JPH07179352A - 腫瘍反応性細胞の豊富なリンパ節を用いた養子細胞療法に於ける治療薬とその方法 - Google Patents

腫瘍反応性細胞の豊富なリンパ節を用いた養子細胞療法に於ける治療薬とその方法

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JPH07179352A
JPH07179352A JP6187828A JP18782894A JPH07179352A JP H07179352 A JPH07179352 A JP H07179352A JP 6187828 A JP6187828 A JP 6187828A JP 18782894 A JP18782894 A JP 18782894A JP H07179352 A JPH07179352 A JP H07179352A
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Pierre L Triozzi
ピエール・エル・トリオッツィ
Julian A Kim
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Abstract

(57)【要約】 【目的】養子免疫療法に於いてガンを有する患者の生存
を改善すること。 【構成】本発明では、新生組織により生成された若しく
はそれに関連したマーカーに特異的に結合する放射性標
識されたロケータを患者へ投与し、放射性ロケータが新
生組織に優先的に集中し、結合されていない放射性標識
されたロケータが患者から浄化されて背景の光子放出に
対する新生組織からの光子放出の比が増大するよう時間
を経過させた後放射線検出プローブで放射性標識された
ロケータの付加を示すリンパ節部位を決定して除去し、
その内の視覚的に腫瘍の証拠のない節を、分裂促進刺激
を与えて培養し、その中のＣＤ４＋腫瘍特異リンパ球を
含む腫瘍特異リンパ球を増殖して養子免疫療法のための
患者に投与される治療薬とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、養子免疫療法及び治療
薬に係り、一層詳細には、腫瘍反応性細胞の豊富なリン
パ節の決定、腫瘍反応性細胞の増殖及びそれらの養子免
疫療法に於ける使用に係る。
【０００２】
【従来の技術】本明細書に於て以下の略記号が用いられ
る。 ＬＮＬ リンパ節リンパ球 ＰＢＬ 末梢血リンパ球 ＴＩＬ 腫瘍浸透リンパ球 ＬＡＫ リンホカイン活性化キラー ＩＬ−２ インターロイキン２ 抗ＣＤ3 抗ＣＤ3 モノクローナル抗体（表中ではAn
ti−ＣＤ3 ） ＣＣ４９ ＣＣ４９モノクローナル抗体 ＴＡＧ 腫瘍関連糖蛋白質 Ａuto オートローガス Ａllo 異型的 Ｇlio ヒトグリオームの培養された細胞系統 ＣＡＲ１ ヒトカルシノイド腫瘍 ＣＥＡ ガン胎児性抗原 Ｍo ＡＢ モノクローナル抗体 ＢＳＭ ウシ上顎下粘液 ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞 ＷＤ１２４ 培養されたヒト結腸ガン腫細胞系統 結腸直腸ガンと診断された患者の約５０％に於て、結腸
若しくは直腸の外側に転移性の疾患が進行する。かかる
疾患は、肝外性であると同時に肝内性である場合がある
ので、二次的な外科的処置ではこれらの患者の多くが治
癒されない。この疾患を有する患者の生存を改善するた
めに更なる治療が必要とされる。
【０００３】養子免疫療法は、ガンの治療に於て興味あ
る治療様式を提供する。インターロイキン２（ＩＬ−
２）の如きリンホカイン及び患者の末梢血に由来するリ
ンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を用いて、ロゼ
ンバーグ等（Rosenberg,et al.）は、少ないが有意なパ
ーセンテージの黒色腫及び腎細胞ガンを有する患者が長
期間応答することを示した（Rosenberg,et al. "Adopti
ve Cellular Therapy ：Clinical Applications",Biolo
gic Therapy of Cancer, DeVita ，et al.（Eds），J.
B.Lippincott Company，Philadelphia,Pa., （199
1））。腫瘍からのリンパ球を培養に於て増加するべく
養子免疫療法についての第二の試みが成された（Rosenb
erg,"Adoptive Cellular Therapy:Clinical Applicatio
ns" ，Biologic Therapy of Cancer,DeVita,et al.（Ed
s ），J.B.Lippincott Company，Philadelphia,Pa.,p.2
41(1991)；Topalian,et al."Tumor Infiltrating Lymph
ocytes:Evidence of Specific Immune Reactions Again
st Growing Cancers in Mice and Human" ，Important
Advances in Oncology 1990, DeVita ，et al.（Eds
），J.B.Lippincott Company，Philadelphia,Pa.,p.19
（1990）及びRosenberg,et al.,"Use of Tumor-Ifiltr
ating Lymphocytes and Interleukin-2 in the Immunot
herapy of Patients with Metastatic Melanoma" ，N.E
ngl.J.Med.,25:1671,1988）。幾つかの研究グループ
は、腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）を用いて、包括的な腫
瘍細胞溶解活性を示し、これらのＴＩＬ細胞の腫瘍に対
する作用がＬＡＫ細胞よりもより良いということを示し
た（Rosenberg,et al.,N.Engl.J.Med.,id;Dillman,et a
l.,"Continuous Interleukin-2 and Tumor-Infiltratin
g Lymphocytesas Treatment of Advanced Melanoma ”,
Cancer,68:1,1991;Kradin, et al.,"Tumor-Infiltratin
g Lymphocytes in Interleukin-2 in Treatment of Adv
anced Cancer",Lancet,33:577,1989;及びＢukowski,et
al.,"Clinical Results and Characterization of Tumo
r-Infiltrating Lymphocytes with or without Recombi
nant Interleukin-2 in Human Metastaic Renal Cell C
arcinoma",Cancer Res.51:4199,1991. ）。全体とし
て、これらのＴＩＬ細胞は、黒色腫を有する患者に対し
て治療学的に有効であるよう見える。腫瘍浸透リンパ球
は、結腸ガン及び乳ガンを含む多くの充実性腫瘍から生
成されている。しかしながら、これらの細胞はin vitro
腫瘍特異細胞溶解活性を成すようには見えず、また、養
子免疫療法のモデルに於てこれらの細胞が有効であるど
うかは決定されるべき問題として残っている（Rosenber
g,"Gene Therapy of Cancer",Importatnt Advances in
Oncology,1992,DeVita,et al.(Eds),J.B.Lippincott C
o.,New York,NY,pp17-18,1992）。
【０００４】腫瘍特異リンパ球を用いた腫瘍治療法につ
いてのもう一つの興味ある試みは、腫瘍に対し局所的に
サイトカインを供給することのできる細胞内にサイトカ
イン遺伝子を配置することである。（Kasid,et al.,"Hu
man Gene Transfer:Characterization of Human Tumor
Infiltrating Lymphocytes as Vehicles for Retrovira
l-Medeated Gene Transfer in Man"，Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,87:473-477,1990及びRosemberg,et al.,"Gene T
ransfer into Humans: Immunotherapy of Patients wit
h Advanced Melanoma Using Tumor Infiltrating Lymph
ocytes Modified by Retroviral Gene Transduction"，
New Engl.J.Med.,323:570-578,1990）。幾つかのモデル
系に於て、ＩＬ−２、ガンマインタフェロン及び腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）を含む種々のサイトカイン遺伝子を感
染させられた腫瘍細胞がサイトカインを生成しない母細
胞よりも免疫原性があり腫瘍発生性が少ないということ
が示された（Gansbacher,et al."Retroviral Vector-Me
diated Gamma InterferonGene Transfer into Tumor Ce
lls Generates Potent and Long Lasting Antitumor Im
munity"，Cancer Res.50:7820-7825,1990:Gansbacher,e
t al.,"Interleukin 2 Gene Transfer into Tumor Cell
s Abrogates Tumorigenecity and InducesProtective I
mmunity"，J.Exp.Med.,172:1217-1224,1990;及びBlanke
nstein,etal., "Tumor Suppression after Tumor Cell
-Targeted Tumor Necrosis Factor-Alpha Gene Transfe
r",J.Exp.Med.173:1047-1052,1991. ）。このことは、
腫瘍細胞の近くでサイトカインを局所的に生成すること
が腫瘍の成長を阻害し免疫応答を刺激することによって
有利に影響していることということを示唆する。実際、
腫瘍を認識し腫瘍に応答して種々のサイトカインを分泌
することのできるリンパ球を見出し、それらの細胞を養
子免疫療法に用いることは有用であろう。最近では、ガ
ンマインターフェロンとＴＮＦ−アルファを分泌する或
るＴＩＬ細胞がin vitroに於て直接的な腫瘍細胞毒性を
示さないが、in vivo に於て腫瘍の後退を媒介するとい
うことが示されている（Barth,et al., "Interfelon-Ga
mma andTumor Nectosis Factor Have a Role in Tumo
r Regression Mediated by Murine CD 8 +Tumor-Infilt
rating Lymphocytes"，J.Exp.Med.,173:647,1991 ）。
【０００５】乳ガン、結腸直腸ガンの如き殆んどの充実
性腫瘍からＴＩＬ細胞を得ることの難しさ、これらの状
況下に於て増加するリンパ球の形式及びＴＩＬ細胞を生
成するのに必要な培養時間が長期間であることを含む幾
つかの問題によって、多くの腫瘍に対して広く適用する
ことが制限されている。腫瘍リンパ球を得るもう一つの
源は、リンパ節であろう。幾つかの研究室は、胸部、頭
部、頸部、膵臓及び結腸を含むガン患者からの所属リン
パ節に於ける腫瘍特異免疫応答を示している（Hoover,e
t al.,"Activation and In Vitro Expansion of Tumor-
Reactive T Lymphocytes from Lympho Nodes Draining
Human Primary Breast Cancers" ，J.Surg.Oncol.,46:1
17,1991;Cozzolino,et al.,"Characterization of Cell
s from Invaded Lympho Nodes in Patients with Solid
Tumors, Lymphokine Requirement for Tumor-Specific
Lymphoproliferative Response",J.Exp.Med.,166:303,
1987;Brand,et al.,"Specific,Major Histocompatibili
ty Complex-Unresricted Recognition of Tumor-Associ
ated Mucins by Human Cytotoxic T-cells" ，Proc.Na
t.Acad.Sci.USA ，86:7159-7163,1989 及びVose,et a
l.,"Tumor Reacting Lymphocytes Stimulated in Mixed
Lymphocyte and Tumor Culture" ，Cancer Immunol.an
d Immunother.,15:227-236(1983))。実験動物のモデル
に於て、所属リンパ節は、in vitroに於て増加された際
に実験的な転移を除去することのできる腫瘍特異前エフ
ェクター細胞を含むことが示されている（Yoshizawa,et
al.,"Actication by Anti-CD 3 of Tumor-Draining L
ymph Node Cells for Specific Adoptive Immunotherap
y"，Cell Immunol.,134:473,1991; 及びYoshizawa,et a
l.,"Specific Adoptive Immunotheraby Mediated by Tu
mor-Draining Lymph Node Cells Sequentially Activat
ed by Anti-CD 3 and IL-2"，J.Immunol.,147:729,199
1 ）。動物のモデルに於て、リンパ節除去の時期及び一
次腫瘍の大きさは、前エフェクターリンパ球を検出する
ことができるどうかに於て重要な要因である（Yoshizaw
a,et al.,"Activation by Anti-CD 3 of Tumor-Draini
ng Lymph NodeCells for Specific Adoptive Immunothe
rapy,supra;及びSakai,et al.,"Phenotype Analysis in
Cellular Mechanisms of Pre-Effector T-Lymphocyte
Response to a Progressive Syngeneic Murine Sarcom
a"．Cancer Res.,50:4371-4376,1990 ）。これらのリン
パ球は、また、in vitroに於て腫瘍の刺激のないところ
で抗ＣＤ3 及びＩＬ−２を用いることにより増加するこ
とができる。もしヒトに於て同定されれば、前エフェク
ターリンパ球は、養子免疫療法に於て潜在的に価値のあ
る細胞となろう。ヒトに於て、腫瘍特異免疫応答を確か
に含んでいる節を選択することは難しく、従って腫瘍特
異養子免疫療法の源としてリンパ節リンパ球（ＬＮＬ）
の有用性は制限される。
【０００６】
【発明の概要】概して、一つの局面に於て本発明は、例
えば、Ｔヘルパー細胞若しくはＴヘルパーリンパ球と呼
ばれるＣＤ４＋腫瘍特異リンパ球などの腫瘍反応性細胞
の豊富なリンパ節を確実に決定するための方法に関連し
たものである。本発明の方法は、新生組織、例えばガン
等により生成される若しくはそれに関連したマーカーに
特異的に結合する効果的な量の放射性標識されたロケー
タを患者へ投与する過程を含んでいる。その後かかる投
与過程に続いて放射性標識されたロケータが任意の新生
組織に於て優先的に集中し、結合されていない放射標識
されたロケータが浄化され、患者に於て背景の光子放出
に対する新生組織からの光子放出の比が増大するよう時
間が経過される。かかる時間が経過した後、放射検出プ
ローブを用いて、リンパ節の部位に於て放射線レベルが
上昇していることを検出することにより放射標識された
ロケータが付加していることを示すリンパ節部位を決定
するべく患者が検査される。（例えば好ましくは外科的
に行われる。但し、腹腔鏡を用いることは実用的ではな
いと考えられるが、かかる機器を用いることは本発明に
於て除外されるものではない。）その後、かかる増大し
た放射線レベルを呈するリンパ節部位は除去され肉眼的
な分析を受ける。かかる部位は、別の方法として或いは
付加的に組織学的分析、例えばヘマトキシリン及びエロ
シン（Ｈ＆Ｅ）組織学的評価、を受けるようにしてもよ
い。
【０００７】かくして決定され除去されたリンパ節のう
ち肉眼的観察により腫瘍がないと判断されたもの若しく
は肉眼的に転移性の疾患がないと判断されたリンパ節
（即ち視覚的には正常に見えるが抗体を取込んだリンパ
節）は、腫瘍反応性細胞、例えば、その中に腫瘍特異Ｔ
リンパ球を増殖させるべく選択され培養される。かかる
リンパ節の部位は組織学的分析を受けた際に、Ｈ＆Ｅに
より組織学的に陰性であると判断されたリンパ節部位が
増加のために選択される。その後選択されたリンパ節は
分裂促進刺激を受ける。その後リンパ節は、例えばイン
ターロイキン２（ＩＬ−２）、抗ＣＤ3 モノクローナル
抗体及び追加的にオートローガス若しくは異型的腫瘍で
ある新生組織の存在下で有利に培養される。その後増殖
された腫瘍反応性細胞、例えばＴリンパ球は、腫瘍の発
達を軽減（緩和）するべく養子免疫療法の方式に従って
用いられる。増加された、即ち増殖された腫瘍反応性細
胞、例えばＴリンパ球、は、ガンの治療に於て有効な治
療薬である。
【０００８】現在に於て、ＣＤ４＋腫瘍特異リンパ球
は、証明されてはいないが、本発明の治療薬により示さ
れている治療作用に関連していると信じられている。除
去されたリンパ節は、ＣＤ４＋腫瘍特異リンパ球の内容
によって、かかるリンパ球が腫瘍発達の軽減に重要であ
るかどうかによらず確実に特徴付けることができる。
「腫瘍反応性細胞」は、除去され増加されたリンパ節に
於て含まれている活性（腫瘍発達を軽減する上での活
性）を有する細胞を述べるものとして選択された語であ
る。かかる「活性を有する細胞」は、ＣＤ４＋腫瘍特異
リンパ球を含むと信じられるが、このことは本発明を制
限するものではない。
【０００９】本発明の有利な点は、例えばＣＤ４＋腫瘍
特異リンパ球などの腫瘍反応性細胞が確実に豊富な或る
リンパ節を確実に選択することができるということを含
む。更なる利点は、リンパ節を除去することにより患者
から疾患した組織を除去できることである。本発明の更
なる利点はin vivo に於ける腫瘍発達の軽減のための治
療薬を形成するべくＴリンパ球を含む腫瘍反応性細胞を
容易に増加できるということである。これら及びその他
の利点はここに含まれている開示事項に基いて当業者に
容易に理解されるであろう。
【００１０】
【実施例】図面に於て報告された実験的結果は以下に於
て議論される。
【００１１】最近まで、疾患した（例えば腫瘍に関連し
た）リンパ節をin vivo で選択することは外科医の視覚
的な選択及び病理学者の診断に限られていた。ニアロダ
等（Nieroda et al,"Radioimmunoguided Surgery(RIGS)
in Recurrent Colorectal Cancer",Cancer Detection
and Prevention,Vol.14,Issue 6,pages 651-656(1990)
，及び "Radioimmunoguided Surgery in Primary Colo
n Cancer"，Cancer Detection and Prevention,Vol.15,
Issue 3,pages 225-229(1991)）は、Ｎeoprobe（登録商
標）ＲＩＧＳ（登録商標）ガンマ検出プローブを用いた
「Radioimmunoguided Surgery TM」システムによって新
生組織に苦しめられている患者の段階付けをするための
方法を開示している。（Radioimmunoguided Surgery TM
はネオプローブコーポレーション（Neoprobe Corporati
on，Colombus,Ohio ）の商標であり、Neoprobe（登録商
標）及びＲＩＧＳ（登録商標）はネオプローブコーポレ
ーションの登録商標である。）かかるシステムにより決
定された如きリンパ節の関連物によって外科医若しくは
腫瘍学者は患者を適切に段階付けすることができ、例え
ば補助的な化学療法のために患者を更に詳しく段階付け
することができる。
【００１２】かかる段階付けについての発展は米国特許
第４，７８２，８４０号に基いており、同米国特許は、
新生物の位置決めをし、新生物を識別し除去するための
非常に改良された方法を開示する。かかる技術は、放射
性標識された抗体と外科医が放射能が増大した部位を検
出するために手術中に於て使用できる携帯用の放射線検
出プローブとを用いている。かかる処理手順はＲＩＧＳ
（登録商標）システムとして知られており、腫瘍の検出
は、血液中に流れる放射性標識された抗体の背景が患者
の体から浄化され腫瘍によって放射される光子放出若し
くは放射線が腫瘍の周囲の組織に比べて増大するように
なった後で行われるべきであると認識することで成功裡
に行われる。幸運なことに、米国特許第４，７８２，８
４０号は、放射性標識された抗体がその放射性タッグを
結合した状態で長い期間新生組織に結合した状態もしく
は関連した状態に残っていることができるということを
開示する。更に、腫瘍部位に於て放射能の付加は時間と
共に低減するが、血流及び周囲の組織の背景は腫瘍部位
に比べて更に早い速度で低減し、従って、Neoprobe（登
録商標）ＲＩＧＳ（登録商標）１０００放射線検出器の
如き手で持てるプローブを用いることで放射性部位が容
易に決定される。
【００１３】Neoprobe（登録商標）ＲＩＧＳ（登録商
標）１０００放射線検出器と125 I CC49モノクロナル抗
体と共に米国特許第４，７８２，８４０号のＲＩＧＳ
（登録商標）システムを用いて、リンパ節は、同定され
５つの分類に分けられている。その後の成果により、そ
のような細かい分類は腫瘍発達の軽減のための治療薬の
ために増加され形成されるための適切なリンパ節を選択
するためには必要はないことが明らかにされた。以下の
議論の幾つかは、その元々のリンパ節の分類について述
べるが、本発明を実施するに当たりかかる分類の使用は
必要はないということは理解されるべきである。この初
期の分類は以下の表１に示されている。
【００１４】
【表１】 タイプ0 のリンパ節は、検出され得る放射能を持たず又
腫瘍の組織学的証拠を有していない。タイプI のリンパ
節は、放射能について陽性であるが通常のＨ＆Ｅ組織学
的検査によれば陰性である。タイプIIのリンパ節は、放
射能について陽性でありオカルト腫瘍の証拠を含んでい
る。タイプIII のリンパ節は、放射能について陽性であ
り腫瘍の組織学的証拠を含んでいる。タイプIVのリンパ
節は、放射能について陰性であるが、腫瘍の証拠を含ん
でいる。
【００１５】解剖学上、多くのタイプI のリンパ節は門
部周辺のリンパ節、腹腔リンパ節及び膵臓上大動脈のリ
ンパ節に見出される。一次結腸直腸ガンを有する患者に
於て排出領域的結腸間膜リンパ節はタイプI である。タ
イプIII 及びタイプIVのリンパ節は、その大部分につい
て腫瘍周辺の結腸間膜に見出される。タイプI のリンパ
節が更に連続断面化若しくはサイトケラチン抗体により
分析されると、タイプI のリンパ節の約４０％は腫瘍の
証拠を有しており、それらは実質的にタイプIIのリンパ
節とされる。本発明の目的について、タイプI のリンパ
節は、Ｈ＆Ｅ組織学的検査により決定され、それらのリ
ンパ節は腫瘍反応性細胞、例えばＣＤ４＋Ｔリンパ球を
増殖するべく培養するために選択される。しかしなが
ら、見かけのタイプI のリンパ節に於て、連続断面化若
しくはサイトケラチン抗体による方法で検査され、組織
学的方法によって陽性とされかくしてオカルト腫瘍を含
んでいることの分ったリンパ節は、分類し直して実質的
にタイプIIのリンパ節とするのが好ましい。かくして殆
んど若しくは全く腫瘍を有していないＬＮＬがＣＤ４＋
腫瘍特異リンパ球を増殖するべく培養するのに用いられ
る。リンパ節の分類についての更なる議論は以下の文献
に見られる（Arnold,et al.,"Radioimmunoguided Surge
ry Challenges Traditional Decision Making in Patie
nts with Primary Colorectal Cancer", Surgery,Vol.1
12,No.4,pp 624-630（October 1992);及びArnold,et a
l., "Intraoperative Detection of Colorectal Cancer
with Radioimmunoguided Surgery and CC49, a Second
-Generation Monoclonal Antibody" ，Annals of Surge
ry,Nol.216,No.6,,627-632 （December 1992 ））。
【００１６】本発明の方法の第一の過程は、新生組織に
より生成された若しくはそれに関連したマーカーに特異
的に結合する有効な量の放射性標識されたロケータを患
者へ投与することを含む。上記の如く、「ロケータ」
は、新生組織若しくは新生物により生成された或いはそ
れに関連したマーカー（例えばガン細胞若しくはガン細
胞の生成物）に結合することにより腫瘍の部位に優先的
に集中する物質を含む。今日の適当なロケータは、基本
的には抗体（全及びモノクローナル）、抗体のフラグメ
ント、全抗体及び抗体フラグメントのキメラ型、及びそ
れらのヒト型化されたものを含む。しかしながら、一本
鎖の抗体（米国特許第４，９４６，７７８号に開示され
ている如きＳＣＡ）及び同様の物質が開発されており、
同様に有効であることを示すことができるということが
理解されるであろう。生化学及び遺伝子工学により、
「抗体」の伝統的な定義に包含されないが新生組織の部
位に選択的に集中する抗体の機能を真似る物質を生成す
ることができる。「ロケータ」は、ここに開示する本発
明の方法に於て抗体を模倣すると判断される物質と共に
現在までの抗体及びそれに等価なものを含む語として選
択された。
【００１７】現在に於て、本発明に於て有用な抗体は、
抗ＴＡＧ抗体、例えばＢ７２．３（抗ＴＡＧ７２抗体、
（Dr.Jeffrey Schlom,National Cancer Institute
）），ＣＣ４９（第二世代のＢ７２．３抗体,Arnold,e
t al., ”Intraoperative Detection of Colorectal Ca
ncer with Radioimmunoguided SurgeryTM（RIGS（登録
商標）） and cc49 a second-Generation Monoclonal A
ntibody (Mab）",Ann.Surg.,出版されるよう受け入れら
れた。；Cancer Res.50,6987-6994,Nov.1,1990;Cancer
Res.48,4597-4603,Aug.15,1987;J.Clin.Lab.Analysis
3:369-369(1989);Biol.Chem,Hoppe-Seyler,1989,370:21
-26;Cancer Res.50:4885-4890,Aug.15,1990;Cancer Re
s.,48:4588-4596,1988;Cancer Res.,50:4872-4879,Aug.
15,1990;Cancer 67:2880-2886,1991;Cancer Res.50:129
1-1298,1990;Biotechnology,3:378-384,1985;Proc.Nat'
l Acad.Sci.USA,78 ：3199-3203 ，Cancer Res.,48:681
1-6818,1988;Cancer Res.,48:2214-2220,1988;J.Nat'l
Canc.Inst..1986:6666):995-1003;Int'l J.Cancer 198
2:29:539-545;Int'l J.Cancer 1983:31:543-551;Cancer
Res.,50:6987-6994,1990;Cancer Res.,51:2889-2896,1
991;J.Clin.Lab.Anal.,4:465-473,1990;Cancer Res.,5
1,6363,6371,Dec.1,1991;J.Nat'l Cancer Inst.82:1191
-1197,1990;Cancer Res.51,5378-5383,Oct.1,1991); を
参照。）、ＣＣ８３（もう一つの第二世代のＢ７２．３
抗ＴＡＧ抗体）、ＣＥＡ抗体、例えばＡ5 Ｂ7 モノクロ
ーナル抗体（Cancer Research Campaign Technology,Lt
d,London,England) （Int.J.Cancer,47:597-602,1991;B
r.J.Cancer,54:75-82,1986;Br.J.Cancer,61:891-894,19
90;Int.J.Cancer,Spplement 3,34-37,1988;Eur.J.Nucl.
Med.,13:197-202,1987;Br.J.Cancer,60:594-554,1989;a
nd Br.J.Cancer,61:659-662,1990;を参照）、モノクロ
ーナル抗体Ｂ１７−１Ａ及びそのＦ(ab') 2 フラグメン
ト (Winster Institute,Philadelphia，Pa.)、そしてモ
ノクローナル抗体１９−９とそのＦ(ab') 2 フラグメン
ト（Centocor,Inc.,Philadelphia，Pa.)などを含む。
【００１８】放射性標識の選択について、リンパ節の直
ぐ近くに配置され得る放射性検出プローブを用いること
ができるためには、低エネルギレベルの同位体が好まし
く、特にそれらの同位体の光子放出のエネルギレベル
は、約５５０kev 以下であり、約３００kev 以下が有利
であり、好ましくは１５０kev である。125 Ｉが現在使
われている選択された同位体であるが、米国特許第４，
７８２，８４０号に開示されている如く更なる低エネル
ギの同位体が必要であれば、或いは望ましい場合若しく
は便宜上用いることができる。高エネルギレベルの放射
性同位体（例えば131 Ｉ）もまた用いることができる
が、放射線検出プローブの適当なコリネーションが採用
されなければならず、このことは、装置が外科医にとっ
て容易に用いることのできるということが妨げられ、適
当に検査されるべき体腔内に於ける領域が制限されると
いうことである。
【００１９】ガンマ放射線を発する放射性同位体の他
に、ベータ放射線を呈する放射性同位体も更にベータ放
射線若しくはポジトロンを検出することのできるプロー
ブと共に用いることのできる。手術中に於てベータ放射
線を検出することが例えば米国特許第５，００８，５４
６号に於て開示されている。
【００２０】放射性標識されたロケータの投与量は、か
かる放射性標識されたロケータの付加を呈するリンパ節
部位を決定するのに放射線検出プローブが使用可能とな
る量である。かかる投与量は、標識の仕様形式、ロケー
タの形式及び当業者に明らかな投与の要件に影響し得る
因子に依存している。
【００２１】放射性標識されたロケータの付加を示すリ
ンパ節の部位の検出に関して、米国特許第４，８０１，
８０３号、同第４，８８９，９９１号及び同第５，０７
０，８７８号に於てガンマ放射線の検出の好ましい手で
保持できるプローブが示されている。上記の如く米国特
許第５，００８，５４６号は、ベータ放射線の検出に適
当なプローブを開示する。更なる放射線検出装置が必要
に応じて、所望の場合若しくは便宜上用いることができ
る。この点に関して、リンパ節関連物を決定するために
手術中に於て患者の検査を行うということは本発明の実
施についての一つの例に過ぎない。更に、プローブは、
腹腔鏡、縦隔鏡、若しくは放射能の付加を決定するため
にリンパ節のすぐ近くに配置することができるよう最小
化された放射線検出装置に適当に装備することのできる
同様の特別の装置の一部として用いられてよい。採用さ
れる装置若しくは技術に拘らず、本願発明は、標識が如
何なるものであっても、全てのこれらの装置及び技術を
含む。
【００２２】米国特許第４，７８２，８４０号に於て報
告されている如く、放射線検出プローブを用いて患者を
直ぐ検査することは賢明ではない。好ましくは、放射性
標識されたロケータの投与の後、結合していない放射性
標識されたロケータが検査されるべきリンパ節の周囲の
組織から浄化されるまでの時間が経過される。適当な放
射線検出プローブは、血液流の背景（血液流中を循環す
る放射性標識されたロケータ）及び循環する結合してい
ない放射性標識されたロケータを含み得る周囲の組織と
共に患者が検査される場所（例えば手術室）に於て見出
される通常の背景放射能を越える放射能レベルを決定す
ることにより機能する。かかる時間は、患者の体が放射
性標識されたロケータをどの程度の早さで浄化（若しく
は代謝）するかに依存して数分間程度から数周間に亙
る。重要なことは、放射性標識されたロケータが、かか
る時間経過した後に、低減されたレベルではあるが放射
性標識がそのままの状態で腫瘍細胞の部位に結合されて
いるということを認識することである。外部シンチグラ
フィ及び外部画像技術に於て伝統的に教示される如く放
射性標識されたロケータの取込みが腫瘍に於て最大であ
るということに基いてリンパ節を調べることは適当では
ないということは重要である。
【００２３】適当な時間が経過された後、患者は放射線
検出プローブをもって検査され、リンパ節の部位がそこ
に於ける放射線のレベルが上昇されたことをそのプロー
ブで検出することにより放射性標識されたロケータの付
加が決定されるようプローブで調べられる。米国特許第
４，７８２，８４０号に開示されている如く外科的処理
の手順を変更し得る微小転移性組織を決定する他に、本
願発明によれば、外科医は、新生組織（ガン）の後退の
ための治療薬を調製するのに使われるＣＤ４＋リンパ球
の豊富なリンパ節を決定することが可能となる。
【００２４】その後、決定されたリンパ球細胞は、従来
の免疫療法の手順に於ける慣用の細胞増加とは大きく逸
脱した態様にて増加若しくは増殖される。簡単に述べれ
ば、細胞増加は、リンパ節組織からのＬＮＬの分離の過
程と、ex vivo に於ける細胞増加の活性化及び開始、培
養液の交換、細胞培養の分割及び外因性サイトカインか
らの分離及び細胞の採取と患者へ投与するための最終生
成物の調製の過程を含む。
【００２５】細胞及び組織の分離は、慣用的に、例えば
遠心等によってＬＮＬを採取するために行われる。細胞
増加の開始は、この細胞増加の方法に独特な血清のない
マクロファージＳＦＭ培養液を初めに用いることを含
む。更に、分裂促進刺激が最も好ましくは、ＩＬ−２及
び溶解性の抗ＣＤ3 セルを用いて行われる。ＩＬ−２及
び抗ＣＤ3 セルは、（従来の如く連続的に加えること及
びプレートに結合された抗ＣＤ3 セルを用いるのではな
く、）同時に加えられる。成長の過程に於て培養には、
新鮮な培養液及びサイトカインが周期的に加えられる。
重要なことには、細胞は、ＩＬ−２の量を低減するべ
く、即ち２０セタス（Cetus ）単位／mlまで低減するべ
く新鮮な培養液のみ取込むことによって外因性のサイト
カイン（例えばＩＬ−２）から離れる。細胞を外因性の
サイトカインから離すことによって、ＬＮＬ細胞と共に
患者へ更なるサイトカインの投与をする必要がなくなる
と信じられる。そしてデータはこのことを確証すること
となろう。
【００２６】典型的な細胞増加の方法の詳細は以下の通
りである。
【００２７】第０日 ex vivo に於ける細胞成長のための培養液は、５０μg
／m Ｌのゲンタマイシンを含む無血清マクロファージＳ
ＦＭ培養液が予め梱包された１０Ｌ培養液分注バックを
用いて無菌状態で調製される。細胞及び組織分離処理か
らの洗浄されたリンパ節リンパ球を含む円錐形チューブ
が静かに数回に亙り反転され細胞を混合する。細胞は混
合され、１ｍｌ量が計数のために取出される。細胞の濃
度に基いて、ＩＬ−２及び抗ＣＤ3 が細胞の懸濁液へ加
えられる。その量は、加えられた培養液に於てＩＬ−２
（キロン・コーポレーション（Chiron Corp.,Emeryvill
e,CA））が１００Cetus 単位／１０6 細胞の濃度となる
ように、抗ＣＤ3 （ＯＫＴ３、ジョンソン・アンド・ジ
ョンソン(Johnson and Johnson,Raritan,NJ)）が１００
ng／１０6 細胞の濃度となるような量である。
【００２８】ＩＬ−２及びＯＫＴ３を含む細胞懸濁液
は、６０ccの無菌シリンジを用いて完成した培養液を含
む１Ｌ無菌気体透過性培養バッグへ移される。従って最
終的な細胞濃度は、１×１０6 細胞／mlである。細胞
は、ここで閉じた培養系内に含まれ、１０日間の培養期
間の終りまで閉じた系にあることとなる。
【００２９】細胞培養バッグは、患者の同定のための印
がラベルされ、７％ＣＯ2 を含む３７℃の湿潤されたイ
ンキュベータ中に置かれる。
【００３０】第４日 インキュベーション期間の開始４日後に於て、細胞培養
バッグは、インキュベータから取出される。バッグは静
かに揉まれ、細胞を溶液中に分散する。無菌シリンジが
培養バッグのサンプリングポートに差込まれ、５mlの量
が計数、生存率及び形態学的分析のために取出される。
【００３１】新鮮な１Ｌの培養バッグの各々へ加えられ
るべき新鮮な完成培養液と細胞懸濁液との最終的な体積
は、バッグ当たりの最終濃度が０．２５×１０6 細胞／
mlとなることを基本にして計算される。１０6 細胞毎に
３００セタス単位の濃度のＩＬ−２が細胞懸濁液を含む
培養バッグへ加えられ、従って、最終的なＩＬ−２の濃
度は各々の新鮮な１Ｌ培養バッグに於て１００Cetus 単
位となる。
【００３２】細胞培養バッグは、ここで新鮮な培養液及
び新鮮な無菌の気体透過性培養バッグへ移送されるべく
準備される。デュポン（DuPont) ＳＣＤ無菌チュービン
グウェルダーを用いて、閉じた移送線が無菌ポンプチュ
ーブ機構、細胞懸濁液を含む培養バッグ、新鮮な完成培
養液のバッグ及び培養液及び細胞が移送されることとな
る無菌バッグの間に形成される。ポンプチューブは、蠕
動ポンプのカムに捩込まれ、懸濁液と加えられる新鮮な
完成培養液の体積が設定される。ポンプが始動され、細
胞懸濁液のバッグの内容物と新鮮な培養液が予め定めら
れた数の新鮮な培養バッグへ分配される。
【００３３】移送が完了すると、無菌チューブシールが
各々のバッグに溶接される。バッグは患者の同定の印が
ラベルされる。全てのバッグは、３７℃、７％ＣＯ2 の
湿潤されたインキュベータへ戻される。全ての元の培養
バッグは医療廃棄物についての産業上の指示に基いて廃
棄される。
【００３４】第７日 培養期間の開始から７日後、静かに揉まれることにより
細胞は再び混合される。５ml量が培養バッグのうちの一
つから取出され、細胞の数、生存率及び形態について分
析される。細胞の数に基いて、新しい培養液と細胞懸濁
液の体積が、新鮮な１Ｌ培養バッグに於ける最終的な濃
度が０．５×１０6 細胞／mlになるよう計算される。４
０セタス単位／１０6 細胞のＩＬ−２が新鮮な完成培養
液へ加えられ、培養液及び細胞懸濁液が移送されること
となる培養バッグの各々に於けるＩＬ−２の最終的な濃
度が２０セタス単位／mlとされる。
【００３５】前記の如く蠕動ポンプと無菌チューブウェ
ルダーの機構を用いて新鮮な気体透過性バッグへ細胞と
新鮮な培養液が移送される。移送とシールが完了する
と、バッグはラベルされ、３７℃、７％ＣＯ2 の湿潤さ
れたインキュベータに置かれる。
【００３６】第９日 患者への注入のための細胞の調製の２４時間前に、１０
％のバッグから１０mlの量が、好気的及び嫌気的微生物
学的分析のために取出される。患者への注入のための調製 第１０日 培養期間の１０日目に於て、培養バッグは、培養バッグ
の各々から培養液を取除き、細胞をプールし、細胞を濃
縮するためにインキュベータから取出される。バッグの
数によって、この処理は、４５分から２時間かかること
となろう。各々の１Ｌ培養バッグはステリセル（Steric
ell ）処理器及び収集ボールを用いて２５０ml／分の速
度にて処理される。バッグのチューブは処理器のカムに
捩込まれ、ポンプと遠心が始動される。細胞は処理器の
ボールに集められ、残りの培養液は引出されて廃棄され
る。
【００３７】全ての培養バッグがプールされ培養液が除
去された後に、約９５０mlの１．２５％ＵＳＰヒトアル
ブミンの無菌塩溶液が細胞に通され、残留する培養液を
除去する。ステリシェルポンプの流れは逆転され、約２
７０mlの細胞が無菌５００ml移送パックへ汲み入れられ
る。処理器ボールは５０mlのアルブミン及び塩水溶液の
混合物を用いて移送パックへ注がれる。この輸液調製物
の最終的な細胞の濃度は、１−５×１０10細胞となる。
この調製物には適当な患者の同定のラベルが成される。
【００３８】品質管理（ＱＣ）検査のために輸液バッグ
から無菌シリンジを用いて１ml量が取出される。その後
全てのＱＣ検査が完了するまで輸液バッグは２−８℃に
保存される。ＱＣ検査から満足のいく結果が報告された
後、かかる患者の輸液調製物は主治医へ送られる。
【００３９】製造行程の管理 全ＱＣ過程 品質管理過程は、製造に用いられる物質及び最終生成物
の品質の双方を確実にするために構成されている。
【００４０】付加的な管理は、製造行程全体に亙り患者
の細胞の同定を保証することを含んでいる。或る患者に
ついての全ての細胞培養容器はその他の患者の細胞から
隔離されており、特定の患者同定の印をもってはっきり
とラベルされている。各々の患者は、１０日間のインキ
ュベーション期間の間、彼等の細胞がその他の患者のも
のと混ざらないよう各個人の細胞に提供されたインキュ
ベータに割当てられている。
【００４１】開放した状態で細胞培養を操作することは
最小化されており、初めの培養開始の過程に於て、要求
されれば、かかる開放系に於ける細胞培養処理操作は薄
いフローフード中に於て無菌状態下で実行される。細胞
培養の分割及び移送を含む処理の多くは汚染を防ぐべく
閉じた培養系内にて行われる。
【００４２】細胞培養ＱＣ検査 第０日、第４日、第７日及び第１０日に於て、細胞培養
の試料が無菌的に収集され、生存率、細胞数、及び形態
について分析される。生存率及び細胞数は、青色染色技
術を用いて調べられる。形態は、ライト−ギムザ染色法
を用いてサイトスピン試料を顕微的に観察することによ
り実行される。
【００４３】患者への注入の２４時間前に、好気性細菌
及び嫌気性細菌培養がＢＡＣＴec血液培養試薬を用いて
実行される。患者への注入の直前に於て、グラム染色が
実行され、ＦＤＡが権利を有する市販の試験を用いてエ
ンドトキシン検査が行われる。
【００４４】増加され活性化された細胞の輸液調製物は
グラム染色について陰性であり細胞生存率≧７０％を示
し、測定されたＬＡＬレベルが＜１．０ＥＵ／mlでなけ
ればならない。
【００４５】望ましくは、約１０10細胞が患者に投与す
るために生成される。オートローガスの増加された細胞
が、リンパ節が除去された患者へ投与する際に用いるの
に好まれる。また、好ましくは外科医により切除可能と
判断された新生組織は前記の如く決定されたリンパ節と
共に除去される。治療薬の投与は、その後に行われる。
関連物が切除できない患者については、決定されたリン
パ節のみが除去され、増加され、かくして生成された治
療薬が投与される。
【００４６】ここに報告される初期のデータは以下の実
験的手順に基いて得られた。
【００４７】例１ 初期の実験的手順 患者の選択とＲＩＧＳ（登録商標）プローブ装置 患者の選択及びＲＩＧＳ（登録商標）プローブ装置に適
当な患者は、結腸直腸ガンであって再発性疾患若しくは
一次ガンの何れかを有する患者とされた。本研究に於て
対象となった全ての患者は、それらの患者から腹部外の
腫瘍について除去できるかどうかを詳しく手術前に評価
された。手術前の評価は胸部、腹部、骨盤のＣＴスキャ
ンを含み、必要と見倣されれば骨の走査を行うことも含
む。ＣＥＡ検査及び結腸鏡もまた術前評価の一部であ
る。全ての患者は学会検査委員記載の同意書（Institut
ional Review Board Written Consent）に署名した。放
射性標識された抗体の投与の２日前に患者はヨウ化カリ
ウムの経口溶液による処置を開始し（１日に２回１０滴
のＳＳＫＩ、若しくは１日に２回の５００mgのＫＩ）、
放射性標識されたＣＣ４９モノクローナル抗体の甲状腺
による取込みを防ぎ、この療法を３週間若しくは手術ま
で続けた。ＣＣ４９ MoAb はオハイオ州立大学（ＯＳ
Ｕ）メディカルセンターに於ける核薬剤部でヨードゲン
（Ｉodogen）法を用いて放射性ヨウ素化された。標識さ
れていない抗体をもってネガティブ皮膚検査が実行され
ると、患者は静脈注射により４mlのリン酸により緩衝さ
れた塩溶液に薄められた１mCi のヨウ素１２５
（125 Ｉ）にて標識された０．１mgのＣＣ４０ MoAb を
受取り５分間に亙り注入された。全ての患者は注射後１
時間に亙り１５分毎に生命徴候を記録することにより観
察された。患者は、ガンマ検出プローブ（ＧＤＰ）、Ne
oprobe（登録商標）ＲＩＧＳ（登録商標）１０００装置
により決定される胸部の計数が２秒当たり２０カウント
以下になったとき手術をするよう予定された。血清試料
が手術に於ける注射の前に得られた。
【００４８】手術中の手順は、Neoprobe（登録商標）Ｒ
ＩＧＳ（登録商標）１０００装置を用いた開腹術に関連
している。その詳細は以前に記載されている。外科的手
術の時点に於て肝胃間膜、胸部領域、腹腔節、膵臓上領
域及び腸肝膜節に於けるリンパ節が探査され、ＲＩＧＳ
（登録商標）プローブが陽性であるリンパ節が見出され
た。ＲＩＧＳ（登録商標）プローブが陽性である組織は
背景に対する組織の比が１．５：１以上であることによ
り決定される。種々のリンパ節が腫瘍組織の試料と共に
患者から採取された、これらの物質は緩衝塩溶液中に於
て迅速に病理学部門へ送られた。全ての物質は病理学者
により検査された。組織は無菌的に処置された。
【００４９】用いられた全てのリンパ節は、長手方向に
二分され、半分はリンパ節研究所へ送られ、通常のヘマ
トキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）組織学的評価のため
に保存された。病理学者は、全ての切断された節を調べ
た。腫瘍組織は病理学者により調べられ、数センチ以下
の小さな断片が取出され無菌塩溶液中に置かれ、リンパ
節研究所へ送られた。ヘマトキシリン及びエオシン染色
法を含む通常の病理学検査が全ての患者の物質について
行われた。
【００５０】リンパ球の調製 手術の日に於て、患者から血液が採られフィコール−ハ
イパーク（Ficoll-Hypaque）（ファルマシア（Pharmaci
a ））分離が実行され、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が
得られた。これらの細胞はＲＰＭＩ１６４０に於て洗浄
され再懸濁された。ＲＰＭＩ１６４０には、ペニシリン
（１００単位／ml）、ストレプトマイシン（１００ug／
ml）、及びＡＢ型の１０％のヒト血清（ＧＩＢＣＯ、マ
イコプラズマ検査された）が加えられた。これは完全な
ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩc ）である。脾細胞が用いられる場
合、脾臓組織は穏やかに細分化されてＲＰＭＩc へ入れ
られた。かくして生成された細胞懸濁液は上記のフィコ
ール−ハイパーク分離により処理された。これらのリン
パ球が刺激因子細胞として用いられる場合、それらは混
合されたリンパ球培養に添加される前に４０００rads
（セシウム源）に曝された。
【００５１】リンパ節は処理されるまで無菌媒体内に於
て氷上にて保存され、節を穏やかに細分化してＲＰＭＩ
c に入れることにより調製された。細胞懸濁液は遠心分
離され、ペレットがＲＰＭＩc に於て洗浄された。生存
率が各々の測定の前に青色排除法により決定された。生
存率は通常９５％以上であった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋
リンパ球についての測定は、クールター（Coulter ）か
らのエピックスエリート（Epics ELITE)フローサイトメ
ーターを用いて行われた。ＬＮＬは二重染色試薬Ｔ４−
ＦＩＴＣ／Ｔ８−ＰＥ（Olympus ）を用いて染色され
た。細胞（５×１０5 ／チューブ）は、０．１mlＰＢＳ
（１％ウシ胎児血清）中に再懸濁され、室温にて遮光し
て１０ulのＴ４／Ｔ８染色試薬中にて２０分間インキュ
ベートされた。それらは更にＰＢＳにて二度洗浄され、
０．５mlのＰＢＳで緩衝された１％ホルマリンによって
固定され、フローサイトメーターを用いて分析するまで
４℃にて遮光して保存された。
【００５２】腫瘍試料の調製 切除された腫瘍は生存率を維持するべ無菌塩溶液中にて
氷上で保存された。病理学的検査に必要な組織を除去し
た後、腫瘍は血清を含まないＲＰＭＩ（ＲＰＭＩic）に
て洗浄され、ペトリ皿に置かれ、そこに於て１〜１．５
mmの寸法の断片に分割された。分割された腫瘍は５０ml
の円筒形の遠心チューブへ移送され、そこに於て組織は
更にＲＰＭＩicにて洗われた。５ml〜１０mlを除いて全
ての媒体が除去され、ＰＢＳ中に調製された同じ体積の
０．４％タイプ１コラゲナーゼ（シグマ（ＳＩＧＭ
Ａ））がチューブへ加えられた。この消化作用は、３７
℃にて１時間インキュベートして可能となった。チュー
ブは細胞の分散を補助するべく１５分おきに振盪され
た。インキュベーションの後、ＲＰＭＩc が４５mlに等
しくなるよう加えられた。消化されなかった腫瘍は沈め
られ、細胞懸濁液がチューブの上部から注意深く除去さ
れた。細胞は１５分間４００g にて遠心された。残りの
腫瘍はチューブ内に残され、その後更なる消化を行っ
た。腫瘍細胞のペレットが２倍のＲＰＭＩc 中にて洗浄
された後、生存率が青色排除法により決定された。腫瘍
細胞が増殖測定に用いられる場合、それらは添加される
前に３０００rads（セシウム源）に曝された。残りの生
腫瘍懸濁液は将来の実験に於て異型的細胞として用いる
べく凍結腫瘍バンクとして保存された。
【００５３】腫瘍細胞系統 腫瘍細胞は、アール（Earle)塩を用いた最小の必須培養
液にて成長された。培養液にはＬ−グルタミン２m Ｍ、
非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム０．１m Ｍ、Ｍ
ＥＭビタミン溶液及び１５％ウシ胎児血清（全てＧＩＢ
ＣＯからのもの）が加えられた。Glico はヒトグリオー
ム腫瘍系統である。ＣＡＲ−１は肝移植を受けた患者か
ら得られた転移性カルシノイドについてのカルシノイド
腫瘍であり、結腸ガン細胞と同じ過程を用いて処理され
た。ＷＤ１２４（結腸ガン腫細胞系統）は、ＲＩＧＳ
（登録商標）処理過程中に於て再発性の結腸ガンを有す
る患者から単離された。これらの継代された細胞系統が
混合されたリンパ球／腫瘍の測定に於て用いられる場
合、それらは添加に先立って３００００rads（セシウム
源）に曝された。
【００５４】混合された腫瘍リンパ球の測定 ＩＬ−２は２０u ／mlの濃度にて用いられた。抗ＣＤ3
はマウス型の抗ヒト抗体である。（Yoshizawa,et al,"A
ctivation of Anti-CD3 of Tumor-Draining Lymph Node
Cells for Specific Adoptive Immunotherapy",Cellul
ar Immunology,134,473-479,1991 を参照。）混合され
た腫瘍リンパ球培養の実験は９６の円形の底部を有する
組織培養ウェルプレートに於て実行された。ＲＰＭＩc
が、ウェル当たりの最終的な体積が０．２mlとなるよう
試薬及び細胞の希釈剤として分析全体に亙り用いられ
た。全てのグループについて対照実験が行われており、
それらは、抗ＣＤ3 投与による応答と共に、ＩＬ−２を
伴なったリンパ球若しくは腫瘍細胞だけのもの、リンパ
球と腫瘍細胞を両方含むもの、ＩＬ−２の混合された培
養の場合からなる。リンパ球はウェル当たり１×１０4
の密度にて、腫瘍細胞はウェル当たり５×１０3 の密度
にて添加された。プレートは湿潤されたＣＯ2インキュ
ベータ（５％ＣＯ2 ）中にて３７℃で９６時間インキュ
ベートされた。この期間の後ウェル当たり１u Ｃi の［
3Ｈ］チミジン（ＩＣＮ、特異的活性、６．７Ｃi ／mm
ol）が１８時間加えられた。細胞採取器（ＰＨＤ）がガ
ラスファイバーフィルタストリップと共に用いられ、ウ
ェルが採取された。孔の開けられたフィルタディスクが
バイアルへ落され、水性のシンチレーション混合溶液が
ベックマン１８０１シンチレーションカウンタにて計数
される前に加えられた。ステューデントのt テストを用
いた統計的分析が有意性を決定するべく行われた。
【００５５】初期の実験結果 タイプI ＬＮＬがＩＬ−２及び抗ＣＤ3 の存在下に於て
オートローガス（照射された）腫瘍と共に混合された腫
瘍リンパ球培養に於て培養されると、図１及び表２に於
けるデータを参照して理解される如く［ 3Ｈ］チミジン
の取込みにより測定される如きリンパ球の増殖が３倍〜
１０倍に増大する。
【００５６】
【表２】 増殖は、リンパ球が抗ＣＤ3 と低濃度のＩＬ−２（２０
Ｕ／ml）にて活性化された場合のみ生じる。これらのＬ
ＮＬは前記のデータが示す如く種々の程度にて異型的ヒ
ト結腸ガン細胞に反応する。ＬＮＬはＩＬ−２のみ存在
する場合に腫瘍細胞に対して僅かながら増殖する。そし
てしばしばＩＬ−２及び抗ＣＤ3 と共に見られる増殖に
比較してＩＬ−２及び腫瘍細胞のみの場合に有意な増殖
は見ることはできない。
【００５７】図２及び表３のデータに示されている如
く、ＩＬ−２の濃度を非常に高くしても（１００若しく
は５００u ／ml）、増殖は刺激されず、低濃度のＩＬ−
２と抗ＣＤ3 との場合も同様である。
【００５８】
【表３】 タイプI のリンパ節は、約４０％〜７０％のＣＤ４＋リ
ンパ球と約８％〜１５％のＣＤ８＋リンパ球を含む。Ｐ
ＢＬによってＩＬ−２及び抗ＣＤ3 がＣＤ４＋及びＣＤ
８＋リンパ球の増殖を刺激することができＩＬ−２のみ
ではＣＤ４＋リンパ球の増殖を刺激しないということが
示されている（Nishimura,et al.,"Generation,Propaga
tion, and Targeting of Human CD4+ Helper/Killer T-
cells Induced by Anti-CD3 Monoclonal Antibody Plus
Recombinant IL-2． An Efficient Strategy for Ad
optive Tumor Immunotherapy.",J.Immunol.,148:285-29
1,1992. ）。タイプI のリンパ節に於けるＣＤ４＋リン
パ球の高いパーセンテージから抗ＣＤ3 及びＩＬ−２は
これらの細胞を刺激し、ＩＬ−２のみではこれらの細胞
を刺激できないということがある得る。
【００５９】図３及び表４から理解される如く、タイプ
I のリンパ節に比べて、タイプIIIＬＮＬは、オートロ
ーガス腫瘍、異型的腫瘍若しくはＩＬ−２及び抗ＣＤ3
の組合せに応答して増殖しない。
【００６０】
【表４】 増殖に関する限り、かかる腫瘍免疫活性が欠如している
ことについての理由は、腫瘍含有節がＴＩＬ細胞の源で
あるので明確ではない。（Schwartzentruber,et al.,"S
pecific Release of Granulocyte-Macrophage Colony-S
timulating Factor, Tumor Necrosis Factor Alpha,and
Gamma Interferon by Human Tumor-Infiltrating Lymp
hocytes After Autologus Stimulations,",J.Immunol.,
146:3674-3681,1991）。しかしながら、ＴＩＬ細胞の成
長についての測定は長期間の培養及び高濃度のＩＬ−２
を必要とし、ここに報告されているＬＮＬの測定は新鮮
な培養に於ける短期間、即ち４日間の分析である。
【００６１】図４及び表５から理解される如くタイプ0
のリンパ節のリンパ球はその応答が変化しており、殆ん
どがＩＬ−２及び抗ＣＤ3 の存在下で異型的若しくはオ
ートローガス腫瘍に対して殆んど腫瘍特異的増殖を示さ
ない。
【００６２】
【表５】 選択されたタイプ0 の節のうち約２５％〜３０％のみ
が、タイプI の節の＞９０％の有意な増殖に比較して腫
瘍に対し有意に増殖する。腫瘍特異的増殖を呈するタイ
プI の節を有する患者から得られたタイプ0 の節が存在
した。しかしながら細胞に於て見られる増殖量は、常
に、図５及び表６に示されている如く、タイプI のリン
パ節に於て見られるものより遥かに小さい。
【００６３】
【表６】 これらの結果は、腫瘍特異活性についてリンパ節を選択
するということについて本発明が有用であるということ
を示唆する。
【００６４】図６Ａ及び図６Ｂと表７に於て見られる如
く、脾臓リンパ球は、ＬＮＬについて見られるものと同
様の応答を有する。即ちタイプI の脾臓リンパ球は結腸
腫瘍に応答して増殖し、タイプIII の脾臓リンパ球は増
殖しない。
【００６５】
【表７】 殆んどの脾臓は腫瘍細胞の存在に矛盾しないプローブの
放射能を呈する。しかしながら、殆んど脾臓は除去され
ないので現在のところ脾臓リンパ球に於けるデータは殆
んどない。
【００６６】タイプI のリンパ節からのＬＮＬは、オー
トローガス及び異型的腫瘍に応答して増殖する。図７及
び表８を参照して理解される如く、これらのＬＮＬは異
型的結腸ガンの供与者と同じ供与者からの異型的ＰＢＬ
に対して増殖せず、また、それらはオートローガスＰＢ
Ｌ（図１参照）、ヒトグリオーム細胞、若しくはヒトカ
ルシノイド腫瘍細胞に対して増殖しない。
【００６７】
【表８】 最近の研究により、ＩＬ−２及び抗ＣＤ3 の組合せがＩ
Ｌ−２のみではできないＣＤ４＋末梢血リンパ球の増殖
を刺激し得ることが示されている（Nishimura,et al.,"
Generation,Propagation, and Targeting of Human CD4
+ Helper/Killer T-cells Induced by Anti-CD3 Monocl
onal Antibody Plus Recombinant IL-2".,supra.) 。タ
イプI のＬＮＬは５０％以上ＣＤ４＋リンパ球を含み、
抗ＣＤ3及びＩＬ−２を使用することによりＣＤ８＋リ
ンパ球と共にＣＤ４＋のリンパ球の増殖が刺激される。
かくしてＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の分離及び成長
因子及び腫瘍に対する増殖応答が望まれる。
【００６８】以下の例３に報告される治療手順に関連し
て、本発明により決定されたリンパ節の表現型分析が、
フローサイトメトリック分析を用いてＩＬ−２（２０u
／ml）及び抗ＣＤ3 中の培養がなされる前及び後のリン
パ球について行われ、以下の結果が記録された。
【００６９】
【表９】 これらの結果は、培養後Ｔ細胞（ＣＤ3 ）集団が増殖し
ていることを示している。また、これらの結果はＣＤ１
９細胞（Ｂ細胞）が培養中に於て低減していくことを示
している。その他の研究に於て抗クラスI 主要組織適応
性抗体（ＭＨＣ）を加えることにより、ＬＮＬ増殖が阻
害され、抗クラスIIＭＨＣ抗体も同様であった、という
ことは、注意されるべきことである。
【００７０】種々の分裂促進刺激条件下に於てリンパ節
リンパ球を長期間培養することが行われ、そこでの増加
が前記のデータの多くに於て報告された如き抗ＣＤ3 を
使用した場合に比較された。培養は１×１０6 ＬＮＬ／
ml ＲＰＭＩc （２５m ＨＥＰＥＳ緩衝剤、１００単位
／ml ペニシリン、０．１mg／ml ストレプトマイシ
ン、及び１０％ 硬化され熱により不活性化されたヒト
プラズマが補足されたＲＰＭＩc ）にて第一日を開始さ
れた。四日後、細胞は１ml当たり０．２５×１０6 に分
割され、その後この態様にて継代が続けられた。以下の
ものが添加された。ＩＬ−２ ２０単位／ml、抗ＣＤ3
５０ng／ml、ホルボール１２−ミリステート１３−ア
セテート（ＰＭＡ） ２ng／ml、イオノマイシン ５０
ng／ml。添加物と細胞増加とは、表１０に示されてい
る。
【００７１】
【表１０】 更なる特徴付けは、単独で培養された患者ＪＧ１９６の
ＬＮＬ試料による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファの分
泌をそれのみで培養された場合とオートローガス腫瘍、
異型的腫瘍若しくは抗ＣＤ3 と共に培養された場合のも
ので比較することに関連している。以下の結果が記録さ
れ図８に示されている。
【００７２】
【表１１】 これらの結果は、ＬＮＬ細胞がオートローガス腫瘍の存
在下でサイトカインを生成することを示す。更に、増殖
されたＬＮＬ細胞がオートローガス腫瘍に応答してサイ
トカインを生成し、このことはこれらが腫瘍反応性リン
パ球であることを支持する。
【００７３】例２ 後期の実験的手順 本発明を発展する過程に於て後期に実行された成果は、
前記の過程をやや改良することを含む。患者の選択及び
手術は実質的に初期の実験的過程について述べられたこ
とと同一である。再度、切除され細胞増加に用いられる
リンパ節の決定は巨視的な腫瘍の証拠（視覚及び触診に
よる）がない放射性標識された抗体の存在を検出するこ
とに関連する。このデータは以下に基本的に報告され
た。Triozzi,et al.,Cancer,Vol.73,No.3,February 1,1
994 。
【００７４】細胞の調製 診断のために必要でないリンパ節及び腫瘍の試料は病理
学者によって切除された試料から得られた。各々のリン
パ節の半分は組織病理学的検査のために用いられ、その
他の半分は免疫学的研究のために用いられた。組織の分
離は薄いフローフードに於て無菌状態下で実行された。
組織は遠心チューブ内にてＲＰＭＩ、抗生物質、抗真菌
性物質により濯がれ、氷上のペトリ皿へ移送された。外
部の組織が外科用メスをもって切除され、組織が約２−
３mmの直径の断片に細分化された。細胞は５mlシリンジ
の先の円い端部で穏やかに分解することにより分けら
れ、その後ハンクスの緩衝塩溶液で二回洗浄された。細
胞の生存率は青色排除試験によって測定され、全ての分
離物について８０％以上であった。末梢血リンパ球がフ
ィコール−ハイパークを用いた通常の勾配遠心技術を用
いて患者からのヘパリン処理された末梢血より分離され
た。全ての直ぐに必要とされない細胞は５％のオートロ
ーガス血清と共にジメチスルフォキシド中に冷凍保存さ
れた。
【００７５】螢光活性化細胞セルソーター分析 ０．１mlの培養液中にて１０6 の細胞が０．５mgのＭo
Ａb をもって４℃にて１時間処理された。２回の洗浄の
後、１／４０希釈にて二次螢光性ヤギ抗マウスＩg Ｇ
（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson,Mount
ain View,CA ））が製造者の推奨に従って加えられた。
細胞は１時間標識され、２回洗浄された後サイトフルオ
ログラフを用いたフローサイトメーターによって解析さ
れた。以下のＭo Ａb が用いられた。pan Ｔ細胞（Ｌeu
４、抗ＣＤ3 ）、細胞溶解性／サプレッサーＴ細胞（Ｌ
eu２a 、抗ＣＤ８）、ヘルパー／インデューサーＴ細胞
（Ｌeu１９、及び抗ＣＤ５６）（全てベクトン・ディッ
キンソンからのもの。）「ナイーブ(naive) 」Ｔ細胞
（２Ｈ４、抗ＣＤ４５ＲＡ）及び「メモリ(memory)」Ｔ
細胞（ＵＣＨＬ１、抗ＣＤ４５ＲＯ）（どちらもＡＭＡ
Ｃ（Westbrook,ＭＥ）からのもの）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ
（ＨＢ１０３、ＡＴＣＣ（Rockville,ＭＤ））。
【００７６】細胞溶解活性 腫瘍細胞は、１００μＣi ／５×１０6 細胞／０．５ml
のクロム酸（51Ｃr ）ナトリウムで３７℃にて１時間標
識された。腫瘍細胞（１０4 ／１００μl ）は、三重の
６mmの円形の底部を有するプレートへ付加された。ナチ
ュラルキラー抵抗性ダウジ（Daudi ）細胞標的が、測定
の陽性対照実験として用いられた。上記の如く生成され
たエフェクタ細胞がエフェクタ対標的比が４０：１、２
０：１、５：１、１．５：１となるよう同一の培養液
（１００μl ）に加えられた。また、トライトンＸ−１
００（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を加えた標識
化された標的細胞のみを含む３つの最大放出ウェルと３
つの自発的放出ウェルが含まれている。プレートは遠心
され（２００g 、５分間）、３７℃にて４時間インキュ
ベートされた。プレートは再度遠心され１００μl の上
澄みが除去された。溶解のパーセンテージは、以下の式
により決定された。（実験の毎分当たりのカウント［cp
m ］−自発的cpm ）／（全cpm −自発的cpm ）各々の変
数は三重に検査された。
【００７７】増殖測定 増殖測定は、ＩＬ−２が存在する場合及び存在しない場
合に於てＢＳＭ（Sigmma Chemical CO.,St.Louis,MO)と
照射されたオートローガス及び異型的腫瘍細胞と共に、
及び照射されたオートローガス正常結腸細胞と共に１０
5 のリンパ球をインキュベートすることにより実行され
た。９６時間培養した後、細胞は１m Ｃi ［ 3Ｈ］チミ
ジンにて３７℃で１時間パルス標識され、セル採取器を
用いて採取された。取込まれた放射能はシンチレーショ
ン計数法により測定された。
【００７８】統計的解析 対になった及び対になっていないステューデントのt テ
スト及びマン−ホイットニー（Mann-Whitney）Ｕテスト
がリンパ球集団の表現型及び機能的特性に於ける違いの
有意性を決定するために用いられた。回帰モデルを用い
た分散解析が増加率の違いを分析するべく用いられた。
【００７９】結果 リンパ節 組織は、例１の調査に於て調査した再発性或いは結腸直
腸ガンを有する２０の患者（８人の女性及び１２人の男
性）からのものが調べられた。これらの患者に於て、平
均年齢は５７歳であった（３３〜７２歳）。視診及び触
診上正常に見られたが125 Ｉ標識されたＣＣ４９を含ん
でいる１〜１１の（平均４）のリンパ節がプローブによ
って同定された。しばしばこれらのリンパ節は非常に高
い放射能レベル（リンパ節対背景カウントが１０：１以
上）を示し、しばしば、それらは、伝統的に肝胃間、腹
腔及び腸骨領域の如き結腸ガン種についての腫瘍排出部
位として考えられていなかった部位に於て同定されるこ
とがあった。２５の放射性標識されたＭo Ａb を含む臨
床的に正常なリンパ節と放射性標識されたＭo Ａbを含
んでいなかった６個の臨床的に正常なリンパ節（５人の
異なる患者からの）が免疫学的調査のために切除され
た。
【００８０】リンパ節に於ける腫瘍の存在は、通常の組
織学的評価、即ちヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆
Ｅ）染色とＭo Ａb ＡＥ１−３（Boehringer Mannhei
m,Indianapolis,IN ）を用いた免疫組織化学的方法で評
価され、サイトケラチンを同定した。改良されたアビジ
ン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体技術（Vectastai
n,Vector,Burlingame,CA ）がマウスＭo Ａb を同定す
るのに用いられた。通常、プローブにより位置決めされ
たリンパ節に於て腫瘍細胞のうち一つ若しくは二つの患
部のみが通常Ｈ＆Ｅ染色法に於て見出された。腫瘍細胞
が同定されない場合、免疫組織化学的調査では、ＣＣ４
９が胚中心にて特徴的な三日月型若しくは円形の樹枝状
パターンに分配されるということが示された。また、腫
瘍細胞の存在は、分離及び勾配遠心法（フィコール−ハ
イパック、ファルマシア）の後、リンパ節から調製され
た細胞遠心調製物を染色することにより調査された。
【００８１】放射標識されたＭo Ａb を含む２５の臨床
的に正常なリンパ節は、「微視的腫瘍」若しくは「放出
された抗原(shedantigen) 」の何れかを含むとして分類
された。１７個の試料は、微視的腫瘍を含んでいると分
類された。腫瘍細胞は１７の全てに於てリンパ節を分離
し勾配遠心した後に見出された。これらのリンパ節のう
ちの１４に於て病理検査に供された半分についてのＨ＆
Ｅ染色法に於て腫瘍が見出された。腫瘍細胞は８個のリ
ンパ節に於て分離により同定されず、またＨ＆Ｅ染色法
に於ても同定されなかった。これらは放出された抗原を
含んでいるとして分類された。放射性標識されたＭo Ａ
b を含んでいなかった６つの臨床的に正常なリンパ節に
於て分離によってもＨ＆Ｅ染色法によっても同定されな
かった。
【００８２】表現型 プローブにより同定されたリンパ節からのリンパ球の表
現型がその他のリンパ球集団（表１２）と比較された。
６つの異なるリンパ球集団が調べられた。（１）微視的
腫瘍を有するリンパ節、（２）放出された抗原を有する
リンパ節、（３）巨視的腫瘍を有するリンパ節、（４）
非関連のリンパ節、（５）ＴＩＬ、及び（６）末梢血リ
ンパ球（ＰＢＬ）。フローサイトメーターによる検査が
新しく単離された物質の表現型についての特徴を決定す
るべく実行された。ＴＩＬは、分離及びリンパ球の収率
を改善するべく１０００Ｕ／ml ＩＬ−２と共に培養さ
れたものに於ける２４時間後に表現型が調べられた。
【００８３】微視的腫瘍若しくは放出された抗原を有す
るリンパ節からのＣＤ４−ＣＤ８比は、その他のリンパ
球集団の何れよりも大きかった（Ｐ＜０．０５）。プロ
ーブによって同定されたリンパ節及び巨視的腫瘍を有す
るリンパ節は、ＴＩＬ、ＰＢＬ、及び非関連のリンパ節
よりも非常に多くのＣＤ４５ＲＯ+ 細胞を有していた
（Ｐ＜０．０５）。ＰＢＬはその他の集団の何れのもの
及びＴＩＬよりも非常に多くのＣＤ５６+ 細胞を多く有
していた（Ｐ＜．０．００１）。微視的腫瘍を有するリ
ンパ節と放出された抗原を有するリンパ節との間に表現
型に於ける違いは検出されなかった。
【００８４】
【表１２】 増加 １０００Ｕ／mlのヒト組換えＩＬ−２（recombinant hu
man,Cetus,Emeryville,CA ）に応答する種々のリンパ球
集団の増加も調べられた。全ての培養は１０6細胞／ml
にて開始され全体に拡がった際に分割された（３−６日
毎）。微視的腫瘍を有するリンパ節及び放出された抗原
を有するリンパ節からのリンパ球の増加は同程度で、双
方ともＴＩＬ、巨視的腫瘍を有するリンパ節、及び非関
連のリンパ節のものよりも非常に大きかった（Ｐ＜０．
０５）。非関連のリンパ節からのリンパ球の増加は巨視
的な腫瘍を有するリンパ節及びＴＩＬよりも非常に大き
かった（Ｐ＜０．０５）。ＴＩＬの集団は通常、ＣＤ４
＋及びＣＤ８＋の組合せ若しくはＣＤ８＋の集団が優位
である状態に発展した。全てのリンパ節リンパ球の集団
はＣＤ４＋の集団が優位である状態でＣＤ４＋及びＣＤ
８＋の組合せに発展した。ＣＤ８＋細胞が現れること
は、培養の増加の低減及びＴＩＬ培養の増加の増大に関
連しているように見られた。
【００８５】増殖 Neoprobe（登録商標）１０００プローブによって同定さ
れたリンパ節からのリンパ節リンパ球の増殖応答と（同
一の患者からの）非関連のリンパ節リンパ球ついてのも
のとを比較した。リンパ球（１０5 ／ウェル）が照射さ
れた（５０００Ｒ）オートローガス及び異型的腫瘍細胞
（０−５０，０００／ウェル）と共に１０Ｕ／mlのＩＬ
−２がある場合及びない場合について５日間培養され
た。また、リンパ球は、或る範囲の濃度の、溶解性のＴ
ＡＧ−７２の源としてＣＣ４９結合エピトープを表現す
るＢＳＭに曝された。［ 3Ｈ］チミジンが採取の１８時
間前に加えられた。オートローガス腫瘍（５０，０００
細胞）は、プローブにより同定された全てのリンパ節
（１６の異なる患者からのＮ＝１９のリンパ節）に於
て、ＩＬ−２が存在する場合及び存在しない場合の双方
に於て有意な増殖を誘導した。（刺激されていない細胞
の三つの標準偏差よりも大きな［ 3Ｈ］チミジンの取込
みが見られた。）オートローガス正常結腸細胞及びＰＢ
Ｌは何れの調査に於ても増殖を誘導しなかった。ＩＬ−
２が存在する場合及び存在しない場合の双方に於てオー
トローガス及び異型的ＴＡＧ−７２＋結腸直腸腫瘍試料
に対する微視的腫瘍を有するリンパ節からのリンパ球の
増殖応答は、非関連のリンパ節からのリンパ球のものよ
りも大きかった（Ｐ＜０．０１）。非関連のリンパ節か
らのリンパ球に比べて、微視的腫瘍に曝されたリンパ節
からのリンパ球は投与に対する応答の態様に於てＢＳＭ
に応答して増殖した。増殖応答に於けるＣＣ４９の可能
な役割とその結合エピトープの可能な役割を特徴付けす
るべく微視的腫瘍に曝されたリンパ節からのリンパ節リ
ンパ球が添加物を何等加えない場合及びＢＳＭ（１００
μg ／ml）、ＣＣ４９（０．１μg ／ml）及びＢＳＭと
ＣＣ４９とを加えたものの存在下に於て１０Ｕ／mlのＩ
Ｌ−２中にて４日間培養された。ＣＣ４９のみでは増殖
を増大しなかった。ＢＳＭとＣＣ４９の組合せはＢＳＭ
のみによって誘導された増殖を抑えることはなかった。
【００８６】プローブによって同定されたリンパ節から
のリンパ球の増殖応答が、ＴＡＧ−７２+ 腫瘍細胞とＴ
ＡＧ−７２- 腫瘍細胞とに対するそれらの増殖応答を比
較することによって更に調べられた。以下の細胞が評価
された。腹膜偽性粘液腫を有する患者からの強いＴＡＧ
−７２+ の細胞を含む患者由来のオートローガス及び異
型的ＴＡＧ−７２+ （即ちＣＣ４９+ ）結腸ガン細胞、
患者由来のＴＡＧ−７２+ 乳ガン、患者由来のＴＡＧ−
７２- 扁平細胞肛門直腸ガン、ＴＡＧ−７２-黒色腫、
及びＴＡＧ−７２- 結腸直腸ガン、ＴＡＧリンパ芽球ダ
ウジ細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）、結腸ガン腫
細胞系統であってin vivo にてＴＡＧ−７２を表現しin
viro にて表現しないもの。微視的腫瘍を有するリンパ
節からのリンパ球は全てのＴＡＧ−７２+ 腫瘍に対して
増殖した。微視的腫瘍を有するリンパ節の患者由来のＴ
ＡＧ+ 腫瘍細胞に対する増殖はＴＡＧ−７２- 細胞に対
するものよりも大きかった（ｐ＝０．０００１）。これ
らの結果は表１３に示されている。
【００８７】
【表１３】 培養されたＬＳ１７４Ｔ細胞は増殖応答を抑制した。こ
のことは、かかる形質転換された細胞系統に於て腫瘍由
来の抑制因子が存在する可能性を示唆する。標的として
凍結されたＬＳ１７４Ｔ細胞を用いた場合抑制は誘導さ
れなかった。
【００８８】細胞溶解活性 これらの実験に於ては、ＰＢＬの集団と共に分離された
リンパ節及び腫瘍が、ＩＬ−２が１０００Ｕ／mlにて、
３５日間までの間に於て培養された。全ての培養は１０
6 細胞／mlにて開始され全面増加の際に分割された。増
加されたリンパ球の細胞溶解活性は、４−７日間の培養
の後のもの及び２１−２８日間の培養のものについて標
準的な４時間の51Ｃｒ放出分析によって評価された。予
め凍結されたオートローガス腫瘍、異型的腫瘍及びナチ
ュラルキラー抵抗性ダウジ細胞が標的として用いられ
た。ＴＡＧ−７２を表現する二人の患者の一方から由来
する腫瘍細胞が全ての異型的測定に於て用いられた。こ
れら二つの患者からの細胞は健康な供与者から生成され
たリンホカイン活性キラー試薬に対して等しく感受性を
示した（±１０％）。これらのデータは表１４に示され
ている。
【００８９】
【表１４】 最も高いレベルの細胞溶解性活性はＰＢＬから生成され
た。微視的腫瘍を有するリンパ節の細胞溶解活性及び放
出された抗原を有するリンパ節の細胞溶解活性は類似し
た。ＰＢＬから生成された細胞溶解活性よりも低いがこ
れらのリンパ節からの細胞溶解活性は、ＴＩＬから生成
されたもの、巨視的に関連のあるリンパ節及び非関連の
リンパ節から生成された細胞溶解活性よりも一致して大
きかった（Ｐ＜０．０５）。オートローガス腫瘍を特異
的に殺すことはどの時点でも観察されなかった。全ての
培養に於て細胞溶解活性は時間と共に低減した。
【００９０】考察 in vivo に於て腫瘍反応性リンパ球を位置決めすること
ができる技術が発展された。放射性標識されたＭｏＡｂ
及びガンマ検出プローブを用いて微視的腫瘍を若しくは
放出された抗原を有するリンパ節を同定することによっ
てin vivo に於て再現性よくオートローガス腫瘍に対し
て反応性を有するリンパ節リンパ球を位置決めすること
ができる。リンパ節はその腫瘍に対する応答性が変化す
る。それらは、結腸直腸ガンに於ける転移の初めの部位
であり、宿主−腫瘍相互作用に於て重要な役割を演ず
る。リンパ節に転移する結腸直腸ガンを有する多くの患
者は関連する排出リンパ節を含む単純な外科的処理過程
によって長期間の生存を達成する。ここに於ける結果
は、結腸直腸ガン腫を有する患者のリンパ節に於てはた
とえ一次腫瘍から離れたリンパ節に於ても微視的腫瘍に
対する免疫応答が存在することを支持する。我々の結果
は、巨視的腫瘍に関連したリンパ球及びＴＩＬの免疫学
的応答性が乏しいということを確証するものである。微
視的腫瘍及び放出された抗原を有するリンパ節からのリ
ンパ球に比較して巨視的腫瘍を有するリンパ節、ＴＩ
Ｌ、及び非関連のリンパ節からのリンパ球は機能的に低
減されているように見える。細胞溶解活性、増殖応答及
び増加を含む機能についての幾つかの研究に於て違いは
明らかである。
【００９１】観察された免疫学的応答に対するマウスＭ
ｏＡｂの寄与は未知である。リンパ節の免疫組織学的構
成はin vivo に於て放射性標識されたＭｏＡｂを用いて
再発性又は転移性疾患を有する患者に於ける腹腔全体に
亙り位置決めされ、これはMariani-Costantiniの免疫組
織学的研究に於て報告されたものに類似している（Mari
ani-Costantini,et al.,"Immunohistochemical Evidenc
e of Immune Responseto Tumor-Associated Antigens i
n Lymph Nodes of Colon Carcinoma Patients", Cance
r, 1991;67:2880-66.)。これらの研究者は、（ex vivo
に於て）ＣＣ４９を含むＴＡＧ−７２に対する種々のＭ
ｏＡｂ及びリンパ球と単球／マクロファージ抗原決定基
に対する種々のＭｏＡｂを一次結腸直腸ガンを有する患
者からの非関連の所属リンパ節部分へ適用した。また彼
等は胚中心に於ける免疫病理化学的反応を記載し、放出
されたＴＡＧ−７２エピトープが選択的に認識され胚中
心のＢ細胞に対して示されるということを結論した。
【００９２】in vivo に於けるＭｏＡｂを受取っていな
い患者からのリンパ節の免疫病理組織化学的研究に加え
てその他の観察により、ＭｏＡｂ ＣＣ４９が組織学的
応答の中心ではないということが示唆される。ＭｏＡｂ
ＣＣ４９のみではプローブによって同定されたリンパ
節リンパ球のin vitvoに於ける増殖を刺激しない。オー
トローガス腫瘍に対して反応するリンパ節リンパ球は、
ヒト抗マウス型ＭｏＡｂ抗体が検出された患者に於て及
びヒト抗マウス型ＭｏＡｂ抗体が検出されていない患者
に於てかかる技術を用いて同定された。更に、巨視的腫
瘍を有するリンパ節及びＴＩＬがＭｏＡｂを含むという
事実と共にリンパ節の各々の位置は、観察された免疫学
的変化が抗マウスＭｏＡｂ応答に対する単なる二次的な
ものであるという可能性について反論するものである。
【００９３】プローブによって同定されたリンパ節は、
ＣＤ４：ＣＤ８比の増大により特徴づけられる。ＣＤ４
+ 細胞の増加は炎症性応答に於ける重要な初期現象であ
る。結腸直腸ガンを有する患者を含むガンを有する患者
のリンパ球表現型は詳しく研究されている。種々の研究
グループからの結果は一致していない。現在の結果を含
む殆どの研究によれば、ＴＩＬのＣＤ４：ＣＤ８比はＰ
ＢＬに於て及び非関連のリンパ節に於て通常見られる
２：１比よりも遥かに低いことが見出されている。ま
た、その他の研究者によれば、結腸直腸ガンを有する患
者のリンパ節に於てＣＤ４+ 細胞が増大することが観察
されている。アダチ等は、結腸直腸ガンを有する患者の
リンパ節に於けるＣＤ４+ 細胞がかなり増大しているこ
とを報告した。アダチ等は、中間的な節（即ち動脈幹の
節）及び胆のうヒステル形成処理からの節と比較して腫
瘍のない結腸周囲節に於てＣＤ４+ 細胞がかなり増大し
ていることを報告した。（Adachi,et al.,"Immune Comp
etent Cells of Rogional Lymph Nodes in Colorectal
Cancer Patients : I. Flow Cytometric Analysis of L
ymphocyte Subpopuration" J.Surg.Oncol., 1991;46:11
0-6.) 。
【００９４】プローブにより同定されたリンパ節は、矛
盾なくＴＡＧ−７２+ 腫瘍細胞及び溶解性のムチンに対
する増殖応答を示し、前の感作を示唆する。ＴＡＧ−７
２-腫瘍に対する増殖応答は、ＴＡＧ−７２+ に対する
ものよりも低いが、増殖応答の特異性及びＴＡＧ−７２
／腫瘍関連ムチンが重要であるかどうかは確立されてい
ない。炭化水素エピトープに結合するＣＣ４９ ＭｏＡ
ｂを増殖測定に於て添加しても応答は抑制されなかっ
た。
【００９５】オートローガス腫瘍が何れかのリンパ球集
団によって優先的に殺されるということは観察されなか
った。ダウジ細胞、異型的腫瘍及びオートローガス腫瘍
に対する細胞溶解活性は、全ての調査に於て平行的に生
じた。すぐ見出されたことは、用いられたＩＬ−２の濃
度（１０００Ｕ／ml）についての結果である。ＩＬ−２
と共に培養された殆どのＴＩＬは、主要組織適合性によ
る制限された細胞毒性を示さず非特異的な細胞毒性を示
す。ムチンを認識する細胞毒性Ｔ細胞は、主要組織適合
性ではない制限された態様にて細胞を殺す。ムチンの複
数の抗体価を持った性質は、複数のＴ細胞の受容体が効
果的に同時に係合することを見越しており、かくして抗
原−レセプタ複合体が主要組織適合性により制限された
安定化をする必要がなくなると仮定されている。細胞毒
性及び増殖の研究による結果は、非主要組織適合性的に
制限された相互作用に一致する。プローブによって同定
させたリンパ節の細胞溶解活性は、その他のリンパ節よ
りも大きいが、ＰＢＬのものより小さかった。リンパ球
細胞毒性についての以前の研究の結果は相違している。
幾つかの研究は、関連の及び非関連のリンパ節リンパ球
及びＴＩＬの非特異的な細胞溶解活性はＰＢＬのものよ
り低いということが結論されている。その他は、リンパ
節及びＴＩＬから生成される非特異的な細胞溶解は、対
応するＰＢＬのものに匹敵するか若しくはそれ以上であ
ると報告されている。
【００９６】微視的腫瘍を有するリンパ節と放出された
抗原を有するリンパ節との間に於てリンパ球の表現型及
び機能に違いは検出されなかった。結腸直腸ガンを有す
る患者に於ける局所的なリンパ節は、正常な障壁が腫瘍
に誘導されて壊されている結果として種々の細菌的及び
化学的抗体によって影響されるので、結腸直腸ガンの局
所的なリンパ節に於て見られる免疫学的変化が、腫瘍に
よる結果なのか或いはその他の腸に由来する二次的な刺
激の結果なのかどうかについてはしばしば不明瞭であ
る。一次腫瘍から離れた及び結腸そのものから離れたリ
ンパ節に於て免疫学的変化が見られるという事実は、か
かる応答が腫瘍に対するものであり二次的な腸に由来す
る刺激ではないということが示唆される。
【００９７】例３ 更なる実験的過程 患者の手術、リンパ節の検出及び切除は上記の報告され
た態様にて実行された。分析によって以下のことが更に
後の実験により見出された。
【００９８】細胞培養 リンパ球懸濁液は、１０％の熱により非活性化されたヒ
トプラズマ、ペニシリン及びＬ−グルタミン（ＧＩＢＣ
Ｏ，Grand Island, NY）を含むＲＰＭＩ１６４０に於て
初めの密度を１０6 細胞／mlとして７５cm2 の組織培養
フラスコ（Falcon Co.）内で種々の条件下でインキュベ
ートされた。培養は湿潤された組織培養インキュベータ
（Forma Scientific）を用いて３７℃にて５．０％ＣＯ
2 中で無菌状態下で行われた。細胞培養は、新鮮な培養
液を調製された培養液へ加えることにより、４日目に於
て密度が２．５×１０5 細胞／mlとなるように分割さ
れ、７日目に於て密度が５．０×１０6 となるよう分割
された。細胞数は、クールターカウンタ（Coulter Coun
ter ）により決定され、生存率は青色排除法によって決
定された。培養は、以下の生物学的応答修正剤を用いて
行われた。ＩＬ−１（Immunex, Seattle WA)、ＩＬ−２
（Cetus Corp.,Emeryville, CA）、ＩＬ−４（Amgen,Th
ousand Oaks,CA）インターフェロン−（ＩＦＮ−γ）ガ
ンマ（Biogen,Cambridge,MA ）、ＯＫＴ３抗−ＣＤ3 抗
体（Ortho,Raritan,NJ）、インドメタシン、及びシメチ
ジン。
【００９９】表現型分析 リンパ球の表現型はモノクローナル抗体及びＦＡＣＳを
用いて決定された。新鮮なＬＮＬ及び培養されたリンパ
球が、９６個のＶ字形状のウェルプレート（Linbro C
o.）へ１０％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ媒体）を含む５０μl の
ハンクスの平衡塩類溶液中で１０6 細胞になるよう置か
れた。細胞は、４℃にて２０μl 中に０．２μｇのマウ
スモノクローナル抗体（ベクトン−ディッキンソン）と
共に１時間インキュベートされた。マイクロプレートは
６００rpm にて遠心され、ペレットが振盪され１５０μ
l ＦＡＣＳ媒体で３回洗浄された。細胞ペレットは振盪
され０．２μg のフルオレセインの結合したヤギ抗マウ
スモノクローナル抗体（ベクトン−ディッキンソン）と
共に約４℃にして１時間再懸濁された。ＦＩＴＣ染色さ
れた細胞は遠心され、ＦＡＣＳ媒体中で３回洗浄され、
１％のフォルマリンを有する０．５mlＦＡＣＳ媒体中に
再懸濁され、分析に用いるまで４℃にて保存された。用
いられた抗体は、エピトープＣＤ3 （Ｔ−細胞レセプ
タ）、ＣＤ4 （Ｔ−ヘルパ／インデューサー）、ＣＤ8
（Ｔ−細胞毒性サプレッサ）、ＣＤ25（Ｔac／IL-2レセ
プタ）、ＣＤ４５ＲＡ（ナイーブ）、ＣＤ４５ＲＯ（メ
モリ）、ＣＤ５６（ＮＫ／ＬＡＫ）、ＣＤ１９（Ｂ細
胞）ＣＤ１４（単球／マクロファージ）及びフローレセ
インが結合されたヤギ抗マウスＩg Ｇ。
【０１００】リンパ球の細胞毒性 培養されたリンパ球の細胞毒性は、標準の４時間の51Ｃ
r 放出分析を用いて評価された。オートローガス結腸ガ
ンの腫瘍細胞標的とＮＫ−抵抗性ダウジ細胞系統とが３
７℃にて１時間１００μＣi ／５×１０6 細胞／０．５
mlにてクロム酸（51Ｃr ）ナトリウムと共にインキュベ
ートされた。細胞毒性測定は、１００μl ／ウェルにて
１０4 の腫瘍標的を有する９６のウェルマイクロプレー
トに於て行われた。エフェクタ細胞が１００μl に於て
エフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比が１．５：１、５：１、
２０：１及び４０：１となるように加えられた。トライ
トンＸ−１００が完全な放出のために標識された腫瘍標
的に加えられた。完全な放出及び自発的な放出の試料の
双方は、各々の分析に於て対照実験として行われた。プ
レートは、３７℃にて採取される前４時間５％ＣＯ2 に
於てインキュベートされた。インキュベート期間が完了
した時点で細胞を含まない１０μl の上澄みが注意深く
吸引され計数された。細胞毒性のパーセンテージは、次
の公式によって計算された。（実験のcpm −自発的cpm
）／（全cpm −自発的cpm ）。
【０１０１】リンパ球増殖測定 リンパ球の増殖応答は、 3Ｈ−チミジン取込みによって
測定された。リンパ球は、０．２mlの完成培養液中に於
て１０5 細胞／ウェルにて９６のウェルマイクロ滴定プ
レートにて培養された。オートローガス腫瘍がコラーゲ
ナーゼにて消化され、洗浄され、３０００rad （セシウ
ム源）にて照射され、反応子：刺激子比が２：１となる
状態でリンパ球と共に、インキュベートされた。リンパ
球は、９６時間インキュベートされ、１２時間の間１．
０μＣi ／ウェルの 3Ｈ−チミジン（ニューイングラン
ド・ニュクリア（New England Nuclear ））をもってパ
ルス標識された。プレートは、スカトロン（Skatron P
h.D．）（（Cambridge Technology））によってナイロ
ンフィルタ上に採取され、ベックマン６５００ガンマカ
ウンタでシンチレーション溶液中にて計数された。
【０１０２】ＩＬ−２生成分析 増加前及び増加後のリンパ球のＩＬ−２の生成は、ＩＬ
−２依存のＣＴＬＬ細胞を用いて測定された。端的に述
べれば、１×１０5 リンパ球が生物学的応答修正剤と共
に、一晩、９６のウェルマイクロプレートに於てインキ
ュベートされた後、１０μl の上澄みが各々のウェルか
ら吸引され、別のプレートへ移された。ＣＴＬＬ細胞が
２×１０3 細胞／ウェルの密度にてプレートへ加えら
れ、６時間後に１μＣi ／ウェルの 3Ｈ−チミジンにて
パルス標識された。プレートは１２時間の時点で採取さ
れ、前記の如く計数された。ＩＬ−２の標準の濃度に対
するＣＴＬＬの 3Ｈ−チミジンの取込みのcpm が陽性の
対照実験として行われた。
【０１０３】サイトカイン mＲＮＡ分析 サイトカインm ＲＮＡが、モルガン等によって記載され
ている如く（Morgan,et,al., "Detection of Cytokine
mRNA in vivo by PCR: Problems and Solutions",Trans
plantation,56;2:437(1993).）複製連鎖反応（ＰＣＲ）
を用いて逆転写及び増幅により分析された。全ＲＭＡ
は、グアニジンイソチオシアネート溶液（４Ｍ グアニ
ジンイソチオシアネート、２．５m Ｍクエン酸ナトリウ
ム pＨ７．０、０．５％サルコシル（sarkosyl) ナトリ
ウム、０．７％β−メルカプトエタノール）中にて均質
化され、５．７Ｍ Ｃs Ｃl クッション上にて超遠心す
ることにより抽出された。 cＤＮＡは、５μg ＲＮＡか
らオリゴ（d Ｔ）プライマと、２００Ｕ ＭＭＬＶ逆転
写酵素を用いて調製された。試料は、無菌水にて最終的
な体積が１５０μl となるようＰＣＲのために希釈され
た。ＰＣＲ増幅は、パーキン−エルマ（Perkin-Elmer）
若しくはサーモラインテンプトロニックサーマルサイク
ラー（Thermolyne Temptronic thermal cycler）に於て
通常の技術を用いて実行された。c ＤＮＡ（５μl ）
は、１０m Ｍ Ｔris −Ｃl 、ｐＨ８．３、５０m Ｍ
ＫＣl 、１．５m Ｍ Ｍg Ｃl 2 、０．２m Ｍ dＮＴ
Ｐ、０．４μＭプライマ及び１．２５Ｕ Ｔａq ポリメ
ラーゼを含む５０μl の反応液中にて増幅された。サイ
クルのパラメータは、９４℃ １分間、５０℃〜６０℃
２分間、７２℃ １分間、４０サイクル。ＰＣＲ生成
物は２％アガロースゲルに於ける電気泳動及びエチジウ
ムブロマイド染色によって解析された。ＩＬ−２、ＩＬ
−４、ＩＬ−５、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−β、β−ア
クチン及びインターフェロン（ＩＦＮ−γ）についての
ＰＣＲプライマは、ブレンナ等（Brenner,et al."Messa
ge Amplification Phenotyping: A Technique to Simul
taneously Measure Multiple mRNAs from Small Number
s of Cells",Biotechniques,7:1096(1989)を基に、オリ
ゴス（Oligos,Etc. （Wilsonville,OR））によって合成
された。
【０１０４】統計的分析 分散分析（ＡＮＯＶＡ）が処理されたグループに於ける
増殖及びＩＬ−２生成分析に於ける違いを比較するべく
用いられた。ノンパラメトリック分析が増加率を評価す
るために用いられた。
【０１０５】結果 増加 米国特許第４，７８２，８４０号に従って手術を受けた
３０人の患者からのリンパ節がＣＣ４９モノクローナル
抗体により位置決めされ、種々の生物学的応答修正剤を
用いてex vivo にて増加された。短期間の増加（＜２１
日）の後の増加率（即ち全リンパ球数の倍数）が表１５
に示されている。
【０１０６】
【表１５】 ＲＩＧＳ−で位置決めされたＬＮＬは、ＩＬ−２ １０
０Ｕ／ml及びＩＬ−１２００Ｕ／ml＋ＩＬ−２ １００
Ｕ／mlを含む培養に於て約４０倍の増加を示した。ＩＬ
−２ １００Ｕ／ml及び抗ＣＤ3 Ｍo Ａb と共にインキ
ュベートされたリンパ節集団は、ＩＬ−２のみと共にイ
ンキュベートされた培養よりも遥かに高い増加率を示し
た（p ＜０．００００１）。ＩＬ−２を含む培養へＩＬ
−４（１００−１０００Ｕ／ml）、インターフェロン−
γ（１００−１０００Ｕ／ml）、シメチジン（１００μ
g ／ml）、若しくはインドメタシン（１００μg ／ml）
を加えることは、如何なる時点に於ても増加及び表現型
を有意に変化しなかった。 表現型分析が、リンパ球の
集団がこれらの培養条件に応答して如何に成長するかを
同定するべく種々の時間に於て実行された。
【０１０７】
【表１６】 ０日目に於てＲＩＧＳによって位置決めされた新鮮なＬ
ＮＬの表現型は、ＣＤ−４／ＣＤ８比に於て約５：１で
あった。ＣＤ４＋優位表現型は、１０日目に於てＩＬ−
２／抗ＣＤ3 セルに於て維持されたが、ＩＬ−２中に於
て及びＩＬ−１／ＩＬ−２中に於て培養されたＬＮＬは
１０日目に於てＣＤ８＋及びＣＤ５６＋の表現型に移る
傾向があった。表１７は、５人の患者からの、ＩＬ−２
／抗ＣＤ3 に於て増加されたＬＮＬの特徴を示す。
【０１０８】
【表１７】 培養期間の初めに於て（＜１２日）、ＣＤ４＋細胞増加
は維持され、このことは１０日までに約４０倍の増加が
あることに関連している。培養期間が１４日を越える
と、ＣＤ８＋細胞が生成され、ＣＤ：ＣＤ８細胞比が低
減した。ＣＤ４５ＲＯ＋（メモリ）の増加が、活性化を
示唆するＨＬＡ−ＤＲの発現の増大と共に培養期間全体
に亙り見られる。Ｂ細胞（ＣＤ１９）及び単球（Ｌeu−
Ｍ３）に関連した表現型は、１０日後に検査された全て
の培養に於て５％以下であった。
【０１０９】細胞毒性 これらの培養条件が細胞溶解性リンパ球の増殖を惹起す
かどうかを評価するべく、細胞毒性がin vitroに於て測
定された。オートローガス結腸腫瘍細胞に対する細胞毒
性は７日目までに於て見られ、これは培養１０日目以降
徐々に僅かなレベルまで低減した。細胞溶解性Ｔ細胞の
長期間の成長は何れの検査された培養条件に於ても見ら
れなかった。ＮＫ抵抗性ダウジ細胞に対する細胞溶解性
は、培養期間に当り同様の反応態様を示し、このことは
培養期間の初期に於ける細胞毒性がリンホカイン活性化
キラー細胞（ＬＡＫ）の活性に関連していることを示唆
する。
【０１１０】増加されたＬＮＬの増殖応答 増加された細胞の増殖の能力を評価するために、ＩＬ−
２／抗ＣＤ3 中に於て培養されたＬＮＬが、ＣＣ４９エ
ピトープを含むウシ上顎下ムチン（ＢＳＭ）の存在下と
共にオートローガス腫瘍の存在下に於て１０日目に検査
された。以下のデータが記録された。
【０１１１】
【表１８】 これらの結果は、ＩＬ−２／抗ＣＤ3 にて増加された細
胞がオートローガス腫瘍と溶解性ムチンとに応答して増
殖する能力を維持しているということを示唆する。
【０１１２】ＩＬ−２生成 増加された細胞のサイトカイン分泌の能力を評価するべ
く、ＩＬ−２及び抗ＣＤ3 抗体中で増大されたプローブ
により位置決めされたＬＮＬ（米国特許第４，７８２，
８４０号の手順）が、０日目（増加前）及び１０日目
（増加後）に於けるＩＬ−２生成について評価された。
【０１１３】
【表１９】 ＩＬ−２と抗ＣＤ3 と共に１０日間培養されたＬＮＬ
は、in vitroに於てＩＬ−２を分泌する能力を保持し
た。基準線の値は、患者によって変化することを反映し
ているが、増大された細胞をフォボールエステル（ＰＭ
Ａ １０ng／ml）により刺激することで、矛盾なく第０
日に比較してＩＬ−２の生成の有意な増大が見られた
（p ＝０．０００１）。
【０１１４】サイトカインm ＲＮＡ発現 ＲＴ−ＰＣＲを用いたＬＮＬのサイトカインm ＲＮＡ分
析が、増加されたエフェクタのサイトカインを生成する
潜在的能力を確証するために行われた。ＩＬ−２／抗Ｃ
Ｄ3 に於て増加された１０日目のＬＮＬのサイトカイン
m ＲＮＡの発現が図９にて示されている。この培養され
た細胞集団は、種々のm ＲＮＡ、例えばＩＬ−２、ＩＬ
−４、ＩＬ−５、ＩＦＮγ及びＴＮＦ−βを発現した。
パターンはＴh １及びＴh ２の混合された集団を示唆す
る。
【０１１５】考察 養子細胞治療は、幾つかのガンに対しての臨床的な試み
に於て有望であるということが示されているが、結腸直
腸ガンは、通常あまり有効ではなかった。細胞の源、ex
vivo に於ける活性化の方法、in vivo に於ける抗腫瘍
活性の機構に関する文献は一致していない。養子細胞療
法についての最適なエフェクタ細胞の特徴は確立されて
いないが、最近の成果によれば、養子として移入された
細胞のinvivo に於ける有効性は、in vitvoに於ける細
胞毒性ではなくサイトカインを分泌する能力により関連
しているということが示唆されている。（Barth, et,a
l,"Interferon γ and tumor Necrosis Factor Have a
Role in Tumor RegressionMediated by Murine CD8+ Tu
mor-Infiltrating Lymphocytes", J.Exp.Med., 173:647
(1991).）。本発明の成果には、ＴＡＧ−７２特異ＣＣ
４９モノクローナル抗体を用いて結腸直腸ガンを有する
患者のin vivo に於ける微視的腫瘍及び放出された腫瘍
ムチンに対して反応するリンパ節からのエフェクタを増
加する方法を研究することを含んでいる。
【０１１６】腫瘍から分泌された因子に従属的な抑制を
避ける試みとして、米国特許第４，７８２，８４０号の
システムは、臨床的にオカルトである微視的腫瘍及び放
出されたＴＡＧ−７２を含む腫瘍から離れたリンパ節を
同定することに用いられた。上記に示されたデータは、
米国特許第４，７８２，８４０号により位置決めされた
リンパ節が微視的転移性腫瘍及び放出された腫瘍抗原に
応答してin vivo に於て活性化する良好なＣＤ４＋の源
であるということを示している。これらの位置決めされ
たリンパ節は、ＣＤ４５ＲＡ＋「ナイーブ」が優位的で
ある非関連のＬＮＬに比べてＣＤ４５ＲＯ＋「メモリ」
細胞の割合が高いＣＤ４＋細胞増殖によって特徴付けら
れている。微視的腫瘍及び放出された抗原を有するこれ
らのＬＮＬのマイトジェンに対するin vitroの増殖応答
は、末梢血リンパ球、ＴＩＬ、非関連リンパ節若しくは
巨視的腫瘍を有するリンパ節に比べて非常に高く且より
特異的である。
【０１１７】一連の事実は、これらのリンパ節によるＴ
ＡＧ−７２抗原の抗原特異的処理機能に一致する。抗体
を以前に受けていない結腸直腸ガンを有する患者の腫瘍
のないリンパ節の胚中心についての免疫組織化学的染
色、即ち抗ＣＥＡ抗体を有するこれらのリンパ節を染色
する方法による免疫組織化学的研究では、同一の様式の
抗原処理機能は示されなかった。更に、溶解性のＴＡＧ
−７２ムチンに対するこれらのリンパ節リンパ球のin v
itroに於ける増殖は、それらがＴＡＧ−７２に対しin v
ivo に於て感作されているということを示唆する。溶解
性のＣＥＡに対する同様の応答は見られてない。
【０１１８】検査された培養方法に於ては、その制限さ
れた培養時間及び条件の結果によるからかもしれない
が、腫瘍特異ＣＴＬ生成の証拠は得られていない。腫瘍
ムチン特異性（ＣＴＬ）はフィンとその共同研究者によ
り膵臓ガンの患者の腫瘍排出リンパ節をＩＬ−２及び繰
返しの腫瘍細胞に対する刺激と共に培養することによっ
て発展されている。（Finn, Chapter on"Pancreatic Tu
mor Antigens: Diagnostic Markets and Targets for I
mmunotherapy", pp 61-77,DeVita, et al.Important Ad
vances in Oncology, J.B. Lippincott, Philadelphia,
PA(1992); 及びJerome, et al.,"Cytotoxic T-Lympho
cytes Derived from Patients with Breast Adenocarci
noma Recognize an Epitope Present on the Protein C
ore of a Mucin Molecule Preferentially Expressed b
y Malignant Cells ", Cancer Res., 51:2908-2916, 19
91; 及びBarnd, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
supra.）。これらのＣＴＬは、ムチン特異的ではある
が、非ＭＨＣ的に制限された態様にて細胞を殺した（Ma
riani-Constantini, et al.,"Immunohistochemical Evi
dence of Immune Response to Tumor-Associated Antig
ens in Lymph Nodes ofColon Carcinoma Patients", Ca
ncer, 67:2880(1991). ）。米国特許第４，７８２，８
４０号にて位置決めされたリンパ節リンパ球の培養に於
てＣＤ４＋細胞が優位であるので、一般的に腫瘍標的に
対する直接的な細胞毒性が低いということは驚かれるこ
とではない。米国特許第４，７８２，８４０号のシステ
ムによって検出されたＬＮＬがフィン等によって観察さ
れた如き非ＭＨＣ的に制限された態様にてムチンコア蛋
白質抗原を認識しているかどうかは現在研究されている
ことである。
【０１１９】非細胞溶解性のサイトカイン分泌Ｔ細胞の
養子移入は、幾つかの動物モデルに於て散布されたガン
を完全に根絶することを促進するということが示されて
いる（Kahn, et al.,"CD4 Cell Clones Specific for t
he Human p97 Melanoma-Associated Antigen Can Eradi
cate Pulmonary Metastases from Murine Tumor Expres
sing the p97 Antigen", J. Immunol.,146:3225(1991);
及びForni, et al.,"Helper Strategy in tumor Immu
nology: Expansion of Helper Lymphocytes and Utiliz
ation of Helper Lymphokines for Experimental and C
linical Immunotherapy", Can. Metast.Rev., 7:289(19
88).）。幾つかのサイトカインを分泌するＴ細胞は、Ｃ
ＴＬ、多形核細胞、及び腫瘍を殺すマクロファージを含
む種々の宿主−エフェクタ機構を活性化することが示さ
れている。ＩＬ−２／抗ＣＤ3 中で増加された細胞に於
てＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−β、及びＩＦＮ−γの
サイトカインｍＲＮＡが存在することは、細胞免疫応答
及び体液免疫応答の両方を含み得る混合されたＴｈ１及
びＴｈ２表現型を示唆する。これらの米国特許第４，７
８２，８４０号により位置決めされたＬＮＬによる増加
に続くＩＬ−２の有意な生成が観察されたことは、それ
らがin vivo に於てＴヘルパー細胞として機能し得るこ
とを示唆する。実験動物のモデルに於て腫瘍の発達及び
退行の制御が観察されており、そこに於ては、予め宿主
エフェクタを漸増することを介して遺伝子感染させられ
た腫瘍細胞によって低いレベルのＩＬ−２及びＩＬ−４
が連続的に生成されている（Golumbek, et al.,"Treatm
ent of Established Renal Cancer by Tumor Cells Eng
ineered to Secrete Interleukin-4", Science, 254:71
3(1991).）。
【０１２０】in vivo に於て特異腫瘍関連ムチンに対し
て反応するＬＮＬを選択するべく放射性標識されたモノ
クローナル抗体を用いることによって、進行した結腸直
腸ガンを有する患者に養子細胞免疫療法を用いる独特な
機会が提供される。米国特許第４，７８２，８４０号に
よる位置決めされたリンパ節の各々は約５×１０8 の細
胞を含んでいるので、２０倍の増加により、質量当りに
於て実験動物モデルで有効な細胞数が得られることにな
る。
【０１２１】ここに開示する新規な治療薬の腫瘍退行能
力を示すために、以下のデータが提示される。このデー
タは、本発明を例示するものであり制限するものである
と解釈されるべきではない。
【０１２２】例４ 治療的過程 結腸直腸ガンの研究 この結腸直腸ガンの研究に於て２７人の患者が登録され
た。各々の患者は125Ｉ ＣＣ４９モノクロナル抗体を
受け、その後米国特許第４，７８２，８４０号に教示さ
れる如く上記のように或る時間経過させられた。その後
各々の患者は手術を受けた。３人の患者は患部が完全に
切除できると判断され、従ってこの研究から除外され
た。残る２４の患者は、切除できない疾患を有すると判
断された。しかしながらリンパ節は決定され除去され
た。肉眼による視診によって腫瘍を含まないと決定され
たこれらのリンパ節は、上記の態様にて増加された。患
者はランダムに細胞のみ（ＩＬ−２がない状態）若しく
はＩＬ−２を加えた細胞を投与された。以下のデータが
記憶された。
【０１２３】
【表２０】
【０１２４】
【表２１】 臨床的応答 ２人の患者（Ｎｏ．３及び４）は、外因性のＩＬ−２が
ある状態及びない状態で腫瘍の退行が見られた。腫瘍の
応答を分析する更なる調査はこの研究に於て現在もこれ
らの患者について継続中である。
【０１２５】毒性 治療は耐毒性的であった。細胞の注入に関連した困難は
なかった。全ての患者は細胞注入の約１時間後から熱及
び寒けを報告した。これらの現象は薬によって容易に解
決された。自覚症状のない一過的な肝酵素の上昇が外因
性のＩＬ−２を受入れた患者に於て見られた。
【０１２６】免疫学的効果 表面表現型、サイトカインｍＲＮＡ発現、及び増加され
た細胞の細胞毒性、オートローガス腫瘍に対するＤＴＨ
応答（皮膚検査）、末梢血細胞毒性、末梢血細胞表現
型、血清サイトカイン、 111In標識された細胞を用いた
細胞追跡研究（患者Ｎｏ．５）を含む詳しい免疫学的デ
ータが収集された。それらは決定的な結論を出すには焦
燥である。
【０１２７】上記のデータは、ＣＤ４＋リンパ球の豊富
な決定されたリンパ節から由来する治療薬の有効性を明
瞭に示している。患者４に於て見られた応答に基づく
と、本発明の治療薬を受けた患者に対し補助的な化学療
法を施すことは、患者にとって、ここに開示された本発
明の養子細胞療法を受ける前に化学療法に抵抗のあった
患者に対しても特に有効であろう。このことは、適当に
段階付けされた患者に対し補助的な化学療法を投与する
ことに関するナョナル・インスティテュート・オブ・ヘ
ルス（National Institute of Health (ＮＩＨ））の合
意の報告書（"NIHConsensus Conference: Adjuvant The
rapy for Patients with Colon and Rectal Cancer", J
AMA,1990;264:1444-50 ）から見て特に重要である。
【０１２８】ブロッカ等（Buroker, et al, "Randomize
d Comparison of Two Schedules ofFluorouracil and L
eucovorin in the Treatment of Advanced Colorectal
Cancer", J.Clin. Oncol., Vol. 12,No.1,pp 14-20(Jan
uary 1994））は、５ＦＵ／ルイコバリンの二つの異な
る療法を受けた３７２人の患者が９．３ケ月及び１０．
７ケ月（平均）生存したことを報告している。一方、ス
タングル等（Stangl,et al.,"Factors Influencing the
Natural History of Colorectal Liver Metastases",
Lancet, 1994; 343:1405-10）は、４８４人の未処置の
患者に於て、平均の生存が診断の時点から７．５ケ月で
あり、局所的な若しくは系統的な化学療法を受けた患者
について平均の生存期間は各々１２．７ケ月及び１１．
１ケ月であったことを報告した。図１２は、新規な治療
薬の投与の後、生存した患者の数（表２０参照）とかか
る投与の後の時間との関係を示すグラフである。これら
の結果は予備的なものであり少数の患者に対するもので
あるが患者にとって利点があるように見られる。
【０１２９】膵臓ガンについての研究 これまでにこの膵臓ガンについての研究に於て２人の患
者が登録された。各々の患者は125 Ｉ ＣＣ４９モノク
ローナル抗体を受け、米国特許第４，７８２，８４０号
に教示されている如くある時間経過させられた。各々の
患者はその後、手術を受けた。これら２人の患者は切除
不可能な患部を有すると判断された。しかしながらリン
パ節は決定され除去された。肉眼での視診によって腫瘍
を含んでいないと判断されたリンパ節は、その後上記の
態様にて増加された。患者はランダムに細胞のみ（ＩＬ
−２を含まない状態）若しくはＩＬ−２と共に細胞を投
与された。以下のデータが得られた。
【０１３０】
【表２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】［ 3Ｈ］チミジンを取込みにより測定されたＩ
Ｌ−２及び種々の濃度の抗ＣＤ3 の存在下に於てオート
ローガス（照射された）腫瘍と共に混合された腫瘍リン
パ球培養に於けるタイプI ＬＮＬの増殖を示すグラフ
図。同一のデータは表２に示されている。ＬＮＬ（１０
4 細胞）は、新鮮な腫瘍から分離されたオートローガス
（Auto）若しくは異型的（Allo) の結腸ガン細胞と共に
若しくはオートローガス若しくは異型的ＰＢＬ（５×１
０3 細胞、４０００radsにて照射された）と共に９６の
ウェルプレートに於て培養された。４日間の後［ 3Ｈ］
チミジン（１μCi／ウェル）が加えられ、１８時間後
に、プレートは採取され、液体シンチレーション計数法
によりチミジンの取込みが決定された。全ての培養液は
２０u ／ml ＩＬ−２を含む。腫瘍とＬＮＬのみの、成
長因子と腫瘍細胞のみ、若しくはＬＮＬのみの各々をイ
ンキュベーションした場合、増殖は見られなかった。
【図２】タイプI ＬＮＬに於ける混合された腫瘍リンパ
球培養を刺激した際のＩＬ−２に対するＩＬ−２と抗Ｃ
Ｄ3 の比較を示すグラフ図。同一のデータが表３に示さ
れている。タイプI ＬＮＬ（１０4 細胞）は、種々の濃
度のＩＬ−２のみ存在する場合若しくはＩＬ−２（２０
u ／ml）及び抗ＣＤ3 （５０ng／ml）の存在する場合に
於て照射されたオートローガス腫瘍（５×１０3 ）と共
に培養された。培養は、９６時間後［ 3Ｈ］チミジンを
もってパルス標識され、１８時間の後採取された。計数
は液体シンチレーション計数法によって決定された。
【図３】タイプIII ＬＮＬの混合された腫瘍リンパ球培
養を示すグラフ図。同一のデータが表４に示されてい
る。ＬＮＬ（１０4 細胞）は、オートローガス若しくは
異型的（５×１０3 、４０００rads）ヒト結腸ガン腫細
胞、ＩＬ−２（２０u ／ml）及び種々の濃度の抗ＣＤ3
の存在下に於て９６時間培養された。［ 3Ｈ］チミジン
（１ uCi／ウェル）を添加した１８時間の後に細胞は採
取され、チミジンの取込みが液体シンチレーション計数
法によって決定された。
【図４】タイプ0 ＬＮＬの混合された腫瘍リンパ球培養
を示すグラフ図。同一のデータが表５に示されている。
ＬＮＬ（１０4 ／ウェル）がオートローガス若しくは異
型的ヒト結腸ガン腫細胞（５×１０3 ／ウェル、４００
０rads）、２０ u／mlＩＬ−２及び種々の濃度の抗ＣＤ
3 と共に９６時間培養された。９６時間の後［3Ｈ］チ
ミジンが加えられ（１ uCi／ウェル）、１８時間の後、
プレートは採取され液体シンチレーションカウンタによ
りチミジンの取込みが決定された。
【図５】結腸直腸ガンを有する同一の患者からのタイプ
I ＬＮＬのタイプ0 ＬＮＬとの比較を示すグラフ図。同
一のデータが表４に模式的に示されている。タイプI 及
びタイプ0 のＬＮＬ（１０4 ／ウェル）は、２０ u／ml
ＩＬ−２及び抗ＣＤ3（５０ng／ml）と共にオートロ
ーガス結腸ガン腫細胞（５×１０3 ／ウェル、４０００
rads) の存在下に於て９６時間培養された。９６時間の
後［ 3Ｈ］チミジンが１ uCi／ウェルだけ加えられプレ
ートは１８時間後に採取された。
【図６】タイプI 及びタイプIII の脾細胞の混合された
腫瘍リンパ球培養を示すグラフ図。同一のデータが表６
に示されている。脾細胞（１０4 細胞／ウェル）が、オ
ートローガス若しくは異型的結腸ガン腫細胞（５×１０
3 ／ウェル、照射された細胞）の存在下に於て９６時間
インキュベートされた。タイプIII の脾細胞の場合、二
つの異形的腫瘍が用いられた。培養は全て２０ u／ml
ＩＬ−２及び種々の濃度の抗ＣＤ3 を含んでいた。９６
時間の後、［ 3Ｈ］チミジン（１ uCi／ウェル）が加え
られ１８時間の後プレートが採取されチミジンの取込み
が決定された。
【図７】混合された腫瘍リンパ球培養に於てタイプI Ｌ
ＮＬを刺激した際の種々の腫瘍の比較を示すグラフ図。
同一のデータが表６に示されている。タイプI からのＬ
ＮＬ（１０4 ／ウェル）がオートローガス結腸ガン細
胞、ヒトグリオーム（Glio）培養細胞系統、肝臓移植を
受けた患者から採取したヒトカルシノイド（ＣＡＲ１）
腫瘍、培養されたヒト結腸ガン腫細胞系統（ＷＤ１２
４）及びオートローガスＰＢＬの存在下に於てＩＬ−２
（２０ u／ml）及び抗ＣＤ3 （５０ng／ml）と共に培養
された。９６時間の後［ 3Ｈ］チミジンが加えられ（１
uCi／ウェル）、細胞は１８時間後に採取された。［ 3
Ｈ］チミジンの取込みは、液体シンチレーション計数法
によって決定された。成長因子なしで腫瘍と共にＬＮＬ
を培養したもの若しくは成長因子の存在下での任意の腫
瘍のみの培養に於ては増殖が刺激されなかった。ＬＮＬ
は、ＩＬ−２（２０ u／ml）及び抗ＣＤ3 （５０ng／m
l）だけと共に培養されたタイプI である。
【図８】二つの異る組の分裂促進刺激状態に於て培養さ
れた増加されたＬＮＬ細胞若しくはオートローガス腫瘍
若しくは異型的腫瘍の存在下にて培養された増加された
ＬＮＬ細胞による細胞壊死因子（ＴＮＦ）アルファの生
成を示すグラフ図。
【図９】１０日後に於けるＩＬ−２（１００Ｕ／ml）と
抗ＣＤ3 抗体（０．１μg ／ml）に於て培養された局所
的な細胞のサイトカイン mＲＮＡの発現を示す図。サイ
トカイン mＲＮＡは逆転写と複製連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いて増幅された cＤＮＡとによって分析された。レー
ンＭ＝１２３bp分子量ラダー（Gibco ／ＢＲＬ）。
【図１０】新規な治療薬を受けた後の患者の生存のパー
センテージとかかる治療薬の投与の後の時間（月）との
関係を示すグラフ図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/30 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 39/395 Ｅ Ｔ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 エドワード・ダブリュ・マーティン・ジュ ニア アメリカ合衆国 43015 オハイオ州、デ ラウエア、ブライドルスパー・レーン 7799 (72)発明者 ブライアン・ジェイ・ツェルニーキ アメリカ合衆国 20879 メリーランド州、 ゲイサーズバーグ、タンヤード・ヒル・ロ ード 1536 (72)発明者 ピエール・エル・トリオッツィ アメリカ合衆国 43201 オハイオ州、コ ロンバス、ウェスト・セヴンス・アヴェニ ュー 360 (72)発明者 ジュリアン・エイ・キム アメリカ合衆国 43202 オハイオ州、コ ロンバス、ダブリュ・ブライトン・ロード 187

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＣＤ４＋腫瘍特異リンパ球を含む腫瘍特異
    リンパ球の豊富なリンパ節を決定する方法であって、 （ａ）新生組織により生成された若しくはそれに関連し
    たマーカーに特異的に結合する有効な量の放射性標識さ
    れたロケータを患者へ投与する過程と、 （ｂ）（ａ）の過程に続いて、前記患者に於て前記放射
    性ロケータが新生組織に優先的に集中し、結合されてい
    ない放射性標識されたロケータが浄化されて前記患者に
    於ける背景の光子放出に対する新生組織からの光子放出
    の比が増大するよう時間を経過させる過程と、 （ｃ）（ｂ）の過程に於て前記時間が経過させられた後
    に、放射線検出プローブをもって前記放射性標識された
    ロケータの付加を示すリンパ節部位を該リンパ節部位に
    於て放射線のレベルが増大していることを検出すること
    によって決定するべく前記放射線検出プローブをもって
    前記患者を調べる過程と、 （ｄ）（ｃ）の過程に於て決定されたリンパ節を除去す
    る過程と、 （ｅ）前記の除去されたリンパ節のうち腫瘍の証拠を視
    覚的に含んでいないリンパ節を選択する過程と、 （ｆ）（ｅ）の過程に於て選択された前記リンパ節を培
    養しその中に於て腫瘍特異リンパ球を増殖する過程とを
    含む方法。
  2. 【請求項２】請求項１による方法であって、前記（ｄ）
    の過程に於て除去されたリンパ節が視診及び触診によっ
    て巨視的な腫瘍を含んでいないと確認されたリンパ節で
    ある方法。
  3. 【請求項３】請求項１による方法であって、前記選択さ
    れたリンパ節が前記（ｆ）の過程に於て分裂促進刺激に
    よって培養される方法。
  4. 【請求項４】請求項３による方法であって、前記（ｆ）
    の過程に於ける前記リンパ節がインターロイキン−２及
    び抗ＣＤ3 モノクローナル抗体の存在下にて培養される
    方法。
  5. 【請求項５】請求項４による方法であって、前記培養の
    過程に於て腫瘍関連糖蛋白質（ＴＡＧ）抗原が含まれて
    いる方法。
  6. 【請求項６】請求項４による方法であって、前記培養の
    過程に於て、更にオートローガス新生組織若しくは異型
    的新生組織の一つ若しくはそれ以上含む新生組織が含ま
    れている方法。
  7. 【請求項７】請求項４による方法であって、前記インタ
    ーロイキン−２の量が約１０ u／mlと５００ u／mlの間
    の範囲であり、前記抗ＣＤ3 モノクローナル抗体の濃度
    が約１０ng／mlと５００ng／mlの間の範囲である方法。
  8. 【請求項８】請求項６による方法であって前記新生組織
    が前記（ｆ）の培養する過程に先立って不活性化されて
    いる方法。
  9. 【請求項９】請求項８による方法であって、前記新生組
    織が不活性化されるべく放射線源により照射されている
    方法。
  10. 【請求項１０】請求項１による方法であって、前記
    （ｅ）過程に於て選択された前記リンパ節中のＣＤ４＋
    細胞が（ｆ）の過程に於て培養されるべく分離される方
    法。
  11. 【請求項１１】請求項１による方法であって前記（ｆ）
    の過程に於て培養された前記リンパ球が脾臓リンパ球に
    由来する方法。
  12. 【請求項１２】請求項１による方法であって、前記ロケ
    ータがポリクローナル抗体、モノクロナル抗体、抗体フ
    ラグメント、それらのキメラ型、それらの人型、それら
    の一本鎖抗体、若しくはペプチドのうちの一つ若しくは
    それ以上である方法。
  13. 【請求項１３】請求項１による方法であって前記ロケー
    タがＡ5 Ｂ7 モノクローナル抗体、ＣＣ４９モノクロー
    ナル抗体、ＣＣ８３抗体及びそれらの組合せから選択さ
    れる方法。
  14. 【請求項１４】請求項１による方法であって前記放射性
    標識されたロケータが前記放射線検出プローブによって
    検出されるガンマ放射線若しくはベータ放射線を放射す
    る方法。
  15. 【請求項１５】請求項１４による方法であって前記放射
    性標識されたロケータが約５５０kevを越えない選択さ
    れたエネルギレベルを呈する方法。
  16. 【請求項１６】請求項１５による方法であって前記放射
    性標識されたロケータが125 Ｉを含む方法。
  17. 【請求項１７】請求項１による方法であって前記放射性
    標識されたロケータが125 Ｉを含む方法。
  18. 【請求項１８】請求項４による方法であって、前記放射
    性標識されたロケータが125 Ｉを含む方法。
  19. 【請求項１９】請求項１による方法であって、前記患者
    が（ｃ）の過程に於て手にて所持され得る携帯用の放射
    線検出プローブをもって外科的に調べられる方法。
  20. 【請求項２０】請求項１による方法であって前記患者が
    （ｃ）の過程に於て内視鏡若しくは腹腔鏡をもって調べ
    られる方法。
  21. 【請求項２１】請求項１による方法であって前記放射線
    検出プローブが放射線のレベルが上昇した部分が存在す
    ることに応答する音発生器に結合されている方法。
  22. 【請求項２２】請求項１による方法であって（ｂ）の過
    程に於ける前記比が約１．５：１以上である方法。
  23. 【請求項２３】請求項４による方法であって前記患者が
    （ｃ）の過程に於て内視鏡若しくは腹腔鏡をもって調べ
    られる方法。
  24. 【請求項２４】請求項１による方法であって前記（ｆ）
    の過程の前記増殖されたリンパ節が前記患者へ投与され
    る方法。
  25. 【請求項２５】請求項７による方法であって前記（ｆ）
    の過程の前記増殖されたリンパ節が前記患者へ投与され
    る方法。
  26. 【請求項２６】請求項９による方法であって前記（ｆ）
    の過程の前記増殖されたリンパ節が前記患者へ投与され
    る方法。
  27. 【請求項２７】腫瘍を有する患者に於ける腫瘍の発達を
    軽減するのに有効な治療薬であって、調合上許容し得る
    担体に於て、患者から切除されたＣＤ４＋腫瘍特異リン
    パ球を含む腫瘍特異リンパ球の豊富なリンパ節であっ
    て、それらが増加するべく分裂促進刺激を受けているリ
    ンパ節を含む治療薬。
  28. 【請求項２８】請求項２７による治療薬であって前記リ
    ンパ節がインターロイキン−２及び抗ＣＤ3 モノクロー
    ナル抗体の存在下にて培養されたものである治療薬。
  29. 【請求項２９】請求項２８による治療薬であって、前記
    リンパ節の培養に於て腫瘍関連糖蛋白質（ＴＡＧ）抗原
    若しくは新生組織のうちの一つもしくはそれ以上を含ん
    でいる治療薬。
  30. 【請求項３０】請求項２９による治療薬であって、前記
    リンパ節を培養する際にオートローガス新生組織若しく
    は異型的新生組織のうちの一方若しくはそれ以上を含む
    新生組織が含まれている治療薬
  31. 【請求項３１】請求項２８による治療薬であって、前記
    インターロイキン−２の量が約１０ u／mlと５００ u／
    mlの間の範囲であり、前記抗ＣＤ3 モノクローナル抗体
    の濃度が約１０ng／mlと５００ng／mlの間の範囲である
    治療薬。
  32. 【請求項３２】請求項３０による治療薬であって前記新
    生組織が前記リンパ節と共に培養される前に先立って不
    活性化されている治療薬。
  33. 【請求項３３】請求項３２による治療薬であって、前記
    新生組織が不活性化されるべく放射線源によって照射さ
    れている治療薬。
  34. 【請求項３４】請求項２７による治療薬であって、前記
    リンパ節が脾臓リンパ球に由来する治療薬。
  35. 【請求項３５】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の退行を行
    うための方法であって、有効な量の請求項２７に記載さ
    れた治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  36. 【請求項３６】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の退行を行
    うための方法であって、有効な量の請求項２８に記載さ
    れた治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  37. 【請求項３７】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の退行を行
    うための方法であって、有効な量の請求項２９に記載さ
    れた治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  38. 【請求項３８】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の退行を行
    うための方法であって、有効な量の請求項３３に記載さ
    れた治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  39. 【請求項３９】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の退行を行
    うための方法であって、有効な量の請求項３４に記載さ
    れた治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  40. 【請求項４０】請求項３５による方法であって前記患者
    がその後補助的な化学療法を受ける方法。
  41. 【請求項４１】患者から切除されたＣＤ４＋腫瘍特異リ
    ンパ球を含む腫瘍特異リンパ球の豊富なリンパ節を含む
    リンパ節を培養する方法であって、 （ａ）前記切除されたリンパ節からリンパ節リンパ球
    （ＬＮＬ）を分離する過程と、 （ｂ）前記ＬＮＬを分裂促進刺激状態下にて培養し前記
    ＬＮＬを増加する過程と （ｃ）その後前記分裂促進刺激を低減する過程と、 を含む方法。
  42. 【請求項４２】請求項４１による方法であって前記ＬＮ
    Ｌがインターロイキン−２（ＩＬ−２）、抗ＣＤ3 モノ
    クローナル抗体、及び腫瘍関連糖蛋白質（ＴＡＧ）抗原
    の存在下にて培養される方法。
  43. 【請求項４３】請求項４２による方法であって、前記イ
    ンターロイキン−２の量が約１０ u／mlと５００ u／ml
    の間の範囲であり、前記抗ＣＤ3 モノクローナル抗体の
    濃度が約１０ng／mlと５００ng／mlの間の範囲である方
    法。
  44. 【請求項４４】請求項４２による方法であって前記ＩＬ
    −２と溶解性である前記抗ＣＧ3 が前記ＬＮＬに同時に
    加えられる方法。
  45. 【請求項４５】請求項４１による方法であって前記ＬＮ
    Ｌがマクロファージ媒体中に於て培養される方法。
  46. 【請求項４６】請求項４５による方法であって前記媒体
    が血清のない媒体である方法。
  47. 【請求項４７】患者から切除された腫瘍活性細胞の豊富
    なリンパ節を含むリンパ節を培養する方法であって、 （ａ）前記切除されたリンパ節から腫瘍反応性細胞を分
    離する過程と、 （ｂ）前記腫瘍反応性細胞を分裂促進刺激条件下のもと
    で培養し前記腫瘍反応性細胞を増加する過程と、 （ｃ）その前記分裂促進刺激を低減する過程とを含む方
    法。
  48. 【請求項４８】請求項４７による方法であって前記腫瘍
    反応性細胞がインターロイキン−２（ＩＬ−２）、抗Ｃ
    Ｄ3 モノクローナル抗体、及び腫瘍関連糖蛋白質（ＴＡ
    Ｇ）抗原の存在下にて培養される方法。
  49. 【請求項４９】請求項４８による方法であって、前記イ
    ンターロイキン−２の量が約１０ u／mlと５００ u／ml
    の間の範囲であり、前記抗ＣＤ3 モノクローナル抗体の
    濃度が約１０ng／mlと５００ng／mlの間の範囲である方
    法。
  50. 【請求項５０】請求項４８による方法であって前記ＩＬ
    −２と溶解性である前記抗ＣＧ3 が前記ＬＮＬに同時に
    加えられる方法。
  51. 【請求項５１】請求項４７による方法であって前記腫瘍
    反応性細胞がマクロファージ媒体中に於て培養される方
    法。
  52. 【請求項５２】請求項５１による方法であって前記媒体
    が血清のない媒体である方法。
  53. 【請求項５３】腫瘍を有する患者に於ける腫瘍の発達を
    軽減するのに有効な治療薬であって、調合上許容し得る
    担体に於て、患者から切除された腫瘍反応性細胞の豊富
    なリンパ節であって、それらが増加するべく分裂促進刺
    激を受けているリンパ節を含む治療薬。
  54. 【請求項５４】請求項５３による治療薬であって前記リ
    ンパ節がインターロイキン−２及び抗ＣＤ3 モノクロー
    ナル抗体の存在下にて培養されたものである治療薬。
  55. 【請求項５５】請求項５４による治療薬であって、前記
    リンパ節の培養に於て、腫瘍関連糖蛋白質（ＴＡＧ）抗
    原若しくは新生組織のうちの一つもしくはそれ以上を含
    んでいる治療薬。
  56. 【請求項５６】請求項５５による治療薬であって、前記
    リンパ節を培養する際にオートローガス新生組織若しく
    は異型的新生組織のうちの一方若しくはそれ以上を含む
    新生組織が含まれている治療薬
  57. 【請求項５７】請求項５４による治療薬であって、前記
    インターロイキン−２の量が約１０ u／mlと５００ u／
    mlの間の範囲であり、前記抗ＣＤ3 モノクローナル抗体
    の濃度が約１０ng／mlと５００ng／mlの間の範囲である
    治療薬。
  58. 【請求項５８】請求項５６による治療薬であって前記新
    生組織が前記リンパ節と共に培養される前に先立って不
    活性化されている治療薬。
  59. 【請求項５９】請求項５８による治療薬であって、前記
    新生組織が不活性化されるべく放射線源によって照射さ
    れている治療薬。
  60. 【請求項６０】請求項５３による治療薬であって、前記
    リンパ節が脾臓由来のリンパ節である治療薬。
  61. 【請求項６１】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の発達を抑
    えるための方法であって、有効な量の請求項５３に記載
    された治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  62. 【請求項６２】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の発達を抑
    えるための方法であって、有効な量の請求項５４に記載
    された治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  63. 【請求項６３】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の発達を抑
    えるための方法であって、有効な量の請求項５５に記載
    された治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  64. 【請求項６４】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の発達を抑
    えるための方法であって、有効な量の請求項５９に記載
    された治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  65. 【請求項６５】腫瘍を有する患者に於て腫瘍の発達を抑
    えるための方法であって、有効な量の請求項６０に記載
    された治療薬を前記患者へ投与することを含む方法。
  66. 【請求項６６】請求項６１による方法であって前記患者
    がその後補助的な化学療法を受ける方法。
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