JPH07198A - 核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法 - Google Patents
核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 PCR法及び他の同様な増幅方法の重要な制御因
子は、それぞれの反応の最終産物である増幅核酸による
実験環境の汚染であり、該汚染はサンプル中に存在する
標的核酸の増幅だけでなく、前の反応の汚染最終産物の
増幅ももたらす。このような核酸増幅反応の増幅産物に
よる汚染を防止する方法を提供する。 【構成】 特定核酸配列を増幅する反応において、修飾
プライマーの存在下に、混入した前増幅物の３’末端を
例えばExonuclease IIIなどにより破壊する工程を含む
核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法、該
方法を使用する特定核酸配列を増幅する方法、標的核酸
の検出方法およびそれらの試薬キット。
子は、それぞれの反応の最終産物である増幅核酸による
実験環境の汚染であり、該汚染はサンプル中に存在する
標的核酸の増幅だけでなく、前の反応の汚染最終産物の
増幅ももたらす。このような核酸増幅反応の増幅産物に
よる汚染を防止する方法を提供する。 【構成】 特定核酸配列を増幅する反応において、修飾
プライマーの存在下に、混入した前増幅物の３’末端を
例えばExonuclease IIIなどにより破壊する工程を含む
核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法、該
方法を使用する特定核酸配列を増幅する方法、標的核酸
の検出方法およびそれらの試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸増幅反応の増幅産
物による汚染を防止する方法、該方法を使用した核酸配
列を増幅する方法、特定核酸を検出する方法およびそれ
らの試薬キットに関する。さらに詳細には本発明は、そ
の後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼす、混入した前核
酸増幅産物を排除する方法に関する。
物による汚染を防止する方法、該方法を使用した核酸配
列を増幅する方法、特定核酸を検出する方法およびそれ
らの試薬キットに関する。さらに詳細には本発明は、そ
の後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼす、混入した前核
酸増幅産物を排除する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)は、二本鎖
の変性、２種のプライマーのアニーリングおよびＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を含む一連の
操作を通して特定の核酸配列を増幅する方法である（特
開昭61-274697 号公報等）。これらの工程は何回も反復
することができ、原特定配列のコピー数の大きな増幅を
もたらすことができる。ＤＮＡ１分子でさえも増幅して
数百ナノグラムの産物を産生することができる（Honghu
a Li et al.Nature 335414-417（1988））。しかしこの
PCR 法では、増幅反応の結果、増幅産物自体が、その後
のPCR 法の鋳型となることができる。さらに、増幅産物
の量が大きくなり得るため、反応液のごく小さい分画の
散乱でさえも、その後の他のサンプルを増幅する試みの
汚染を導くことがあり得る。
の変性、２種のプライマーのアニーリングおよびＤＮＡ
ポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を含む一連の
操作を通して特定の核酸配列を増幅する方法である（特
開昭61-274697 号公報等）。これらの工程は何回も反復
することができ、原特定配列のコピー数の大きな増幅を
もたらすことができる。ＤＮＡ１分子でさえも増幅して
数百ナノグラムの産物を産生することができる（Honghu
a Li et al.Nature 335414-417（1988））。しかしこの
PCR 法では、増幅反応の結果、増幅産物自体が、その後
のPCR 法の鋳型となることができる。さらに、増幅産物
の量が大きくなり得るため、反応液のごく小さい分画の
散乱でさえも、その後の他のサンプルを増幅する試みの
汚染を導くことがあり得る。
【０００３】PCR 法及び他の同様な増幅方法の重要な制
御因子は、それぞれの反応の最終産物である増幅核酸に
よる実験環境の汚染であり、該汚染はサンプル中に存在
する標的核酸の増幅だけでなく、先の反応の汚染最終産
物の増幅ももたらす。
御因子は、それぞれの反応の最終産物である増幅核酸に
よる実験環境の汚染であり、該汚染はサンプル中に存在
する標的核酸の増幅だけでなく、先の反応の汚染最終産
物の増幅ももたらす。
【０００４】この汚染防止のために、核酸配列の増幅の
間にエキソサンプルヌクレオチドであるｄＵＴＰを組み
入れて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（UDG)を用いて
エキソサンプルヌクレオチドを非増幅性にする処理を第
二サンプルの核酸に施す方法が提案されている（特開平
3-58785 号公報）。しかし一般に合成には用いられない
ｄＵＴＰの取込は、ｄＴＴＰより悪く、またＵＤＧの使
用も一般的でない。また５’エキソヌクレアーゼを用い
る方法も提案されている（特表平4-500610号公報）が、
この方法ではプライマーの５’末端がリン酸化されてい
る必要があり、増幅反応との反応液も異なる。
間にエキソサンプルヌクレオチドであるｄＵＴＰを組み
入れて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（UDG)を用いて
エキソサンプルヌクレオチドを非増幅性にする処理を第
二サンプルの核酸に施す方法が提案されている（特開平
3-58785 号公報）。しかし一般に合成には用いられない
ｄＵＴＰの取込は、ｄＴＴＰより悪く、またＵＤＧの使
用も一般的でない。また５’エキソヌクレアーゼを用い
る方法も提案されている（特表平4-500610号公報）が、
この方法ではプライマーの５’末端がリン酸化されてい
る必要があり、増幅反応との反応液も異なる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、その
後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼす、前核酸増幅産物
を排除する方法を提供することである。
後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼす、前核酸増幅産物
を排除する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの課題を
解決すべく鋭意研究を進めた結果、増幅反応の間に実質
的に前核酸増幅産物をこれ以上増幅しないように、反応
液を適当な試薬と接触させることにより、混入している
該前増幅物の３’末端を破壊することによって、上記課
題が解決されるのを見出して、本発明を完成させるに至
った。
解決すべく鋭意研究を進めた結果、増幅反応の間に実質
的に前核酸増幅産物をこれ以上増幅しないように、反応
液を適当な試薬と接触させることにより、混入している
該前増幅物の３’末端を破壊することによって、上記課
題が解決されるのを見出して、本発明を完成させるに至
った。
【０００７】すなわち本発明は特定核酸配列を増幅する
反応において、修飾プライマーの存在下に、混入した前
増幅物の３’末端を破壊する工程を含むことを特徴とす
る核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法で
ある。
反応において、修飾プライマーの存在下に、混入した前
増幅物の３’末端を破壊する工程を含むことを特徴とす
る核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法で
ある。
【０００８】また本発明は特定核酸配列を増幅する反応
において、(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した前
増幅物の３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修飾
プライマーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程を含
むことを特徴とする特定核酸配列を増幅する方法であ
る。
において、(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した前
増幅物の３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修飾
プライマーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程を含
むことを特徴とする特定核酸配列を増幅する方法であ
る。
【０００９】さらに本発明は特定核酸配列を増幅する反
応において、(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した
前増幅物の３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修
飾プライマーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程お
よび(c) 増副反応による生成物に、検出されるべき各配
列用であって該配列及び／又はその変異体とハイブリダ
イズすることができる標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを加え、該ハイブリダイゼーションが生じたか否
かを決定することにより、標的核酸を検出する工程を含
むことを特徴とする標的核酸の検出方法である。
応において、(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した
前増幅物の３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修
飾プライマーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程お
よび(c) 増副反応による生成物に、検出されるべき各配
列用であって該配列及び／又はその変異体とハイブリダ
イズすることができる標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを加え、該ハイブリダイゼーションが生じたか否
かを決定することにより、標的核酸を検出する工程を含
むことを特徴とする標的核酸の検出方法である。
【００１０】また本発明は修飾オリゴヌクレオチド、
３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転
写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反
応緩衝液を含む標的核酸を増幅するための試薬キットで
ある。
３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転
写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反
応緩衝液を含む標的核酸を増幅するための試薬キットで
ある。
【００１１】さらに本発明は修飾オリゴヌクレオチド、
３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転
写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反
応緩衝液、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及び
標識を検出するための試薬を含む標的核酸を検出するた
めの試薬キットである。
３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転
写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反
応緩衝液、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ及び
標識を検出するための試薬を含む標的核酸を検出するた
めの試薬キットである。
【００１２】本発明における特定核酸増幅反応とは、酵
素を利用するin vitro製法であり、該方法の一つの例と
してポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 法が挙げられる。該ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR)は、二本鎖の変性、２種のプ
ライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによ
るプライマーの伸長反応を含む一連の操作を通して特定
の核酸配列を増幅する方法である（特開昭61-274697 号
公報等）。他の公知である核酸増幅法としては、転写に
もとづく増幅法がある (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86, 1173, 1989) 。
素を利用するin vitro製法であり、該方法の一つの例と
してポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 法が挙げられる。該ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR)は、二本鎖の変性、２種のプ
ライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによ
るプライマーの伸長反応を含む一連の操作を通して特定
の核酸配列を増幅する方法である（特開昭61-274697 号
公報等）。他の公知である核酸増幅法としては、転写に
もとづく増幅法がある (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86, 1173, 1989) 。
【００１３】本発明における前増幅産物とは、上記PCR
のような増幅法の結果、増幅した産生物が、その量が大
きくなるため、実験室の中で散乱して、その後の他のサ
ンプルを増幅する試みの汚染を導くものをいう。
のような増幅法の結果、増幅した産生物が、その量が大
きくなるため、実験室の中で散乱して、その後の他のサ
ンプルを増幅する試みの汚染を導くものをいう。
【００１４】本発明の汚染防止方法では、上記特定核酸
配列を増幅する反応において、混入した前増幅物が、該
増幅反応の間に実質的にこれ以上増幅しないように、反
応液を修飾したプライマーの存在下に、混入している前
増幅物の３’末端を破壊する工程を含む。修飾したプラ
イマーとは、プライマーの３’末端の一部及び／または
全部がチオホスフェート基などのヌクレアーゼ耐性基を
含む。好ましくは３’末端の配列がＴＣＴである核酸を
いう。このプライマーは、例えばABI 社（Applied Bios
ystems Inc.）のDNA シンセサイザー391 型を用いてホ
スホアミダイト法により合成できる。他にもリン酸トリ
エステル法、H-ホスホネート法、チオホスファイト法等
いかなる方法で合成してもよい。
配列を増幅する反応において、混入した前増幅物が、該
増幅反応の間に実質的にこれ以上増幅しないように、反
応液を修飾したプライマーの存在下に、混入している前
増幅物の３’末端を破壊する工程を含む。修飾したプラ
イマーとは、プライマーの３’末端の一部及び／または
全部がチオホスフェート基などのヌクレアーゼ耐性基を
含む。好ましくは３’末端の配列がＴＣＴである核酸を
いう。このプライマーは、例えばABI 社（Applied Bios
ystems Inc.）のDNA シンセサイザー391 型を用いてホ
スホアミダイト法により合成できる。他にもリン酸トリ
エステル法、H-ホスホネート法、チオホスファイト法等
いかなる方法で合成してもよい。
【００１５】前増幅物の３’末端を破壊する手段は、生
物学的方法、物理学的方法、化学的方法などがある。一
般的には３’末端を破壊する方法は、酵素的方法である
ことが好ましく、酵素的方法としては、エキソヌクレア
ーゼIII、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、ＡＴＰ依存性ヌク
レアーゼおよびＡＴＰ依存性デオキシリボヌクレアーゼ
からなる群から選ばれる酵素を使用する方法がある。適
当な３’末端を破壊する試薬とは、このような酵素を含
有する試薬である。物理学的方法としては、超音波処理
などがあり、化学的方法としては、ＵＶ照射などがあ
る。
物学的方法、物理学的方法、化学的方法などがある。一
般的には３’末端を破壊する方法は、酵素的方法である
ことが好ましく、酵素的方法としては、エキソヌクレア
ーゼIII、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、ＡＴＰ依存性ヌク
レアーゼおよびＡＴＰ依存性デオキシリボヌクレアーゼ
からなる群から選ばれる酵素を使用する方法がある。適
当な３’末端を破壊する試薬とは、このような酵素を含
有する試薬である。物理学的方法としては、超音波処理
などがあり、化学的方法としては、ＵＶ照射などがあ
る。
【００１６】本発明の増幅方法では、混入した前増幅物
が該増幅反応の間に実質的にこれ以上増幅しないよう
に、修飾オリゴヌクレオチドを加えた反応液を上記３’
末端を破壊する試薬と接触させることにより、混入して
いる前増幅物の３’末端を破壊する。その後、該修飾オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い、
該特定核酸配列を増幅する工程を含む。具体的には特定
核酸配列を増幅する方法としては、二本鎖の変性、修飾
プライマーを含む２種のプライマーのアニーリングおよ
びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を含
む一連の操作を含む。
が該増幅反応の間に実質的にこれ以上増幅しないよう
に、修飾オリゴヌクレオチドを加えた反応液を上記３’
末端を破壊する試薬と接触させることにより、混入して
いる前増幅物の３’末端を破壊する。その後、該修飾オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして伸長反応を行い、
該特定核酸配列を増幅する工程を含む。具体的には特定
核酸配列を増幅する方法としては、二本鎖の変性、修飾
プライマーを含む２種のプライマーのアニーリングおよ
びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を含
む一連の操作を含む。
【００１７】本発明の増幅試薬は修飾したオリゴヌクレ
オチド、３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／
又は逆転写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸および反応緩衝液を含む。ＤＮＡポリメラーゼとし
ては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼなどがある。逆転写酵
素としては、Ｔｔｈ逆転写酵素、ＡＭｖ逆転写酵素、Ｍ
ＬＶ逆転写酵素などがある。４種のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸とは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＧＴＰである。反応緩衝液としては、ｐＨ４〜８の緩
衝液が好ましい。該緩衝液には無機塩、例えばＭｇＣｌ
2 、ＫＣｌなど、コール酸塩、例えばコール酸ナトリウ
ムなど、界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００など、
タンパク質、例えばＢＳＡなどを含んでいてもよい。
オチド、３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／
又は逆転写酵素、４種のデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸および反応緩衝液を含む。ＤＮＡポリメラーゼとし
ては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼなどがある。逆転写酵
素としては、Ｔｔｈ逆転写酵素、ＡＭｖ逆転写酵素、Ｍ
ＬＶ逆転写酵素などがある。４種のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸とは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＧＴＰである。反応緩衝液としては、ｐＨ４〜８の緩
衝液が好ましい。該緩衝液には無機塩、例えばＭｇＣｌ
2 、ＫＣｌなど、コール酸塩、例えばコール酸ナトリウ
ムなど、界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００など、
タンパク質、例えばＢＳＡなどを含んでいてもよい。
【００１８】本発明の検出方法では上記増副反応による
生成物に、検出されるべき各配列用であり、該配列及び
／又はその変異体とハイブリダイズすることができる標
識されたオリゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブ
リダイゼーションが生じたか否かを決定することによ
り、標的核酸を検出する。標識としては、アルカリホス
ファターゼ、パーオキシダーゼなどの酵素、アビジン、
ビオチンなどの標識、放射性標識、発光基質などが挙げ
られる。
生成物に、検出されるべき各配列用であり、該配列及び
／又はその変異体とハイブリダイズすることができる標
識されたオリゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブ
リダイゼーションが生じたか否かを決定することによ
り、標的核酸を検出する。標識としては、アルカリホス
ファターゼ、パーオキシダーゼなどの酵素、アビジン、
ビオチンなどの標識、放射性標識、発光基質などが挙げ
られる。
【００１９】本発明の検出試薬キットは、修飾オリゴヌ
クレオチド、３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及
び／又は逆転写酵素、４種のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸、反応緩衝液、標識されたオリゴヌクレオチド
プローブ及び標識を検出するための試薬を含む。標識を
検出するための試薬とは、ハイブリダイゼーション用緩
衝液、洗浄液および標識が酵素である場合、基質溶液を
含む。
クレオチド、３’末端破壊酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及
び／又は逆転写酵素、４種のデオキシリボヌクレオチド
三リン酸、反応緩衝液、標識されたオリゴヌクレオチド
プローブ及び標識を検出するための試薬を含む。標識を
検出するための試薬とは、ハイブリダイゼーション用緩
衝液、洗浄液および標識が酵素である場合、基質溶液を
含む。
【００２０】
【発明の効果】本発明では、標的核酸の望ましい増幅に
影響しないで、この前増幅産物の汚染をできるだけ除去
することができる。特に汚染している前増幅産物の３’
末端を破壊することにより、増幅に用いられるプライマ
ーが、アニールできなくなり、その結果、汚染している
前増幅産物は増幅できないが、標的核酸は増幅し続ける
ようにすることができる。本発明においては、増幅に特
別な核酸を用いたり、プライマーのリン酸化などを必要
とせずに、反応液を上記試薬と接触させるだけでその効
果が得られる。
影響しないで、この前増幅産物の汚染をできるだけ除去
することができる。特に汚染している前増幅産物の３’
末端を破壊することにより、増幅に用いられるプライマ
ーが、アニールできなくなり、その結果、汚染している
前増幅産物は増幅できないが、標的核酸は増幅し続ける
ようにすることができる。本発明においては、増幅に特
別な核酸を用いたり、プライマーのリン酸化などを必要
とせずに、反応液を上記試薬と接触させるだけでその効
果が得られる。
【００２１】
【実施例】次に本発明を具体的に説明する。 参考例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。 1)第一オリゴヌクレオチド：コレラ毒素遺伝子の 271番
目から 292番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有
する（配列表1 ）。また３’末端の２塩基はホスホチオ
エート基で結合している。 2)第二オリゴヌクレオチド：コレラ毒素遺伝子の 622番
目から 642番目に相補的な配列を有する（配列表2 ）。
また３’末端の２塩基はホスホチオエート基で結合して
いる。 手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μM スケールで実
施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は、アンモニ
ア水を使用し、55℃で一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。 1)第一オリゴヌクレオチド：コレラ毒素遺伝子の 271番
目から 292番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有
する（配列表1 ）。また３’末端の２塩基はホスホチオ
エート基で結合している。 2)第二オリゴヌクレオチド：コレラ毒素遺伝子の 622番
目から 642番目に相補的な配列を有する（配列表2 ）。
また３’末端の２塩基はホスホチオエート基で結合して
いる。 手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μM スケールで実
施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護は、アンモニ
ア水を使用し、55℃で一夜実施した。精製はファルマシ
ア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。
【００２２】参考例２ 特定核酸の増幅 参考例１の第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌク
レオチドを各40pmolとコレラの培養菌体から分離、部分
精製したゲノム核酸 1ng、100pg および０ｇとを共に50
μl の下記反応液に加えた。94℃に５分間保った後、Tt
h DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）４単位加え、94℃に１
分間保った後、下記のサイクルにより増幅を行なった。 変性 94℃、 60秒 アニール 58℃、 120秒 伸長反応 75℃、 90秒 サイクル数 30回 反応液 10 mM Tris-HCl(pH 8.9) 3 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% TritonX-100 0.2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した（図
１）。その結果は372bp 付近にDNA が合成されていた。
レオチドを各40pmolとコレラの培養菌体から分離、部分
精製したゲノム核酸 1ng、100pg および０ｇとを共に50
μl の下記反応液に加えた。94℃に５分間保った後、Tt
h DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）４単位加え、94℃に１
分間保った後、下記のサイクルにより増幅を行なった。 変性 94℃、 60秒 アニール 58℃、 120秒 伸長反応 75℃、 90秒 サイクル数 30回 反応液 10 mM Tris-HCl(pH 8.9) 3 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% TritonX-100 0.2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した（図
１）。その結果は372bp 付近にDNA が合成されていた。
【００２３】実施例１ Exonuclease IIIによる汚染防止 参考例１の第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌク
レオチドを各40pmolとコレラの培養菌体から分離、部分
精製したゲノム核酸1ng 、100pg および 0g とを共に50
μl の下記反応液に加えた。この反応液に、参考例２の
ゲノム核酸１ngから増幅させた反応液を106 倍に希釈し
たものを１μl 加えた。94℃に５分間保った後、37℃に
降温し、Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡）を４単位加
え、Exonuclease III（東洋紡）を380 単位加えたもの
と加えないものを用意した。37℃に0分間保った後、94
℃に昇温し、２分間保った後、下記のサイクルにより増
幅を行なった 変性 94℃、 60 秒 アニール 58℃、120 秒 伸長反応 75℃、 90 秒 サイクル数 30 回 反応液 10 mM Tris-HCl(pH 8.9) 3 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% TritonX-100 0.2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した（図
２）。その結果は、Exonuclease III処理を行った群で
は、コレラゲノムを入れたものだけに増幅が認められた
が、無処理の群では、コレラゲノムを入れないものでも
増幅が認められた。なお、参考例２のゲノム核酸１ngか
ら増幅させた反応液を106 倍に希釈したものは、標的核
酸を含まない前増幅物を含むものである。
レオチドを各40pmolとコレラの培養菌体から分離、部分
精製したゲノム核酸1ng 、100pg および 0g とを共に50
μl の下記反応液に加えた。この反応液に、参考例２の
ゲノム核酸１ngから増幅させた反応液を106 倍に希釈し
たものを１μl 加えた。94℃に５分間保った後、37℃に
降温し、Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡）を４単位加
え、Exonuclease III（東洋紡）を380 単位加えたもの
と加えないものを用意した。37℃に0分間保った後、94
℃に昇温し、２分間保った後、下記のサイクルにより増
幅を行なった 変性 94℃、 60 秒 アニール 58℃、120 秒 伸長反応 75℃、 90 秒 サイクル数 30 回 反応液 10 mM Tris-HCl(pH 8.9) 3 mM MgCl2 80 mM KCl 500 μg/ml BSA 0.1% コール酸ナトリウム 0.1% TritonX-100 0.2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した（図
２）。その結果は、Exonuclease III処理を行った群で
は、コレラゲノムを入れたものだけに増幅が認められた
が、無処理の群では、コレラゲノムを入れないものでも
増幅が認められた。なお、参考例２のゲノム核酸１ngか
ら増幅させた反応液を106 倍に希釈したものは、標的核
酸を含まない前増幅物を含むものである。
【００２４】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 存在を決定した方法：ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の271 番目から292 番目の
ヌクレオチド配列と相同的な配列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22
ヌクレオチド配列と相同的な配列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 存在を決定した方法：ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の622番目から642番目のヌ
クレオチド配列と相的な配列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21
クレオチド配列と相的な配列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21
【図１】参考例２において合成されたDNA の電気泳動パ
ターンを示す。レーン１はマーカー、2 、3 、4 はそれ
ぞれ核酸試料1ng 、100pg 、0gに対応している。
ターンを示す。レーン１はマーカー、2 、3 、4 はそれ
ぞれ核酸試料1ng 、100pg 、0gに対応している。
【図２】実施例１において合成されたDNA の電気泳動パ
ターンを示す。レーン１はマーカー、2 、3 、4 および
5 、6 、7 はそれぞれ核酸試料1ng 、100pg 、0gに対応
している。また、2 、3 、4 はExonuclease III処理を
行った群であり、5 、6 、7 は無処理の群である。
ターンを示す。レーン１はマーカー、2 、3 、4 および
5 、6 、7 はそれぞれ核酸試料1ng 、100pg 、0gに対応
している。また、2 、3 、4 はExonuclease III処理を
行った群であり、5 、6 、7 は無処理の群である。
Claims (5)
- 【請求項１】 特定核酸配列を増幅する反応において、
修飾プライマーの存在下に、混入した前増幅物の３’末
端を破壊する工程を含むことを特徴とする核酸増幅反応
の増幅産物による汚染を防止する方法。 - 【請求項２】 特定核酸配列を増幅する反応において、
(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した前増幅物の
３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修飾プライマ
ーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程を含むことを
特徴とする特定核酸配列を増幅する方法。 - 【請求項３】 特定核酸配列を増幅する反応において、
(a) 修飾プライマーの存在下に、混入した前増幅物の
３’末端を破壊する工程と、次いで(b) 該修飾プライマ
ーを用いて該特定核酸配列を増幅する工程および(c) 増
副反応による生成物に、検出されるべき各配列用であっ
て該配列及び／又はその変異体とハイブリダイズするこ
とができる標識されたオリゴヌクレオチドプローブを加
え、該ハイブリダイゼーションが生じたか否かを決定す
ることにより、標的核酸を検出する工程を含むことを特
徴とする標的核酸の検出方法。 - 【請求項４】 修飾オリゴヌクレオチド、３’末端破壊
酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素、４種
のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応緩衝液を含
む標的核酸を増幅するための試薬キット。 - 【請求項５】 修飾オリゴヌクレオチド、３’末端破壊
酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素、４種
のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応緩衝液、標
識されたオリゴヌクレオチドプローブ及び標識を検出す
るための試薬を含む標的核酸を検出するための試薬キッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14750893A JPH07198A (ja) | 1993-04-21 | 1993-06-18 | 核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-94548 | 1993-04-21 | ||
| JP9454893 | 1993-04-21 | ||
| JP14750893A JPH07198A (ja) | 1993-04-21 | 1993-06-18 | 核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07198A true JPH07198A (ja) | 1995-01-06 |
Family
ID=26435835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14750893A Pending JPH07198A (ja) | 1993-04-21 | 1993-06-18 | 核酸増幅反応の増幅産物による汚染を防止する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07198A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998028443A1 (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-02 | Dade Behring Marburg Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US10167500B2 (en) | 2006-06-06 | 2019-01-01 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
-
1993
- 1993-06-18 JP JP14750893A patent/JPH07198A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998028443A1 (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-02 | Dade Behring Marburg Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US10167500B2 (en) | 2006-06-06 | 2019-01-01 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
| USRE48909E1 (en) | 2006-06-06 | 2022-02-01 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
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