JPH0717677B2 - “８−アミノ酸”に改良のある新規シクロスポリン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調整異常は“自己免疫”の広範囲な変化及び慢性炎
症疾患の中にみられ、全身性エリテマトーデス、慢性リ
ウマチ関節炎、タイプＩ糖尿病、炎症性腸疾患、胆汁性
肝硬変、ブドウ膜炎、多発硬化症及びその他限局性回腸
炎、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、類肉腫症、乾癬、
魚鱗癬、及び重症な眼障害などの様な疾患を含んでい
る。これらの状態のそれぞれについての潜在的な病因論
は、かなり異なってはいるが、一般的にそれらは自己抗
体の変化及び自己反応リンパ球の出現をもたらす。この
自己反応性は、１つには正常免疫系を調整している生体
恒常性制御の欠損にある。

同様に、骨髄あるいは臓器移植後、宿主リンパ球は外来
性組織抗原を認識し拒絶現象を引き起こす抗体の産生を
始める。

自己免疫あるいは拒絶反応の結果として、炎症細胞及び
それらの遊出する媒介物質による組織の破壊を引きおこ
す。NSAID及びコルチコステロイドなどの様な抗炎症因
子は、これら媒介物質による影響や分泌を阻止する事を
主として行ない、疾患の免疫学的基礎的緩和に対しては
なんの作用をも示さない。

一方、シクロホスフォアミドの様な細胞障害因子は、正
常及び自己免疫応答の両者をシャットオフさせる非特異
的様式で作用する。さらに、この様な非特異的免疫抑制
剤で治療を受けた患者は、彼らの自己免疫疾患によって
引き起こされた感染症に負けてしまうであろう。

シクロスポリンは、トリポクラジウム インフラタム
（Tolypocladium inflatum）及びシリンドロカルポン
ルチダム（Cylindrocarpon lucidum）を含む色々な真菌
種の発酵培地中より単離された免疫抑制化合物の一員で
ある。

シクロスポリン類の一般的構造は、11個のアミノ酸を含
んでいる環状ペプチドとして確立されている。

例えば、シクロスポリンＡの確立された構造は環状ペプ
チドであり、幾つかのメチル化されたアミノ酸を含み、
８位でこのアミノ酸はシクロスポリンの生物学活性に重
要であると考えられているＤ−アラニンより成ってい
る。

Bmt＝（4R）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メ
チル−Ｌ−スレオニン Me＝メチル Abu＝α−アミノブチル酸 Val＝バリン Ala＝アラニン MeLeu＝Ｎ−メチル ロイシン MeVal＝メチル バリン Sar＝ザルコシン 慨してシクロスポリンＡの様なシクロスポリンには、細
胞毒性あるいは骨髄毒性はない。また、これは単核球の
遊走を阻止するものでもなければ、果粒球及びマクロフ
ァージの機能も阻害しない。この作用は特異的なもので
あり、主な確立された免疫応答には、なんの悪影響も及
ぼさない。しかしながら、これは腎細胞毒性を持ち、以
下の好ましくない副作用を誘起することが知られてい
る。

（１） 肝機能異常 （２） 多毛症 （３） 歯肉肥大 （４） 振せん （５） 神経毒 （６） 知覚過敏性及び （７） 消化器系不快感。

従がって、本発明の目的は（１）抗炎症因子よりも早期
に作用することによって免疫系のヘルプ及びサプレッシ
ョン メカニズムのバランスを修復し、かつまた、
（２）からだの感染症に対する罹病性を増大させる事な
く、サプレッサー細胞サーキットによる特異的長期間に
及ぶ移植トレランスを誘発する、より腎細胞毒性の低
い、新規シクロスポリン誘導体を提供することにある。

本発明の他の目的は、治療を必要としている患者に本発
明の活性免疫抑制剤を投与する為の薬剤的構成物を提供
することにある。

本発明の更に他の目的は、新規免疫抑制剤をその様な治
療を必要としている哺乳動物種に対して十分量投与する
事によって、拒絶現象、自己免疫及び慢性炎症疾患を制
御する方法を提供することにある。

最後に、本発明の目的は、この活性化合物の生合成及び
単離に関する方法を提供することでもある。

A. 発明の範囲 本発明は８位が３−フルオロ−アラニンであるシクロス
ポリン誘導体に関するものであり 式中Ｒは３−フルオロ−Ｄ−アラニンあるいは２−ジュ
ーテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニンである。３−フル
オロ−アラニン誘導体はシクロスポリンＡと同様の免疫
抑制特性を示しかつまたその腎細胞毒性はシクロスポリ
ンＡより低い。

B. 生合成方法論 本発明における改良シクロスポリンは以下の発酵方法に
従って調製される。

実施例 1. ８−（２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）
−シクロスポリンＡの調製 培養：トリポクラジウム インフラタムMF5080,NRRL−8
044 培地：斜面培地Ａ g/ モルトエキス 20.0 イーストエキス 4.0 寒天 20.0 シード培地Ｂ モルトエキス 70.0 グルコース 50.0 培養培地Ｃ グルコール 40.0 カゼインペプトン 10.0 MgSO₄・7H₂O 0.5 KH₂PO₄ 2.0 NaNO₃ 3.0 KCl 0.5 FeSO₄・7H₂O 0.01 凍結乾燥菌の入ったチューブを無菌的に開け、シード培
地Ｂ（３ケ所にバッフルの付いた250ml用のエーレンマ
イヤーフラスコ中に20ml）を用いて４日間、27℃、回転
振とう（220rpm）で発育させる。

このシード菌を、より詳しい解析の為に斜面寒天（培地
Ａ）に植菌する。斜面培地で14日間、27℃で培養し、そ
の後、使用時まで４℃に保存しておく。

胞子を5mlの培地Ｃで全斜面寒天培地より洗い流して取
り出し、プレ培養フラスコ（50mlの培地Ｃの入った250m
l用のエーレンマイヤーフラスコ）中で培養する。この
プレ培養は５日間、27℃で行なう。

プレ培養菌の5mlをプロダクション培地（250ml用のエー
レンマイヤーフラスコに50mlの培地Ｃ及び5mg/mlの２−
ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニンを含む）中に
植菌する。過滅菌２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ
−アラニンを、その培養に先立って滅菌した後に加える
（最終濃度、5mg/ml）。全量2.2リッターのプロダクシ
ョン培地からなる44本のフラスコ中で14から21日間、27
℃、攪拌（220rpm）しながら培養する。培養後、発酵培
地より、以下の項目Ｃ記載の方法で抽出する。

実施例 ２ ８−（３−フルオロ−アラニン）シクロスポリンの調製 プレ培養を、２−ジューテロ−３−フルオロ−アラニン
の代わりに5mg/mlの３−フルオロ−アラニンを含む全量
400mlのプロダクション培地で行なう以外は、実質的に
は実施例１記載と同様の方法で行なった後、以下の項目
Ｃ記載の方法で抽出が行なわれる発酵培地が得られる。

C. 抽出方法論 a.培地から、遠心により細胞を除去する。

b.各25mlのメチレンクロライドで３回、清浄化された培
地を抽出する。

c.各25mlのアセトンで３回、細胞を抽出する。

d.メチレンクロライド及びアセトン抽出物を集め、減圧
下で乾燥させる。

e.残留物をメタノールに溶解し、無水Na₂SO₄で乾燥さ
せ、過後、減圧下で乾燥する。

f.試料をHPLC分析にかけ、シクロスポリンの誘導体を決
定し単離する。

D. HPLC分析 実施例１の８−（２−ジューテロ−３−フルオローアラ
ニン）シクロスポリンＡ 粗抽出物を、次のクロマトグラフ系を用いてHPLC分析を
行なう。

溶媒 80/20 v:v アセトニトリル：水 流速 0.6ml/分 カラム デュポン ゾルバックス（DuPont Zorbax）ODS
4.6mm×25cm,60℃に維持 検出器 LDSスペクトロメーターIII,210nm,0.05AUFS インテグレーター スペクトラーフィジックス SP4100
コンピューティング インテグレーター シクロスポリンＡの保持時間と92％の等価を示す保持時
間を持っている期待されたシクロスポリンＡの２−ジュ
ーテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン類似体の濃度は、
濃度既知のシクロスポリンＡの外来的標準物より得られ
るシクロスポリンＡの領域カウント/mcgで測定領域カウ
ントを割り算する事によって、計算される。

2.2培地の内から、４本の発酵産生物から得た抽出残
留物を75mlのメタノール中に集め、HPLCクロマトグラフ
ィーによりアッセイする。43.1mgの粗８−（２−デュー
テロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シクロスポリン
Ａを含むこの試料をＡとして標示する。試料Ａをわずか
に油状を示す残留物として濃縮する。この残留物を6ml
の1:1 v:vなるメチレンクロライド：メタノール中に溶
解する。あらかじめメタノールで平衡しておいたファル
マシア（Pharmacia）LH−20からなる200mlカラムに、こ
の溶液をのせ、クロマトグラフィーを行なう。クロマト
グラフィーを、流速5ml/分のメタノールによって行ない
１本8mlの分画後、40本、各5mlの分画をする。フラクシ
ョン22から26までを集めＢとして標示する。容量は25ml
である。

試料ＢはHPLC分析により33.7mgの８−（２−ジューテロ
−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シクロスポリン−Ａ
を含むものであった。

試料Ｂを濃縮し乾燥後、この残留物を1mlのメタノール
中で溶解する。この溶液を、80/20 v:vのアセトニトリ
ル：水の溶媒系、流速10ml/分、60℃からなるデュポン
ゾルバックスODSカラム2.1×25cmを用いた調製用HPLC
クロマトグラフィーにかける。溶出の動向を、0.05mm光
路長セル、0.32AUFS設定した、ギルソン（Gilson）モデ
ル116U.V.検出装置を用いた、波長210nmにおいて追跡す
る。U.V.シグナルはスペクトラーフィジクスSP4100コン
ピューティング インテグレーターでモニターされ、こ
の紫外線トレースに基づいて15の分画を得た。フラクシ
ョン９をＣとして標示し、フラクション10は濃縮し乾燥
した。残留物をＤとして標示した。

試料Ｄを0.5mlのメタノール中で溶解する。この溶液
を、80/20 v:vのアセトニトリル：水の溶媒系、流速10m
l/分、60℃からなるデュポン ゾルバックスODSカラム
2.1×25cmを用いた調製用HPLCクロマトグラフィーにか
ける。溶出の動向を1mm光路長セル、0.32AUFS設定し
た、LDCスペクトロモニターII装置を用いた波長226nmに
おいて追跡する。U.V.シグナルはスペクトラー フィジ
クスSP4100コンピューティング インテグレーターでモ
ニターされ、この紫外線トレースに基づいて10の分画を
得た。フラクション４及び５を取り出し、試料Ｃと混ぜ
て、容量35mlとした。これをＥとして標示した。この試
料はHPLC分析により、226nmにおける紫外線純度で99％
以上を示す。20.1mgの８−（２−ジューテロ−３−フル
オロ−Ｄ−アラニン）−シクロスポリンＡを含むもので
あった。試料Ｅを高減圧下で濃縮乾燥を行ない、20.2mg
の８−（２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニ
ン）−シクロスポリンＡを獲得した。

実施例２の８−（３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シク
ロスポリンＡ １本400mlの発酵産生物より抽出された残留物を1mlのメ
チレン クロライド中に溶解し、この溶液を、あらかじ
めメタノールで平衡しておいたファルマシアLH−20から
なる40mlカラムにのせ、クロマトグラフィーを行なう。
クロマトグラフィーを、流速2ml/分のメタノールによっ
て行ない、１本10mlの分画後、30本、各1mlの分画をす
る。フラクション16から27をHPLC分析の結果に基づいて
取り出し、一つにまとめ合わせる。この混合分画物を濃
縮乾燥した。この残留物をＦとして標示した。

試料Ｆを、250mlのメタノール中に溶解し、デュポン
ゾルバックスODSカラム0.94×25cm、60℃で維持される
調製用HPLCクロマトグラフィーにかける。クロマトグラ
フィーは、流速2ml/分、80:20v:vのアセトニトリル：水
の溶媒系を用いて行なう。溶出の動向を1mm光路長セ
ル、1.28AUFS設定した、LDSスペクトルモニターII装置
を用いた波長220nmにおいて追跡する。紫外線シグナル
はスペクトラーフィジクスSP4100コピューティング イ
ンテグレーターでモニターされ、この紫外線トレースに
基づいて11の分画を得た。フラクション７はHPLC分析に
より、210nmにおける紫外線純度で99％以上を示す、3.2
5mgの８−（３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シクロス
ポリンＡを含むものであった。フラクション７を高域圧
下で濃縮乾燥を行ない、3.3mgの８−（３−フルオロ−
Ｄ−アラニン）−シクロスポリンＡを獲得した。

E.8−（２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニ
ン）−シクロスポリンＡの物理的特性 質量スペクトル：数値（1202）より19マスユニット多い
（Ｍ＋Ｍ）^＋、m/2 1221がシクロスポリンＡに対して検
出され、これは、シクロスポリンＡのアラニン残基が２
−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニンにより置換
されている事と一致するものである。¹ H NMRスペクトル:¹H NMRデーターは８位における２−
ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニンの取り込みを
確定するものである。¹³ C NMRスペクトル：スペクトルは恒室温中で、CDCl₃使
用100MHzのバリアン（Varian）XL−400スペクトルメー
ターにより記録される。対照として77.0ppmの溶媒ピー
クを用いて、0ppmにおけるTMSに対する相関として化学
シフトを示した。10.0,16.1,17.0,18.1,18.5,18.8,20.
0,20.5,21.2,21.8,22.0,23.6（２×）,23.9（２×）,2
4.0,24.2,24.5,24.9,25.0,25.6,29.3,29.88,29.94,29.9
6,31.2,31.4,35.8,36.0,36.2,37.5,39.2,39.6,40.6,48.
75（２×）,48.83,50.4,55.3,55.45,55.49,57.6,57.9,5
9.0,74.8,81.9d,（Ｊ＝177.2Hz）^＊,126.2,129.5,169.
8,169.9（２×）,170.9d^＊,170.1,171.1,171.53,171.5
6,173.4,173.59,173.61ppm。^＊ ３−フルオロ−２−ジューテロ−Ｄ−アラニン残基の
これら共鳴は、¹⁹F核種とカップリングするために重複
して測定される。61個の炭素に対する¹³C NMRデーター
は、重水素原子を保有している３−フルオロ−２−ジュ
ーテロ−Ｄ−アラニン残基のα−炭素は観察されないと
いう仮定のもとに、分子構造式C₆₂H₁₀₉DN₁₁O₁₂Fと一致
するものである。

F.発明の範囲に基づく本化合物の有用性 本発明は移植後の拒絶現象、自己免疫あるいは慢性炎症
疾患にかかっている患者に対して、活性成分として構造
式（Ｉ）なる化合物の投与を含む治療についての方法に
も同様に関するものである。

これらの状態及び疾患の治療に対して、構造式（Ｉ）な
る化合物は、一般的な非毒性薬学的に許容されるキャリ
アー、アジュバンド及び賦形剤を含む適用量ユニットな
る調剤を、経口、局所、非経口、吸入噴霧、あるいは経
直腸的に投与するものである。本明細書中で使用されて
いる非経口なる用語は、皮下注射、静脈、筋内、腹板内
（itrasternal）注射あるいは点滴による方法を含む。
温血動物、例えば馬、畜牛、羊、犬、猫などに対する治
療に加えて、本発明の化合物は人体に対する治療におい
ても効果的である。

活性成分を含む薬剤組成物は、経口投与に際して適切な
形態をとる。例えば錠剤、トローチ、飴、水性あるいは
油性懸濁液、分散しやすい粉末あるいは顆粒、乳剤、ハ
ードあるいはソフトカプセル、あるいはシロップまたは
エリキシルなどである。経口使用の為の組成物は、薬剤
組成物製造に対する公知の技術に従い、かつ薬剤的洗練
され、口にあった調剤にする為に、これら組成物は甘味
剤、香味剤、着色剤及び防腐剤などのグループより幾つ
か選んで、それを含む組成物として調整されるものであ
る。非毒性薬学的に許容される賦形剤との混合剤中に活
性成分を含む錠剤も同様に公知の方法で製造されるもの
である。使用しうる賦形剤とは、例えば（１）炭酸カル
シウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウ
ムあるいはリン酸ナトリウムなどの様な不活性希釈剤、
（２）コーンスターチ、あるいはアルギン酸などの様な
顆粒形成剤及び崩壊剤、（３）スターチ、ゲラチンある
いはアラビアゴムなどの様な結合剤、及び（４）ステア
リン酸マグネシウム、ステアリン酸あるいは滑石などの
様な潤滑形成剤である。錠剤にはコート操作は不要であ
るが、消化器系での錠剤の崩壊、及び吸収作用を遅ら
せ、それによって、長期に及ぶ作用の持続をもたらすコ
ート操作を公知の技術によって行なってもよい。例え
ば、モノステアリン酸グリセリルあるいはジステアリン
酸グリセリルなどが時間遅延物質として使用される。ま
たこれら錠剤を、この解離を制御する為に浸透性治療用
錠剤として形成する、U.S.特許4,256,108;4,106,452;及
び4,265,874に記載の技術によってコートしてもよい。

場合によっては、経口使用の為の調剤は、活性成分が不
活性固形希釈剤と伴に混合されている、ハードゲラチン
カプセルとしての形態をとることもある。例えば、炭酸
カルシウム、リン酸カルシウムあるいはカオリンなどの
不活性固形希釈剤である。また、同様に、活性成分が水
または油状メディウム、例えばピーナッツ油、液状パラ
フィン、あるいはオリーブ油などと伴に混合されている
ソフトゲラチンカプセルとしての形態をとることもあ
る。

水性懸濁液は普通、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤と
の混合において活性物質を含むものである。その様な賦
形剤を以下に示す。

（１）懸濁形成性、例えばナトリウムカルボキシメチル
セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピ
ロリドン、トラガカントガム、及びアラビアゴム。

（２）分散あるいは湿潤剤、 （ａ）自然に存在している燐脂質、例えばレシチン、 （ｂ）脂肪酸とのアルキレンオキサイド縮合反応産物、
例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、 （ｃ）長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキサイド縮
合反応産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノ
ール、 （ｄ）脂肪酸及びヘキシトール油来の部分的エステルと
のエチレンオキサイド縮合反応産物、例えばポリオキシ
エチレンソルビトールモノオリエート、あるいは （ｅ）脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分的エス
テルとのエチレンオキサイド縮合反応産物、例えばポリ
オキシエチレンソルビタンモノオリエート。

水性懸濁液は同様に幾つかの防腐剤をも含み得る。例え
ば、エチルあるいはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾ
エート、幾つかの着色剤、幾つかの香味剤、及び幾つか
の甘味剤、例えばシュクロースあるいはサッカリンなど
である。

油性懸濁液は活性成分を植物油の中に懸濁することによ
って形成させるものである。例えば、アラキス油、オリ
ーブ油、ゴマ油、あるいはココナッツ油、あるいは液状
パラフィンなどの鉱油である。また油性懸濁液は、例え
ばビーズワックス、ハードパラフィンあるいはセチルア
ルコールの様な濃化剤をも含む。甘味剤及び香味剤など
も含まれ、口にあった経口調剤となる。これら組成物は
アスコルビン酸の様な酸化防止剤の添加により保存され
る。

分散しやすい粉末あるいは顆粒は、水性懸濁液の調製に
適している。それらは、活性成分を分散あるいは湿潤
剤、懸濁形成剤及び幾つかの防腐剤との混合剤として提
供するものである。適切な分散あるいは湿潤剤、及び懸
濁形成剤はすでに上記において例示されている。添加剤
としての賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤な
ども、上記に示されている。

本発明の薬剤組成物は水中油型乳剤としての形態もとり
うる。油相は、オリーブ油あるいはアラキス油などの植
物油、あるいは液状パラフィンの様な鉱油、または、そ
れらの混合により形成されている。適切な乳化形成剤と
は（１）アラビアゴム及びトラガカントゴムの様に自然
に存在しているゴム、（２）大豆及びレシチンなどの様
に自然に存在している燐脂質、（３）ソルビタンモノオ
レエートの様な脂肪酸及びヘキシトール無水物由来のエ
ステルあるいは部分的エステル、（４）ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエートの様なエチレンオキサイ
ドとの当該部分エステルの縮合反応産物、などである。
また、乳剤にも同様に甘味剤及び香味剤が含まれてい
る。

シロップ及びエリキシルも、グリセロール、プロピレン
グリコール、ソルビトールあるいはシュクロースなどの
甘味剤と、伴に形成される。その様な調剤にも同様に粘
滑剤、防腐剤及び香味及び着色剤などが含まれる。

薬剤組成物は無菌的注射可能な水性あるいは油性懸濁液
としての形態をとることもある。この懸濁液は上記記載
の適切な分散あるいは湿潤剤及び懸濁形成剤を用いて、
公知の技術によって形成されるものである。無菌的注射
可能な調剤とは、1,3−ブタンジオール溶液の様な毒性
のない非経口使用に許容されている希釈液あるいは溶媒
中に存在している無菌的注射可能な溶液あるいは懸濁液
のことである。使用されうる適切なる賦形剤及び溶媒と
して水、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液など
がある。更に、無菌的固定油も、溶媒あるいは懸濁形成
メディウムとして、一般に使用されている。この目的の
為に、刺激の少ない固定油例えば合成モノ−あるいはジ
グリセライド、などが用いられている。また、更にオレ
イン膜の様な脂肪酸の使用も、注射可能調剤中にみられ
る。

（Ｉ）の化合物は、薬の経直腸使用に際して坐薬として
の形態で投与される時もある。これらの組成物は、適切
な非刺激性の賦形剤と、本薬剤を混合することによって
調製され、この賦形剤は通常の温度においては固形であ
るが、直腸内温度に際しては液状となるもので、それに
より直腸内で融解して薬を遊離するものである。その様
な材料としては、ココアバター及びポリエチレングリコ
ールがある。

局所的使用に際しては、本免疫調整剤を含んだ、クリー
ム、軟膏、ゼリー、溶液あるいは懸濁液、等が用いられ
る。一回投与量として調製される、担体材料との混合に
おける活性成分の容量は、治療を受ける側と、及び個々
の投与形態に非常に左右されるものである。例えば、人
体経口投与用の調剤は、総組成物量に対して約５から約
95％の間で変動しうる適切かつ一般的な量の担体材料と
の混合における、治療上十分である活性成分の容量を含
むものである。

特定患者に対する特異的投与量レベルは、使用しうる特
異的化合物の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性、
食事内容、投与時間、投与経路、体外排出速度、他の薬
との併用、治療中の特定疾患の度合い、などの種々の因
子に依存している。

G.本発明の範囲における、本化合物の有用性を支持する
生物学的証拠 構造式（Ｉ）なる化合物は免疫抑制活性を持ち、それに
より種々の“自己免疫”及び慢性炎疾患者の治療におい
て有効である事が知られている。また、それら化合物
は、移植手術を受けた時の移植片拒絶あるいは、“ドナ
ー”臓器に対する拒絶反応の阻止という面においても有
効である。以下の表は、本発明の化合物の有用性を説明
し、かつ支持するものである。

インビトロでのこの腎細胞毒性アッセイにおいて、８−
（２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シ
クロスポリンＡは、実験結果を解析しうる比較的限定さ
れた投与量範囲にわたって、シクロスポリンＡよりも、
その毒性が少なかった。

インビトロ腎細胞毒性アッセイ 標的組織としてラビット由来の新鮮調達した近位曲細管
を利用し、毒性のパラメータとする³H−ロイシンの取り
込み量の変化を測定するインビトロ腎細胞毒性アッセイ
を用いて、試料２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−ア
ラニンを評価した。このアッセイの目的はシクロスポリ
ンＡに対する試験試料の毒性を測定することにある。セ
ファロスポリン抗生物質を用いて、以前に行なったアッ
セイの確認により、このアッセイが細胞レベルにおけ
る、相関、本来の毒性潜在能力に対して正確な予測が出
来る事を示している。加えるべき唯一の仮定条件は、薬
物速度／薬剤の分布パラメーターは実質上、異なっては
いないという事である。本方法論の有用性は、更にツニ
カマイシン類似体のインビボ及びインビトロにおけるデ
ーターの比較により立証されており、対照化合物に対す
る。インビボの腎細胞毒性の予測を少なくとも90％の正
確さで示すのが、このインビトロアッセイである。

細管懸濁液と適切な濃度を持った試験化合物を混合し合
計で23時間反応させ、最後の３時間において、パスルを
与える3H−ロイシンを加える。ロイシンの取り込み量を
１μｇタンパクに対する数値として測定し、各試験ポイ
ントにおける比活性を、コントロール比活性に対するパ
ーセントとしてグラフ化する。本実験において、溶液中
に遊離されてくる最高可能容量（23時間の反応中に溶解
し、平衡化されうる化合物を与える）の薬剤レベルの量
を決定した。以下の表に見られる様に、化合物８−（２
−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）シクロス
ポリンＡは、投与量30μg/mlにおいて、シクロスポリン
Ａよりも低い毒性を示した。

限定された、試験範囲でのデーター及び薬物速度因子は
等価であるという仮定により、動物中において、８−
（２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）−シ
クロスポリンＡは、シクロスポリンＡよりも腎細胞毒性
が低いと期待されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＬ ＡＣＪ ＡＣＳ ＡＤＡ ＡＤＰ Ｃ１２Ｐ 21/04 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ０７Ｋ 99:00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ ＡＣＪ ＡＣＳ ＡＤＡ ＡＢＬ (72)発明者 ロバート テー．ジヨージルマン アメリカ合衆国，07036 ニユージヤーシ イ，リンデン，アカデミー テラス 437

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の構造式なる化合物。 （式中Ｒは３−フルオロ−Ｄ−アラニン、あるいは２−
   ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）
2. 【請求項２】Ｒが２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−
   アラニンである請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】薬剤的キャリアー及び以下の構造式（Ｉ）
   なる化合物を治療上効果的な量で含んでいる、免疫調整
   異常あるいは疾患を予防、制御あるいは治療するための
   医薬組成物。 （式中Ｒは３−フルオロ−Ｄ−アラニン、あるいは２−
   ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニン）
4. 【請求項４】Ｒが２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−
   アラニンである請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】（ａ）培養液中でトリポクラジウム イン
   フラタムMF5080を３−フルオロ−Ｄ−アラニン、あるい
   は２−ジューテロ−３−フルオロ−Ｄ−アラニンと伴に
   インキュベーションし、 （ｂ）ステップ（ａ）で得られる発酵培地中より生産物
   を抽出及び単離する事より成る請求項１記載の構造式
   （Ｉ）の化合物の調製方法。