JPH07184697A - 腸内細菌科細菌の検出のためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

腸内細菌科細菌の検出のためのオリゴヌクレオチド

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JPH07184697A
JPH07184697A JP6264916A JP26491694A JPH07184697A JP H07184697 A JPH07184697 A JP H07184697A JP 6264916 A JP6264916 A JP 6264916A JP 26491694 A JP26491694 A JP 26491694A JP H07184697 A JPH07184697 A JP H07184697A
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ルートヴィヒ アルブレヒト
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シューベルト ペーター
Siegfried Dr Neumann
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 腸内細菌科、とくにサルモネラ属の細菌など
の病原性腸内細菌科細菌の検出のための核酸プローブま
たはプライマーとしての使用に適するオリゴヌクレオチ
ドを提供する 【構成】 オリゴヌクレオチドはサルモリシン様ＤＮＡ
領域から選択され、好ましくは下記式ＩＩＩａ〜ＩＩＩ
ｈの一つによる配列または対応する相補的配列を有す
る。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、とくにサルモネラ属
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌などの病原性腸内細菌
科細菌の検出のための核酸プローブまたはプライマーと
して適するオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）、サルモネラ属細菌およびシゲラ属細菌（Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａ ｓｐ．）は食中毒をもっとも頻繁に引き起
こす腸内細菌科細菌の代表的なものである。近年、食中
毒、とくにサルモネラ族によって引き起こされる食中毒
が増加しており、頻度増加とともに症状の重篤化の傾向
が認められる。
【０００３】サルモネラ族および他の病原性腸内細菌科
細菌の検出のための迅速でかつ特異的な方法は、感染し
た患者の迅速で特異的な治療および感染源の早急な封じ
込めのために欠かせない。法令規則では、サルモネラ族
細菌の検出法は病原性および毒性に関わらずこれら細菌
に感受性であることが要求されている。サルモネラ族細
菌の検出のための通常の方法は、多段階培養および血清
学的分類からなる。これらの方法によると結果が得られ
るまでに数日を要する。免疫学的方法はより迅速ではあ
るが、用いたマーカーが必ず現れるという保証がある場
合にのみ使用し得る。したがって、これらの方法の適用
には必然的な限界がある。これらの限界は核酸プローブ
の使用に基づいた検出方法には当てはまらない。しか
し、核酸プローブを用いる検出法は、予備培養を省略で
きるほどの充分な感受性を一般には示さない。このため
に、コロニーハイブリダイゼーションが普通採用され
る。
【０００４】例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）な
どの核酸増幅反応に基づく検出法では検出限界が改善さ
れ、したがって予備培養が一般に省略できる。
【０００５】ポリメラーゼ連鎖反応に基づくサルモネラ
族細菌の検出法は次の文献から公知である。
【０００６】ａ）Ｓｐｉｅｒｕｎｇｓ、Ｇら（Ｇｅｎ
ｅ、１２２、４５−５２、１９９２）は、ネズミチフス
菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｐｈｏＥ遺伝子か
らのプライマーを用いた。しかし、検出反応において試
験されたサルモネラ属の菌株の全部は認識されなかっ
た。
【０００７】ｂ）Ｒａｈｎ、Ｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、６、２７１
−２７９、１９９２）は、ｉｎｖＡ遺伝子からのプライ
マーを用いた。しかし、検出反応において試験されたサ
ルモネラ属の菌株の全部は認識されなかった。ＰＣＲ産
物はまた、他の腸内細菌科細菌を用いた対照実験におい
ても現れた。
【０００８】ＥＰ−Ａ−０ ３５５ ９８９およびＥＰ−
Ａ−０ ３８３ ５０９には、核酸プローブを用いるサル
モネラ族細菌の検出法が開示されている。ここで検出さ
れる配列は、それぞれ、ａｒａＣ遺伝子および特殊グル
ープのビリ線毛をコードする遺伝子からの配列である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】サルモネラ菌の検出に
は極めて高度の診断的感受性が要求されることから、核
酸プローブ法および／または核酸増幅反応に基づいた改
良検出法の提供が課題として残されている。
【００１０】病原性大腸菌の菌株において溶血性毒素の
発現に関与する遺伝子の一群が他の腸内細菌科の細菌に
も存在することが見出だされた。これは、試験した多く
の菌株が溶血性毒素を形成しないがそれでもこれらの遺
伝子を有することから驚くべきことであった。
【００１１】これら遺伝子の二つが溶血性毒素を形成す
るサルモネラ族細菌において初めて発見され、ｓｌｙＡ
およびｓｌｙＣと命名された。ｓｌｙＡおよびｓｌｙＣ
遺伝子領域から選択された構成配列が特異的検出法にお
ける使用に適していることが見出だされた。本発明によ
るこれらの検出法は、核酸プローブ手法および／または
他の核酸増幅反応に基づくことができる。これらによっ
て、サルモネラ属および／または他の腸内細菌科の細菌
の高度に特異的な検出が可能になる。
【００１２】「サルモリシンＤＮＡ領域」の本発明によ
る定義はコード部分（ｓｌｙＡおよびｓｌｙＣ）からな
るサルモネラ属細菌のＤＮＡ領域を意味するが、これに
はサルモリシンの機能に必要なそれらに隣接する非コー
ド領域が含まれる。「サルモリシン様ＤＮＡ領域」と
は、サルモネラ属および他の腸内細菌科の細菌における
これらの部分からなるＤＮＡ領域を意味する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、腸内細菌科細
菌の検出のためのサルモリシン様ＤＮＡ領域から選択さ
れるオリゴヌクレオチドに関し、下記の式Ｉａ〜Ｉｈの
一つによる構成配列または対応する相補的配列を含むこ
とを特徴とし、２０個までの追加のヌクレオチド構造部
分を結合したかたちで特定構成配列の上流および／また
は下流に存在させることが可能である。
【００１４】
【化３】 これに関連して、下記の式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｈの一つに
よる配列またはそれに対応する相補的配列を有するオリ
ゴヌクレオチドがとくに好ましい。
【００１５】
【化４】 本発明は、式ＩＩａ〜ｈおよび／またはＩＩＩａ〜ｈの
一つによるオリゴヌクレオチドの、腸内細菌、とくにサ
ルモネラ属の細菌の検出のための核酸プローブまたはプ
ライマーとしての使用に関する。
【００１６】本発明は、腸内細菌科の細菌、とくにサル
モネラ属の細菌の検出のための方法に関し、式ＩＩａ〜
ｈおよび／またはＩＩＩａ〜ｈの一つによるオリゴヌク
レオチドを核酸プローブまたはプライマーとして使用す
ることを特徴とする。
【００１７】本発明はまた、腸内細菌科の細菌、とくに
サルモネラ属の細菌の検出のための試験キット関し、試
験キットが式ＩＩａ〜ｈおよび／またはＩＩＩａ〜ｈの
一つによるオリゴヌクレオチドを核酸プローブまたはプ
ライマーとして含むことを特徴とする。
【００１８】本発明を以下により詳細に記述する。これ
に関連して、当業者に公知であって文献に詳細が記述さ
れているような化学的、免疫学的および分子生物学的方
法については、一般に詳述しない。自体公知であって本
明細書では詳述しないこれら方法の変法もまた使用でき
る。
【００１９】ヌクレオチド配列中の一つまたは二、三の
塩基の置換はその配列の生物学的な性質に変化を及ぼさ
ないことは当業者に公知である。同様に、二つの核酸フ
ラグメントは、それぞれの塩基が相補的構造に完全に対
応しなくてもハイブリダイズできることは公知である。
この理由から、本発明によるヌクレオチド配列もまた、
配列ＩＩａ〜ＩＩｈおよびＩＩＩａ〜ＩＩＩｈから塩基
交換によって誘導され、それぞれのオリジナル配列と同
様にハイブリダイズする配列を含む。
【００２０】個々の配列によって、本発明によるオリゴ
ヌクレオチドは、例えばホスホトリエステル法やホスホ
アミダイト法などの当業者に公知の方法によって合成す
ることができる。ホスホアミダイト法、とくに自動合成
機による方法が好ましく用いられる。この方法は、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２２、１８５９−１
８６２、１９８１に記述されている。このタイプの合成
法のさらなる詳細は、例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｅ．
Ｌ．（Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ（遺伝子とクロー
ン）、４４−６１、１９８５、ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓ
ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉ
ｍ）に記述されている。
【００２１】式ＩＩａ〜ＩＩｈおよびＩＩＩａ〜ＩＩＩ
ｈの本発明によるオリゴヌクレオチドは、核酸プローブ
としての使用に適しており、したがって腸内細菌細菌
科、とくにサルモネラ属の細菌の特異的検出のための使
用に適している。これらの配列は通常の方法で表され、
５′末端から３′末端に記される。核酸プローブが標的
配列とハイブリダイズすることから、そして全ての標的
配列には必ず反対鎖に相補的配列があることから、式Ｉ
Ｉａ〜ｈまたはＩＩＩａ〜ｈの一つに相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドもまた同様に本発明による使用
に適している。
【００２２】核酸プローブは、分析的検出を可能にする
ために一般にはトレーサーに結合している。例えば、プ
ローブ自体をＰ−３２またはＨ−３などを用いて放射性
標識することができる。同位元素による標識法および標
識に適した他の放射性同位元素は、当業者に公知であ
る。当業者はこれら放射性トレーサーに加えて他の非同
位元素トレーサーについても精通している。非同位元素
トレーサーは分析的目的のためにしばしば好んで用いら
れる。これら標識物は、例えば架橋分子を用いてプロー
ブと結合される。適当な非同位元素トレーサーの例とし
てはフルオレセインなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ
またはアルカリホスファターゼなどの酵素があげられ
る。当業者は、適切な蛍光物質または酵素の選択および
必要な検出法について精通している。多くの場合、トレ
ーサーをプローブに直接に結合させずに、代わりに追加
の強力な結合リガンドを用いて間接的に結合させること
が有用である。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ス
トレプトアビジンの組み合わせがこの目的のためにとく
に有用であることが証明された。当業者は、そのような
リガンドの選択および必要な結合法について精通してい
る。本発明およびこれらの例において、トレーサーとい
う用語は直接標識法に用いられるトレーサー、それに間
接標識法において用いられる結合リガンドを含む組み合
わせトレーサーの両方を意味する。本発明において、用
語「核酸プローブ」とはプローブとして用いられる核
酸、それに核酸およびトレーサーからなる構成物の両方
を意味する。式ＩＩａ〜ＩＩｈおよびＩＩＩａ〜ＩＩＩ
ｈの本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、核酸増幅
法のためのプライマーとしての使用、したがって腸内細
菌科、とくにサルモネラ属の細菌の特異的検出のための
使用に適している。これらの方法において、予備培養は
一般に必要ではない。それぞれの場合に用いられる増幅
系の要求に応じて、デオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチドが本発明による配列物とともに用いられ
る。後者の場合、チミジン構成部分がそれぞれウリジン
構成部分に置き代えられる。通常、それぞれの場合、一
つのプライマーがＤＮＡ鎖の一つとそれぞれ反応するこ
とから、プライマーのうちの一つが相補的配列に用いら
れる。この相補的配列は公知の方法で塩基対合のルール
に従って誘導される。
【００２３】本発明によるプライマーは、例えばポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ増幅における
使用に適している。この目的のために、ＤＮＡをまず加
熱によって一本鎖に解離する。二つのプライマーを用い
てそれぞれ一つのＤＮＡ鎖上の相同的ＤＮＡ部分とそれ
ぞれハイブリダイズさせる。これら二つのプライマーの
間にあるゲノム部分が増幅される。ＤＮＡにアニーリン
グされたプライマーは、増幅の開始点を表す。次いで、
ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼに
よって、四つのヌクレオチド三燐酸の存在下でオリジナ
ルＤＮＡの配列に対応する第二鎖が完成される。次い
で、得られた二本鎖を再び加熱によって一本鎖に解離す
る。この増幅サイクルは何回も繰り返すことができる。
増幅サイクルを充分回数繰り返した後、増幅された核酸
を公知の方法によって検出することができる。このため
に、ＤＮＡを電気泳動によって分画して、次いで臭化エ
チジウムによって染色して、最後にＵＶ励起を用いて蛍
光による検出を行うことができる。検出は、ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションによってもまた可能である。適当な
増幅および検出法の詳細は、例えばＩｎｎｉｓら（編
者）のＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ
Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ）などの総説に記述されている。
本発明によるプライマーを用い得る他の核酸増幅法につ
いてもまた、文献から公知である。これらの方法には、
Ｂｏｎｄ、Ｓ．ら（４２５−４３４、Ｒａｖｅｎ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ／ＵＳＡ、１９９０）
による記載のリガーゼ連鎖反応が含まれる。
【００２４】二つのプライマーの一つの選択は常にとく
に重要であるが、第二のプライマーは検出反応の特異性
を有意に変えることなくより容易に変えることができ
る。したがって、本発明の教示によれば、この第二のプ
ライマーのための配列に式ＩＩａ〜ＩＩｈまたはＩＩＩ
ａ〜ＩＩＩｈの一つと一致しないものを選択することも
また充分に可能である。
【００２５】本発明によると、プライマーの少なくとも
一つは式ＩＩａ〜ＩＩｈまたは、好ましくは式ＩＩＩａ
〜ＩＩＩｈから選択される。既に説明したように、第一
のプライマーに較べて第二のプライマーは増幅反応の特
異性への影響が実質的に少ない。しかし、両方のプライ
マーを式ＩＩａ〜ＩＩｈまたはＩＩＩａ〜ＩＩＩｈから
選択する組み合わせが好ましい。
【００２６】ＰＣＲ法の詳細に関するさらなる情報につ
いては前出のＳｐｉｅｒｕｎｇｓ、Ｇ．ら（１９９２）
およびＲａｈｎ、Ｋ．ら（１９９２）に記述がある。
【００２７】増幅産物を核酸ハイブリダイゼーションに
よって検出することもまた可能である。このためには、
増幅部分とハイブリダイズする核酸プローブを増幅後に
反応混合物に加える。
【００２８】
【実施例】本発明によるオリゴヌクレオチドの調製およ
びそれらの使用の詳細を、以下の実施例に明示する。当
業者は引用文献からさらなる方法の詳細を見出だすこと
ができる。以下の実施例は本発明の主題内容を説明する
ものであって、本発明のいかなる限定をも意図するもの
ではない。 ［実施例１］ 式ＩＩＩｂによるオリゴヌクレオチドの調製 式ＩＩＩｂによるオリゴヌクレオチドを、アプライド・
バイオシステムズ３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いてホス
ホアミダイト法によって調製する。この方法の要点はＴ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２２、１８５９−
１８６２、１９８１に記述されている。さらなる詳細
は、機器製造者による説明書類に見出だされる。
【００２９】式ＩＩＩａ、ＩＩＩｃおよびＩＩＩｄによ
るオリゴヌクレオチドを、対応する方法によって調製す
る。式ＩＩＩｆ、ＩＩＩｇおよびＩＩＩｈによるプライ
マーを、それぞれの相補的配列に調製する。式ＩＩＩｅ
によるオリゴヌクレオチドをオリジナルの配列および対
応する相補的配列の両方に調製する。このようにして得
られたオリゴヌクレオチドをＤＮＡプローブとしてある
いはまたＰＣＲ反応のためのプライマーとして用いるこ
とができる。 ［実施例２］ ＤＮＡプローブのＰ−３２標識 実施例１によって得られたオリゴヌクレオチドを「Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｎｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）の４．８項に記載の方法
で放射性標識する。
【００３０】２０μｌのγ−32Ｐ ＡＴＰ溶液（２００
μＣｉ）、２．５μｌの１０倍濃縮キナーゼ緩衝液
（０．７ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミ
ジンＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）および４単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア社製）を１００
ｎｇのオリゴヌクレオチドを含む１μｌのオリゴヌクレ
オチド溶液に加えて、混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベートする。酵素を次いで加熱（６５℃、５分間）に
よって失活させる。標識されたオリゴヌクレオチドを２
５μｌの４Ｍ酢酸アンモニウム溶液および２５０μｌの
無水エタノールを添加して沈澱させて、遠心分離（１２
０００ｒｐｍ、１５分間）する。沈澱を各２５μｌの水
に３回懸濁させて、再遠心分離する。 ［実施例３］ 放射性標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン（コロニーハイブリダイゼーション法） コロニーハイブリダイゼーションを、Ｄａｔｔａら（Ａ
ｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．、５４、２９３３−２９３７、１９８８）
に記載の方法によって行う。 ａ）前処理 被検試料サンプルから細菌をペトリ皿上で前培養（脳心
臓浸出液、３７℃、１８時間）する。次いで前培養細菌
が増殖した寒天培地表面に薄膜フィルター（ハイボンド
−Ｃ、アメルシャム社製）を置いて軽く圧す。このフィ
ルターを、３ｍｌのＮａＣｌ溶液（０．８５重量％）を
含むプラスチックペトリ皿に置いた濾紙（ワットマン３
Ｍ）上に細菌を上に向けて置いて、マイクロウェーブオ
ーブン中で７００Ｗで３０秒間処理する。次いで、この
濾紙を３ｍｌの溶解溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５
Ｍ ＮａＣｌ）を用いて室温で５分間処理して、次いで
中和溶液（１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．０、２Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）に浸した濾紙上に短時間置く。この濾紙を次いで
中和溶液中で５分間インキュベートして、風乾する。 ｂ）予備ハイブリダイゼーション 薄膜フィルターに付着したＤＮＡを１００μｇ／ｍｌの
変性ニシン精子ＤＮＡを用いて４５℃で４時間ハイブリ
ダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズさせる。ハイ
ブリダイゼーション溶液は次のような組成を有する。
０．６ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、６Ｍ ＮａＣｌお
よび６０ｍＭ ＥＤＴＡ（６倍濃縮ＳＴＥ溶液）、０．
１％フィコール（登録商標）、０．１％ポリビニルピロ
リドンおよび０．１％ウシ血清アルブミン（５倍濃縮デ
ンハート溶液）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムおよ
び１００μｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡ。 ｃ）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションのために、実施例１に従って調
製した式ＩＩＩｅによる放射性標識オリゴヌクレオチド
プローブを、付着させたＤＮＡを含む薄膜フィルターに
ハイブリダイゼーション緩衝液とともに加える。ハイブ
リダイゼーションを４５℃で１８時間かけて行う。次い
で、フィルターを室温で０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムの２倍濃縮ＳＳＣ溶液（０．３Ｍ ＮａＣｌの３０ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）中でそれぞ
れ５分間づつ３回、４５℃で０．１％ドデシル硫酸ナト
リウムＳＳＣ溶液中でそれぞれ２０分間づつ３回、そし
て室温でＳＳＣ溶液中で１回洗浄する。
【００３１】次いで、フィルターをＸ線フィルム（フジ
ＲＸ医用Ｘ線フィルム、フジ写真フィルム社製）上に置
いて、フィルムを一晩露光する。現像後、黒い着色がサ
ルモネラコロニーを示す。 ［実施例４］ サルモネラの属特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施 約１μｇのＤＮＡを有する細菌サンプルを、５０μｌの
緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌ）に懸濁させて、
１１０℃で５分間加熱する。次いで、式ＩＩＩｂおよび
ＩＩＩｈによるプライマー（実施例１を参照、各０．４
μｇ）、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア
製）の反応緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．
５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌ）溶
液、各２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよ
びｄＣＴＰを加える（反応液総量１００μｌ）。最初の
変性段階を９４℃で３分間続ける。次いで、サンプルを
５５℃で３０秒間（結合期）、そして７２℃で１分間
（伸長期）温度平衡させる。次いで、変性段階（９４
℃）を４５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５
分間保持の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００３２】ＰＣＲ産物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を
含むトリス／ホウ酸塩（各５０ｍＭ）泳動緩衝液中でポ
リアクリルアミドゲル（６％）上で分画する。次いで、
分画ＰＣＲ産物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ、
水中）を用いて染色して、ＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射
して可視化する。
【００３３】ＰＣＲ産物は、サルモネラＤＮＡまたはサ
ルモネラ菌体がサンプル中に存在する場合にのみ観察さ
れる（表１のａ）欄を参照されたい）。 ［実施例５］ サルモネラの属特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施 式ＩＩＩｂおよびＩＩＩｈによるプライマーの代わりに
式ＩＩＩｅおよびＩＩｈによるプライマー（実施例１を
参照）を用いて、実施例４に記述の方法を繰り返す。こ
の場合もまた、ＰＣＲ産物は、サルモネラＤＮＡまたは
サルモネラ菌体がサンプル中に存在する場合にのみ観察
される（表１のｂ）欄を参照されたい）。 ［実施例６］ サルモネラの属特異的検出のためのＰＣＲ反応の実施 式ＩＩＩｂおよびＩＩＩｈによるプライマーの代わりに
式ＩＩＩｂおよびＩＩＩｅによるプライマー（相補的配
列、実施例１を参照）を用いて、実施例４に記述の方法
を繰り返す。この場合もまた、ＰＣＲ産物は、サルモネ
ラＤＮＡまたはサルモネラ菌体がサンプル中に存在する
場合にのみ観察される。 ［実施例７］ 腸内細菌科サルモネラ属、シトロバクター属、大腸菌お
よびシゲラ属のグループ特異的検出のためのＰＣＲ反応
の実施 約１μｇのＤＮＡを有する細菌サンプルを５０μｌの緩
衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ）に懸濁させて、１１０
℃で５分間加熱する。
【００３４】次いで、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｈによる
プライマー（実施例１を参照、各０．４μｇ）、２．５
ＵのＴａｑポリメラーゼ（ファルマシア製）の反応緩衝
液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2および５０ｍＭ ＫＣｌ）溶液、各２００μＭ
のｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを加え
る（反応液総量１００μｌ）。最初の変性段階を９４℃
で３分間行う。次いで、サンプルを５５℃の温度で３０
秒間（結合期）、そして７２℃の温度で１分間（伸長
期）温度平衡させる。次いで、変性段階（９４℃）を４
５秒間続ける。３０回の反応サイクルの後、５分間保持
の終結伸長段階（７２℃）を行う。
【００３５】ＰＣＲ産物を、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）を
含むトリス／ホウ酸塩（各５０ｍＭ）泳動緩衝液中でポ
リアクリルアミドゲル（６％）上で分画する。次いで、
分画ＰＣＲ産物を臭化エチジウム（０．１ｍｇ／ｍｌ、
水中）を用いて染色してＵＶ光（２６０ｎｍ）で照射し
て可視化する。
【００３６】ＰＣＲ産物は、腸内細菌科サルモネラ属、
シトロバクター属、大腸菌（エシェリヒア属）およびシ
ゲラ属のＤＮＡまたは菌体がサンプル中に存在する場合
にのみ観察される（表１のｃ）欄を参照されたい）。 ［実施例８］ 腸内細菌科サルモネラ属、シトロバクター属、大腸菌お
よびシゲラ属のグループ特異的検出のためのＰＣＲ反応
の実施 式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｈによるプライマーの代わりに
式ＩＩＩｄおよびＩＩｈによるプライマー（実施例１を
参照）を用いて、実施例７に記述の方法を繰り返す。こ
の場合もまた、ＰＣＲ産物は、腸内細菌科サルモネラ
属、シトロバクター属、大腸菌およびシゲラ属のＤＮＡ
または菌体がサンプル中に存在する場合にのみ観察され
る（表１のｄ）欄を参照されたい）。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【配列表】
（１）一般的情報 （ｉ）出願者 （Ａ）名称：メルク・パテントＧｍｂＨ （Ｂ）町名：フランクフルター・ストリート２５０ （Ｃ）都市：ダルムシュタット （Ｅ）国名：ドイツ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６４２７１ （Ｇ）電話：０６１５１−７２７８４０ （Ｈ）テレファックス：０６１５１−７２７１９１ （Ｉ）テレックス：４ １９ ３２８ ３２ ｅｍ ｄ （ｉｉ）発明の名称：腸内細菌科細菌の検出のためのオ
リゴヌクレオチド （ｉｉｉ）配列の数：１８ （ｉｖ）コンピュータ解読型 （Ａ）媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ互換機 （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ ＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ） （Ｖ）現在の出願データ： 出願番号： （２）配列ＩＤ番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１２９５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１：
【００４０】
【化５】 （２）配列ＩＤ番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１２５３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号２：
【００４１】
【化６】 （２）配列ＩＤ番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号３：
【００４２】
【化７】 （２）配列ＩＤ番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号４：
【００４３】
【化８】 （２）配列ＩＤ番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号５：
【００４４】
【化９】 （２）配列ＩＤ番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号６：
【００４５】
【化１０】 （２）配列ＩＤ番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号７：
【００４６】
【化１１】 （２）配列ＩＤ番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号８：
【００４７】
【化１２】 （２）配列ＩＤ番号９に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号９：
【００４８】
【化１３】 （２）配列ＩＤ番号１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１０：
【００４９】
【化１４】 （２）配列ＩＤ番号１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１１：
【００５０】
【化１５】 （２）配列ＩＤ番号１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１２：
【００５１】
【化１６】 （２）配列ＩＤ番号１３に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１３：
【００５２】
【化１７】 （２）配列ＩＤ番号１４に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１４：
【００５３】
【化１８】 （２）配列ＩＤ番号１５に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１５：
【００５４】
【化１９】 （２）配列ＩＤ番号１６に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：大腸菌 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１６：
【００５５】
【化２０】 （２）配列ＩＤ番号１７に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１７：
【００５６】
【化２１】 （２）配列ＩＤ番号１８に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：サルモネラ菌種 （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１８：
【００５７】
【化２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 サルモネラ属の細菌におけるサルモリシン遺
伝子産生物をコードするＤＮＡ領域の配列の説明図であ
る。
【図２】 大腸菌における対応するＤＮＡ領域の配列の
説明図である。シゲラ・フレキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）における位置１から９７２まで
の配列領域は、大腸菌のものと一致する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:42） (72)発明者 アンドレアス ブーベルト ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ヴェルナー ゲーベル ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 モニカ ゲッツ ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 アルブレヒト ルートヴィヒ ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ペーター シューベルト ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内 (72)発明者 ジークフリート ノイマン ドイツ連邦共和国 デー−64293 ダルム シュタット フランクフルター シュトラ ーセ 250 エー．メルク内

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の式ＩＩａ〜ＩＩｈの一つによる配
    列および／または対応する相補的配列によることを特徴
    とする腸内細菌科細菌の検出のためのサルモリシン様Ｄ
    ＮＡ領域から選択されるオリゴヌクレオチド。［ただ
    し、式中、 Ｘ1およびＸ2は、互いにそれぞれ独立して水素または１
    〜２０個の追加のヌクレオチドである。］ 【化１】
  2. 【請求項２】 式ＩＩＩａ〜ＩＩＩｈの一つによる配
    列、または対応する相補的配列によることを特徴とする
    オリゴヌクレオチド。 【化２】
  3. 【請求項３】 腸内細菌科、とくにサルモネラ属の細菌
    の検出のための核酸プローブまたはプライマーとしての
    請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
  4. 【請求項４】 検出を核酸プローブを用いて行うことを
    特徴とする請求項３に記載の使用。
  5. 【請求項５】 検出を請求項１または２に記載のオリゴ
    ヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅によっ
    て行うことを特徴とする請求項３に記載の使用。
  6. 【請求項６】 請求項１または２に記載のオリゴヌクレ
    オチドを核酸プローブまたはプライマーとして用いるこ
    とを特徴とする腸内細菌科、とくにサルモネラ属の細菌
    の検出法。
  7. 【請求項７】 検出を核酸プローブを用いて行うことを
    特徴とする請求項６に記載の検出法。
  8. 【請求項８】 検出を請求項１または２に記載のオリゴ
    ヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅によっ
    て行うことを特徴とする請求項６に記載の検出法。
  9. 【請求項９】 請求項１または２に記載のオリゴヌクレ
    オチドを核酸プローブまたはプライマーとして含んでな
    ることを特徴とする腸内細菌科、とくにサルモネラ属の
    細菌の検出のための試験キット。
  10. 【請求項１０】 検出を核酸プローブを用いて行うこと
    を特徴とする請求項９に記載の試験キット。
  11. 【請求項１１】 検出を請求項１または２に記載のオリ
    ゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅によ
    って行うことを特徴とする請求項９に記載の試験キッ
    ト。
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EP0658630A3 (de) 1998-01-07
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ES2161736T3 (es) 2001-12-16
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DE4337295A1 (de) 1995-05-04
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