JPH07196694A - プレｂ細胞増殖支持能を有する膜タンパクポリペプチド及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 プレＢ細胞増殖支持能を有する新規膜タンパ
クポリペプチドをコードする遺伝子、及び１８０個のア
ミノ酸配列又はその一部を有するプレＢ細胞増殖支持能
を有する新規膜タンパクポリペプチド。該遺伝子を含有
するベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換体
を作製し、該形質転換体を培養することからなる該新規
膜タンパクポリペプチドの製造方法。該新規膜タンパク
ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体。 【効果】 上記遺伝子は、プレＢ細胞増殖支持能を有す
る膜タンパクをコードする。均一な新規膜タンパクポリ
ペプチドを大量に製造することが可能であり、更には、
該ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を製造す
ることが可能であり、慢性関節リウマチ（ＲＡ）の同定
及びこれらの臨床上の診断用試薬の作製が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子、及び該遺伝子
によってコードされる新規膜タンパクに関し、更に詳し
くは、プレＢ細胞増殖支持能を有する新規膜タンパクポ
リペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベ
クター、該ベクターによる形質転換体、及び該遺伝子を
用いた新規膜タンパクポリペプチドの製造方法に関す
る。本発明は、更にプレＢ細胞増殖支持能を有する新規
膜タンパクポリペプチドを認識するモノクローナル抗体
に関する。

【０００２】本発明の遺伝子は、慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）患者の滑膜細胞上のプレＢ細胞増殖支持能を亢進す
る新規膜タンパクをコードする。本発明の遺伝子を適当
なベクターに挿入した後、常用の宿主細胞を形質転換す
ることにより、大量に均一なプレＢ細胞増殖支持能を有
する新規膜タンパクポリペプチドを製造することが可能
となる。このことから、本発明により、慢性関節リウマ
チ（ＲＡ）の同定及びこれらの臨床上の診断用試薬の作
製が可能となる。

【０００３】

【従来の技術】慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜や
滑膜液中の炎症細胞は末梢血由来であり、これらの細胞
の滑膜等への移行については完全に解明されていない
が、細胞に与えられる化学シグナルと細胞膜上のタンパ
ク（接着分子）との複雑な相互作用が関与していると考
えられている。

【０００４】関節炎におけるこれ等膜タンパクの重要性
については種々研究されている。例えば、慢性関節リウ
マチ（ＲＡ）患者の滑膜内層上や滑膜血管上にはＴ細胞
表面分子ＬＦＡ−１のリガンドであり、血管壁における
細胞の接着や遊出の両方に関与している細胞間接着分子
−１（以下ＩＣＡＭ−１）が発現していることが知られ
ている〔Ｈａｌｅ等；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．，３２：２２（１９８９）、及びＨａｙｎｅｓ等；
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ
ｏｌ．，１１：１６３（１９８９）〕。

【０００５】同様にＴリンパ球（特に記憶細胞）や単球
上に発現しているインテグリンＶＬＡ−４のリガンドで
ある血管細胞接着分子−１（以下ＶＣＡＭ−１）が慢性
関節リウマチ（ＲＡ）や変型性関節炎等の滑膜や線維芽
細胞様滑膜細胞上に発現していること〔Ｍｏｒａｌｅｓ
−Ｄｕｃｒｅｔ等；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：１
４２４（１９９２）〕、更にはＶＡＰ−１と呼ばれる膜
タンパクが滑膜の高内皮性小静脈に発現しており、この
タンパクは白血球の特異的認識構造として働いている可
能性が示唆されている〔Ｓａｌｍｉ等；Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５７，１４０７（１９９２）〕。

【０００６】本発明者は、Ｂ細胞の機能異常をきたす疾
患における骨髄微小環境の病的意義を明らかにすること
を目的に研究を進め、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者及
び多発性骨髄腫（ＭＭ）患者では、正常人と比較して、
骨髄由来ストローマ細胞のプレＢ細胞増殖支持能が亢進
していること、及びこの支持能には、プレＢ細胞とスト
ローマ細胞との直接接触が必須である等の知見を得たこ
とから、各々の患者のストローマ細胞をセルライン化
し、プレＢ細胞の増殖を促進する因子を有するストロー
マ細胞株（ＲＡＳＶ５−５，ＭＭＳＶ３−３）を樹立し
たところ、これらストローマ細胞株によるプレＢ細胞の
増殖支持には、既知のＳｔｅｍ ｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ
（ＳＣＦ）、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４、ＶＣＡＭ−１、
ＬＦＡ−１α，ＬＦＡ−１β、ＮＣＡＭ、ＥＬＡＭ−１
とは別の未知の接着因子が関与していることを見い出し
た〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：４０８８（１９９
２）〕。

【０００７】更には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の
滑膜細胞をセルライン化した滑膜細胞株ＳｙｎＳＶ６−
１４も、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の骨髄由来スト
ローマ細胞株ＲＡＳＶ５−５と同様に、プレＢ細胞増殖
支持能を有していることが示唆されたことから、これ等
の細胞株に反応し、プレＢ細胞増殖支持能を持たないヒ
ト骨髄由来ストローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１には反応し
ない新規モノクローナル抗体を得るとともに、その抗原
膜タンパク（Ｂｓｔ−１）をコードする遺伝子のクロー
ニングにも成功した（特願平５−１４１１７８号）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】一方、本発明者は、慢
性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細胞に発現してい
るが、正常由来細胞には発現していない膜タンパクを認
識する種々のマウスモノクローナル抗体の作製の過程
で、ＳｙｎＳＶ６−１４と反応するが、正常骨髄間質細
胞株ＮＦＳＶ１−１とは反応しない性質を有し、前述の
Ｂｓｔ−１とは異なる膜タンパクを認識する新規マウス
モノクローナル抗体ＲＳ３８を得た。次いで、更に、こ
のＲＳ３８抗体を用いて慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者
滑膜細胞株より作製されたｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、該ＲＳ３８と反応する新規膜タンパクを
コードするクローンを単離することに成功し、本発明を
完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、プレＢ細胞増殖支持
能を有する新規膜タンパクポリペプチド、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、
該ベクターによる形質転換体、及び該遺伝子を用いた新
規膜タンパクの製造方法を提供することを目的とするも
のである。

【００１０】更には、本発明は、プレＢ細胞増殖支持能
を有する新規膜タンパクを認識するモノクローナル抗体
の提供も目的の一つとするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明は、以下の（１）〜（７）からなる。 （１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列又はその
一部を有するリウマチ患者滑膜上に発現する新規膜タン
パクポリペプチド。

【００１２】（２）配列表の配列番号１に示すアミノ酸
配列又はその一部を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ。

【００１３】（３）配列表の配列番号２に示す塩基配
列、又はこれを一部置換、欠除もしくは付加した塩基配
列にハイブリダイズする塩基配列を有する前記（２）記
載のＤＮＡ。

【００１４】（４）前記（２）〜（３）のいずれかに記
載のＤＮＡを含有する組換えベクター。

【００１５】（５）前記（４）に記載の組換えベクター
により形質転換された原核又は真核宿主細胞。

【００１６】（６）前記（５）に記載の宿主細胞を培養
することを特徴とする配列番号１に示すアミノ酸配列又
はその一部を有するポリペプチドの製造方法。

【００１７】（７）配列表の配列番号１に示すアミノ酸
配列又はその一部を有するポリペプチドを認識するモノ
クローナル抗体。

【００１８】続いて、本発明について詳細に説明する。

【００１９】本発明のモノクローナル抗体は、基本的に
は、次のようにして作製することができる。すなわち、
本発明の抗体は、プレＢ細胞増殖支持能を有する慢性関
節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細胞を感作抗原として
使用して、通常の免疫法に従って免疫し、通常の細胞融
合法に準じて細胞融合させ、通常のクローン化法に準じ
てクローン化することによって作製することができる。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体の作製方法
は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、培
養細胞として樹立されている慢性関節リウマチ（ＲＡ）
患者の滑膜由来細胞株ＳｙｎＳＶ６−１４を使用し、該
感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）
を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、
得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、
その中からＳｙｎＳＶ６−１４を認識する本発明の抗体
を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とす
る抗体を回収する方法が好ましく例示される。

【００２１】前記モノクローナル抗体の作製方法におい
て、感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定
されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ
細胞との適合性などを考慮して選択するのが好ましく、
一般的には、マウス、ラット、ハムスター等が使用され
る。

【００２２】免疫は、一般的方法により、例えば、前記
慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜由来細胞株Ｓｙｎ
ＳＶ６−１４の培養細胞を哺乳動物に腹腔内注射等によ
り投与することにより行われる。より具体的には、ＰＢ
Ｓや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望
により通常のアジュバンドを併用して、動物に４〜２１
日毎に数回投与するのが好ましい。また、前記投与に際
しては通常の担体（シュレッバー）を採用することもで
きる。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に摘
出した脾細胞を使用するのが好ましい。

【００２３】前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
しての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知
の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６
５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８（１
９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃ
ｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１−７（１９７８）〕、ＮＳ
−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５
１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８：４
０５−４１５（１９７６）〕、ＳＰ２／０〔Ｎａｔｕｒ
ｅ，２７６：２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ
〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５：１−２１
（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１
４８：３１３−３２３（１９７８）〕、Ｒ２１０〔Ｎａ
ｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３（１９７９）〕等が
好適に使用される。

【００２４】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８
１）〕等に準じて行うことができる。

【００２５】より具体的には、前記細胞融合は、例え
ば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施され
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミ
エローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とす
るのが好ましい。前記細胞融合に用いる培地としては、
例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ
−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培
養に使用される通常の培地が使用可能であり、更に、牛
胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することも可能
である。

【００２６】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，００
０〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜
６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによっ
て行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心し
て上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とする
ハイブリドーマが形成される。

【００２７】該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例
えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及
びチミジンを含む培地）で培養することにより選択され
る。該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時
間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希
釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドー
マのスクリーニング及び単一クローン化が実施される。

【００２８】このようにして作製される本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することが可能であり、また液体窒素中で長
期保存することが可能である。

【００２９】該ハイブリドーマから本発明のモノクロー
ナル抗体を採取するには、該ハイブリドーマを常法に従
って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハ
イブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して
増殖させその腹水として得る方法などが採用される。前
者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法であ
り、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した方法
である。

【００３０】更に、前記の方法により得られる抗体は、
塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィ
ー等の通常の精製手段を利用して高純度に精製すること
ができる。

【００３１】このようにして作製される本発明のモノク
ローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫
測定法（ＥＩＡ）、蛍光抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫
学的手段により、抗原の新規膜タンパクを発現している
慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜細胞を高感度且つ
高精度をもって識別し、同定することを可能にするもの
である。

【００３２】本発明の遺伝子は、ヒトプレＢ細胞増殖支
持能を示す膜タンパクを発現する慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）患者の滑膜細胞等からｍＲＮＡを調製した後、既知
の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換することにより得ら
れる。このｍＲＮＡの供給源となる細胞としては、ハイ
ブリドーマＲＳ３８の免疫源として用いたＳｙｎＳＶ６
−１４の細胞株等があげられるが、これらの細胞株に限
らず、プレＢ細胞増殖支持能を有する膜タンパクを発現
している細胞であればいずれのものでもよい。尚、本発
明では、ＳｙｎＳＶ６−８を用いた。

【００３３】ｍＲＮＡを得るための全ＲＮＡの調製は、
グアニジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾
配遠心を行い〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４（１９７
９）〕、全ＲＮＡを得る方法や、バナジウム複合体のリ
ボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、
フェノール処理を行う〔Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｂｉｒｋｅ
ｎｍｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５１
４３（１９７９）〕方法の他、公知の手段を用いること
ができる。

【００３４】全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、オリゴ
（ｄＴ）を結合した担体、例えば、セファロースやセル
ロース等を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィー法かバッチ法により全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＮＡを回収することでできる。また、ショ糖密度勾配
遠心法等によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを更に精製する
こともできる。その他、いったんＲＮＡを調製せずに、
直接ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを得る方法や市販のキット
を用いた簡便な方法も使用することができる。

【００３５】上記の如くして得たｍＲＮＡから二本鎖ｃ
ＤＮＡを得るには、例えば、ｍＲＮＡを鋳型にして、
３′末端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）を
プライマーとして逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補
的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。

【００３６】ｍＲＮＡをアルカリ処理により分解、除去
した後、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ
断片等）処理後、Ｓ１ヌクレアーゼなどで処理するか、
直接ＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼ等で処理する
ことによっても二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる〔Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）、及びＧｕｂ
ｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｇｅｎｅ，２５：２６３
（１９８３）〕。最近、簡便なキットも市販されてお
り、これらを用いて二本鎖ｃＤＮＡを得ることもでき
る。

【００３７】このようにして得られたｃＤＮＡを適当な
ベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１等のＥ
Ｋ型プラスミドベクターやλｇｔ１０等のファージベク
ター等に組み込んだ後、大腸菌（Ｘ１７７６，ＨＢ１０
１，ＤＨ１，ＤＨ５など）等を形質転換してｃＤＮＡラ
イブラリーを得ることができる（例えば、前出の“Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”を参照）。

【００３８】一方、前述の方法で得た二本鎖ｃＤＮＡを
適当な発現ベクターに挿入することにより、他の原核生
物又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることができ
る。

【００３９】二本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるに
は、適当な化学合成ＤＮＡアダプターを付加し、予じめ
制限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡとＡＴＰ存
在下にＴ４ファージＤＮＡリガーゼで処理することによ
り行うことができる。

【００４０】本発明の発現ベクターは、複製起源、選択
マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナル等を含んでいる。

【００４１】哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモ
ーターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、シミアンウイルス（ＳＶ）４０等
のウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェー
ン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）等の細胞由来のプロモーターを用いればよい。例え
ば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎ等の方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１０８
（１９７９）〕に従えば、容易に実施することができ
る。

【００４２】複製起源としては、ＳＶ４０ポリオーマウ
イルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（ＢＰ
Ｖ）等の由来のものを用いることができ、選択マーカー
としては、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）Ｉ
ＩあるいはＩ（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒド
ロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を用いることがで
きる。

【００４３】宿主細胞として原核細胞を用いて目的の遺
伝子を形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来の
レプリコン、すなわち複製起源及び調節配列を含んでい
るプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよ
い。また、ベクターは、形質転換細胞に表現形質（表現
型）の選択性を付与することができるマーカー遺伝子を
持つものが望ましい。例えば、大腸菌の場合には、それ
を宿主とするベクターであるｐＢＲ３２２を用いて形質
転換することができる〔Ｂｏｌｉｖｅｒ等：Ｇｅｎｅ，
２：９５（１９７５）〕。該ｐＢＲ３２２は、アンピシ
リン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、
どちらかの耐性を利用することによって形質転換細胞を
同定することができる。

【００４４】原核宿主細胞の遺伝子発現に必要なプロモ
ーターとしては、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモータ
ー〔Ｃｈａｎｇ等：Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５（１
９７８）〕や、ラクトースプロモーター〔Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ等：Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）〕、
及びトリプトファンプロモーター〔Ｇｏｅｄｄｅｌ等：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，８：４０５７
（１９８０）〕、ｔａｃプロモーター等が好適なものと
してあげられるが、これらに限定されるものではない。

【００４５】本発明の発現系に用いる宿主のうち原核宿
主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、バシラス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が好適なものと
してあげられるが、これらに限定されるものではない。

【００４６】また、真核宿主細胞としては、例えば、サ
ッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核微生物が好適な
ものとしてあげられるほか、ＣＯＳ細胞、チャイニーズ
ハムター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細
胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ナマルバ細胞、ヒト胎
児腎細胞（２９３細胞）等のホ乳動物由来の細胞も好適
に用いることができるが、これらに限定されるものでは
ない。尚、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適
した培養条件を適宜選択して行えばよい。

【００４７】本発明のプレＢ細胞増殖支持能を有する膜
タンパクをコードするｃＤＮＡを単離するには、例え
ば、プレＢ細胞増殖支持能を指標とするか、抗体を用い
た直接発現クローニング等の方法を用いて行うことがで
きる。プレＢ細胞増殖支持能の測定は、マウスプレＢ細
胞株ＤＷ３４〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：
１７６７（１９８８）〕を用いて実施することができ
る。すなわち、２４穴プレートにプレＢ細胞増殖支持能
を有する膜タンパクを発現している細胞をサブコンフル
エント（概ね５０％密度が望ましい）になるまで培養
し、適量の放射線を照射した後、１穴あたり１〜２×１
０³ 個のＤＷ３４を添加し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中で５％ＣＯ₂ の条件下、３７℃で４
〜６日間程度培養する。各穴のＤＷ３４の生存細胞数を
トリパンブルー染色で調べることによって増殖支持能の
亢進の程度がわかる。

【００４８】本発明では、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患
者の滑膜細胞上の新規膜タンパクを認識するモノクロー
ナル抗体ＲＳ３８を用いたＦＡＣＳｃａｎによるフロー
サイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によ
り、膜タンパクを発現している形質転換体を選別し、そ
の形質転換体の作製に用いたプラスミドＤＮＡを細分化
して再度形質転換体を作製し、その形質転換体をフロー
サイトメトリーによりスクリーニングすることをくり返
すことによって、目的の遺伝子をクローニングすること
ができた。

【００４９】具体的には、形質導入された形質転換体
（２９３Ｔ細胞）を培養した後、０．０２％のＥＤＴＡ
を含むＰＢＳでプレートより剥がし、２％ＦＣＳ、０．
０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ緩衝液で
細胞を洗浄した後、１次抗体としてＲＳ３８と反応させ
る。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して未反応の１次抗
体を除去し、２次抗体のＦＩＴＣ標識抗体（ＦＩＴＣ標
識ヤギ抗マウスＩｇ抗体）と更に反応させた後、ヨウ化
プロピジウムによる染色で死亡細胞を識別し、生存細胞
をＦＡＣＳｃａｎで解析することによって、ＲＳ３８と
強く反応する形質転換体を選別した。

【００５０】更に、抗体と反応した形質転換体の作製に
用いたｃＤＮＡを含む大腸菌（ＤＨ５）をアルカリ処理
して目的遺伝子を含むプラスミド群を選別し、これらの
プラスミド群を更に幾つかのプラスミド群に小分けし
て、再度、２９３Ｔ細胞に形質導入させた後、前述のモ
ノクローナル抗体ＲＳ３８を用いたＦＡＣＳｃａｎ解析
による形質転換体の選択をくり返すことにより、配列表
の配列番号２に示される新規なプレＢ細胞増殖支持能を
有する膜タンパクポリペプチドをコードする完全長ｃＤ
ＮＡ（ｐＲＳ３８−ＢＯＳ）を得ることができた。

【００５１】尚、このｃＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターの
ＸｂａＩ切断部位間に挿入したｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９
を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株は、平成
５年（１９９３年）１０月５日付で工業技術院生命工学
工業技術研究所に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（ｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９），受託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４４３４としてブダペスト条約に従って国
際寄託されている。

【００５２】一般に、真核生物の遺伝子は、ヒトインタ
ーフェロン遺伝子等で知られているように、多形現象を
示すと考えられ〔例えば、Ｎｉｓｈｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，９７：１５３（１９８５）〕、この多形現象
によって１個又はそれ以上のアミノ酸が置換されている
場合もあれば、塩基配列の変化はあってもアミノ酸は全
く変わらない場合もある。

【００５３】また、配列表の配列番号１のアミノ酸配列
の中の１個又はそれ以上のアミノ酸を欠くか又は付加し
たポリペプチドあるいはアミノ酸が１個もしくはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでも本発明の新
規膜タンパクと同じ機能（プレＢ細胞増殖支持能）を有
することがある。例えば、ヒトインターロイキン−２
（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列を
セリンに相当する配列に変換して得られたポリペプチド
がＩＬ−２活性を保持することも既に公知となっている
〔Ｗａｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１４３１（１
９８４）〕。

【００５４】更には、既知タンパクの遺伝子と配列表の
配列番号２の遺伝子を適当な制限酵素又はアダプター等
を用いて連結させて、既知タンパクと結合したポリペプ
チドとして産生させることもできる。既知タンパクの遺
伝子としては、例えば、免疫グロブリンがあげられ、そ
の可変領域部分の代わりに配列表の配列番号２に示され
る遺伝子を用いて、Ｆｃ部分と結合させればよい〔（Ｚ
ｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ等，ＤＮＡ ＡＮＤ ＣＥＬＬ
ＢＩＯＬＯＧＹ，９：３４７−３５３（１９９０）〕。

【００５５】また、真核細胞で発現させた場合、その多
くは糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１ないしそれ以上
変換することにより糖鎖付加を調節することができる
が、この場合も本発明の新規膜タンパクポリペプチドと
同じ機能を有することがある。従って、前記の如き種々
の方法により本発明における膜タンパクポリペプチドを
コードする遺伝子を人工的に改変したものでも、得られ
たポリペプチドが本発明の膜タンパクポリペプチドと同
じ機能を有する限り、それらの遺伝子及びポリペプチド
は全て本発明に含まれることは云うまでもない。

【００５６】更に、配列表の配列番号２に示される遺伝
子とハイブリダイズする遺伝子も、その遺伝子から発現
されるポリペプチドが本発明の膜タンパクポリペプチド
と同じ機能（プレＢ細胞増殖支持能）を有する限り、そ
れらの遺伝子及びポリペプチドは全て本発明に含まれる
ことは云うまでもない。この場合、ハイブリダイゼーシ
ョンは、通常のハイブリダイゼーションの条件（例え
ば、前述の“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”を
参照）を用いて行うことができる。

【００５７】目的とするプレＢ細胞増殖支持能を有する
膜タンパクポリペプチドを製造するには、該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養
し、産生したポリペプチドを適当な可溶化剤で可溶化し
た後、分離、精製することによって、均一な可溶性の膜
タンパクポリペプチドを得ることができる。尚、可溶化
剤としては、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ
−４０），Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｐｈ
ａｔｅ（ＳＤＳ），Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，Ｔｗｅ
ｅｎ ２０等が好適なものとしてあげられる。

【００５８】また、可溶性の膜タンパクは、遺伝子工学
的に製造することもできる。すなわち、図３に示される
ごとく、ＲＳ３８は、Ｎ末端側に細胞膜貫通ドメイン及
び細胞内ドメインを持つ細胞膜貫通型蛋白質であると予
想されることから、配列表の配列番号１の４９番目のＡ
ｓｎをＮ末端とする可溶性ＲＳ３８をＰＣＲ−変異誘発
法〔Ｍ．Ｋａｍｍａｎ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１５：５４０４（１９８９）〕を用いて製造する
ことができる。その場合、シグナル配列としては、公知
のものを用いればよく、例えば、Ｂｓｔ−１（特願平５
−１４１１７８号）及びＧ−ＣＳＦ（特公平２−５３９
５号）のシグナル配列などがあげられる。

【００５９】該膜タンパクポリペプチドの分離、精製の
手段としては、通常の蛋白質で用いられる方法を適用す
ればよく、例えば、前述のモノクローナル抗体を用いた
アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグ
ラフィー、限外ろ過、塩析、透析等を適宜選択、組合わ
せて通常の方法に準じて分離、精製すれば、本発明の膜
タンパクのポリペプチドを分離、精製することができ
る。

【００６０】

【実施例】以下、参考例及び実施例によって本発明を詳
細に説明するが、この実施例によって本発明は何ら限定
されるものではない。

【００６１】参考例１ 健常人由来ストローマ細胞株の樹立 健常人のストローマ細胞にＳＶ４０のＬａｒｇｅ Ｔ抗
原ｃＤＮＡとニワトリβ−アクチンプロモーターを含む
ｐＡｃｔ−ＳＶＴプラスミド〔ＢＢＲＣ １８６：１２
９−１３４（１９９２）〕を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ
（ＢｉｏＬａｄ製）を用いてエレクトロポレーションし
た。すなわち、ＰＢＳ中の健常人のストローマ細胞１×
１０⁷ 細胞／ｍｌの０．８ｍｌアリコートと１０μｇの
プラスミドを混合し、１０分間氷中でインキュベートし
た後、２５０Ｖ、２５０μＦ静電容量の条件でエレクト
ロポレーションを行い、更に、１０分間氷中でインキュ
ベートした後、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に
懸濁し、１０ｃｍ培養皿にて培養した。培養液の交換は
３日おきに行い、約２週間後に生育のよい付着細胞のコ
ロニーをトリプシンを染み込ませた小片のろ紙にて取り
だし、健常人の骨髄由来ストローマ細胞株（ＮＦＳＶ１
−１）を得た〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：４０８
８（１９９２）〕。

【００６２】参考例２ 慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細胞株の樹立 慢性関節リウマチ（ＲＡ）由来の滑膜細胞にＳＶ４０の
Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原ｃＤＮＡとニワトリβ−アクチンプ
ロモーターを含むｐＡｃｔ−ＳＶＴプラスミド〔ＢＢＲ
Ｃ，１８６：１２９−１３４（１９９２）〕を、Ｇｅｎ
ｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＬａｄ製）を用いてエレクト
ロポレーションした。すなわち、ＰＢＳ中のＲＡ患者由
来の滑膜細胞１×１０⁷ 細胞／ｍｌの０．８ｍｌアリコ
ートと１０μｇのプラスミドを混合し、１０分間氷中で
インキュベートした後、２５０Ｖ、２５０μＦ静電容量
の条件でエレクトロポレーションを行い、更に、１０分
間氷中でインキュベートした後、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
（ＧＩＢＣＯ製）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿にて培養し
た。培養液の交換は３日おきに行い、約２週間後に生育
のよい付着細胞のコロニーをトリプシンを染み込ませた
小片のろ紙にて取りだし、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患
者由来滑膜細胞株（ＳｙｎＳＶ６−８及びＳｙｎＳＶ６
−１４）を得た。

【００６３】実施例１ モノクローナル抗体の作製 １）感作抗原と免疫法 感作抗原として、上記参考例２で得たプレＢ細胞増殖支
持能を有する慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細
胞株ＳｙｎＳＶ６−１４を用いて抗原感作を行った。細
胞株は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ製）、及び５０μＭ ２−メルカプトエタノール
含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ製）を培地として
使用し、５％ＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃の温度
条件下で継代培養を行った。

【００６４】細胞は、０．０２％ＥＤＴＡ、ＰＢＳ処理
後、軽いピペッティングによってインキュベーターの培
養フラスコより回収した。この細胞を約１×１０⁷ 個／
ｍｌの細胞数でＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、浮遊
させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス（４週令、♀、日本エスエ
ルシー社製）に免疫した。初回免疫には、約１×１０⁷
個／ｍｌの細胞をマウス腹腔内に注射し、２〜３週後に
１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞を追加免疫した。更に、２〜
３週間隔にて１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞を２〜３回追加
免疫し、最終免疫３日後にマウスを屠殺して脾臓を摘出
した。

【００６５】２）細胞融合 １匹のマウスから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細
胞を遠沈した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ
製）中に懸濁し、浮遊させ、充分に洗浄を行った。一
方、マウス・ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５
３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８（１９７
９）〕を、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ、ＦＩＬＴＲＯＮ
製）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ製）培地にて培養
して得た細胞を、同様に前記ＤＭＥＭ培地で洗浄後、そ
の１×１０⁷ 個と、前記脾細胞１×１０⁸ 個とを遠心管
に入れ混合し、ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ製）によって常法〔Ｃｌｉｎ．Ｅｘ
ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：４５８−４６２（１９８
０）〕に従い細胞融合させた。

【００６６】得られた融合細胞を、１０％ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培地にて９６個のウエルプレートに分注し、５
％ＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃で培養した。翌日
よりＨＡＴ選択培地（１．０×１０^-4Ｍヒポキサンチ
ン、４．０×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．６×１０^-5
Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０
％ＦＣＳ及び５０μＭ ２−メルカプトエタノールを加
えた培地）に徐々に置換させて培養を続けた。培養開始
後、上清の半分を週２回の頻度に、それぞれ新しいＨＡ
Ｔ培地に代え、培養を継続し、増殖維持させた。

【００６７】このようにして得られた融合細胞を限界希
釈法を用いてクローニングした。すなわち、前記融合細
胞の培養上清中の抗体を利用して、感作抗原との結合性
を調べ、感作抗原と強い結合性を有するクローンだけを
常法により限界希釈法を用いてクローンを形成させた。

【００６８】クローンの形成は、前記ハイブリドーマ及
びＢＡＬＢ／Ｃ系マウス脾細胞を所定量含むように調整
し、ハイブリドーマ１〜１０個／ウエルとなるように９
６ウエルのプレートに播いて、５％ＣＯ₂ インキュベー
ター中で３７℃にて培養した。増殖してくるハイブリド
ーマを同様にクローニングする操作を、通常の限界希釈
法に従って、理論上単一のクローンとなるまで繰り返し
た。目的の抗体を産生するクローンは、前記感作抗原を
用いてスクリーニングを行った。

【００６９】３）スクリーニング 融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フロ
ーサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を
使った間接蛍光抗体法により行った。目的の抗体を産生
するクローンのスクリーニングは、ターゲット細胞とし
て、 ａ）ＳｙｎＳＶ６−１４（感作抗原）、ｂ）正常ヒト骨
髄由来ストローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１、等を用いて行
った。すなわち、プレＢ細胞増殖支持能を有する慢性関
節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜由来細胞株（ＳｙｎＳＶ
６−１４）をＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに免疫することによ
り、ＳｙｎＳＶ６−１４と反応するがプレＢ細胞増殖支
持能を持たない正常ヒト骨髄由来ストローマ細胞株（Ｎ
ＦＳＶ１−１）とは反応しないことを指標としてモノク
ローナル抗体のスクリーニングを行った。最初のスクリ
ーニングは、反応細胞として感作抗原であるＳｙｎＳＶ
６−１４を用いて行った。先ず、ＳｙｎＳＶ６−１４に
反応する融合細胞クローンを選ぶために、該ＳｙｎＳＶ
６−１４に反応する培養上清を選別し、１次スクリーニ
ングを行った。

【００７０】すなわち、細胞を反応バッファー〔２％Ｆ
ＣＳ、０．０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢＳ〕に懸濁し、ハ
イブリドーマ培養上清２０μｌ中に浮遊させ（約５×１
０⁵個／２０μｌ）、４℃にて２０分間反応させた。前
記バッファーにより２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ
抗マウスＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ製）を加えて２０分間
インキュベーションした。３回洗浄した後、フローサイ
トメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＦＡＣ
Ｓｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）にて
解析した。

【００７１】次に、反応細胞として正常ヒト骨髄由来ス
トローマ細胞株ＮＦＳＶ１−１を用い、前記の如くフロ
ーサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に
より解析した。これによって、ＳｙｎＳＶ６−１４によ
り強く反応する抗体を産生しているハイブリドーマを得
た。

【００７２】このようにして、ＳｙｎＳＶ６−１４とは
反応するが、正常ヒト骨髄由来ストローマ細胞株ＮＦＳ
Ｖ１−１とは反応しない抗体を産生するハイブリドーマ
（ＲＳ３８）を分離した。このハイブリドーマが産生す
る抗体は、ＩｇＭ，κ型であった。

【００７３】尚、上記のモノクローナル抗体ＲＳ３８を
産生する当該ハイブリドーマは、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス
脾細胞とマウス・ミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
を親細胞として作製された新規な融合細胞であり、平成
５年（１９９３年）１０月５日付で公的微生物寄託機関
である工業技術院生命工学工業技術研究所に、Ｍｏｕｓ
ｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＲＳ３８，受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４４３３としてブダペスト条約に
従って国際寄託されている。

【００７４】４）抗体の精製 前記２）で作製した融合細胞を常法に従って培養し、培
養上清中に産生される抗体を常法により分離し、精製し
た。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原に対する抗
体価の最も高かったウエルからハイブリドーマを採取
し、細胞の増殖が認められたウエルのうち１つを取り、
得られた培養細胞を５％ＣＯ₂ 組織培養フラスコに広げ
て３７℃にて継代培養を行い、増殖させた。得られた細
胞をプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／Ｃ系マウス
（６週令，♀，日本エスエルシー社製）に腹腔内注入し
た。１０〜１４日後、産生された腹水を採取し、５０％
硫酸アンモニウムで塩析し、ＰＢＳで透析後、ＱＡＥカ
ラムにて精製を行った。抗体は、更に塩析し、充分に透
析を行い約６ｍｇ／ｍｌの精製品を得た。

【００７５】実施例２ モノクローナル抗体の性質 １）細胞株の分布 種々の細胞株（表１に示す各種セルライン）におけるＲ
Ｓ３８抗原の分布をＦＡＣＳｃａｎを用いて解析した。
すなわち、種々の細胞株を、１次抗体として実施例１で
得られたマウスモノクローナル抗体ＲＳ３８、１０μｇ
／ｍｌ存在下で２％ＦＣＳ、０．０２％ＮａＮ₃ を含む
ＰＢＳからなるＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、２０分間氷中
でインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄
後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体
（Ｃａｐｐｅｌ製）を使用し、更に１５分間氷中でイン
キュベートした。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉ
ｕｍＩｏｄｉｄｅ，ＰＩ）を最終濃度１μｇ／ｍｌとな
るように加え、更に５分間氷中でインキュベートした。
ＦＡＣＳ緩衝液にて３回洗浄後、前方散乱光にて細胞の
生死を識別し、生細胞のみをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）にて解析した。尚、対象
として、マウスモノクローナル抗体ＳＧ２及びＲＦ３
（特願平５−１４１１７８号）を使用した。その結果を
表１に示す。表１から明らかな如く、ＲＳ３８抗原の分
布は、ＳＧ２及びＲＦ３と異なるものであることがわか
った。

【００７６】

【表１】

【００７７】実施例３ １．ｃＤＮＡライブラリーの作製 １）ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製 慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来滑膜細胞株ＳｙｎＳ
Ｖ６−８細胞からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製は、
Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ^TM ｍＲＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯ
Ｎ ＫＩＴ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ製）を用いて実施した。すなわち、１０ｃｍ培養
皿２０枚分のＳｙｎＳＶ６−８細胞をホモジネートし、
キット添付の処方に従って全ＲＮＡを調製した。更に、
キット付属のオリゴｄ（Ｔ）セルロースを用いて、キッ
ト添付の処方に従ってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し
た。

【００７８】２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 上記ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ５μｇを材料としてｃＤＮ
Ａ合成キットＴｉｍｅＳａｖｅｒ^TM ｃＤＮＡ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用い
てキット添付の処方に従って二本鎖ｃＤＮＡを合成し、
ＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）をＤ
ＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い
てキット添付の処方に従って連結した。遊離のＢｓｔＸ
Ｉアダプターの除去はキット付属のＳｉｚｅ Ｓｅｐ
４００ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを用いてキット添付の
処方に従って行い、アダプター付加２本鎖ｃＤＮＡ約１
００μｌを得た。

【００７９】このようにして作製したアダプター付加２
本鎖ｃＤＮＡ約１００μｌのうち１回のＬｉｇａｔｉｏ
ｎ反応には２μｌを使用し、予じめ制限酵素ＢｓｔＸＩ
及びアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）処理した
ｐＥＦ−ＢＯＳベクター〔Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．，１８：５３２２（１９９０）〕とＤＮＡ ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、ｃ
ＤＮＡライブラリーを構築した。構築したｃＤＮＡライ
ブラリーは、大腸菌細胞株ＤＨ５（トーヨーボー社製）
に形質導入され、全体のサイズは約２×１０⁵ の独立し
たクローンであると推定された。形質導入した大腸菌
２，０００〜４，０００クローンからなるプールを５０
プール作製し、以下の実験に用いた。

【００８０】２．直接発現法によるクローニング １）２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション 上記のプールした大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢ培地〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕に
て培養することによりｃＤＮＡの増幅を行い、アルカリ
法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕により大腸菌からプ
ラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡ
は、塩化セシウム／臭化エチジウム密度勾配による超遠
心を２回繰り返すことにより精製度を高め、リン酸カル
シウム法により２９３Ｔ細胞〔２９３細胞（Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ
ｋｉｄｎｅｙ，ｈｕｍａｎ ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７
３）にＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原ｃＤＮＡを導入した細
胞株〕にトランスフェクションした。

【００８１】すなわち、精製したプラスミドＤＮＡ２μ
ｇを１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む１００μｌの緩衝液に溶解し、１４μｌの２Ｍ
ＣａＣｌ₂ を添加した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．１）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｓｏｄ
ｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅからなる緩衝液に徐々に混
合し、室温にて３０分間インキュベートし、２４穴プレ
ート中の２９３Ｔ細胞に添加した。２９３Ｔ細胞は、１
０％牛胎児血清（ＰＣＳ；Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）
を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ製）培地にて、３７℃、５
％ＣＯ₂ の条件下で２日間培養した。

【００８２】２）ＦＡＣＳｃａｎによる解析 形質導入した２９３Ｔ細胞は、０．０２％のＥＤＴＡを
含むＰＢＳにて２４穴プレートより剥がし、２％ＦＣ
Ｓ、０．０２％Ｎ_a Ｎ₃ を含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ
緩衝液にて２回細胞を洗浄した後、１次抗体として１０
μｇ／ｍｌの前記モノクローナル抗体ＲＳ３８存在下で
２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、２０分間氷中でイ
ンキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液にて２回洗浄後、２
次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｃａ
ｐｐｅｌ製）を使用し、更に１５分間氷中でインキュベ
ートした。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ
Ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）を最終濃度１μｇ／ｍｌとなるよ
うに加え、更に５分間氷中でインキュベートした後、Ｆ
ＡＣＳ緩衝液にて３回洗浄後、前方散乱光にて細胞の生
死を識別した後、生細胞のみをＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）にて解析した。

【００８３】３）ｃＤＮＡライブラリーのクローニング ２，０００〜４，０００クローンの大腸菌をひとつのプ
ールとしてアルカリ法にて回収されたプラスミドＤＮＡ
を前述の方法に従って２９３Ｔ細胞にトランスフェクシ
ョンし、上記ＦＡＣＳ解析によるスクリーニングを行っ
た。２５番目のプールを発現させた２９３Ｔ細胞に、マ
ウスモノクローナル抗体ＲＳ３８により強く染色される
ピークを認めた。本プラスミドＤＮＡのプールを再び大
腸菌ＤＨ５（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）に形質導入し、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢアガープレート
に接種した。

【００８４】コロニーを形成した約２，０００個のクロ
ーンをプレート底面に網目状に区分を入れ、接種したク
ローンの位置がわかるようにしたアガープレートに１０
０クローン／プレートとなるように一つずつ接種し、同
じものを２つ作製した。１００個のクローンを一つのプ
ールとして２０プール作製し、５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培地で大腸菌を培養した。アルカリ法
にてプラスミドＤＮＡを回収後、２９３Ｔ細胞にリン酸
カルシウム法によりトランスフェクションして前述と同
様にＦＡＣＳｃａｎ解析を行った。ＦＡＣＳｃａｎ解析
の結果、陽性と認められた一つのプールから大腸菌１０
０クローンを一つずつ単離してそれぞれのクローンを培
養し、アルカリ法にてプラスミドＤＮＡを回収した。各
プラスミドＤＮＡを２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウム法
によりトランスフェクションして前述と同様にＦＡＣＳ
ｃａｎ解析を行い、単一の陽性クローンを得て、ｐＲＳ
３８−ＢＯＳと命名した。

【００８５】本クローンについて、Ａｕｔｏ Ｒｅａｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
製）及びＡｕｔｏ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて、キット添
付の処方に従いシークエンス反応を行い、Ａ．Ｌ．Ｆ．
^TM ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に
て塩基配列の決定を行った。その結果、最長のＯｐｅｎ
Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅより１８０アミノ酸残基
をコードすると推定される全長９９６ｂｐ（配列表の配
列番号２）の遺伝子であり、遺伝子解析ソフトＧｅｎｅ
ｔｅｘを用いてデータベースＳＷＩＳＳ ＰＬＯＴ、及
びＮＢＲＬによるホモロジー検索を行った結果、新規の
遺伝子であった。

【００８６】４）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
ａｎａｌｙｓｉｓによる発現検討 ＲＡ患者由来滑膜細胞株ＳｙｎＳＶ６−１４、ＲＡ患者
由来骨髄間質細胞株ＲＡＳＶ５−５、及び正常ヒト由来
骨髄間質細胞株ＮＦＳＶ１−１よりＦａｓｔＴｒａｃｋ
^TM ｍＲＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＫＩＴ ｖｅｒｓ
ｉｏｎ ３．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてＰ
ｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂ
ｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８９）を行った。すなわち、１０ｃｍ培養皿１
０枚で培養したそれぞれの細胞株を回収し、ホモジネー
ト後、キット添付の処方に従って全ＲＮＡを調製した。
更に、キット付属のオリゴｄ（Ｔ）セルロースを用い
て、キット添付の処方に従ってＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ
を精製した。

【００８７】プローブの標識は、Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ
ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｙｔｅｍ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ製）を用いて行った。すなわち、ｐＥＦ−
ＢＯＳのＢｓｔＸＩ部位に挿入されたＲＳ３８をコーデ
ィングすると考えられるインサートを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩにより消化させて３１５ｂｐの断片を調製し、キ
ット添付の処方に従って標識プローブを作製した。Ｓｙ
ｎＳＶ６−１４、ＲＡＳＶ５−５、及びＮＦＳＶ１−１
より調製したＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを１レーンあたり
３μｇ使用し、アガロースゲル電気泳動を行った後、Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍ
ｂｒａｎｅとしてＧｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ^TM
（ＤＵＰＯＮＴ製）を使用し、キャピラリー法によりブ
ロッティングした。ハイブリダイゼイションは、０．５
Ｍ ＮａＰＯ₄ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、１％
ＢＳＡ、ｐＨ７．０の組成よりなるＧｉｌｂｅｒｔ＆Ｃ
ｈｕｒｃｈ ｂｕｆｆｅｒを用いて６５℃で一晩実施し
た。ハイブリダイゼイション終了後、メンブレンを２×
ＳＳＣで室温にて４回洗浄し、更に０．１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳにて５５℃で２回洗浄した後、Ｘ線フィ
ルムと重ねあわせて一晩オートラジオグラフィーを行っ
た。その結果、図１に示すようにＳｙｎＳＶ６−１４に
約１．０ｋｂの明瞭なバンドが検出された。

【００８８】３．ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞による発現 新規分子をＢＡＬＢ３Ｔ３細胞に導入し動物細胞での発
現を検討した。すなわち、２０μｇのｐＲＳ３８−ＢＯ
Ｓと２μｇのネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶ２ｎ
ｅｏ〔Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｅｔｈｅｍ ａｎｄ Ｐ．Ｂｅｒ
ｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７
（１９８２）〕を１×１０⁷ 細胞／ｍｌの０．８ｍｌの
アリコートに加え、１０分間氷中でインキュベートした
後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＬａｄ製）を用い
て、２５０Ｖ、２５０μＦの静電容量の条件にてトラン
スフェクションを行い、同時形質転導入した。

【００８９】更に、１０分間氷中でインキュベートした
後、細胞を２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び１０％ＦＣＳ
（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇ
ＩＢＣＯ製）に懸濁し、２４穴プレートにて培養した。
培養液の交換は３日おきに行い、約２週間後に生育のよ
いネオマイシン耐性付着細胞の単一のコロニーを形成し
ている穴より、前記マウスモノクローナル抗体ＲＳ３８
と反応する形質転換細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３ ３８−１、
３８−３及び３８−９を得た。また、対照細胞として、
ＲＳ３８と反応しないがネオマイシン耐性である形質転
換細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３ ３８−４を得た。

【００９０】４．新規分子の生物学的性質 １）マウスプレＢ細胞株の増殖支持 新規分子の生物学的性質は、ストローマ細胞依存性に増
殖するマウスプレＢ細胞株ＤＷ３４を用いて、増殖細胞
数を指標として以下に示す方法にて解析した。まず、２
４穴プレートに形質導入細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３ ３８−
１、３８−３及び３８−９ならびに対照細胞株ＢＡＬＢ
３Ｔ３及びＢＡＬＢ３Ｔ３ ３８−４をサブコンフルエ
ントになるまで培養し、３０Ｇｙの放射線を照射後、１
穴あたり２×１０³ 個のＤＷ３４を添加し、１０％ＦＣ
Ｓ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）を含むＲＰＭＩ−１６
４０（ＧＩＢＣＯ製）培地中で、３７℃、５％ＣＯ₂ の
条件で４日間培養した。各穴のＤＷ３４の生細胞数をト
リパンブルー染色にて算定し、増殖支持能を解析した。
その結果、図２に示す如く、形質導入細胞株ＢＡＬＢ３
Ｔ３ ３８−１、３８−３及び３８−９において、対照
細胞株ＢＡＬＢ３Ｔ３及びＢＡＬＢ３Ｔ３ ３８−４と
比べて、ＤＷ３４の増殖が促進された。

【００９１】５．新規分子の物理化学的性質 １）Ｎ末端の解析 ＤＮＡ解析ソフトＧｅｎｅ Ｗｏｒｋｓを用いて、前記
のようにして得られた遺伝子の、疎水性領域と親水性領
域の解析を行った。解析した結果を図３に示す。その結
果、配列表の配列番号１の２１番目に示されるアミノ酸
Ｌｙｓから４８番目のアミノ酸Ａｌａにいたる２８個の
アミノ酸残基からなる領域が最も疎水性が高く、成熟蛋
白質のＮ末端側に細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイ
ンを持つ細胞膜貫通型蛋白質であると予想された。

【００９２】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、プレＢ
細胞増殖支持能を有する新規膜タンパクポリペプチドを
コードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベ
クターによる形質転換体、及び該遺伝子を用いたプレＢ
細胞増殖支持能を有する新規膜タンパクの製造方法に関
するものであり、本発明の遺伝子は、慢性関節リウマチ
（ＲＡ）患者の滑膜細胞上の膜タンパクをコードする。

【００９３】本発明の遺伝子を適当なベクターに挿入し
た後、常用の宿主細胞を形質転換することにより、大量
に均一な新規膜タンパクポリペプチドを製造することが
可能であり、更には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由
来滑膜細胞を感作抗原として使用して、当該膜タンパク
ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を製造する
ことが可能であり、このことから、本発明により慢性関
節リウマチ（ＲＡ）の同定及びこれらの臨床上の診断用
試薬の作製が可能である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Gln 配列番号：２ 配列の長さ：９９６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTGGAATTC ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC AGA GTG CCC ATG GAA 51 GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA GGA ATT CTG GTG 99 CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147 AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG GCA GTG ATG GAG 195 TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG ACC GAG GCC CAG 243 AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC ACC TGC AAC CAC ACT 291 GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG AAG GCC CAA GGA CAA 339 AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAG 387 CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG AGA AGA GAA AAC CAG 435 GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC TAC CCC AGC TCC CAG 483 GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG ATT GTG CTG CTG GGC 531 CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGAGATCCCA GGAAGCTGGC ACATCTTGGA AGGTCCGTCC 589 TGCTCGGCTT TTCGCTTGAA CATTCCCTTG ATCTCATCAG TTCTGAGCGG GTCATGGGGC 649 AACACGGTTA GCGGGGAGAG CACGGGGTAG CCGGAGAAGG GCCTCTGGAG CAGGTCTGGA 709 GGGGCCATGG GGCAGTCCTG GGTGTGGGGA CACAGTCGGG TTGACCCAGG GCTGTCTCCC 769 TCCAGAGCCT CCCTCCGGAC AATGAGTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTG AGATTGGGCA 829 TGGGGTGCGG TGTGGGGGGC ATGTGCTGCC TGTTGTTATG GGTTTTTTTT GCGGGGGGGG 889 TTGCTTTTTT CTGGGGTCTT TGAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGAGCAA 949 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGAATTC CACCACA 996

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例で得られた遺伝子のＮｏｒｔｈ
ｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓによる解
析結果（アガロースゲル電気泳動写真図）を示す。

【図２】本発明の実施例で得られた膜タンパクのマウス
プレＢ細胞株ＤＷ３４の増殖支持能を示す。

【図３】本発明の実施例で得られた遺伝子の疎水性領域
と親水性領域をＤＮＡ解析ソフトＧｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ
を用いて解析した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   又はその一部を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   又はその一部を有するポリペプチドをコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に示す塩基配列、又
   はこれを一部置換、欠除もしくは付加した塩基配列にハ
   イブリダイズする塩基配列を有する請求項２に記載のＤ
   ＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２〜３のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含有する組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えベクターにより
   形質転換された原核又は真核宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の宿主細胞を培養するこ
   とを特徴とする配列番号１に示すアミノ酸配列又はその
   一部を有するポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   又はその一部を有するポリペプチドを認識するモノクロ
   ーナル抗体。