JPH07170871A - 生物学的に活性なバチルス・チューリンゲンシス分離体、及び鞘翅目活性毒素をコードした遺伝子 - Google Patents

生物学的に活性なバチルス・チューリンゲンシス分離体、及び鞘翅目活性毒素をコードした遺伝子

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JPH07170871A
JPH07170871A JP4069340A JP6934092A JPH07170871A JP H07170871 A JPH07170871 A JP H07170871A JP 4069340 A JP4069340 A JP 4069340A JP 6934092 A JP6934092 A JP 6934092A JP H07170871 A JPH07170871 A JP H07170871A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、殺虫活性がある毒素、その
毒素をコードしたＤＮＡ又は遺伝子、コードしたＤＮＡ
を含む組替えＤＮＡ運搬ベクター、毒素をコードした遺
伝子によって形質転換された植物、微生物及びバクロウ
イルス、及び毒素含有微生物を含む殺虫方法及び殺虫組
成物の提供である。 【構成】 トウモロコシ・ルートワーム幼虫及びアルフ
ァルファ・ゾウムシに対して活性があり、Ｂ．ｔ．ＰＳ
８６Ａ１及びＢ．ｔ．ＰＳ８６Ｑ３と命名されるバチル
ス・チューリンゲンシスの単離体が開示され、特許請求
されている。さらに新規なδ−エンドトキシンをコ−ド
する遺伝子をこれらの単離体から除いて他の宿主微生物
又は植物に移すことが出来る。そのような宿主でδ−エ
ンドトキシンを表現すると感受性の鞘翅類昆虫を抑制で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生物学的に活性なバチル
ス・チューリンゲンシス分離体、及び鞘翅目活性毒素を
コードした遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】バチルス・チューリンゲンシス(B.t.)の
何百の菌株はδ-エンドトキシンと指定される殺虫毒素
を生産する。これらは胞子形成するB.t.細胞によって合
成される。この毒素が感受性のある昆虫の幼虫によって
摂取されると、腸上皮細胞が破壊される。
【０００３】B.t.の報告された活性スペクトルは、鱗翅
目（Lepidoptera）と鞘翅目（Coleoptera）内の昆虫種
を包含し、その多くは農林業の主要害虫である。活性ス
ペクトルはまた、蚊とブヨを含む双翅目(Diptera)の昆
虫を包含している。コウチ・ティー・エル(Couch, T.
L.)(1980年)「バチルス・チューリンゲンシス・バラエテ
ィ・イスラエレンシス（B.thuringiensis var. israele
nsis）の蚊病原性」工業微生物学の発展22巻61-76頁；
ビーグル・シー・シー(Beegle, C.C.)(1978年)「農業生
態系における昆虫体内細菌の使用」工業微生物学の発展
20巻97-104頁を参照のこと。双翅目昆虫は非常に厄介な
ものであり、またマラリア、回旋糸状虫症、ウマ脳炎、
及びイヌ糸状虫のようなヒトや動物の多くの重大な病気
の媒介物である。
【０００４】アメリカ合衆国トウモロコシ畑の約930万
エーカーが、さまざまな種のトウモロコシ・ルートワー
ムに荒されており、これに含まれるものとしては北部ト
ウモロコシ・ルートワーム（ディアブロチカ・バルベリ
Diabrotica barberi）、南部トウモロコシ・ルートワ
ーム（Ｄ・ウンデクイムプンクタータ・ハワーディ D.u
ndecimpunctata howardi）、及び西部トウモロコシ・ル
ートワーム（Ｄ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ D.
virgifera virgifera）が含まれる。これらのディアブ
ロチカ種の土壌生息幼虫は、トウモロコシの根を食し、
トウモロコシ苗木の倒伏を起こす。このため、終には収
穫減少や苗木の枯死をもたらす。トウモロコシ穂の毛を
食すことによって、成虫は授粉を低下させ、従って苗木
当たりのトウモロコシ収量を低下させる。更に、南部ト
ウモロコシ・ルートワームの成虫と幼虫は班点のあるウ
リハムシ（spotted cucumber beetle）としても知ら
れ、ウリ科作物（キュウリ、メロン、カボチャ等）や、
商業生産ならびに家庭菜園の多くの野菜及び畑作物を襲
う。
【０００５】トウモロコシ・ルートワームの防除は、部
分的には作物の輪作や、不定根系の成長を刺激するため
の高窒素水準の適用といった栽培法によって行なわれて
きた。しかし、所望の防除水準を保証するために、化学
殺虫剤には大幅に依存している。殺虫剤は土壌上に帯状
に施用されるか、土壌中に混入される。これらの化学薬
品の使用に関わる主要な問題は、処理される昆虫集団に
耐性が発達することである。
【０００６】米国特許第4,849,217号は、アルファルフ
ァ・ゾウムシに対して活性のあるバチルス・チューリン
ゲンシス分離体を明らかにしている。明らかにされた分
離体の一つは、Ｂ・チューリンゲンシスPS86A1（NRRL B
-18400）である。アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ・
ポスチカ Hypera postica）及び近縁関係のあるエジプ
ト・アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ・ブルネイペニ
ス Hypera brunneipennis）は、米国で生育するアルフ
ァルファの最も重要な害虫であり、1984年に290万エー
カーが虫害を受けている。これらの害虫の防除のため、
年間２千万ドルが使われている。エジプト・アルファル
ファ・ゾウムシは合衆国南西部で優勢な種であり、暑い
夏期には夏眠（つまり冬眠）をする。その他の点では、
合衆国のほかの地域で優勢なアルファルファ・ゾウムシ
と同じである。
【０００７】ゾウムシの生活周期の中で、幼虫段階がも
っとも被害をもたらす。アルファルファ植物の成長点を
食することにより、幼虫は葉の葉脈化、矮化、成長低
下、及び最終的に収穫低下をもたらす。重大な虫害は牧
草の刈取り全体を損う。成虫は葉も食べるため、程度は
落ちるが追加の被害をもたらす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】化学殺虫剤は、アルフ
ァルファ・ゾウムシの有効な防除に大きな役割を果た
す。しかし、その使用には以下のような幾つかの問題が
ある。 １． 哺乳類への急性毒性。ゾウムシ防除に使用される
最も有効な殺虫剤の幾つかは、ヒトその他の哺乳類に非
常に有毒であり、多くの州で限定的な基盤で販売されて
いる。毒性残留物は家畜飼料として販売される干し草に
とって追加の問題となっている。 ２． ミツバチ毒性： ミツバチは、アルファルファ・
ゾウムシの防除用に使用される殺虫剤の幾つかに感受性
がある。合衆国では、アルファルファが商業用ミツバチ
集団にとって主要な蜜の給源であるため、ミツバチ毒性
をもった殺虫剤の使用は、蜂蜜生産業者の必要と相いれ
ない。 ３． 天敵への毒性： 通常、副次的なアルファルファ
害虫（アリマキ、クモダニ、ヨコバイ、イモムシ）の集
団を防除する助けになる昆虫寄生虫や捕食動物は、アル
ファルファ・ゾウムシの防除に現在使用されているすべ
ての殺虫剤に非常に感受性がある。益虫の数が減るとこ
れらの副次的な害虫集団が増加し（二次的害虫の急発
生）、その結果、追加の殺虫剤施用を要することにな
る。アリマキやダニの二次的害虫発生は、しばしば、深
刻な収穫減少につながる。
【０００９】現在、もっと有効な防除剤、特に選択的に
作用し、アルファルファに破壊的となりうるダニ類とア
リマキ類の二次的急増を生じないような効果的な薬剤の
必要性がある。
【００１０】大腸菌におけるB.t.結晶タンパク遺伝子の
クローニング及び発現は、公表文献に記述されている
［シュネフ・エッチ・イー（Schnepf, H.E.）及びホワ
イトリー・エッチ・アール（Whitely, H.R.）[1981年]
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78巻2893-2897頁］。合衆
国特許第4,448,885号及び合衆国特許第4,467,036号は、
大腸菌でのB.t.結晶タンパクの発現を明らかにしてい
る。欧州特許出願公告第0202 739号は、種々の環境中で
鞘翅目害虫を防除するのに使用できる新規なＢ・チュー
リンゲンシス微生物を明らかにしている。
【００１１】
【課題を解決する手段】本発明はトウモロコシ・ルート
ワーム幼虫（ディアブロチカ・ウンデクイムプンクター
タ・ウンデクイムプンクタータ）及びエジプト・アルフ
ァルファ・ゾウムシ（ヒペラ・ブルネイペニス）に対す
る活性をもった新規なバチルス・チューリンゲンシス分
離体に関する。また、鞘翅目害虫に有毒な新規な毒素を
発現する新規な毒素遺伝子も明らかにされ、特許請求さ
れている。この毒素遺伝子は、プラスミドベクターを経
由して適当なホストに移すことができる。
【００１２】特定的には、本発明はB.t.PS86A1及びB.t.
PS86Q3と指定されるB.t.分離体とその突然変異株、及び
トウモロコシ・ルートワーム幼虫とエジプト・アルファ
ルファ・ゾウムシに対して活性のあるタンパクをコード
した、これらのB.t.分離体から得られる新規なδ-エン
ドトキシン遺伝子を含めてなる。本明細書で明らかにさ
れているB.t.微生物及び形質転換された微生物は、単独
でも、混合物でも使用できる。本発明はまた、SDS-PAGE
で決定されるとおりに、配列ID No.1で示されるＤＮＡ
配列をもった約58 kDaのタンパクをコードした新規なエ
ンドトキシン遺伝子を含めてなる。また、配列ID No.2
に示すアミノ酸配列をもった新規な毒素も、本発明の態
様に含まれる。
【００１３】明細書中に記載の配列と添付図面の説明は
以下の通りである。図１は、B.t.PS86Q3とPS86A1のアル
カリ可溶性タンパクを示す9％SDSポリアクリルアミドゲ
ルの写真である。図２は、アルファルファ・ゾウムシに
活性のあるB.t.菌株のアルカリ可溶性タンパクを示す標
準的なSDSポリアクリルアミドゲルの写真である。すべ
てのＢ・チューリンゲンシス菌株は、合衆国第4,849,21
7号に明らかにされているが、但しＢ・チューリンゲン
シスPS86Q3は本明細書で明らかにされている。図３は、
プラスミドpMYC2320の制限地図である。配列ＩＤ No.1
は遺伝子86A1-Aプローブ、配列ＩＤ No.2はN末端アミノ
酸配列、配列ＩＤ No.3は新規な遺伝子のＤＮＡ配列、
配列ＩＤ No.4は新規な毒素のアミノ酸配列である。
【００１４】本発明のバチルス・チューリンゲンシス分
離体は、以下の特性をもっている。 B.t.PS86A1 集落形態 -- B.t.に典型的な大集落で、表面
はくすんでいる。 増殖期の細胞形態 -- B.t.に典型的。 培養法 -- B.t.に典型的。 活性 -- 封入体はトウモロコシ・ルート
ワーム幼虫とアルファルファ・ゾウムシ幼虫を死滅させ
る。 封入体型 -- 複数アタッチト（密着） タンパク分子量（kDa） -- 58, 45 B.t.PS86Q3 集落形態 -- B.t.に典型的な大集落で、表面
はくすんでいる。 増殖期の細胞形態 -- B.t.に典型的。 培養法 -- B.t.に典型的。 活性 -- 封入体はトウモロコシ・ルート
ワーム幼虫とアルファルファ・ゾウムシ幼虫を死滅させ
る。 封入体型 -- 長くアタッチト（密着） タンパク分子量（kDa） -- 155, 135, 98, 62, 58
【００１５】本発明のB.t.分離体とその突然変異株は、
標準的な既知培地及び発酵法を用いて培養できる。発酵
周期が完了したら、この技術で周知の手段によって、初
めにB.t.胞子及び結晶を分離することによって、細菌を
取り入れることができる。回収されたB.t.胞子及び結晶
は、表面活性剤、分散剤、不活性担体、及び特定目標害
虫用に取扱いと施用を容易にするためのその他成分を添
加することによって、水和剤、濃厚液、粒剤、その他処
方剤に処方できる。処方及び施用手順はこの技術で周知
であり、市販の菌株で使用されている。新規なB.t.分離
体とその突然変異株は、本発明で明らかにされている害
虫の防除に使用できる。
【００１６】B.t.PS86A1の新規な毒素遺伝子は、本明細
書で明らかにされているとおりに得られた。
【００１７】本発明の培養基は、61604合衆国イリノイ
州ピオリア、ノース・ユニヴァーシティ・ストリート18
15番地、北部地域研究センター、農業研究サービス特許
培養基保存施設（NRRL）に寄託された。 培養基 呼出番号 寄託期日 バチルス・チューリンゲンシスPS86A1 NRRL B-18400 1988年8月16日 バチルス・チューリンゲンシスPS86Q3 NRRL B-18765 1991年2月6日 大腸菌NM522（pMYC2320） NRRL B-18769 1991年2月14日
【００１８】本培養基は、37 CFR1.14及び35 USC 122の
下に特許庁長官が権原ありと認めた者は、本願対応の米
国特許出願の係属中に培養基を入手できることを保証さ
れるという条件の下に寄託された。また、本出願又はそ
の子孫の対応特許出願が提出されている国々の特許法で
要求されるなら寄託物は入手できる。しかし、寄託物が
入手できるからといって、行政行為によって付与された
特許権を損わしめて本発明を実施する権利を構成するも
のではないことを理解すべきである。
【００１９】更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生
物寄託条約の規定に従って保存され、一般の人々に入手
可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最
も最近の請求後少なくとも5年間、かつどんな場合も、
寄託期日から少なくとも30年間か、又は培養基を開示し
て発行される特許の権利行使可能な期間中、これらの寄
託物は、生育可能で汚染されていない状態に保つために
必要なあらゆる配慮をもって保存される。要求を受けた
受託施設が、寄託物の状態のために試料を供給できない
場合には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるもの
である。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関する
すべての制限は、これらを開示した特許の付与に際して
永久に取り除かれる。
【００２０】本培養基は認められた高い資格をもつ培養
基保存施設に寄託された。本発明はまた、他の培養基保
存施設における同じ培養基の寄託物を包含する。このた
め、開示及び特許請求は本明細書に明らかにされた特定
の培養基呼出番号に限定されない。また、本明細書で明
らかにされた培養基の同じ生物学的活性特性をもつこと
が示された他の保存施設の寄託物も、本発明の範囲内に
ある。
【００２１】本発明の新規な分離体によって保たれてい
る毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホストへ導入できる。
毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に殺虫剤の細胞内生
産と保有をもたらす。適当なホスト、例えばシュードモ
ナスの場合、微生物はトウモロコシ・ルートワーム幼虫
又はアルファルファ・ゾウムシの発生位置に施用される
と、そこで増殖し、幼虫又はゾウムシに摂取される。そ
の結果、これらの害虫を防除できる。その代わりに、毒
素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる毒素の
活性を持続させるような条件下に処理できる。次に処理
細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物はB.t.
毒素の毒性を保持している。
【００２２】B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経て微
生物ホストへ導入されて、このホストが生きている状態
で環境へ施用される場合に、あるホスト微生物を使用す
ることが必須である。微生物ホストは、土壌を占有する
ことが知られたものを選択する。これらの微生物は、土
壌中で野性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、
ポリペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と
発現を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と
不活性化からの改良された保護を提供する。
【００２３】根の領域(植物の根の周囲の土壌)に生息す
る多数の微生物が知られている。これらの微生物は細
菌、藻類及びカビを包含している。特に興味あるもの
は、細菌、例えばバチルス(Bacillus)、シュードモナス
(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、セラティア(S
erratia)、クレブシェラ(Klebsiella)、キサントモナス
(Xanthomonas)、ストレプトミセス(Streptomyces)、リ
ゾビウム(Rhizobium)、ロードシュードモナス(Rhodopse
udomonas)、メチロフィリウス(Methylophilius)、アグ
ロバクテリウム(Agrobacterium)、アセトバクター(Acet
obacter)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、アースロバクタ
ー(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azotobacter)、リ
ューコノストック(Leuconostoc)、アルカリゲネス(Alca
ligenes)及びクロストリジウム（Clostridium）属の細
菌；真菌類、特に酵母、例えばサッカロミセス(Sacchar
omyces)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、クルイベ
ロミセス(Kluyveromyces)、スポロボロミセス(Sporobol
omyces)、ロードトルラ(Rhodotorula)、及びオーレオバ
シジウム(Aureobasidium)属；ミクロ藻類、例えばシア
ノフィセアエ（Cyanophyceae）、プロクロロフィセアエ
（Prochlorophyceae）、ロードフィセアエ（Rhodophyce
ae）、ジノフィセアエ（Dinophyceae）、クリソフィセ
アエ（Chrysophyceae）、プリムネシオフィセアエ（Pry
mnesiopyceae）、キサントフィセアエ（Xanthophycea
e）、ラフィドフィセアエ（Raphidophyceae）、バシラ
リオフィセアエ（Bacillariophyceae）、ユースチグマ
トフィセアエ（Eustigmatophyceae）、クリプトフィセ
アエ（Cryptophyceae）、ユーグレノフィセアエ（Eugle
nophyceae）、プラシノフィセアエ（Prasinophycea
e）、及びクロロフィセアエ（chlorophyceae）科の藻類
などの微生物である。特に重要なものは、シュードモナ
ス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナ
ス・フルオレッセンス、セラティア・マルセスケンス(S
erratia marcescens)、アセトバクター・キシリヌム(Ac
etobacter xylinum)、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens)、ロードシュード
モナス・スフェロイデス(Rhodopseudomonas spheroide
s)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonascamp
estris)、リゾビウム・メリオチ(Rhizobium melioti)、
アルカリゲネス・エントロフス(Alcaligenes entrophu
s)、及びアゾトバクター・ヴィンランディ(Azotobacter
vinlandii)のような植物領域の細菌種；及びロードト
ルラ・ルブラ(Rhodotorula rubra)、R.グルチニス(R. g
lutinis)、R.マリーナ(R. marina)、R.オーランティア
カ(R.aurantiaca)、クリプトコッカス・アルビダス(Cry
ptococcus albidus)、C.ジフルエンス(C. diffluens)、
C.ローレンティ(C. laurentii)、サッカロミセス・ロゼ
イ(S. rosei)、S.プレトリエンシス(S. pretoriensi
s)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、スポロボロミセス
・ロゼウス(Sporobolomyces roseus)、S.オドルス(S. o
dorus)、クルイベロミセス・ヴェローナエ(Kluyveromyc
es veronae)及びオーレオバシジウム・ポルランス(Aure
obasidium pollulans)のような植物領域の酵母種であ
る。特に重要なのは有色素微生物である。
【００２４】遺伝子の安定な保持と発現を可能とするよ
うな条件下に、毒素を発現させるB.t.遺伝子を微生物ホ
ストに導入するには、さまざまな方法を利用できる。毒
素遺伝子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の
毒素遺伝子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の
配列と相同のDNA配列、また組込みや安定な保持が起こ
るための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだDNA
構造体を用意することができる。
【００２５】転写開始信号はプロモータと転写開始出発
位置を包含しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を
提供して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるよ
うにするのが望ましいこともある。これはオペレータ、
又はアクチベータやエンハンサに結合する領域、によっ
て達成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の
変化によって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域
を使用すると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育で
き、環境へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実
験室で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用
し、一方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするも
のを使用できる。転写開始には、リボソーム結合位置と
開始コドンが存在しよう。
【００２６】メッセンジャーＲＮＡの安定性を強化する
配列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用して
メッセンジャーＲＮＡの発現を強化するために種々の操
作を使用できる。転写及び翻訳終結領域は停止コドン、
終結領域、及び任意にポリアデニル化信号を包含しよ
う。内膜を経由する蛋白の分泌を促進するために、翻訳
されたポリペプチド配列のアミノ末端に疎水性「リーダ
ー」配列を使用できる。
【００２７】転写の方向、すなわちコーディング又はセ
ンス配列の5'から3'への方向で、構造体は転写調節領域
(これがある場合)とプロモータ（制御領域はプロモータ
の5'又は3'のいずれかにある)、リボゾーム結合位置、
開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもっ
た構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列
(使用する場合)、及び終結領域を包含しよう。二本鎖と
してのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使
用できるが、通常マーカーを含めたDNA配列を伴ってお
り、この第二のDNA配列はホストへのDNA導入中に毒素発
現構造体に結合させることができる。
【００２８】マーカーとは、変更又は形質転換されたホ
ストの選定を行なうための構造遺伝子のことである。マ
ーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば抗
生物質や重金属への耐性などの殺生物剤耐性や、栄養素
要求ホストに原栄養性を与える相補性を提供する。変更
されたホストが選定されるだけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカーを使
用できる。野外で他の野性型微生物に対する競合的利点
を提供することによって、生物を更に変更できる。例え
ば、金属キレート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺
伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入
できる。この方法で、シデロフォアの強化された発現が
毒素生産ホストに競合的利点を提供するため、ホストは
野性型微生物と効果的に競合し、環境中で安定した生態
的地位を占めるようになる。
【００２９】機能的な複製系が存在しない場合、構造体
はホスト内の配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、
好ましくは少なくとも約100 bp、及び通常約5,000 bpま
での配列を包含しよう。こうして合法的な組換えの可能
性が強化されるため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホス
トによって安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提
供する遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接
しているのが望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる
場合、生ずる生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点
を提供する遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の
構造体を保持している遺伝子と環境中で競合できなくな
る。
【００３０】細菌、バクテリオファージ、シアノバクテ
リア、藻類、真菌類等のような広範囲の微生物ホストか
ら多数の転写調節領域が入手できる。種々の転写調節領
域は、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及
び右プロモータ、tacプロモータ、及びホスト中で機能
的な場合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモー
タを包含する。例として合衆国特許第4,332,898号、第
4,342,832号及び第4,356,270号を参照のこと。終結領域
は、普通は転写開始領域又は別の転写開始領域(二つの
領域がホスト内で適合的で機能的である限りにおいて)
と関連する終結領域でありうる。
【００３１】安定なエピゾーム保持又は組込みを所望す
る場合は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミ
ドが使用されよう。複製系は染色体、ホスト又は異なる
ホスト内に通常存在するエピゾーム要素から、又はホス
ト内で安定なウイルスの複製系から誘導される。pBR32
2、pACYC184、RSF1010、pRO1614等のような多数のプラ
スミドが入手できる。例として、オルソン(Olson)ら、
(1982年) J. Bacteriol.150巻6069頁、及びバグダサリ
アン(Bagdasarian)ら、(1981年) Gene 16巻237頁、並び
に合衆国特許第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,
371,625号を参照のこと。
【００３２】B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にある
ように、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に
導入できる。この構造体はプラスミドに含有され、プラ
スミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以
上を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開
発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終
ホストでの機能発揮に必要である。更に、すでに述べた
一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが
望ましい。
【００３３】形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生
物が存在する時は、それらに対して所望生物を選定でき
るように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離
できる。次に形質転換体を殺虫活性のために試験でき
る。
【００３４】処理細胞を目標害虫環境に施用する時に細
胞内毒素の活性を持続させるために、殺虫剤含有細胞を
処理するのに適したホスト細胞は、原核生物か真核生物
を包含するが、通常、哺乳類のような高等動物に有毒な
物質を生じない細胞に限定される。しかし、毒素が不安
定か、哺乳類ホストへの毒性の可能性を回避するのに十
分な低い施用水準である場合には、高等生物に有毒な物
質をつくる生物も使用できる。ホストとして特に興味あ
るものは、原核生物と、真菌類のような低級真核生物で
ある。グラム陰性・陽性双方の原核生物の例はエシェリ
キア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、シゲラ(S
higella)、サルモネラ(Salmonella)及びプロテウス(Pro
teus)のような腸内細菌科(Enterobacteriaceae)；バチ
ルス科(Bacillaceae)；リゾビウム(Rhizobium)のような
リゾビウム科(Rhizobiaceae)；発光細菌、ジモモナス(Z
ymomonas)、セラティア(Serratia)、アエロモナス(Aero
monas)、ビブリオ(Vibrio)、デスルホビブリオ(Desulfo
vibrio)、スピリルム(Spirillum)のようならせん菌科；
乳酸かん菌科;シュードモナス(Pseudomonas)及びアセト
バクター(Acetobacter)のようなシュードモナス科；ア
ゾトバクター科、及びニトロバクター科を包含する。真
核生物には藻菌類(Phycomycetes)と子のう菌類(Ascomyc
etes)のような真菌類があり、これはサッカロミセス(Sa
ccharomyces)とシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyc
es)のような酵母、ロードトルラ(Rhodotorula)、オーレ
オバシジウム(Aureobasidium)、スポロボロミセス(Spor
obolomyces)のような担子菌類(Basidiomycetes)の酵母
を包含する。
【００３５】生産目的のためにホスト細胞を選択する上
で特に重要な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容
易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の
安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤
ミクロカプセルとして使用するのに重要な特性は厚い細
胞壁、色素形成、及び封入体の細胞内パッケージング又
は形成のような殺虫剤保護性；水性環境での生存性；対
哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取させるための誘引力；毒
素に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他
の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、経済性、保存
安定性等がある。
【００３６】特に重要なホスト生物は、ロードトルラ
種、オーレオバシジウム種、サッカロミセス種、スポロ
ボロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウ
ィニア種、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生
息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バチルス
種等の他の生物を包含する。特定的な生物は、シュード
モナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュ
ードモナス・フルオレッセンス(P.fluorescens)、サッ
カロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、
バチルス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌(B.sub
tilis)等を包含する。
【００３７】細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子
型よりも実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も
使用できる。
【００３８】微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含有
する微生物の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさない
か、又は毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、
化学的又は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的
手段の組合わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化
剤、特に原子番号17-80のハロゲンである。もっと特定
的には、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成す
るのに十分な時間に使用できる。他の適当な手法は、ホ
ルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒ
ド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのよう
な抗感染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのよ
うなアルコール類；ルゴールヨウ素、ブアン固定剤、及
びヘリー固定剤［フマソン(Humason)、グレッチェン・
エル(Gretch-en, L.)「動物組織手法」ダブリュー・エ
ッチ・フリーマン社、1967年、を参照］のような種々の
組織学的固定剤等での処理；又はホスト動物に細胞を投
与する時に細胞中につくられる毒素の活性を保持し、持
続させるような物理的処理（加熱）と化学薬剤処理との
組合わせを包含する。物理的手段の例は、ガンマ放射線
とＸ線のような短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥
等である。
【００３９】一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強
化するような、強化された構造安定性をもつであろう。
殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えばホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制しうる。不活性化ないし殺虫方法は、毒素の少な
くとも実質量の生物学的利用率又は生物活性を保持す
る。
【００４０】B.t.殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは
任意慣用の栄養培地で生育できるが、ＤＮＡ構造体は選
択的利点を提供するため、細胞の全量又は実質的全量が
B.t.遺伝子を保持するように選択培地となる。次にこれ
らの細胞を慣用方法に従って取り入れる。その代わり
に、細胞を取り入れる前に処理することもできる。
【００４１】本発明のB.t.細胞は、標準技術の培地及び
発酵法を用いて培養できる。発酵周期の完了後、初めに
この技術で周知の手段によって発酵液からB.t.胞子及び
結晶を分離することによって細菌を取り入れることがで
きる。回収されたB.t.胞子及び結晶を、表面活性剤、分
散剤、不活性担体、及び特定目標害虫の取扱いと施用を
容易にするためのその他の成分の添加によって、水和
剤、濃厚液、粒剤、又はその他の処方剤に処方できる。
これらの処方及び施用手順はこの技術で周知である。
【００４２】B.t.分離体の胞子及び結晶、又は本明細書
で明らかにされているB.t.分離体から得られる遺伝子を
含めてなる組替え微生物と、誘引剤とを含有する処方さ
れた粒状餌を土壌に施用できる。処方された生成物を、
種子被覆や根の処理として、又は作物周期の後の段階で
の植物全体の処理のため施用できる。
【００４３】殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮
液か直接使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫
剤は少なくとも1重量%で存在し、100重量%でありうる。
乾燥処方剤は約1-95重量%の殺虫剤をもつが、液体処方
剤は一般に約1-60重量%の固形分を液相中にもつであろ
う。処方剤は概してmg当たり約102ないし約104個の細胞
をもつであろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約
50 mg(液体又は乾燥)ないし1 kg以上の率で投与されよ
う。
【００４４】処方剤はアルファルファ・ゾウムシ又はト
ウモロコシ・ルートワーム幼虫環境、例えば土壌に噴
霧、散布、散水等によって施用できる。
【００４５】本発明の新規な分離体の突然変異株は、こ
の技術で周知の手順によってつくることができる。例え
ば、胞子非形成変異株は新規な分離体のエチルメタンス
ルホネート（EMS）変異誘発によって得られる。また、
この技術で周知の手順により、紫外線及びニトロソグア
ニジンを用いて突然変異株をつくることができる。
【００４６】小さな割合の胞子非形成変異株は無傷にと
どまり、長期の発酵のあいだ溶菌しない。これらの菌株
は溶菌マイナス（-）と指定される。溶菌マイナス菌株
は振とうフラスコの培地中で胞子非形成変異株を検査
し、発酵の終りにまだ無傷で毒素結晶を含有する突然変
異株を選定することによって確認できる。溶菌マイナス
菌株は、保護されカプセル封入された毒素タンパクを生
ずるような細胞固定化法に適している。
【００４７】上記の胞子非形成変異株のファージ耐性変
種をつくるには、ファージ溶菌液のアリコートを栄養寒
天上に広げ、乾燥させる。次に、ファージ感受性菌株の
アリコートを乾燥した溶菌上に直接プレートし、乾燥さ
せる。プレートを30℃で培養する。プレートを２日間培
養し、この時点で多数の集落が寒天上に生育しているの
を観察できる。これらの集落の幾つかを取り上げ、栄養
寒天プレート上で二次培養する。これらの明白な耐性培
養基をファージ溶菌液との交差線条接種によって耐性に
ついて試験する。ファージ溶菌液の１本の線をプレート
上に線条接種し、乾燥させる。次に、推定上の耐性培養
基をファージ線に交差するように線条接種する。耐性菌
の培養基は、30℃で一夜培養後、ファージ線に交差する
線条のどこでも溶菌を示さない。次に、ファージ耐性
は、栄養寒天プレート上に耐性培養基を一面にプレート
することによって再確認される。陽性対照として役立た
せるため、感受性菌株も同様にプレートする。乾燥後、
ファージ溶菌液の一滴をプレート中心部に撒き、乾燥さ
せる。耐性培養基は、30℃で24時間培養後、ファージ溶
菌液を置いた場所で溶菌を示さなかった。
【００４８】
【実施例】以下は、本発明を実施するために、最善の方
式を含めた手順を例示している実施例である。これらの
実施例は限定的に考えられてはならない。他に注意がな
ければ、百分率はすべて重量、溶媒混合物の割合はすべ
て容量による。
【００４９】実施例１ B.t.分離体の培養 B.t.分離体又はその突然変異株の二次培養基を使用して
次の培地、すなわちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種
した。 バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH2PO4 3.4 g/l K2HPO4 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl2溶液 5.0 ml/l pH 7.2 塩溶液(100 ml) MgSO4・7H2O 2.46 g MnSO4・H2O 0.04 g ZnSO4・7H20 0.28 g FeSO4・7H2O 0.40 g CaCl2溶液(100 ml) CaCl2・2H2O 3.66 g
【００５０】塩溶液とCaCl2溶液を濾過滅菌し、オート
クレーブ処理し調理ずみブロスに、接種時に添加する。
200 rpmで操作される回転振とう機で、フラスコを30
℃、64時間培養する。
【００５１】上の手順は、この技術で周知の手順によ
り、大発酵装置まで容易に規模拡大できる。
【００５２】上の発酵で得られるB.t.胞子及び/又は結
晶は、この技術で周知の手順により単離できる。しばし
ば用いられる手順は、取り入れた発酵液を分離手順、例
えば遠心分離にかけることである。
【００５３】B.t.PS86A1からの鞘翅類活性毒素の精製に
関して、パラ胞子封入体、胞子、及び細胞破砕物を遠心
分離（7.14k*g*20分）によって集めた。パラ胞子封入体
を臭化ナトリウム（28-38％）密度勾配平衡遠心分離
［エム・エイ・ファンネンスチール（M.A. Pfannenstie
l）ら、[1984年] FEMS Microbiol. Lett. 21巻39頁］に
よって部分的に精製した。エジプト・アルファルファ・
ゾウムシ（ヒペラ・ブルネイペニス）に有毒な部分精製
タンパクを、ウエスタン・ブロット法［エッチ・トービ
ン（H. Towbin）ら、[1979年] Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76巻4350頁］によって、インモビロン-P、PVDF膜
（ミリポア社、マサチューセッツ州ベドフォード）に結
合した。N末端アミノ酸配列を、自動化ガス相分離装置
での標準的なエドマン反応［エム・ダブリュー・ハンカ
ピラー（M.W. Hunkapiller）ら、[1983年] Meth. Enzym
ol. 91巻399頁］によって決定した。得られた配列は以
下のとおりである。 ＮＨ2−ＭＩＩＤＳＫＴＴＬＰＲＨＳＬＩＨＴＩＫＬ−
ＣＯ2Ｈ この配列から次のオリゴヌクレオチドプローブが設計さ
れた。 ５' ATG ATT GAT TCT AAA ACA ACA TTA CCA AGA CAT TC
T／ATTA ATT／A CAT ACT／A ATT／A AA ３'
【００５４】実施例２ トウモロコシ・ルートワーム幼
虫に対するB.t.分離体の活性 既知の培地及び培養法を使用して、B.t.分離体PS86Q3及
びPS86A1を生育させることができる。胞子／結晶製剤
は、培養液を遠心分離にかけ、元の培養液の20倍の濃度
でSILWET(R)（ユニオンカーバイド社）表面活性剤（L-7
7）の0.05％水溶液でペレットをもどすことによって得
られる。この溶液50μlを、標準的な２４穴検定プレー
トの穴の人工ダイエット1 ml上にピペットで加えた。第
一齢のＤ・ウンデクイムプンクタータ・ウンデクイムプ
ンクタータ（D. undecimpunctata undecimpunctata）幼
虫を各穴に加えた。
【００５５】5-8日の検定期間の終わりに幼虫の体重を
計って、成長を測定した。成長の低下（Ｇ.Ｒ.）は、次
式によって決定された。 Ｇ.Ｒ.＝（１−Ｔ／Ｃ）*100 式中Ｃ＝対照幼虫の質量（mg）、及びＴ＝処理幼虫の質
量（mg） B.t.PS86A1及びPS86Q3は、いずれもD.u.ウンデクイムプ
ンクタータの成長率を低下させた（表１）。
【００５６】 表１ バチルス・チューリンゲンシス分離体で処理された餌を与えられたディア ブロチカ・ウンデクイムプンクタータ・ウンデクイムプンクタータの成長率低下 主要タンパク 成長低下 分離体 封入体 （kDa） （％） PS86A1 複数アタッチト 58, 45 86 PS86Q3 長いアタッチト 155, 135, 98, 62, 58 83
【００５７】実施例３ エジプト・アルファルファ・ゾ
ウムシに対するB.t.PS86Q3の活性 Ｂ・チューリンゲンシス分離体PS86Q3を、遠心分離によ
って濃縮された発酵液の噴霧乾燥粉末として試験した。
水と生物材料（胞子、結晶δ-エンドトキシン、細胞破
砕物、及び成長培地）からなるペレットを標準的な担
体、防腐剤、及び表面活性剤と混合した。25％生物材料
からなる粉末は、ヤマト噴霧乾燥機（ヤマト科学社（東
京）から販売）を用いて調製された。
【００５８】1.5％寒天ダイエット約２ mlを、〈コーニ
ング細胞穴TM〉２４穴検定プレート（コーニング・ガラ
ス・ワークス、ニューヨーク州コーニング）の各穴に加
えた。ダイエットを含有するトレーを空気フードの下で
乾燥した。PS86Q3の噴霧乾燥粉末をml当たり材料100 mg
で水に懸濁した。懸濁液50μlをダイエット上にピペッ
トした。次に、トレーを完全に乾燥するまで清浄な空気
フードに入れる。アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ・
ブルネイペニス）の第二齢幼虫を各穴に入れた。幼虫入
りトレーをポリオレン処理されたマイラーシートで覆
い、粘着アイロンで加熱密封する。マイラー覆いに小さ
なピンで注意ぶかく針穴を開け（穴当たり４個の針
穴）、トレーを25℃の培養器中に保持する。致死率の評
価を６日めに行なう。
【００５９】第二齢アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ
・ブルネイペニス）に対するB.t.の噴霧乾燥粉末PS86Q3
の毒性 B.t. 致死率 PS86Q3 79％ 対照 8％
【００６０】実施例４ バチルス・チューリンゲンシス
菌株PS86A1からの新規な毒素をコードした遺伝子の分子
クローニング 600 nmで1.0の光学密度に生育させたPS86A1細胞から全
細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心分離によってペレッ
ト化し、原形質緩衝液（0.3M庶糖中20 mg/mlリゾチー
ム、25 mMトリス-Cl、pH 8.0、25 mM EDTA）中に再懸濁
させた。37℃で１時間培養後、２周期の冷凍−解凍によ
って原形質を溶菌化した。0.1M NaCl、0.1％SDS、0.1M
トリス-Clの溶液９倍量を加えて溶菌化を完了させた。
透明溶菌液をフェノール：クロロホルム（1:1）で２回
抽出した。核酸を２倍容量のエタノールで沈殿させ、遠
心分離によってペレット化した。ペレットを10 mMトリ
ス-Cl、1mM EDTA(TE)（pH 8.0）中に再懸濁し、ＲＮＡs
eを50μg/mlの最終濃度に添加した。37℃で１時間培養
後、溶液をフェノール：クロロホルム（1:1）及びTE飽
和クロロホルムでそれぞれ１回抽出した。1/10量の3M N
aOAc及び２倍量のエタノールを添加して、ＤＮＡを水相
から沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化
し、70％エタノールで洗い、乾燥し、TEに再懸濁した。
【００６１】PS86A1ＤＮＡのサザーンブロットと、86A1
-Aで指定される32P-標識つきオリゴヌクレオチドプロー
ブとの標準ハイブリッド形成によって、制限断片長の多
型現象（RFLP）分析を行なった。86A1-Aプローブの配列
は以下のとおりであった。 ５'ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＣ
Ａ ＴＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＴ ＴＣＴ／Ａ ＴＴＡ ＡＴＴ／Ａ
ＣＡＴ ＡＣＴ／Ａ ＡＴＴ／Ａ ＡＡ ３'
【００６２】プローブを図に示すように、４位置で混合
した。ハイブリッド形成バンドは、約3.6 kbp HindIII
断片と約9.3 kbp EcoRV断片を包含した。
【００６３】Ｓau３Ａで部分消化させたPS86A1ＤＮＡか
ら遺伝子ライブラリーを構築した。部分的制限消化物を
アガロースゲル電気泳動によって分画した。6.6-23 kbp
の大きさのＤＮＡ断片をゲルから切出し、ゲルスライス
から電気溶離し、エルチップ-Ｄイオン交換カラムでの
精製後、エタノール沈殿によって回収した。Ｓau３Ａ挿
入物をＢamＨIで消化させたラムダＧＥＭ-11（プロメガ
社、ウィスコンシン州マジソン）へ連結させた。組替え
ファージをパッケージし、大腸菌ＫＷ251細胞（プロメ
ガ社）へプレートした。放射性標識つき86A1-Aオリゴヌ
クレオチドプローブとのハイブリッド形成によって、プ
ラークを選別した。ハイブリッド形成ファージをプラー
ク精製し、これを用いて標準手順によってファージＤＮ
Ａの単離のため大腸菌ＫＷ251細胞の液体培養基に感染
させた［マニアチス（Maniatis）ら[1982年] 「分子ク
ローニング：実験マニュアル」コールドスプリングハー
バー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー］。二次クローニングには、ＤＮＡの調製量をＥcoＲ
ＩとＳalＩで消化させ、アガロースゲル上の電気泳動に
かけた。毒素遺伝子を含有する約2.9 kbpのバンドをゲ
ルから切出し、ゲルスライスから電気溶離し、上のよう
にイオン交換クロマトグラフィによって精製した。精製
されたＤＮＡ挿入体を、ＥcoＲＩ＋ＳalＩで消化させた
pHTＢlueII（すなわちpBlueScript S/K（ストラタジー
ン社、カリフォルニア州サンディエゴ）とレジデントB.
t.プラスミドからの複製開始点［ディー・レレクラス
（D. Lereclus）ら、[1989年] FEMS Microbiol. Lett.
60巻211-218頁］とからなる大腸菌／B.t.シャトルベク
ター）へ連結させた。この連結混合物を使用して、冷凍
されたコンピテント大腸菌NM522細胞（ATCC 47000）を
形質転換させた。形質転換体を、アンピシリン、イソプ
ロピル-(β)-D-チオガラクトシド(IPTG)及び5-ブロモ-4
-クロロ-3-インドリル-(β)-D-ガラクトシド（XGAL)を
含有するLB寒天（前掲マニアチスら）上にプレートし
た。アルカリ溶菌（前掲マニアチス）によって推定上の
組替え型からプラスミドを精製し、アガロースゲル上で
ＥcoＲＩ及びＳalＩ消化物の電気泳動によって分析し
た。所望のプラスミド構造体pMYC2320は、本発明の新規
な毒素遺伝子を含有している。図１を参照。この遺伝子
のＤＮＡ配列を配列ＩＤNo.1に示す。この遺伝子で発現
される新規な毒素を、配列ＩＤNo.2に示す。
【００６４】プラスミドpMYC2320は、エレクトロポレー
ションによって結晶非形成（Cry-）B.t.ホスト（B.t.HD
-1 Cry B、エイ・アイ・アロンソン、パーデュー大学、
インディアナ州ウエストラファイアット）に導入され
た。約58 kDaタンパクの発現は、SDS-PAGE分析とアルフ
ァルファ・ゾウムシに対する活性によって立証される。
【００６５】本明細書で明らかにされた制限酵素は、ベ
テスダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）又は
ニューイングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州
ビバリー）から購入できる。酵素は、供給者から提供さ
れた指示に従って使用される。
【００６６】B.t.毒素遺伝子を含有するプラスミドpMYC
2320は、周知の標準的な手順を用いて、形質転換ホスト
微生物から除去できる。例えば、大腸菌NM522（pMYC232
O）を透明溶菌液等密度勾配手順などにかけると、pMYC2
320が回収される。
【００６７】この技術で周知のように、タンパクのアミ
ノ酸配列は、ＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定さ
れる。遺伝暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつ
くるのに使用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以
上の暗号化ヌクレオチドトリプレット(コドン)を使用で
きるため、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオ
チド配列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のよ
うに描くことができる。 フェニルアラニン(Phe) TTK ロイシン(Leu) XTY イソロイシン(Ile) ATM メチオニン(Met) ATG バリン(Val) GTL セリン(Ser) QRS プロリン(Pro) CCL スレオニン(Thr) ACL アラニン(Ala) GCL チロシン(Tyr) TAK ヒスチジン(His) CAK グルタミン(Gln) CAJ アスパラギン(Asn) AAK リジン(Lys) AAJ アスパラギン酸(Asp) GAK グルタミン酸(Glu) GAJ システイン(Cys) TGK トリプトファン(Trp) TGG アルギニン(Arg) WGZ グリシン(Gly) GGL 終結信号 TAJ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に5'末端、右側に3'末端をもつ伝令RNAのトリヌク
レオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはすべ
て、ウラシルにはチミンを置き換えた、mＲＮＡの配列
に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである。文字はデオキ
シヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩
基を示す。 A=アデニン G=グアニン C=シトシン T=チミン YがAまたはGの場合は、X=T又はC、YがCまたはTの場合
は、X=C、XがCの場合は、Y=A, G, C又はT、XがTの場合
は、Y=A又はG、ZがA又はGの場合は、W=C又はA、ZがC又
はTの場合は、W=C、WがCの場合は、Z=A, G, C又はT、W
がAの場合は、Z=A又はG、SがA, G, C又はTの場合は、QR
=TC又はその代わりにSがT又はCの場合は、QR=AG、J=A又
はG K=T又はC L=A, T, C又はG、M=A, C又はT。
【００６８】上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列
が、このタンパクの同じアミノ酸配列をコードした同等
なヌクレオチド配列によって調製できることを示す。従
って、本発明はこのような同等なヌクレオチド配列を包
含する。更に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構
造を変更しないならば、確認された構造及び機能のタン
パクが、このような変更によって構築できることが示さ
れた［カイザー・イー・ティー（Kaiser, E.T.）及びケ
ズディ・エフ・ジェイ（Kezdy, F.J.）（1984年）Scien
ce 223巻249-255頁]。このように、本発明はタンパクの
二次構造を変更しないような本明細書に記載のアミノ酸
配列の突然変異物、又は構造が変更される場合でも、生
物活性がある程度保持されるような突然変異物を包含す
る。
【００６９】実施例５ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な毒素をコードし
た、本発明のB.t.分離体から得られる新規な遺伝子は、
アグロバクター・ツメファシエンス(Agrobactertumefac
iens)からのTiプラスミドを使用して、植物細胞へ挿入
できる。次に植物細胞を植物へ再生させる[ザンブリス
キ・ピー(Zambryski, P.)、ジョース・エッチ(Joos,
H.)、ジェンテロ・シー(Gentello, C.)、リーマンス・
ジェイ(Leemans, J.)、バン・モンタギュー・エム(Van
Montague, M.)、及びシェル・ジェイ(Schell, J.)(1983
年) Cell 32巻1033-1043頁]。この点で、特に有用なベ
クターはpEND4Kである[クリー・エッチ・ジェイ(Klee,
H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ(Yanofsky, M.F.)及
びネスター・イー・ダブリュー(Nester, E.W.)(1985年)
Bio/Technology 3巻637-642頁]。このプラスミドは、植
物細胞と細菌中で複製でき、パッセンジャー遺伝子に対
して複数のクローニング位置をもっている。例えば毒素
遺伝子はpEND4KのBamHI部位へ挿入され、大腸菌中で増
殖し、適当な植物細胞へ形質転換される。
【００７０】実施例６ 新規なＢ・チューリンゲンシス
遺伝子のバクロウイルスへのクローニング 本発明のB.t.分離体から得られる新規な遺伝子を、オー
トグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)
核ポリヘドロシスウイルス(AcNPV)のようなバクロウイ
ルスへクローン化できる。pUC8のような市販のクローニ
ングベクターにクローン化されたAcNPVゲノムを含有す
るプラスミドを構築できる。AcNPVゲノムを変更し、ポ
リヘドリン遺伝子のコード領域が除かれて、パッセンジ
ャー遺伝子の特異なクローニング位置がポリヘドリンプ
ロモータの真後ろに置かれるようにする。このようなベ
クターの例は、ペノックら［ペノック・ジー・ディー(P
ennock, G.D.)、シューメーカー・シー(Shoemaker, C.)
及びミラー・エル・ケイ(Miller, L. K.)(1984年)Mol.
Cell Biol. 4巻399-406頁］に記述されたpGP-B6874、及
びスミスら[スミス・ジー・イー(Smith,G.E.)、サマー
ズ・エム・ディー(Summers, M.D.)及びフレーザー・エ
ム・ジェイ(Fraser, M.J.)(1983年)Mol.Cell Biol. 3巻
2156-2165頁]に記述されたpAC380である。本発明の新規
なタンパク毒素をコードした遺伝子は、コード領域から
上流及び下流の適当な領域で、BamHIリンカーによって
変更でき、AcNPVベクター類の一つのもののパッセンジ
ャー位置に挿入できる。
【００７１】実施例７ 分離体PS86A1からの精製タンパ
ク及びB.t.HD-1 Cry Bホスト中に発現された精製毒素
の、エジプト・アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ・ブ
ルネイペニス Hypera brunneipennis）に対する毒性 2 mg/mlの精製タンパク50 μlを標準的な２４穴の生物
検定プレートの穴中の人工ダイエット１ ml上にピペッ
トした。第一齢又は第二齢の幼虫を各穴に添加した。
【００７２】処理後６日に、致死率について検定物を等
級づけた。丸みのある探り針でつついても応答しない幼
虫は、死亡したものと考えられた。実験は、数日間連続
して繰り返した。毒性を表１に示す。
【００７３】 表１ エジプト・アルファルファ・ゾウムシ（ヒペラ・ブルネイペニス）に対す る精製タンパクの毒性 タンパク給源 平均致死率、％ PS86A1 46.8 B.t.HD-1 Cry B中に発現されたもの 61.5 未処理 2.0
【００７４】実施例８ B.t.HD-1 Cry Bホスト中に発現
された精製毒素による、西部班点つきウリハムシ（ディ
アブロチカ・ウンデクイムプンクタータ・ウンデクイム
プンクタータ）に対する成長抑制 ２ mg/mlの精製毒素水性懸濁液100μlを、標準的な２４
穴の生物検定プレートの穴中の人工ダイエット１ ml上
にピペットした。第一齢のD.u.ウンデクイムプンクター
タ幼虫を各穴に添加した。
【００７５】８日の検定期間の終わりに幼虫の重さを測
って、成長を測定した。成長減少率（Ｇ.Ｒ.）は次式に
よって決定された。 Ｇ.Ｒ. ＝ (1−Ｔ／Ｃ)*100 式中Ｃ＝対照幼虫の平均質量（mg）、及びＴ＝処理幼虫
の平均質量（mg）。実験は、別の日に繰り返された。精
製毒素は、未処理対照に比べて、D.u.ウンデクイムプン
クタータの成長率を36.6％低下させた。
【００７６】実施例９ 本発明の新規な毒素がB.t.HD-1 Cry Bホスト中に発現さ
れると、他のヒペラ種、例えばＨ．メレス（クローバー
頭花ゾウムシ）、Ｈ．ニグリロストリス（小クローバー
葉ゾウムシ）、Ｈ．ポスチカ（アルファルファ・ゾウム
シ）及びＨ．プンクタータ（クローバー葉ゾウムシ）に
対しても活性がある。
【００７７】配列一覧 (1) 一般情報 (i) 発明者： ナーバ、ケネス Ｅ（Narva, Kenneth
E.）、シュワブ、ジョージ Ｅ（Schwab, George E.）、
ブラドフィッシュ、グレゴリーＡ（Bradfisch, Gregory
A.）、トレーシー・マイケルズ（Tracy Michaels）、
ジュエル・Ｍ・ペイン（Jewel M. Payne） (ii) 発明の名称： 鞘翅目活性毒素をコードした新規
なバチルス・チューリンゲンシス遺伝子 (iii) 配列の数： ４ (iv) 連絡先 (A) 宛名：ローマン・サリワンチック（R
oman Saliwanchik）、(B) 街：N.W.41番街2421番地、A-
1号、(C) 市：ゲインズビル、(D) 州：フロリダ、(E)
国：米国、(F) 郵便番号：32606 (v) コンピュータ読取り形式 (A) 媒体の種類：フロッ
ピーディスク、(B)コンピュータ：IBM PC互換、(C) 操
作システム：PC-DOS/MS-DOS、(D) ソフトウェア：パテ
ントイン・リリース#1.0, バージョン#1.25 (vi) 現在の出願データ (A) 出願番号： (B) 出願
日： (C) 分類： (viii) 弁理士／代理人情報 (A) 名前：ローマン サ
リワンチック、(C) 参照／ドケット番号： MA58.C1 (ix) 電気通信情報 (A) 電話： (904) 375-8100、(B)
テレファクス：(904)372-5800
【００７８】(2) SEQ ID No.1に関する情報 (i) 配列特性 (A) 長さ： 53塩基対 (B) 種類： 核酸 (C) 鎖： １本鎖 (D) トポロジー： 線状 (ii) 分子型： ＤＮＡ（ゲノム） (vi) 給源： (A) 生物： バチルス・チューリンゲンシス (B) 菌株： PS86A1 (xi) 配列の記述： SEQ ID No.1 ATGATTGATT CTAAAACAAC ATTACCAAGA CATTCWTTAA TWCATACWAT 50 WAA 53
【００７９】(3) SEQ ID No.2に関する情報 (i) 配列特性 (A) 長さ： 20アミノ酸 (B) 種類： アミノ酸 (D) トポロジー： 線状 (ii) 分子型： ペプチド (vi) オリジナル給源 (A) 生物： バチルス・チューリンゲンシス (B) 菌株： PS86A1 (xi) 配列の記述： SEQ ID No.2 Met Ile Ile Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu Ile His Thr Ile 5 10 15 Lys Leu 20
【００８０】(4) SEQ ID No.3に関する情報 (i) 配列特性 (A) 長さ： 1425塩基対 (B) 種類： 核酸 (C) 鎖 ： ２本鎖 (D) トポロジー： 線状 (ii) 分子型： ＤＮＡ（ゲノム） (iii) 仮定？： ノ− (iv) アンチセンス？： ノ− (vi) オリジナル給源 (A) 生物： バチルス・チューリンゲンシス (C) 個々の分離体： PS86A1 (vii) 直接の給源 (A) ライブラリー： LAMBDAGEM (TM) - 11 LIBRARY OF
KENNETH NARVA (B) クローン： PS86A1-A (ix) 特徴 (A) 名称／キー： mat peptide (B) 位置： 1..1425 (xi) 配列の記述： SEQ ID No.3
【化１】
【００８１】(5) SEQ ID No.4に関する情報 (i) 配列特性 (A) 長さ： 475アミノ酸 (B) 種類： アミノ酸 (C) 鎖 ： １本鎖 (D) トポロジー： 線状 (ii) 分子型： タンパク質 (iii) 仮定？： イエス (iv) アンチセンス？： ノ− (vi) オリジナル給源 (A) 生物： バチルス・チューリンゲンシス (C) 個々の分離体： PS86A1 (ix) 特徴 (A) 名称／キー： タンパク質 (B) 位置： 1..475 (xi) 配列の記述： SEQ ID No.4
【化２】
【図面の簡単な説明】
図１は、B.t.PS86Q3とB.t.PS86A1のアルカリ可溶性タン
パクを示す9％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の写
真である。図２は、アルファルファ・ゾウムシに活性の
あるB.t.菌株のアルカリ可溶性タンパクを示す標準的な
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。図
３は、プラスミドpMYC2320の制限地図を示す略図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/325 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 7/00 9281−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (31)優先権主張番号 ０７／７１５，１８４ (32)優先日 1991年６月12日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ケネス イ−． ナ−バ アメリカ合衆国 921130 カリフォルニア 州 サンディエゴ コミニト ミラ デル マ− 12123 (72)発明者 トレ−シ− マイケルズ アメリカ合衆国 92027 カリフォルニア 州 エスコンディド ファ−ン ストリ− ト 1110 (72)発明者 ジュウェル エム． ペイン アメリカ合衆国 92126 カリフォルニア 州 サンディエゴ ハンプヒル ドライブ 7984 (72)発明者 ジョ−ジ イ−． シュワブ アメリカ合衆国 92137 カリフォルニア 州 ジャジョラ プロスペクト 316

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 バチルス・チューリンゲンシス（Bacill
    us thuringiensis）PS86A1又はPS86Q3、及びその突然変
    異株、又は上記の微生物の毒性結晶又は胞子のトウモロ
    コシ・ルートワーム幼虫防除有効量を、上記のトウモロ
    コシ・ルートワーム幼虫の土壌生息環境に混入すること
    を含めてなる、トウモロコシ・ルートワーム幼虫の防除
    法。
  2. 【請求項２】 親のバチルス・チューリンゲンシスPS86
    A1（NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシス
    PS86Q3（NRRL B-18765）から調製される安定なlysis-sp
    o-cry+バチルス・チューリンゲンシスと、不活性担体と
    を組合せた組成物。
  3. 【請求項３】 目標害虫環境に施用されると摂食帯域に
    おいて持続的な殺虫活性とより大きな持続性をもった実
    質的に無傷の処理細胞を含めてなる殺虫剤組成物であっ
    て、上記の殺虫剤が上記の害虫に有毒なポリペプチド
    で、細胞内にあり、バチルス・チューリンゲンシスPS86
    A1（NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシス
    PS86Q3（NRRL B-18765）から調製される場合の組成物。
  4. 【請求項４】 トウモロコシ・ルートワーム幼虫の環境
    に施用されると持続的な殺虫活性をもった実質的に無傷
    の処理細胞を含めてなる殺虫剤組成物のトウモロコシ・
    ルートワーム幼虫防除有効量に上記の幼虫を接触させる
    ことを含めてなる、トウモロコシ・ルートワーム幼虫の
    防除法であって、上記の殺虫剤がトウモロコシ・ルート
    ワーム幼虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、バ
    チルス・チューリンゲンシスPS86A1（NRRL B-18400）又
    はバチルス・チューリンゲンシスPS86Q3（NRRL B-1876
    5）によってつくられる場合の防除法。
  5. 【請求項５】 トウモロコシ・ルートワーム幼虫又はア
    ルファルファ・ゾウムシに対して活性のある毒素をコー
    ドしており、バチルス・チューリンゲンシスPS86A1（NR
    RL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシスPS86Q3
    （NRRL B-18765）から得られる遺伝子。
  6. 【請求項６】 バチルス・チューリンゲンシスPS86A1
    （NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシスPS
    86Q3（NRRL B-18765）から得られる遺伝子によってコー
    ドされ、トウモロコシ・ルートワーム幼虫に対して活性
    がある毒素。
  7. 【請求項７】 バチルス・チューリンゲンシスPS86A1
    （NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシスPS
    86Q3（NRRL B-18765）から得られる遺伝子であって、ト
    ウモロコシ・ルートワーム幼虫に対して活性のある毒素
    をコードした遺伝子によって形質転換された植物。
  8. 【請求項８】 バチルス・チューリンゲンシスPS86A1
    （NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシスPS
    86Q3（NRRL B-18765）から得られる遺伝子であって、ト
    ウモロコシ・ルートワーム幼虫に対して活性のある毒素
    をコードした遺伝子によって形質転換された微生物。
  9. 【請求項９】 バチルス・チューリンゲンシスPS86A1
    （NRRL B-18400）又はバチルス・チューリンゲンシスPS
    86Q3（NRRL B-18765）から得られる遺伝子であって、ト
    ウモロコシ・ルートワーム幼虫に対して活性のある毒素
    をコードした遺伝子によって形質転換されたバクロウイ
    ルス。
  10. 【請求項１０】 寄託番号がNRRL B-18765であり、トウ
    モロコシ・ルートワーム幼虫とアルファルファ・ゾウム
    シに対して活性のある同定特性をもったバチルス・チュ
    ーリンゲンシスPS86Q3の生物学的に純粋な培養基。
  11. 【請求項１１】 アルファルファ・ゾウムシによるアル
    ファルファの虫害を防除する方法であって、アルファル
    ファ・ゾウムシに対して実質的に活性をもったバチルス
    ・チューリンゲンシスPS86Q3（NRRL B-18765）又はその
    突然変異株、及びその毒素、結晶、又は胞子の昆虫防除
    有効量に上記の害虫を接触させるか、又は上記害虫の環
    境をこれによって処理することを含めてなる防除法。
  12. 【請求項１２】 上記のアルファルファ・ゾウムシがエ
    ジプト・アルファルファ・ゾウムシ（EAW, Egyptian al
    falfa weevil）である、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 実質的に無傷のB.t.細胞が上記のアル
    ファルファ・ゾウムシの環境に施用される時に殺虫活性
    を持続させるために、分離体又はその突然変異株の実質
    的に無傷のB.t.細胞が処理される、請求項１１に記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 アルファルファ・ゾウムシに対して実
    質的に活性をもったバチルス・チューリンゲンシス分離
    体PS86Q3（NRRL B-18765）又はその突然変異株、及びそ
    の毒素、結晶、又は胞子によってつくられる、エジプト
    ・アルファルファ・ゾウムシに対して活性のある毒素。
  15. 【請求項１５】 バチルス・チューリンゲンシスPS86Q3
    （NRRL B-18765）から得られる遺伝子であってアルファ
    ルファ・ゾウムシに対して活性のある毒素をコードした
    遺伝子によって形質転換された植物。
  16. 【請求項１６】 バチルス・チューリンゲンシスPS86Q3
    （NRRL B-18765）から得られる遺伝子であってアルファ
    ルファ・ゾウムシに対して活性のある毒素をコードした
    遺伝子によって形質転換された微生物。
  17. 【請求項１７】 バチルス・チューリンゲンシスPS86Q3
    （NRRL B-18765）から得られる遺伝子であってアルファ
    ルファ・ゾウムシに対して活性のある毒素をコードした
    遺伝子によって形質転換されたバクロウイルス。
  18. 【請求項１８】 鞘翅目害虫に対して活性のある約58 k
    Daのバチルス・チューリンゲンシス毒素をコードしたＤ
    ＮＡであって、配列ID No.3に示すＤＮＡ配列をもった
    ＤＮＡ。
  19. 【請求項１９】 タンパクの二次構造を変更しないか、
    又は構造が変更される場合でも生物活性がある程度保持
    される、鞘翅目害虫に活性のある毒素又はその変異体で
    あって、配列ID No.4に示すアミノ酸配列をもった毒
    素。
  20. 【請求項２０】 タンパクの二次構造を変更しないか、
    又は構造が変更される場合でも生物活性がある程度保持
    されるような、かつ配列ID No.2に示すアミノ酸配列を
    もった、鞘翅目害虫に活性のある毒素又はその変異体を
    コードしたＤＮＡを含めてなる組替えＤＮＡ運搬ベクタ
    ー。
  21. 【請求項２１】 原核生物又は真核生物ホストに移さ
    れ、そこで複製される、請求項２０に記載のＤＮＡ運搬
    ベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に定義されたとおりの、バ
    チルス・チューリンゲンシス毒素を発現するために形質
    転換される細菌ホスト。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のホストである、NR
    RL B-18769の確認特性をもった大腸菌NM522（pMYC232
    0）。
  24. 【請求項２４】 シュードモナス(Pseudomonas)、バチ
    ルス(Bacillus)、アゾトバクター(Azotobacter)、エル
    ウィニア(Erwinia)、セラティア(Serratia)、クレブシ
    ェラ(Klebsiella)、リゾビウム(Rhizobium)、ロードシ
    ュードモナス(Rhodopseudomonas)、メチロフィリウス(M
    ethylophilius)、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
    m)、アセトバクター(Acetobacter)、又はアルカリゲネ
    ス(Alcaligenes)の種である、請求項２２に記載の微生
    物。
  25. 【請求項２５】 ヒペラ（Hypera）属からの昆虫の防除
    法であって、請求項２４に記載の微生物を上記の害虫
    に、又は上記害虫の環境に投与することを含めてなる防
    除法。
  26. 【請求項２６】 上記のヒペラ種がヒペラ・ブルネイペ
    ニス Hypera brunneipennis（エジプト・アルファルフ
    ァ・ゾウムシ）である、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 上記のヒペラの種がＨ・メレス（H. m
    eles）（クローバー頭花ゾウムシ）、Ｈ・ニグリロスト
    リス（H. nigrirostris）（小クローバー葉ゾウム
    シ）、Ｈ・ポスチカ（H. postica）（アルファルファ・
    ゾウムシ）、及びＨ・プンクタータ（H. punctata）
    （クローバー葉ゾウムシ）からなる群から選ばれる、請
    求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 目標害虫環境に施用されると持続的な
    殺虫活性をもった実質的に無傷の処理細胞を含有する殺
    虫剤を含めてなる殺虫剤組成物であって、上記の殺虫剤
    が鞘翅目昆虫に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、
    請求項１９で定義されたとおりのバチルス・チューリン
    ゲンシス毒素を発現できる形質転換された微生物の発現
    結果としてつくられる場合の殺虫剤組成物。
  29. 【請求項２９】 請求項１９で定義されたとおりのポリ
    ペプチド毒素をコードした、鞘翅目昆虫に有毒なバチル
    ス・チューリンゲンシス毒素遺伝子の発現結果である細
    胞内毒素を含有した、実質的に無傷の処理された単細胞
    微生物細胞であって、上記の細胞が目標害虫環境に施用
    される時に殺虫活性を持続させるような条件下に処理さ
    れる場合の微生物細胞。
  30. 【請求項３０】 pMYC2320と指定されるプラスミド。
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