JPH07196697A - ピリジノリン類の精製方法 - Google Patents
ピリジノリン類の精製方法Info
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- JPH07196697A JPH07196697A JP5353862A JP35386293A JPH07196697A JP H07196697 A JPH07196697 A JP H07196697A JP 5353862 A JP5353862 A JP 5353862A JP 35386293 A JP35386293 A JP 35386293A JP H07196697 A JPH07196697 A JP H07196697A
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Landscapes
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 遊離型のピリジノリン類を得ることができる
リジルピリジノリンの精製方法を提供すること。 【構成】 リジルピリジノリン若しくはヒドロキシリジ
ルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラーゲン断
片を含む試料を(1) セルロース系カラムによる分離精製
工程、(2) 逆相ＨＰＬＣによる分離精製工程及び(3) 陽
イオン交換カラムによる分離精製工程にこの順序で付す
ことから成る、リジルピリジノリン若しくはヒドロキシ
リジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラーゲ
ン断片の精製方法を提供した。
リジルピリジノリンの精製方法を提供すること。 【構成】 リジルピリジノリン若しくはヒドロキシリジ
ルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラーゲン断
片を含む試料を(1) セルロース系カラムによる分離精製
工程、(2) 逆相ＨＰＬＣによる分離精製工程及び(3) 陽
イオン交換カラムによる分離精製工程にこの順序で付す
ことから成る、リジルピリジノリン若しくはヒドロキシ
リジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラーゲ
ン断片の精製方法を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リジルピリジノリン類
の精製方法に関する。本発明の方法は、骨粗鬆症の診断
及び骨粗鬆症の診断薬の製造原料の提供に有用である。
の精製方法に関する。本発明の方法は、骨粗鬆症の診断
及び骨粗鬆症の診断薬の製造原料の提供に有用である。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症とは骨密度が低下し、骨内部が
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
スカスカになり、もろくなる病気のことである。人体は
常に、骨を作ったり、壊したりしており、そのバランス
が保たれている間は強い骨が維持されているが老化など
により、そのバランスが崩れたりした時には、骨粗鬆症
になる恐れがある。病因としては主に加齢という生理現
象、女性ホルモンの欠乏、その他ホルモンの変化、ビタ
ミンD 、カルシウム、蛋白質の摂取不足、運動不足など
の多因子が挙げられる。この症状の特徴は、加齢という
生理現象を背景に発症するケ−スが主であり生化学的及
び内分泌学的検査所見もほとんどが生理的変動範囲内の
変化である事が多いため、異常が認められず、早期発見
が遅れる。骨粗鬆症は、最近、社会の高齢化、食生活の
変化などにより若年層にも発生するケ−スが増加してお
り日本での現在の推定患者数は800〜900 万人と言われ
ており、今後、増加するのは確実である。
【０００３】骨粗鬆症の診断は生化学. 内分泌検査、骨
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のＸ線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
萎縮度測定法、骨密度定量法、組織学的検査などがある
が確定診断には骨密度測定法だけが使われている。この
骨密度測定法とは、光子吸収法（DEXA：２種の異なるエ
ネルギ−のＸ線を用いる方法）であり、正確な診断が可
能であるが装置が特殊設備を要しかつ、高額であるため
普及には限界がある。
【０００４】そこで最近、骨粗鬆症のマ−カ−として尿
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。尿中
のピリジノリン類の精製方法としては、先ず、セルロー
スカラムを用いて分離精製を行い、次いで逆相ＨＰＬＣ
でさらに分離精製を行う方法が知られている（「臨床検
査」vol. 27, no. 4, 1993年４月）。
中ピリジノリン及びその誘導体が注目されている。尿中
のピリジノリン類の精製方法としては、先ず、セルロー
スカラムを用いて分離精製を行い、次いで逆相ＨＰＬＣ
でさらに分離精製を行う方法が知られている（「臨床検
査」vol. 27, no. 4, 1993年４月）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法では、逆相ＨＰＬＣ後の精製試料中に、逆相ＨＰＬＣ
で用いるカウンターイオンが含まれており、遊離型のピ
リジノリン類を得ることができない。もし、遊離型のピ
リジノリンが得られれば、より精製度が高く、目的の免
疫原としての利用が可能になるという利点がある。
法では、逆相ＨＰＬＣ後の精製試料中に、逆相ＨＰＬＣ
で用いるカウンターイオンが含まれており、遊離型のピ
リジノリン類を得ることができない。もし、遊離型のピ
リジノリンが得られれば、より精製度が高く、目的の免
疫原としての利用が可能になるという利点がある。
【０００６】従って、本発明の目的は、遊離型のピリジ
ノリン類を得ることができるリジルピリジノリンの精製
方法を提供することである。
ノリン類を得ることができるリジルピリジノリンの精製
方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、逆相ＨＰＬＣの後にさらに陽イオンカラムク
ロマトグラフィーを行うことにより上記目的を達成する
ことができることを見出し、本発明を完成した。
究の結果、逆相ＨＰＬＣの後にさらに陽イオンカラムク
ロマトグラフィーを行うことにより上記目的を達成する
ことができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、リジルピリジノリン
若しくはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれらの残
基を有するコラーゲン断片を含む試料を(1) セルロース
系カラムによる分離精製工程、(2) 逆相ＨＰＬＣによる
分離精製工程及び(3) 陽イオン交換カラムによる分離精
製工程にこの順序で付すことから成る、リジルピリジノ
リン若しくはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれら
の残基を有するコラーゲン断片の精製方法を提供する。
若しくはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれらの残
基を有するコラーゲン断片を含む試料を(1) セルロース
系カラムによる分離精製工程、(2) 逆相ＨＰＬＣによる
分離精製工程及び(3) 陽イオン交換カラムによる分離精
製工程にこの順序で付すことから成る、リジルピリジノ
リン若しくはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれら
の残基を有するコラーゲン断片の精製方法を提供する。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明の方法により精製されるものは、リ
ジルピリジノリン（ＬＰ）、ヒドロキシリジルピリジノ
リン（ＨＰ）及びこれらの残基を含むコラーゲン断片で
ある。尿中に含まれる、リジルピリジノリン残基含有コ
ラーゲン断片は、下記式［Ｉ］又は［II］で示されるも
のに代表される、ＬＰ又はＨＰがアミノ酸鎖の一部で置
換されたものである。これらの化合物は自然蛍光を持っ
ているので、下記のカラムクロマトグラフィーにおい
て、画分は蛍光を測定することによりこれらの化合物を
含む画分を検出することができる。
ジルピリジノリン（ＬＰ）、ヒドロキシリジルピリジノ
リン（ＨＰ）及びこれらの残基を含むコラーゲン断片で
ある。尿中に含まれる、リジルピリジノリン残基含有コ
ラーゲン断片は、下記式［Ｉ］又は［II］で示されるも
のに代表される、ＬＰ又はＨＰがアミノ酸鎖の一部で置
換されたものである。これらの化合物は自然蛍光を持っ
ているので、下記のカラムクロマトグラフィーにおい
て、画分は蛍光を測定することによりこれらの化合物を
含む画分を検出することができる。
【００１１】
【化１】
【００１２】
【化２】 ただし、式［Ｉ］及び［II］において、PYN はリジルピ
リジノン又はヒドロキシリジルピリジノン残基を示し、
Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリドンカルボ
ン酸を示す。
リジノン又はヒドロキシリジルピリジノン残基を示し、
Gln はグルタミン又は完全に環化したピロリドンカルボ
ン酸を示す。
【００１３】本発明の方法に供される試料としては、尿
等の体液や、アキレス腱等のコラーゲンを含む生体試料
の加水分解物等を挙げることができるが、これらに限定
されるものではない。
等の体液や、アキレス腱等のコラーゲンを含む生体試料
の加水分解物等を挙げることができるが、これらに限定
されるものではない。
【００１４】本発明の方法の第１工程では、試料をセル
ロース系カラムを用いて分離精製する。セルロース系カ
ラムの例としてはＣＦ−１、ＣＦ−１１（Watman社製）
などを用いることができるがこれらに限定されるもので
はない。
ロース系カラムを用いて分離精製する。セルロース系カ
ラムの例としてはＣＦ−１、ＣＦ−１１（Watman社製）
などを用いることができるがこれらに限定されるもので
はない。
【００１５】この工程は、先ず、セルロース系カラムの
担体を溶媒に懸濁し、これに試料を加えて試料を担体に
吸着させ、次いで、この担体をカラムに詰め、同溶媒で
洗浄した後、溶離液で溶離することにより行うことがで
きる。この場合、上記の吸着及び洗浄に用いられる溶媒
としては、ｎ−プロパノール、酢酸及び水を６〜３：
１．５〜０．５：２．５〜０．５（v/v)の比率、さらに
好ましくは、約４：１：１（v/v)で含む混合溶媒を用い
ることが好ましい。なお、従来の方法（「臨床検査」vo
l. 27, no. 4, 1993年４月）では、このセルロース系カ
ラムによる分離精製に用いられる溶媒として、ｎ−ブタ
ノール、酢酸及び水を４：１：１（v/v)で含む混合溶媒
が用いられている。ｎ−プロパノールとｎ−ブタノール
は同系列のアルコールであるが、後述の実施例で明らか
になるように、ｎ−プロパノールを用いた方が収率がか
なり高くなるという予期しない効果が得られた。また、
溶離液としては、水を好ましく用いることができる。
担体を溶媒に懸濁し、これに試料を加えて試料を担体に
吸着させ、次いで、この担体をカラムに詰め、同溶媒で
洗浄した後、溶離液で溶離することにより行うことがで
きる。この場合、上記の吸着及び洗浄に用いられる溶媒
としては、ｎ−プロパノール、酢酸及び水を６〜３：
１．５〜０．５：２．５〜０．５（v/v)の比率、さらに
好ましくは、約４：１：１（v/v)で含む混合溶媒を用い
ることが好ましい。なお、従来の方法（「臨床検査」vo
l. 27, no. 4, 1993年４月）では、このセルロース系カ
ラムによる分離精製に用いられる溶媒として、ｎ−ブタ
ノール、酢酸及び水を４：１：１（v/v)で含む混合溶媒
が用いられている。ｎ−プロパノールとｎ−ブタノール
は同系列のアルコールであるが、後述の実施例で明らか
になるように、ｎ−プロパノールを用いた方が収率がか
なり高くなるという予期しない効果が得られた。また、
溶離液としては、水を好ましく用いることができる。
【００１６】溶離された画分のうち、蛍光を有する画分
を集め、次の第２工程に供する。
を集め、次の第２工程に供する。
【００１７】続く第２工程では、第１工程で得られた蛍
光画分を逆相カラムクロマトグラフィーにかける。逆相
カラムクロマトグラフィーの担体としては、牛のアキレ
ス腱から分離精製する場合には、ＯＤＳ−８０Ｔ、ＯＤ
Ｓ−８０Ｔｓ（東ソー社製）等を用いることができるが
これらに限定されるものではない。
光画分を逆相カラムクロマトグラフィーにかける。逆相
カラムクロマトグラフィーの担体としては、牛のアキレ
ス腱から分離精製する場合には、ＯＤＳ−８０Ｔ、ＯＤ
Ｓ−８０Ｔｓ（東ソー社製）等を用いることができるが
これらに限定されるものではない。
【００１８】第１工程で得られた画分を乾燥後、吸着用
溶媒に溶解し、これをカラムにアプライした後、溶離液
で溶出する。吸着用溶媒としては、例えばヘプタフロロ
酪酸（ＨＦＢＡ）溶液（濃度０．０１〜５％、好ましく
は０．１〜２．０％）等を挙げることができる。また、
溶離液としてはアセトニトリル（濃度５〜２０％）、
０．０１Ｍ ＨＦＢＡ含有のグラジエント溶出等を挙げ
ることができる。
溶媒に溶解し、これをカラムにアプライした後、溶離液
で溶出する。吸着用溶媒としては、例えばヘプタフロロ
酪酸（ＨＦＢＡ）溶液（濃度０．０１〜５％、好ましく
は０．１〜２．０％）等を挙げることができる。また、
溶離液としてはアセトニトリル（濃度５〜２０％）、
０．０１Ｍ ＨＦＢＡ含有のグラジエント溶出等を挙げ
ることができる。
【００１９】得られた画分について紫外吸収極大波長を
分光光度計にて測定し、２９５ｎｍに極大吸収を有する
ピーク画分を次の工程に供することができる。
分光光度計にて測定し、２９５ｎｍに極大吸収を有する
ピーク画分を次の工程に供することができる。
【００２０】続く第３工程では、第２工程で得られた画
分を陽イオンカラムクロマトグラフィーにかける。陽イ
オンカラムクロマトグラフィーの担体としては、陽イオ
ン交換担体であるＰセルロース（Ｐ１１、Ｐ１（Watman
社製））等を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。
分を陽イオンカラムクロマトグラフィーにかける。陽イ
オンカラムクロマトグラフィーの担体としては、陽イオ
ン交換担体であるＰセルロース（Ｐ１１、Ｐ１（Watman
社製））等を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。
【００２１】吸着溶媒としては、０．１Ｎ塩酸を用いる
ことができ、溶出には０．１〜０．５Ｎ塩酸のグラジエ
ントを用いることができる。この場合には、０．４Ｎ塩
酸付近で溶出される画分に所望のピリジノリン類が含ま
れる。
ことができ、溶出には０．１〜０．５Ｎ塩酸のグラジエ
ントを用いることができる。この場合には、０．４Ｎ塩
酸付近で溶出される画分に所望のピリジノリン類が含ま
れる。
【００２２】試料として尿を用いた場合には、上記本発
明の方法により精製されるピリジノリン類を検出又は定
量することにより、骨粗鬆症の診断が可能になる。ま
た、本発明の方法により精製されたピリジノリン類は、
免疫原として用いることができ、これを適当なキャリア
に結合して動物に免疫し、常法により処理することによ
り、ピリジノリン類に対するポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体を得ることができる。これらの抗体
は、試料中のピリジノリン類の検出及び定量に用いるこ
とができるので、骨粗鬆症の診断薬として有用である。
明の方法により精製されるピリジノリン類を検出又は定
量することにより、骨粗鬆症の診断が可能になる。ま
た、本発明の方法により精製されたピリジノリン類は、
免疫原として用いることができ、これを適当なキャリア
に結合して動物に免疫し、常法により処理することによ
り、ピリジノリン類に対するポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体を得ることができる。これらの抗体
は、試料中のピリジノリン類の検出及び定量に用いるこ
とができるので、骨粗鬆症の診断薬として有用である。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、リジルピリジノリン若し
くはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれらの残基を
有するコラーゲン断片を高精度に精製することができる
方法が提供された。本発明の方法によれば、逆相ＨＰＬ
Ｃにおけるカウンターイオンが除去されるので、遊離の
リジルピリジノリン等が得られる。
くはヒドロキシリジルピリジノリン又はこれらの残基を
有するコラーゲン断片を高精度に精製することができる
方法が提供された。本発明の方法によれば、逆相ＨＰＬ
Ｃにおけるカウンターイオンが除去されるので、遊離の
リジルピリジノリン等が得られる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２５】実施例１ 牛アキレス腱４．０ｇを６Ｎ塩酸２００ｍｌと共にテフ
ロンライナー付きスクリューキャップで密栓後、１１０
℃、２４時間オイルバスにて加水分解を行った。加水分
解試料は、遠心エバポレータ（Ｓａｖａｎｔ社製）で乾
固後、カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノー
ル：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌで溶解し、４
℃、３０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清約２０ｍｌを
以後の処理に用いた。
ロンライナー付きスクリューキャップで密栓後、１１０
℃、２４時間オイルバスにて加水分解を行った。加水分
解試料は、遠心エバポレータ（Ｓａｖａｎｔ社製）で乾
固後、カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノー
ル：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌで溶解し、４
℃、３０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清約２０ｍｌを
以後の処理に用いた。
【００２６】セルロース系担体ＣＦ−１１（Whatman 社
製）１０ｇをＡ型分取カラム（２０ｍｍｘ２５０ｍｍ）
に詰め、混合溶媒Ａで通液後、上記上清２０ｍｌをアプ
ライした。上記混合溶媒Ａ通液中蛍光ピーク消失後、蒸
留水に切り替え通液、蛍光強度を有するピークを分取し
た。遠心エバポレータで乾固後、１％ＨＦＢＡ溶液で溶
解した。
製）１０ｇをＡ型分取カラム（２０ｍｍｘ２５０ｍｍ）
に詰め、混合溶媒Ａで通液後、上記上清２０ｍｌをアプ
ライした。上記混合溶媒Ａ通液中蛍光ピーク消失後、蒸
留水に切り替え通液、蛍光強度を有するピークを分取し
た。遠心エバポレータで乾固後、１％ＨＦＢＡ溶液で溶
解した。
【００２７】上記溶解液を４℃、３０００ｒｐｍ、１０
分遠心し、上清をＨＰＬＣ装置（ＯＤＳ−８０ｔｓ分取
カラム：東ソー社製）にて精製した。分離条件は１％Ｈ
ＦＢＡ含有１６．４％アセトニトリル溶液６ｍｌ／分で
溶出、３０分以降の溶出ピークを分画し、それぞれの紫
外吸収極大波長を分光光度計にて測定、２９５ｎｍに吸
収極大を有するピーク画分を遠心エバポレータにより乾
固、白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した。
分遠心し、上清をＨＰＬＣ装置（ＯＤＳ−８０ｔｓ分取
カラム：東ソー社製）にて精製した。分離条件は１％Ｈ
ＦＢＡ含有１６．４％アセトニトリル溶液６ｍｌ／分で
溶出、３０分以降の溶出ピークを分画し、それぞれの紫
外吸収極大波長を分光光度計にて測定、２９５ｎｍに吸
収極大を有するピーク画分を遠心エバポレータにより乾
固、白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した。
【００２８】イオン交換体Ｐ１１セルロース（Whatman
社製）１０ｇに対し、指示書に記載された所定の前処理
を行い、カラムに流し込み、蒸留水で通液した。上記の
白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した上清をカラムにアプ
ライし、０．５Ｎ塩酸までグラジェントをかけ、０．４
Ｎ付近で溶出してくるピークを分取した。その後、ピリ
ジノリン（ハイドロオキシリジルピリジノリン：ＨＰ）
のモル吸光係数から換算した回収量は１．２ｍｇ程度で
あり、ＬＣ−ＭＳの結果からは、分子量４２９と同定さ
れた。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
社製）１０ｇに対し、指示書に記載された所定の前処理
を行い、カラムに流し込み、蒸留水で通液した。上記の
白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した上清をカラムにアプ
ライし、０．５Ｎ塩酸までグラジェントをかけ、０．４
Ｎ付近で溶出してくるピークを分取した。その後、ピリ
ジノリン（ハイドロオキシリジルピリジノリン：ＨＰ）
のモル吸光係数から換算した回収量は１．２ｍｇ程度で
あり、ＬＣ−ＭＳの結果からは、分子量４２９と同定さ
れた。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
【００２９】実施例２ カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノール：酢
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｂ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例１と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．７ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｂ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例１と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．７ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
【００３０】実施例３ カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノール：酢
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｃ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：２）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例１と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．５ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｃ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：２）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例１と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．５ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
【００３１】実施例４ ニワトリアキレス腱４．０ｇを６Ｎ塩酸２００ｍｌと共
にテフロンライナー付きスクリューキャップで密栓後、
１１０℃、２４時間オイルバスにて加水分解を行った。
加水分解試料は、遠心エバポレータ（Ｓａｖａｎｔ社
製）で乾固後、カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プ
ロパノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌで溶
解し、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清約２
０ｍｌを以後の処理に用いた。
にテフロンライナー付きスクリューキャップで密栓後、
１１０℃、２４時間オイルバスにて加水分解を行った。
加水分解試料は、遠心エバポレータ（Ｓａｖａｎｔ社
製）で乾固後、カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プ
ロパノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌで溶
解し、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分遠心後、上清約２
０ｍｌを以後の処理に用いた。
【００３２】セルロース系担体ＣＦ−１１（Whatman 社
製）１０ｇをＡ型分取カラム（２０ｍｍｘ２５０ｍｍ）
に詰め、混合溶媒Ａで通液後、上記上清２０ｍｌをアプ
ライした。上記混合溶媒Ａ通液中蛍光ピーク消失後、蒸
留水に切り替え通液、蛍光強度を有するピークを分取し
た。遠心エバポレータで乾固後、１％ＨＦＢＡ溶液で溶
解した。
製）１０ｇをＡ型分取カラム（２０ｍｍｘ２５０ｍｍ）
に詰め、混合溶媒Ａで通液後、上記上清２０ｍｌをアプ
ライした。上記混合溶媒Ａ通液中蛍光ピーク消失後、蒸
留水に切り替え通液、蛍光強度を有するピークを分取し
た。遠心エバポレータで乾固後、１％ＨＦＢＡ溶液で溶
解した。
【００３３】上記溶解液を４℃、３０００ｒｐｍ、１０
分遠心し、上清をＨＰＬＣ装置（ＯＤＳ−８０ｔｓ分取
カラム：東ソー社製）にて精製した。分離条件は１％Ｈ
ＦＢＡ含有１６．４％アセトニトリル溶液６ｍｌ／分で
溶出、３０分以降の溶出ピークを分画し、それぞれの紫
外吸収極大波長を分光光度計にて測定、２９５ｎｍに吸
収極大を有するピーク画分を遠心エバポレータにより乾
固、白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した。
分遠心し、上清をＨＰＬＣ装置（ＯＤＳ−８０ｔｓ分取
カラム：東ソー社製）にて精製した。分離条件は１％Ｈ
ＦＢＡ含有１６．４％アセトニトリル溶液６ｍｌ／分で
溶出、３０分以降の溶出ピークを分画し、それぞれの紫
外吸収極大波長を分光光度計にて測定、２９５ｎｍに吸
収極大を有するピーク画分を遠心エバポレータにより乾
固、白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した。
【００３４】イオン交換体Ｐ１１セルロース（Whatman
社製）１０ｇに対し、指示書に記載された所定の前処理
を行い、カラムに流し込み、蒸留水で通液した。上記の
白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した上清をカラムにアプ
ライし、０．５Ｎ塩酸までグラジェントをかけ、０．４
Ｎ付近で溶出してくるピークを分取した。その後、ピリ
ジノリン（ハイドロオキシリジルピリジノリン：ＨＰ）
のモル吸光係数から換算した回収量は０．７ｍｇ程度で
あり、ＬＣ−ＭＳの結果からは、分子量４２９と同定さ
れた。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
社製）１０ｇに対し、指示書に記載された所定の前処理
を行い、カラムに流し込み、蒸留水で通液した。上記の
白色粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解した上清をカラムにアプ
ライし、０．５Ｎ塩酸までグラジェントをかけ、０．４
Ｎ付近で溶出してくるピークを分取した。その後、ピリ
ジノリン（ハイドロオキシリジルピリジノリン：ＨＰ）
のモル吸光係数から換算した回収量は０．７ｍｇ程度で
あり、ＬＣ−ＭＳの結果からは、分子量４２９と同定さ
れた。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
【００３５】実施例５ カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノール：酢
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｂ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例４と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．４ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｂ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：１）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例４と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．４ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
【００３６】実施例６ カラム洗浄液である混合溶媒Ａ（ｎ−プロパノール：酢
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｃ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：２）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例４と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．３ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
酸：蒸留水＝４：１：１）２０ｍｌに変えて、混合溶媒
Ｃ（ｎ−ブタノール：酢酸：蒸留水＝４：１：２）２０
ｍｌを用いたことを除き実施例４と同じ操作を行った。
モル吸光係数から換算した回収量は０．３ｍｇ程度であ
った。また、アミノ酸分析の結果、除去できなかったア
ミノ酸は１０％程度であった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＦ (72)発明者 芝 紀代子 東京都千代田区一番町20−９
Claims (3)
- 【請求項１】 リジルピリジノリン若しくはヒドロキシ
リジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコラーゲ
ン断片を含む試料を(1) セルロース系カラムによる分離
精製工程、(2) 逆相ＨＰＬＣによる分離精製工程及び
(3) 陽イオン交換カラムによる分離精製工程にこの順序
で付すことから成る、リジルピリジノリン若しくはヒド
ロキシリジルピリジノリン又はこれらの残基を有するコ
ラーゲン断片の精製方法。 - 【請求項２】 上記(1) の工程における吸着及び洗浄溶
媒として、ｎ−プロパノール、酢酸及び水を６〜３：
１．５〜０．５：２．５〜０．５（v/v)の比率で含む混
合溶媒を用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 上記混合溶媒中のｎ−プロパノール、酢
酸及び水の混合比率がおよそ４：１：１（v/v)である請
求項２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5353862A JPH07196697A (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | ピリジノリン類の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5353862A JPH07196697A (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | ピリジノリン類の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196697A true JPH07196697A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=18433732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5353862A Pending JPH07196697A (ja) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | ピリジノリン類の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07196697A (ja) |
-
1993
- 1993-12-29 JP JP5353862A patent/JPH07196697A/ja active Pending
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