JPH0718874B2 - ▲蛍▼光複合体及び生物学的診断アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 生物学的に活性のある部分と検出可能な信号を発生する
染料部分との結合体を利用することが生物学的診断検定
分野で公知であり、後者の染料部分は電磁放射線を放出
する部分、例えば螢光、化学発光あるいは生物発光部分
のいずれの場合もありうる。生物学的活性部分はDNAプ
ローブ、例えば相補的DNA配列の検出に使用される型の
標識DNAプローブ、酵素、酵素阻害剤、抗原、抗体、ハ
プテンなどでよい。

近年、体液成分、例えば抗原、ホルモン、感染性作用物
質、血清抗体などの検出に用いられる標識試薬免疫検定
法に対して多大の関心が寄せられている。従つて、特許
文献に色の変化や電磁放射線などの検出可能な信号を与
える抗原−抗体間の標識試薬反応を含む種種な検定法に
ついての多数の開示が含まれている。これらの検定法は
リガンド−アンチリンガド間の免疫学的相互作用を含
み、これら二つの反応体の少なくとも一つは免疫学的リ
ガンド−アンチリガンド相互作用の関数として検出可能
な信号を与えることのできる物質または物質の前駆物質
を含んでいる。

このような検定法で一般に使われる標識の一つは螢光染
料か螢光団である。螢光標識結合体を使用する不均一お
よび均一両方の特異的結合検定法はこの分野で公知であ
る。一般に、このような検定法に用いるための螢光標識
は比較的長い発光波長、例えば500nm以上をもつことが
望ましい。更にまた、標識は大きいストークスシフトを
もち、検定条件下で安定であり、溶液中の物質からおよ
び標識を結合させる部分からの非特異的な妨害が比較的
少なく、また高い量子収率を与えることが望ましい。

本発明は、生物学的活性部分に結合したローダミン染料
部分を含む新規螢光性結合体、生物学的診断検定要素お
よび方法への使用に関する。

それ故に、本発明の目的は生物学的活性部分と螢光染料
部分とを含む新規螢光性結合体を提供することにある。

もう一つの目的は生物学的診断検定要素と方法を提供す
ることである。

発明の簡潔な要約 これらの目的と他の目的ならびに利点は式： 〔式中、W,X,YおよびＺは同一かまたは異なり、そして
各々は−（CH₂）ａ（CHR₄）（CH₂）ｂ−により表わさ
れ、 ａとｂは各々独立して０から４の整数であるが、ａ＋ｂ
の合計は１から４の整数であることを条件とし、 ｍおよびｎは各々０または１であるが、ｍおよびｎの一
つは０そしてｍおよびｎの一つは１であることを条件と
し、 ｐおよびｑ各々は０または１であるが、ｐおよびｑの一
つはo,pおよびｑの一つは１であることを条件とし、 R,R₁,R₃およびR₄は各々独立して水素、例えばカルボン
酸、ポリアルコール、スルホン酸などの親水性基を含む
置換基、あるいは抗原、抗体などのような生物活性部分
を含む置換基であり、 R₂は−CO₂ 、SO₃ であり、あるいは上記のような生物
活性部分を含む置換基であるが、ただし R,R₁,R₂,R₃およびR₄の少なくとも一つは生物活性部分を
含む置換基であることを条件とし、 Ａは結合体部分より生ずる電荷と釣合う対イオンまたは
対イオン群であり、ｘは０または１である〕 により表わされる新規螢光性結合体を提供することによ
り、本発明に従つて達成される。

結合体部分が全体として中性である場合には、対イオン
は必要でない。対イオンＡは生物学的に容認できる陰イ
オンまたは陽イオン、例えば塩化物、硫酸塩、ジフエニ
ルホスフエート、トリフルオロ酢酸塩、トリメチルアン
モニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのい
ずれでもよい。結合体部分が１より大きい正味全電荷を
もつとき、その電荷は１個以上の対イオンにより釣合わ
せることができることも明らかであろう。例えば、結合
体部分が＋２という正味全電荷をもつ場合には、これら
電荷は２個の塩化物イオンまたは１個の硫酸イオンによ
り釣合わせることができる。

本明細書および特許請求の範囲で用いた「親水基」とは
分子の水に対する溶解性を良くする基を意味する。本発
明に係る新規螢光性化合物中に取入れることのできる典
型的な適当な親水基には次のものが包含される：カルボ
ン酸（−COOH）；ポリエーテル、例えばOCH₂CH₂cOE
t（式中、ｃは１から20の整数である）より表わされる
もの、例えばポリエチレンオキシド；式−CH₂CHOHd
CH₂OH（式中、ｄは１から20の整数である）により表わ
されるポリアルコール類；−NR₅R₆〔式中、R₅とR₆は各
々独立して水素、アルキル、なるべくは１から６炭素原
子を有するアルキル、アリール（例えばフエニル）であ
る〕により表わされる第１級、第２級、または第３級ア
ミン、あるいはポリアミン、例えば スルホン酸（−SO₃H）；式CH₂ePO（OR₇）（OR₈）
（式中、ｅは１から８の整数であり、R₇およびR₈は各々
独立して水素、アルキル、なるべくは１から６炭素原子
を有するもの、またはアリール、例えばフエニルであ
る）により表わされるホスホン酸またはエステル類；
CH₂eOPO（OH）_２により表わされるホスフエート；式
CH₂eOPO（OH）（OR₉）（式中、R₉はアルキル、なる
べくは１から６炭素原子を有するアルキル、またはアリ
ール、例えばフエニルである）により表わされるホスフ
エートエステル；式CH₂ePO（OH）R₁₀（式中、R₁₀は
アルキル、なるべくは１から６炭素原子を有するアルキ
ルである）により表わされるホスフイン酸；−R₁₁−Ｂ
（OH）_２（式中、R₁₁はCH₂ｅまたはアリール、例え
ばフエニルである）により表わされるボロン酸；および
−R₁₁B（OH）R₁₀により表わされるボリン酸。以下にも
つと詳しく説明するが、本発明化合物は１個以上の同じ
親水基を含むことができ、あるいは１種より多くの異な
る型の親水基を含むこともできる。

式Ｉに包含される新規螢光性結合体は500nm以上の、典
型的には約500nmから約650nmまでの範囲内の発光極大を
もつ。

一般に本発明に係る新規結合体は少なくとも１個の生物
活性部分を含み、そして前記部分は染料の発色団に直接
付けてもよいし、あるいは２価の非発色性結合基を経て
染料発色団に付けてもよい。「非発色性結合基」という
用語は染料部分のスペクトル吸収特性に認めうる程のシ
フトを起こさないものを言う。従つて、式中のR,R₁,R₂,
R₃またはR₄のいずれかが生物活性部分を含む置換基であ
る場合には、このような置換基は染料部分を生物学的に
活性のある部分につなぐ２価の非発色性結合基を含みう
る。このような結合は非共役でなければならない。

生物活性部分は、例えば抗原、抗体、ハプテン、DNAプ
ローブ、Fabフラグメントなどのいずれでもよい。

染料分子に付けることのできるカツプリング基として有
用な典型的な官能基、ならびに標識された結合体中に非
発色性結合基を与えるようにこのようなカツプリング基
が反応できる生物活性部分の置換基は次の通りである： 他の多くの結合基を本発明結合体に取り入れることがで
きる。例えば、前述の親水基は実質的に非発色性であ
り、これらのあるものは誘導体に変えて適当な結合基と
して利用できる。例えば、−NH₂基は、これに生活活性
部分（BIO）を付ける結果としてアミド、即ち−NHCO−B
IOに変換できる。更に、もう一つの具体例では、結合基
に親水基を付けることができる。例えば、第１級アミン
の場合、水素原子の一つを前記のように生物活性部分を
付けることにより置き換え、他の水素原子は例えば−
（CH₂）₂PO₃H₂のような親水基により置き換えることが
できる。このようにして、結合基は染料部分を生物活性
部分に付けるための手段として役立つと同時に、またこ
れに親水基を付けることもできることは明らかであろ
う。その上、結合基は、例えば−NH−BIOおよび−PO
₂（OH）−BIOの場合には親水基としても機能しうる。

本発明に係る標識した螢光性結合体は、種々な応用に、
例えば螢光性標識を活性化するエネルギー移動機構に基
づく診断検定に役立つ。螢光染料部分は典型的には約50
0nmから約650nmまでの極大吸収（λmax）をもち、約15
〜20nmのストークスシフトを示し、そして約0.7〜0.8の
高い量子収率をもつ。これら染料部分は生物活性部分お
よび（または）可溶化基に対し幾つかの付着点を与える
ことも有利な点としてあげられる。このような可溶化基
の存在は、例えば血漿タンパク質といつた生物学的液体
中に存在する成分に対する結合体の望ましくない非特異
的結合を避けるために役立ちうる。

特に適当な具体例の記述 本発明に係る結合体の特に適当な一群は次の式： （式中、R₁₂,R₁₃,R₁₄およびR₁₅は同じかまたは異なる基
で、各々は独立して水素、親水基を含む置換基、例えば
前述したもののいずれか、あるいは生物活性部分を含む
置換基、例えば前述したもののいずれかであり、R₂,R₃,
AおよびＸは前に定義した通りである）により表わされ
る。

本発明に係る結合体のもう一つの特に適当な一群は次
式： （式中、R₂,R₃,R₁₂,R₁₃,R₁₄,R₁₅,Aおよびｘは前に定義
した通りである）により表わされる。

前述したように、本発明結合体における生物活性部分
は、螢光染料部分の種々の位置に付けることができる。
特に適当な一具体例においては、生物活性部分が置換基
R₂（式Ｉ′）内に含まれている。この生物活性部分は、
なるべくは式： により表わされるカルボキサミドピペラジニル誘導体で
ある結合を経て付けるのがよい。従つて、この特に適当
な具体例におけるR₂は次式： または により表わされる。この結合に対する生物活性部分の付
着は該部分上の適当な位置のいずれを経て行なつてもよ
い。例えば、生物活性部分がテオフイリンである場合、
これを３位または８位を経由する結合により付けること
ができる。

本発明に係る標識した結合体は多くの応用面のいずれか
に、例えば競合的結合検定あるいは免疫検定といつた診
断検定に、あるいは標識した試薬を使用する免疫応答反
応に用いられる。特に適当な一具体例を示すと、本結合
体は、例えばテオフイリン、フエニトインなどに対する
薬物検査の応用面に、あるいはチロキシン（T₄）のよう
なホルモン検査の応用面に使用される。本発明に係る結
合体の効用がわかる特定の検定法は公知であつて、例え
ば免疫測定検定法、競合的結合検定法などがあり、従つ
てこのような検定法の詳しい説明はここでは不要であろ
う。このような公知の診断試験、あるいは検定法におい
ては、生物学的反応あるいは相互作用の結果検知可能な
信号を発生する。例えば、多重層検定要素で行なわれる
典型的免疫検定では、血清あるいは全血のような体液か
らなる被検質（アナライト）含有試料を該要素の表面に
適用する。この液体は、典型的には濾過媒質に通過させ
て妨害種および（または）細胞を除去する。次に標識し
た生物活性結合体を含む層に拡散してその検定要素の特
定の方式に従つて免疫学的反応または相互作用を起こ
す。かわつてこの反応あるいは相互作用の結果試料液中
の被検質の関数である検知可能な信号を発生する。この
ようにして発生した信号は、余り精密化されていない装
置では、被検質の存在について単なる定性的な測定でし
かないかもしれないが、もつと精密化された装置では被
検質の半定量的測定ができる。このような系において
は、検知できる信号の発生部分を含む生物学的に活性の
ある結合体は、いわゆる標識タンパク結合体、即ち染料
部分で「標識された」あるいは該部分を含有する抗原、
抗体あるいはFabフラグメントといつたタンパク質であ
る。

本発明に係る一つの典型的な多重層検定要素は支持層
（これは透明でよい）からなつていて、本発明標識結合
体を含む少なくとも一つの試薬層を有する。またこの試
薬層（複数のこともある）には、特定の検定法に対して
開発される特別な信号発生系に必要な他の試薬も具えて
いる。これら要素はまたこの分野で公知の種々な機能を
与えるための他の層、例えば試料を受け入れ、試料成分
を下方にある試薬層（複数のこともある）に均等に分布
させる層；信号発生種が位置する層を要素の他の層から
分離して信号検出に望ましくない妨害を防止することに
よつて信号検出を助けるための遮光層、あるいはスクリ
ーン層なども含むことができる。

本発明に係る結合体は細胞の螢光染色にも使用できる。
次に細胞を顕微鏡下で観察すると、螢光性結合体の存在
は特定の検定因部位の存在の指標となる。更に、この結
合体は螢光性活性細胞ソーターにおいて欠失、分離また
は他の応用面に対しても使用できる。

本発明結合体は当業者にとつて公知の反応により調製で
き、これらは下記の特定の例から明らかになるであろ
う。従って、このような方法の詳しい論議はここでは必
要でない。

本発明を特定の特に適当な具体例に関し例を示すことに
より更に詳細に記述することにする。これらの例は説明
することのみを意図するのであつて、例に記述された特
定の物質、組成物あるいは方法に本発明を限定するもの
ではないことは明らかであろう。

例 １ 95％エタノール75ml中７−ヒドロキシキノリン1.9g（1
3.0ミリモル）とPt₂O100mgとの混合物を一晩水素化し
た。ケイソウ土を通して混合物を吸引濾過し、濾液を減
圧下に蒸発させた。生じた赤褐色油状物は徐々に結晶化
し、下記生成物： を定量的収量で得た。この化合物を窒素下に暗所で貯蔵
した。¹ H NMR（CDCl₃,:δ1.85（quint.,2H,J＝6Hz）,2.65（t,
2H,J＝6Hz）;3.23（t,2H,6Hz）;4.65（b.s.,2H）,5.95
（d,1H,J＝3Hz）;6.1（dd,1H,J₁＝90Hz,J₂＝3Hz）,6.75
（d,1H,J＝9Hz）。M.S.（M⁺149）。

乾いたフラスコ中でこの粗製生成物（VII）（28ミリモ
ル）を未希釈のまま無水フタル酸4.16g（28ミリモル）
および融解ZnCl₂ 1.9g（14ミリモル）と混合し、生じた
混合物を油浴中150℃で窒素下に２時間加熱した。固体
塊を室温に冷却し、粉砕し、温水で抽出し、吸引濾過し
た。生じた赤色固体を250mlを18％HCl水溶液にとり、蒸
気浴上で加温し、数mlの濃HClを加えて溶解させた。こ
の溶液をゆつくり室温まで冷やし、次に冷凍器に２日間
貯蔵した。生じた結晶性生成物を吸引濾過し、過剰の1N
HClで洗浄し、真空乾燥して2.65g（収率42％）の化合
物： を紫色の粉末として得た。カリウムｔ−ブトキシドで滴
定したところこの生成物はビスHCl塩（M⁺410、遊離塩
基）であることが示された。

上記生成物（VIII）2.0gを乾燥DMF200ml中で窒素下で０
゜〜５℃においてかきまぜた溶液に、カリウムｔ−ビト
キシド（1.56g,13.9ミリモル）を一時に加えた。シアン
色が現われ、その後消散した。（注：カリウムｔ−ブト
キシドをシアン色が持続する点まで加え、次に更に１モ
ル相当量追加する方が一層便利なことが後にわかつ
た）。更に0.5g（4.5ミリモル）のカリウムｔ−ブトキ
シドを加え、生じたシアン色溶液を45分間かきまぜた。
この溶液にDMF10ml中ｔ−ブチルブロモアセテート2.2ml
（13.4ミリモル）の溶液を５分間にわたり滴加し、生じ
た混合物を室温まで加温した。次に溶媒を高真空下に除
き、その後残留物をCH₂Cl₂にとり、ケイソウ土を通して
濾過し、瀘液を蒸発させた。この生成物を溶離剤として
10％CH₃OH/CH₂Cl₂を使用するシリカゲル上のクロマトグ
ラフイーによつて精製し、2.0g（出率70％）の化合物： をマゼンタ色粉末として得た。¹ H NMR（CDCl₃）:1.5（s,18H）,1.9（m,4H）,2.55（t,4
H,J＝6Hz）,3.4（t,4H,J＝6Hz）,3.4（t,4H,J＝6Hz）,
3.9（bs.,4H）,6.23（s,2H）,6.34（s,2H）,7.1−7.2
（m,1H）,7.5−7.75（m,2H）,8.0−8.2（m,1H）。

DMF10ml中化合物（IX）370mg（0.58ミリモル）と次の化
合物： （このものは、対応する８−カルボキシプロピルテオフ
イリンとピペラジンとからトリメチルアセチル混合無水
物カツプリングを経てつくつた）193mg（0.58ミリモ
ル）との混合物を−30℃に冷却した。窒素下でかきまぜ
た溶液にジフエニルホスホリルアジド（160μ,0.75ミ
リモル）を加え、浴をゆつくり室温まで温めた。４日後
溶液を過剰のエチルエーテル中に注入し、液体を油状物
からデカンテーシヨンし、10〜15％CH₃OH/CH₂Cl₂を用い
るシリカゲル上でこの油状物のクロマトグラフイーを行
ない下記化合物： 421mg（収率61％）をジフエニルホスフエート塩（Ｘ＝
（PhO）₂PO₂ ^-）、（m/e＝956FAB⁺）として得た。¹ H NMR（CDCl₃）は複雑だが、生成物の構造と一致し
た。

CH₂Cl₂ 10ml中化合物（XI）421mg（0.35ミリモル）の溶
液を約５℃に冷却し、2mlのトリフルオロ酢酸で処理し
た。生じた混合物を窒素下に30分間、次に室温で一晩か
きまぜた。溶媒を蒸発させて生成物を単離し、溶離剤と
して15％〜30％CH₃OH/10％AcOH/CH₂Cl₂を用いるシリカ
ゲル上のクロマトグラフイーにより精製して望む結合
体： （式中、Ｒ′は−OHであり、Ｒ″は−Ｏ である）を吸
湿性固体として収率63％で得た。（M⁺843）。¹H NMR（C
D₃OD,CDCl₃）は複雑ではあるが、対イオンが内部カルボ
キシレートイオンと釣合つた構造と一致した。λmax（p
H7緩衝液）568nm（ε＝107,073）。

元素分析:C₄₅H₄₆N₈O₉・（H₂O）_４に対する計算値:C,59.
07％,H,5.95％,N,12,25％。実測値:C,59.26％,H,5.71
％,N,12,25％。

例 ２ 結合対XIII〔式XII中、Ｒ′は−NH（CH₂）₂SO₃Hで、
Ｒ″は−NH（CH₂）₂SO₃ である〕およびXIV〔式XII
中、Ｒ′＝Ｒ″で、各々は−Ｎ（CH₃）CH₂（CHOH）₄CH₂
OH〕を、XIIからそれぞれタウリンおよびＮ−メチル−
ｄ−グルカミンとのジフエニルホスホリルアジド（DPP
A）カツプリングを経て合成した。このようにして、１
ミリモルのXIIを乾燥DMF1/2ml中タウリン３ミリモル
（あるいはＮ−メチル−ｄ−グルカミン３ミリモル）お
よびトリエチルアミン（タウリンの場合には５ミリモ
ル、Ｎ−メチル−ｄ−グルカミンの場合には２ミリモ
ル）と混合した。この冷却した溶液（−30℃）にDPPA3
ミリモルを一時に加え、浴を徐々に室温まで加温し、一
晩かきまぜた。真空で蒸発させることにより生成物を単
離し、逆相クロマトグラフイーにより精製した。

結合対XIIIはλmax（pH7緩衝液）558nm（ε＝74,900）
を示し、結合体XIVはλmax（pH7緩衝液）555nm（ε＝6
0,300）を示した。

例 ３ N₂ガス導入口を具えた100ml丸底フラスコ（火に当てて
からN₂中で冷却）に、ビスローダミンHCl塩（VIII）2.0
g（4.1×10^-3モル）を乾燥DMSO（3Aシーブ上48時間）50
mlと共に加えた。フラスコを室温で水浴に浸し、次に1.
89g（1.68×10^-2モル）のカリウムｔ−ブトキシド塩を
かきまぜながら一時に加えた。赤−菫色反応混合物を室
温で２時間かきまぜた。プロパンスルトン（2.54g,2.08
×10^-2モル）を一時に加え、反応混合物を室温で更に14
時間かきまぜた。粗製反応混合物を高真空下で蒸発さ
せ、生ずる固体をCH₃CNと次にエチルエーテルとすりま
ぜた後、逆相支持体（Journal of Organic Chemistry,4
8,1983,3589頁に従つて調製したC₁₈シリカ）と溶離剤と
しての30％CH₃OH/H₂Oを使用するクロマトグラフイー精
製を行ない、次の式： により表わされるマゼンタ色粉末、トリス（３−スルホ
プロピル）ローダミン2.3g（収率72％）を得た。

生成物の構造は300MHz NMRスペクトルにより確認した。

このトリス（３−スルホプロピル）ローダミン（2.3g）
を1N NaOH水溶液30ml中で窒素下に１時間かきまぜた。
この溶液に30mlの1N HClを加え、次に高真空下で溶媒を
蒸発させた。生じた固体を少量の水に溶かし、C₁₈シリ
カパツドに加えた。水で洗浄して塩を除去した。望むビ
ス（３−スルホプロピル）ローダミンカルボン酸をCH₃O
H溶離によりパツドから採取し、溶媒を真空蒸発により
除去し、固体生成物をCH₃CNとすりまぜ、続いて真空乾
燥を行なつて1.67g（収率86％）のビス（３−スルホプ
ロピル）ローダミンカルボン酸（この化合物は吸湿性で
あり、窒素下で貯蔵しなければならない）を紫色粉末と
して得た。この化合物は次式： により表わされる。

火に当てて、N₂中で冷却した丸底フラスコにビス（３−
スルホプロピル）ローダミンカルボン酸（50mg,7.67×1
0^-5モル）を２〜3mlの乾燥DMFと共に加え、窒素下に室
温でかきまぜた。トリエチルアミン（64μ,46.4mg,4.
6×10^-4モル）、続いて塩化ピバロイル（28.2μ,27.6
mg,2.3×10^-4モル）を加え、混合物を２時間かきまぜ
た。一部分についてピペリジン失活を行なつてTLCによ
り反応を追跡した。生成した混合無水物にピペラジン
（66mg,7.67×10^-4モル）を加え、反応混合物を更に14
時間かきまぜた。次に溶媒を高真空下で除去し、粗製混
合物を、C₁₈シリカを用いるシリカゲルカラム上で溶離
剤として30％CH₃OH/H₂Oを用いて精製し、式： により表わされるビス（３−スルホプロピル）ローダミ
ンピペラジンアミドを得た。

生成物の構造はNMRスペクトルデータ（300MHz）により
確認した。定量分析は６水和物と一致した。この生成物
は容易に潮解するので高真空下か窒素下で貯蔵しなけれ
ばならない。

火に当てて、N₂中で冷却した丸底フラスコ中で、窒素下
に塩化ピバロイル（14.5μ,14.5mg,1.20×10^-4モル）
およびトリエチルアミン（16.7μ,12.1mg,1.20×10^-4
モル）を、乾燥DMF6ml中０℃で３−（カルボキシプロピ
ル）テオフイリン（28.6mg,1.20×10^-4モル）に添加す
ることにより、３−（カルボキシルプロピル）テオフイ
リン（Jour.of Org.Chem.,45（９）,1980,1711頁に記述
された手順に従つて調製）の混合無水物をつくつた。混
合物を０℃で１1/2時間かきまぜ、次に火に当てて、N₂
中で冷却した別の丸底フラスコにビス（３−スルホプロ
ピル）ローダミンピペラジンアミド（43.4mg,6.01×10
^-5モル）を入れこれに窒素下で上記混合物を移した。反
応混合物を室温で12時間かきまぜた。薄層クロマトグラ
フイーにより反応が不完全であることが判つたので、反
応混合物に更に２当量の混合無水物を加えた。溶媒を高
真空下で除去し、粗製生成物を前述の手順に従い溶離剤
として40％CH₃OH/H₂Oを用いるクロマトグラフイーによ
り精製し、式： （式中、BIOは である）により表わされるローダミン/3−（カルボキシ
プロピル）テオフイリン結合体40mg（収率68.7％）を得
た。

生成物の構造は300MHz NMRスペクトルにより確認され
た。m/e＝958FAB⁺。

例 ４ Cal Biochemから得られるＬ−チロキシンナトリウム塩
（200mg,0.25ミリモル）をDMF2ml中室温で窒素下にかき
まぜた無水酢酸（24μ,0.25ミリモル）の溶液に加え
た。次に、トリエチルアミン（35μ,0.25ミリモル）
を加え、生じた混合物を一晩かきまぜた。溶媒を高真空
下で除去し、残留物を2mlのCH₃OHにとり、次にかきまぜ
ながら1N HClを滴加して白色沈澱を生成させた。上澄液
をデカンテーシヨンし、固体を真空下で乾燥して式： を有する化合物180mg（収率88％）を得た。¹ H NMR（CD₃OD−CDCl₃）;2.02（s,3H）,2.8−3.2（m,2
H）,4.70（b.t.,1H,J＝7Hz）,7.1（s,2H）,7.7（s,2
H）;M.S.（M⁺819）。

DMF2ml中XIX180mg（0.22ミリモル）およびトリエチルア
ミン（34μ,0.24ミリモル）の０゜〜５℃でかきまぜ
た溶液に塩化トリメチルアセチル（30μ,0.24ミリモ
ル）を滴加した。生じた混合物を窒素下に１時間かきま
ぜ、次にDMF1ml中ピペラジン95mg（1.10ミリモル）の冷
溶液中に滴加した。混合物を室温まで温め、２時間かき
まぜてから蒸発乾固した。残留物をCH₃OHとすりまぜ、
濾過し、H₂Oとすりまぜ、濾過し、乾燥して次の化合物 M.S.（M⁺887）。

41mg（収率21％）を得た。

DMF1ml中IX（41mg,0.064ミリモル）およびXX57mg（0.06
4ミリモル）の混合物を窒素下に−30℃で18μ（0.083
ミリモル）のジフエニルホスホリルアジドにより一時に
処理した。生じた混合物を室温まで温め、一晩かきまぜ
た。揮発性物質を高真空下で除き、残留物を10％AcOH/2
0％CH₃OH/CH₂Cl₂を用いるシリカゲル上のクロマトグラ
フイーにかけ12mg（収率13％）の結合体:XXII（XXI） （式中、Ｒ′＝Ｒ″、各々は−OC（CH₃）_３であり、Ｘ
はジフエニルホスフエートである）を得た。XIIについ
て使用したのと同じ手順に従つて、XXIIから結合体XXII
I（XXI、但しＲ′は−OH、Ｒ″はＯ である）がつくら
れた。

例 ５ １−（カルボキシエチル）フエノバルビタール（50mg,
1.64×10^-4モル）を乾燥DMF2mlにN₂下にかきまぜながら
溶かした。この溶液を氷水浴中で冷却し、トリエチルア
ミン（25μ,1.75×10^-4モル）を一時に加えた。この
混合物に塩化ピバロイル（22μ,1.75×10^-4モル）を
一時に加えた。数分以内に沈澱が観察され、この混合物
を５℃で１時間かきまぜた。次に混合物を乾燥DMF5ml中
ピペラジン（70.6mg,8.20×10^-4モル）の溶液にN₂下で
かきまぜながらゆつくり滴加した。この反応混合物を氷
水浴中で冷却しつつ１時間、次に室温で１時間かきまぜ
た後室温で高真空下に溶媒を濃縮した。半固体残留物を
シリカゲルカラム上に加え、10％CH₃OH/1％NH₄OH/CH₂Cl
₂で溶離した。望む生成物フラクシヨンを真空下で濃縮
して45.1mg（収率74％）の化合物： を得た。

乾燥DMF2ml中IX78mg（1.21×10^-4モル）の溶液（〜３℃
に冷却）にトリエチルアミン（19μ,1.33×10^-4モ
ル）を一時に加えた。この溶液に塩化ピバロイル（17μ
,1.33×10^-4モル）を冷却しつつ一時に加えた。殆ど
直ちに沈澱が見られ、混合物を低温で１時間かきまぜ
た。次に混合物を乾燥DMF2ml中XXIV45mg（1.21×10^-4モ
ル）およびトリエチルアミン（19μ,1.33×10^-4モ
ル）の溶液に急いで滴加した。生じた溶液を低温で１時
間、室温で１時間かきまぜた。次に溶液を高真空下で固
体になるまで濃縮した。この固体をシリカゲルカラム上
で酢酸エチル／アセトン1:1で溶離することにより精製
し、未反応染料（24mg,31％）を回収した。

10％CH₃OH/CH₂Cl₂で溶離し65.3mg（54.3％）の化合物： XXVI（XXV、ただしＲ′＝Ｒ″、そして各々は−OC（C
H₃）_３であり、Ｘは塩化物イオンである）を得た。

化合物XXVI（65.3mg,6.57×10^-5モル）をトリフルオロ
酢酸1.5ml中窒素下に室温で１1/2時間かきまぜ、次に溶
媒を真空で濃縮した。この残留物を逆相シリカゲル上に
入れ、40％CH₃OH/H₂Oで次に60％CH₃OH/H₂Oで溶離して生
成物の混合物を含む多数のフラクシヨンを得た。逆相シ
リカゲルでRf＝0.79を示すフラクシヨンを真空下で濃縮
し乾燥して6.1mgのXXVII（XXV、ただしＲ′は−OH、
Ｒ″は−Ｏ である）を得た。その後の合成実験で普通
の相のシリカゲルから10％CH₃OH/10％HOAc/CH₂Cl₂で溶
離する方がより良い回収量が得られることがわかつた。

例 ６ 氷酢酸40mlを含むフラスコを氷水浴中で冷却し、1.9g
（0.03モル）の水素化シアノホウ素ナトリウムをかきま
ぜながらかつ絶えず冷却しつつ滴加した。H₂の放出が止
んだ後、1.0g（0.0075モル）の４−ヒドロキシインドー
ルを加え、生じた溶液を室温で３時間かきまぜた。

次に反応混合物をH₂O400ml中炭酸ナトリウム50gのかき
まぜた溶液にゆつくり注入した。粗製生成物を酢酸エチ
ルで抽出した。回転蒸発器で溶媒を除去し、残留物をシ
リカゲル上でクロマトグラフイーにかけ（10％EtOAc/CH
₂Cl₂）式： の４−ヒドロキシインドリン（XXVIII）723mg（71％）
を白色粉末として得た。¹ H NMR（CDCl₃）：δ2.83（t,2H）,3.43（t,2H）,5.13
（b.s.,1H）,5.9−6.1（m,2H）,6.77（t,1H）,8.80（s,
1H）m/e＝135。

乾燥トルエン20ml中にモノ−メチルスクシネート1.6g
（12.1ミリモル）を懸濁した液を室温でかきまぜ、水素
化ホウ素ナトリウム140mg（3.7ミリモル）を加えた。ガ
ス放出は観察されなかつた。この懸濁液を100mg（0.74
ミリモル）のXXVIIIで処理し、反応混合物の温度をゆつ
くり60℃に上げた。この時間中にガス放出が始まり完全
に溶解した。

60゜で２時間後、反応溶液を室温まで冷やし、次に200m
lの食塩水中に入れて失活させ、生成物をEtOAcで抽出し
た。溶媒を回転蒸発器で除いて粗製生成物を得、これを
シリカゲル上でクロマトグラフイーにかけた５％EtOAc/
CH₂Cl₂）。生成物を含むフラクシヨンを合わせて蒸発さ
せ残留白色固体を得た。この固体をCH₂Cl₂に溶かし、５
％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し、次に蒸発させて35mg（20％）のXXIXを
色のうすい油として得た。

¹H NMR（CDCl₃）：δ1.89（q,2H）,2.39（t,2H）,2.75
−3.2（m,4H）,3.37（t,2H）,3.63（s,3H）5.95−6.15
（m,2H）,6.88（t,1H）m/e＝236（FAB⁺）。

化合物XXIX（32mg,0.14ミリモル）を乾いたフラスコ中
で無水フタル酸（20.1mg,0.14ミリモル）および融解ZnC
l₂（9mg、0.07ミリモル）と未希釈で合わせ、得られた
混合物を油浴中150℃で窒素下に２時間加熱した。生じ
た赤色反応物を室温まで冷却し、次に溶離剤として３％
MeOH〜５％MeOH/CH₂Cl₂を使用してシリカゲル上でクロ
マトグラフイーを行なつた。生成物を含むフラクシヨン
を合わせ、蒸発させて18mg（45％）のXXXを紫色固体と
して得た。

¹H NMR（CDCl₃＋CD₃OD）：δ1.97（m,4H）,2.40（t,4
H）,3.3−3.7（m,8H）,3.63（s,6H）,4.03（t,4H）,6.5
7（d,2H,J＝9Hz）,7.02（d,2H,J＝9Hz）,7.3（m,1H）,
7.75（m,2H）,8.3（m,1H）。m/e＝583。

DMF1.5ml中XXX18mg（0.031ミリモル）および化合物X10.
3mg（0.031ミリモル）の混合物を−30℃に冷却した。窒
素下でかきまぜた溶液にジフエニルホスホリルアジド
（10mg,0.036ミリモル）を加え、反応混合物をゆつくり
室温まで温め、次に60時間かきまぜた。溶媒を高真空下
で除去し、紫色の残留物をシリカゲル上でクロマトグラ
フイーにかけ（５％MeOH〜15％MeOH/CH₂Cl₂）32mg（91
％）のXXXIを紫色固体として得た。

¹H NMR（CDCl₃＋CD₃OD）は複雑だが、生成物の構造と一
致した。

エタノール2ml中XXXI30mg（0.026ミリモル）の溶液を0.
1N NaOH1.0mlで滴加処理し、TLCにより加水分解の完了
が示されるまで生じた溶液を窒素下に30℃で加熱した
（約２時間）。過剰の溶媒を高真空下で除いた。残留物
を５％HOAc溶液とかきまぜ、過剰の溶媒を再び真空下で
除去した。粗製生成物を溶離剤として10％〜20％MeOH/5
％HOAc/CH₂Cl₂を用いてシリカゲル上でクロマトグラフ
イーを行なうことにより精製し、14mg（62％）の結合体
XXXIIを紫色粉末として得た。

m/e＝872（FAB⁺）。

可視スペクトル：λmax（pH7緩衝液）:600nm,ε＝5800
0。¹ H NMR（CD₃OD＋CDCl₃）は複雑であるが、対イオンが内
部カルボキシレートと釣合つた構造と一致した。

例 ７ 本発明の生物学的螢光結合体の効用を更に説明するため
チロキシン（T₄）免疫検定を実施した。この検定に次の
試薬を用いた。

試薬Ａ溶液:HEPES緩衝液（pH7.2）50ミリモル;Na₂ EDTA
10ミリモル;8−アニリノ−ナフタレンスルホネート（AN
S）0.02％、牛血清アルブミン（BSA）0.1％；およびNaN
₃0.05％。

試薬Ｂ溶液：試薬Ａと５％ポリエチレングリコール（PE
G、NW6000）。

校正溶液はそれぞれ試薬A1μ当りT₄1,25,50,100,200
および400ngを含むように調製した。これら校正溶液（2
00μ）を各々200μのマウスモノクローン抗−T₄抗
体（Behringwerke Ag 49/7）、試薬Ａ中Ig G0.15ミリモ
ル、および試薬Ａ中結合体0.17ミリモルの溶液200μ
と混合した。混合物を室温で60分間インキユベーシヨン
した。その後、試薬Ｂ中２％マウス正常血清200μお
よび試薬Ｂ中ヤギ抗マウスIg G抗体（Calbiochem Cat.N
o.401210の1/16希釈）200μを加え、混合物を更に室
温で15分間インキユベーシヨンした。

次に混合物を3000gで15分間遠心し、上澄液をデカンテ
ーシヨンした。上澄液中の遊離結合体の螢光をPerkin E
lmer MPF 44螢光光度計で565nmで励起させて測定し、59
0nmにおける発光を測定した。表Ｉは得られた結果を示
す。 表 Ｉ チロキシン（ng/μ） 遊離結合体（％） 1 19.0 25 25.4 50 39.8 100 71.8 200 84.2 400 87.0 標準曲線は関心のある70〜110ng T₄/ml範囲でい用量レ
スポンスを示した。

本発明を特定の特に適当な具体例に関心して記述して来
たが、これら具体例に制限しようとする意図はなく、む
しろ当業者は行ないうる変更および修正が本発明の主旨
と特許請求の範囲の中にあることを認識するであろう。
例えば、結合体のローダミン標識部分の環は、開示され
た可溶化基で適宜更に置換できる。従つて、本発明結合
体の有利な特徴を有する類似体は特許請求の範囲の目的
に沿つて本発明と同等と見做すものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メネギニ，フランク，エイ. アメリカ合衆国 02174 マサチューセッ ツ州 アーリントン，クレアモント アベ ニュー 123 (72)発明者 パラムボ，ポール，エス. アメリカ合衆国 02165 マサチューセッ ツ州 ウェスト ニュートン，チェリィ ストリート 271 (72)発明者 ストラウド スチーブン ジー. アメリカ合衆国 02155 マサチューセッ ツ州 メッドフォード，ダンバー アベニ ュー 15 (56)参考文献 米国特許4622400（ＵＳ，Ａ) 欧州公開50684 Ｃｈｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ．３（1985）Ｐ. 359−370 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ｖｏｌ．55，Ｎｏ．４（1983）Ｐ. 498Ａ−514Ａ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】蛍光診断検定法において、被検物質を含む
   と推測される試料；該被検物質の結合パートナー；およ
   び該被検物質もしくはその類似体と蛍光性化合物との結
   合体を検定媒質中で合わせ、該結合体は式： または、 （式中、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅は各々独立して水
   素、またはカルボン酸、ポリエーテル、ポリアルコー
   ル、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、ホスホン酸エス
   テル、ホスフェート、ホスフェートエステル、ホスフィ
   ン酸、−Ｂ（OH）_２で表されるボロン酸および−Ｂ（O
   H）R₁₀（R₁₀はアルキルを示す）で表されるボリン酸か
   らなる群より選ばれた親水基を含む置換基、または該被
   検物質もしくはその類似体を含む置換基であり； R₂は−CO₂ 、−SO₃ または該被検物質もしくはその類
   似体を含む置換基であり； ただしR₂、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅の一つは前記被
   検物質もしくはその類似体を含む置換基であり、R₃、R
   ₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅の少なくとも１つは上記親水基
   を含む置換基であり； Ａは結合体部分の全電荷と釣り合う対イオンあるいは対
   イオン群であり;xは０または１であり； 上記式中の蛍光染料部分は約500nmから約650nmまでの極
   大吸収（λmax）をもち、約15〜20nmのストークスシフ
   トを示し、そして約0.7〜0.8の量子収率をもつ。）によ
   り表され；結合した該結合体をフリーの該結合体から分
   離し； 結合した該結合体もしくはフリーの該結合体の蛍光信号
   のレベルを測定し；次いで該試料中の該被検物質の量と
   該信号レベルとを関係付けることからなる上記検定法。
2. 【請求項２】R₂が前記被検物質もしくはその類似体を含
   む置換基である請求項第１項記載の検定法。
3. 【請求項３】R₁₃は親水基を含む置換基である、請求項
   第１項または第２項記載の検定法。
4. 【請求項４】生物学的液体試料を受け入れて該液体中に
   存在するかもしれない被検物質の関数として検知しうる
   信号を与えるようにつくられた診断検定要素において、
   該検定要素は式： または （式中、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅は各々独立して水
   素、またはカルボン酸、ポリエーテル、ポリアルコー
   ル、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、ホスホン酸エス
   テル、ホスフェート、ホスフェートエステル、ホスフィ
   ン酸、−Ｂ（OH）_２で表されるボロン酸および−Ｂ（O
   H）R₁₀（R₁₀はアルキルを示す）で表されるボリン酸か
   らなる群より選ばれた親水基を含む置換基、または抗
   原、抗体、ハプテン、FabフラグメントおよびDNAプロー
   ブからなる群より選ばれた生物活性部分を含む置換基で
   あり； R₂は−CO₂ 、−SO₃ または該生物活性部分を含む置換
   基であり； ただしR₂、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅の一つは該生物
   活性部分を含む置換基であり;R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄および
   R₁₅の少なくとも１つは上記親水基を含む置換基であ
   り； Ａは該結合体部分の全電荷と釣り合う対イオンあるいは
   対イオン群であり； ｘは０または１であり； 上記式中の蛍光染料部分は約500nmから約650nmまでの極
   大吸収（λmax）をもち、約15〜20nmのストークスシフ
   トを示し、そして約0.7〜0.8の量子収率をもつ。）によ
   り表される蛍光性結合体を含む上記診断検定要素。
5. 【請求項５】R₂は生物活性部分を含む置換基である、請
   求項第４項記載の検定要素。
6. 【請求項６】R₁₂は親水基を含む置換基である、請求項
   第４項または第５項記載の検定要素。
7. 【請求項７】少なくとも一つの試薬層をもつ支持体を含
   む、請求項第４項から第５項のいずれか１項記載の検定
   要素。
8. 【請求項８】結合体中に存在する生物活性部分の結合相
   手を含む、請求項第４項から第７項のいずれか１項記載
   の検定要素。
9. 【請求項９】式： または （式中、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅は各々独立して水
   素、またはカルボン酸、ポリエーテル、ポリアルコー
   ル、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、ホスホン酸エス
   テル、ホスフェート、ホスフェートエステル、ホスフィ
   ン酸、−Ｂ（OH）_２で表されるボロン酸および−Ｂ（O
   H）R₁₀（R₁₀はアルキルを示す）で表されるボリン酸か
   らなる群より選ばれた親水基を含む置換基、または抗
   原、抗体、ハプテン、FabフラグメントおよびDNAプロー
   ブからなる群より選ばれた生物活性部分を含む置換基で
   あり； R₂は−CO₂ 、−SO₃ または該生物活性部分を含む置換
   基であり； ただしR₂、R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およびR₁₅の一つは前記生
   物活性部分を含む置換基であり;R₃、R₁₂、R₁₃、R₁₄およ
   びR₁₅の少なくとも１つは上記親水基を含む置換基であ
   ることを条件とし； Ａは該結合体部分の全電荷と釣り合う対イオンまたは対
   イオン群であり； ｘは０または１であり； 上記式中の蛍光染料部分は約500nmから約650nmまでの極
   大吸収（λmax）をもち、約15〜20nmのストークスシフ
   トを示し、そして約0.7〜0.8の量子収率をもつ。）によ
   り表される蛍光性結合体。
10. 【請求項１０】R₂は、前記生物活性部分を含む置換基で
    ある、請求項第９項記載の蛍光性結合体。