ−チミジン（ＩμＣｉ／
ｗｅｌｌ）を加え４時間後の取り込みを測定した（図
１）。

【００３０】実施例１ ８週齢の雌性ｄｄｙ系マウスに偽手術（ｓｈａｍ）また
は卵巣摘出術（ＯＶＸ）を行ない２週後に屠殺した。フ
ェノールレッド不含αＭＥＭ培地を用い、脛骨および大
腿骨より骨髄を採取し遠心分離により骨髄細胞を除いて
骨髄液とした。骨髄液の骨吸収活性は⁴⁵Ｃａでラベルし
たマウス長管骨を用いた器官培養法により測定した。す
なわち、母親マウスに⁴⁵ＣａＣｌ₂ を皮下投与すること
によって ⁴⁵Ｃａ標識された前腕骨を妊娠１７日令の胎児
より採取し、フェノールレッド不含αＭＥＭ培地で５％
ＣＯ₂ ，３７℃にて器官培養した。

【００３１】２４時間後、０．２％ＢＳＡを含むフェノ
ールレッド不含αＭＥＭ培地と交換すると同時に骨髄液
試料を４０％の割合で添加した。骨吸収活性はＳｈａｍ
群では約２５％であったのに対し、ＯＶＸ群は約６０％
であった。そこで、この系を用いて、６６μｇ／mlのマ
ウスＩＬ−６抗体およびＲＳ１２抗体で骨髄液試料を前
処理（３７℃、２時間、５％ＣＯ₂ ）して持続的添加を
行った結果、両抗体ともＯＶＸ群に於いて骨吸収活性を
阻害した（図２）。

【００３２】実施例２ マウスの骨芽細胞と骨髄細胞との共存培養系〔Takahash
i,等:Endocrinology 122:1373, 1988, Takahashi, 等:E
ndocrinology 123:2600, 1988 〕により形成される破骨
細胞数を骨吸収の指標として用いた。

【００３３】マウスの骨芽細胞は以下の方法により調製
した。すなわち生後１または２日令のｄｄｙ系マウスか
ら無菌的に取り出した頭蓋骨を０．１％コラゲナーゼ
（細胞分散用、和光純薬）と０．２％ディスパーゼ（合
同酒精）を含むＰＢＳに入れ３７℃の恒温槽にて１０分
間振とうした。浮遊してきた細胞を集め、更に新しい酵
素溶液を入れ１０分間酵素処理した。この酵素消化を５
回繰返し、２〜５回目の消化で浮遊してきた細胞を骨芽
細胞として回収した。

【００３４】マウスの骨髄細胞は以下の方法により調製
した。すなわち、６〜９週令のｄｄｙ系マウスからけい
骨を無菌的に取りだし、その骨端を切り落とした。けい
骨の遠位端より２５Ｇの針を付けたシリンジで１mlのα
−最少必須培地（α−ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ社）を注入
し、近位端より骨髄細胞を回収した。これらの細胞は共
に１０％の牛胎児血清（Ｂｉｏｃｅｌｌ社）を含むα−
ＭＥＭに懸濁して培養に用いた。

【００３５】共存培養は、４８穴の培養プレートに１×
１０⁴ 細胞／０．５ｍ／ｗｅｌｌの骨芽細胞と２×１０
⁵ 細胞／ｗｅｌｌの骨髄細胞を添加し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂で６〜７日間培養した。形成された破骨細胞は破骨
細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性フォスファ
ターゼ（ＴＲＡＰ）を染色することにより同定した〔Ta
kahashi,等:Endocrinology 122:1373, 1988 〕。

【００３６】これらの培養系にマウスＩＬ−６またはマ
ウス可溶性ＩＬ−６Ｒ〔ＩＬ−６ｓＲ（ｓＲ３２４）〕
〔Saito,等 al.J Immunol,147:168-173 (1991)〕とマウ
スＩＬ−６Ｒ抗体（ＭＲ１６−１あるいはＲＳ１２）ま
たはマウスＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ systems）を添加して
以下の実験を行った。なお、マウスＩＬ−６とｓＲ３２
４は、ＣＨＯ細胞にこれらの遺伝子を組み込んだ細胞の
培養上清をそれぞれ用いた。培養上清中のマウスＩＬ−
６およびＩＬ−６ｓＲ３２４はエンザイムイッムノアッ
セイによってそれぞれの濃度を測定し、α−ＭＥＭで適
当な濃度に希釈して実験に供した。

【００３７】実験１ マウスＩＬ−６又はマウス可溶性
ＩＬ−６Ｒ単独での破骨細胞形成実験 マウスＩＬ−６（０．２ng／ml〜２００ng／ml）とｓＲ
３２４（０．５〜５００ng／ml）単独での破骨細胞形成
能を調べたが、いずれも単独では破骨細胞形成能を示さ
なかった。なお、本実験系において陽性対象薬である活
性型ビタミンＤ ₃ は有意な破骨細胞形成を示した（図
３）。

【００３８】実験２ マウスＩＬ−６とマウス可溶性Ｉ
Ｌ−６Ｒ共存下での破骨細胞形成実験 ２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に０．
０５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた時
の破骨細胞形成能を調べたところ、ｓＲ３２４の濃度に
依存して著明な破骨細胞の形成が認められた（図４）。
なお、形成された破骨細胞を象牙切片上で培養したとこ
ろ多くの吸収窩が認められ、それらはカルシトニンの添
加により抑制された。従って本実験系で形成された破骨
細胞は骨吸収能とカルシトニンリセプターを有する成熟
破骨細胞であると考えられた。

【００３９】実験３ マウスＩＬ−６とマウス可溶性Ｉ
Ｌ−６リセプター共存下での破骨細胞形成に対するマウ
ス抗ＩＬ−６リセプター抗体（ＭＲ１６−１もしくはＲ
Ｓ１２）またはマウス抗ＩＬ−６抗体の抑制効果 ２０ng／mlまたは２００ng／mlのマウスＩＬ−６に６
２．５ng／ml〜５００ng／mlのｓＲ３２４を共存させた
時の破骨細胞形成能を調べたところ、実験２と同様にｓ
Ｒ３２４の濃度に依存して著明な破骨細胞の形成が認め
られた。２０ng／mlのマウスＩＬ−６と５００ng／mlの
ｓＲ３２４による破骨細胞形成に対してＭＲ１６−１は
１ng／ml〜１００ng／mlの濃度範囲で濃度依存的な抑制
作用を示した。ＲＳ１２およびマウス抗ＩＬ−６抗体は
１０ng／mlと１００ng／mlで抑制作用を示した（図
５）。

【００４０】実施例３ マウスＩＬ−６、マウス可溶性
ＩＬ−６リセプターおよびヒトＩＬ−１αの共存下で惹
起される骨吸収に対する抗マウスＩＬ−６リセプター抗
体（ＭＲ１６−１）の抑制効果 母親マウスに⁴⁵ＣａＣｌ₂ を皮下投与することによって
⁴⁵Ｃａ標識された頭蓋冠を妊娠１６日令の胎児より採取
し、１mg／mlのＢＳＡを含むＢＧＪｂ培地で５％Ｃ
Ｏ₂ ，３７℃にて器官培養した。２４時間後、新たな培
地に交換し、１００pg／mlのヒトＩＬ−１α，２０ng／
mlのマウスＩＬ−６および５００ng／mlのマウス可溶性
ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２４）を添加して、３７℃，５％Ｃ
Ｏ₂ で５日間培養した。この場合、前記新たな培地に被
験物質であるＭＲ１６−１を１０μｇ／ml添加した。こ
の実験系で惹起される骨吸収を、１０μｇ／mlのＭＲ１
６−１はほぼ完全に抑制した（図６）。

【００４１】

【発明の効果】以上の通り、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を有効成
分とする本発明の骨吸収抑制剤は、ＩＬ−６とＩＬ−６
Ｒの共存下での破骨細胞の形成を抑制し、骨吸収阻害効
果を有していることが証明される。従って、本発明の骨
吸収抑制剤は、骨吸収が関与する各種骨代謝疾患、例え
ば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、腫瘍性
高カルシウム血症、腎性骨異栄養、ペーゼット症、骨転
移、骨肉腫等の治療剤として期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞のＩＬ−６依存
性増殖に対する抗体ＭＲ１６−１及びＲＳ１２の効果を
示すグラフである。

【図２】図２は、ＯＶＸ（２週）マウスからの骨髄液の
骨吸収活性に対する、抗体の中和効果を示すグラフであ
る。

【図３】図３は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養
系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又は可溶性Ｉ
Ｌ−６Ｒ（ｓＲ３２４）単独による効果を示すグラフで
ある。

【図４】図４は、マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養
系での破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６又はｓＲ３２
４の併用の効果を示すグラフである。

【図５】図５は、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３２
４）の共存下でのマウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養
による破骨細胞の形成に対する、ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制
効果を示すグラフである。

【図６】図６は、ＩＬ−６，可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＲ３
２４）およびＩＬ−１αの共存下での⁴⁵Ｃａ放出に対す
る、抗ＩＬ−６Ｒ抗体の抑制効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮浦 千里 神奈川県横浜市緑区美しケ丘４−24−32 (72)発明者 須田 立雄 東京都立川市若葉町１−８−５

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン６リセプターに対する
   抗体を有効成分とする骨吸収抑制剤。
2. 【請求項２】 前記インターロイキン６リセプターに対
   する抗体がマウス由来であることを特徴とする請求項１
   記載の骨吸収抑制剤。
3. 【請求項３】 前記インターロイキン６リセプターがマ
   ウス由来であることを特徴とする請求項１又は２記載の
   骨吸収抑制剤。