JPH07204000A - 生物学的サンプルから非標的核酸を酵素により除去する方法 - Google Patents
生物学的サンプルから非標的核酸を酵素により除去する方法Info
- Publication number
- JPH07204000A JPH07204000A JP6310515A JP31051594A JPH07204000A JP H07204000 A JPH07204000 A JP H07204000A JP 6310515 A JP6310515 A JP 6310515A JP 31051594 A JP31051594 A JP 31051594A JP H07204000 A JPH07204000 A JP H07204000A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- enzyme
- dna
- sample
- biological sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/08—Reducing the nucleic acid content
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 生物学的サンプル中の非標的核酸を酵素によ
り除去する方法を提供する。 【構成】 検出すべき核酸を含む微生物を含む生物学的
サンプルから混在する核酸を除去するための方法であっ
て、酵素混合物に上記生物学的サンプルを暴露する工程
からなるが、その際、上記酵素混合物の組み合わせが、
エンドヌクレアーゼの様式により核酸を分解する酵素お
よびエキソヌクレアーゼの様式により核酸を分解する酵
素の組み合わせである、前記方法。
り除去する方法を提供する。 【構成】 検出すべき核酸を含む微生物を含む生物学的
サンプルから混在する核酸を除去するための方法であっ
て、酵素混合物に上記生物学的サンプルを暴露する工程
からなるが、その際、上記酵素混合物の組み合わせが、
エンドヌクレアーゼの様式により核酸を分解する酵素お
よびエキソヌクレアーゼの様式により核酸を分解する酵
素の組み合わせである、前記方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的サンプル中の
非標的核酸の酵素による除去に関する。
非標的核酸の酵素による除去に関する。
【０００２】
【従来の技術】増幅のための核酸断片の調製は、適当な
生物学的サンプルの回収、サンプルの液化、サンプル中
の細胞の溶解、フェノール／クロロホルムによるＤＮＡ
の解離、およびガラス表面へのＤＮＡの結合−溶出を含
む多くの工程を含みうる。しかしながら、所望の核酸断
片の増幅は他の非標的核酸断片の存在によりしばしば妨
害され、該非標的断片はプライマーにハイブリダイズし
て不所望の産物の増幅を引き起こして増幅工程を妨害
し、かつ標的特異的増幅を圧倒する。酵素（ポリメラー
ゼ）はしばしば非標的核酸の伸長合成により消費され
る。
生物学的サンプルの回収、サンプルの液化、サンプル中
の細胞の溶解、フェノール／クロロホルムによるＤＮＡ
の解離、およびガラス表面へのＤＮＡの結合−溶出を含
む多くの工程を含みうる。しかしながら、所望の核酸断
片の増幅は他の非標的核酸断片の存在によりしばしば妨
害され、該非標的断片はプライマーにハイブリダイズし
て不所望の産物の増幅を引き起こして増幅工程を妨害
し、かつ標的特異的増幅を圧倒する。酵素（ポリメラー
ゼ）はしばしば非標的核酸の伸長合成により消費され
る。
【０００３】非標的核酸断片により引き起こされるその
問題に対する慣用的技術は、時間を浪費し、退屈であ
り、そして／または労力を要する。これらの方法の幾つ
かは、生物学的サンプルを培養して、増幅前に、所望の
核酸断片を含むはずの生物数を増加させることを含む
（Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ
Ｌａｎｃｅｔ，１９８９年１１月４日、ｐｐ．１０６９
−１０７１；およびＰｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，１
９９１年４月、ｐｐ．７１２−７１７を参照された
い）。しかしながら、これらの方法はさらに日数を要す
る。他の当業者は臨床サンプルよりも精製された培養物
のみを分析した（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｖｏｌ．２８，１９９０年
３月、ｐｐ．５１３−５１８；Ｈａｎｃｅｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖ
ｏｌ．３，１９８９年，ｐｐ．８４３−８４９；および
Ｆｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，１９９１年８月、ｐｐ．１
７４４−１７４７を参照されたい）。さらに他の当業者
は、退屈なＤＮＡ抽出法を用いて増幅前にＤＮＡを精製
した（ＤｅＷｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２８，１９９０年１１月；
およびＳｊｏｂｒｉｎｇｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ２８，１９９０年１０
月、ｐｐ．２２００−２２０４を参照されたい）。
問題に対する慣用的技術は、時間を浪費し、退屈であ
り、そして／または労力を要する。これらの方法の幾つ
かは、生物学的サンプルを培養して、増幅前に、所望の
核酸断片を含むはずの生物数を増加させることを含む
（Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ
Ｌａｎｃｅｔ，１９８９年１１月４日、ｐｐ．１０６９
−１０７１；およびＰｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，１
９９１年４月、ｐｐ．７１２−７１７を参照された
い）。しかしながら、これらの方法はさらに日数を要す
る。他の当業者は臨床サンプルよりも精製された培養物
のみを分析した（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ｖｏｌ．２８，１９９０年
３月、ｐｐ．５１３−５１８；Ｈａｎｃｅｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖ
ｏｌ．３，１９８９年，ｐｐ．８４３−８４９；および
Ｆｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，１９９１年８月、ｐｐ．１
７４４−１７４７を参照されたい）。さらに他の当業者
は、退屈なＤＮＡ抽出法を用いて増幅前にＤＮＡを精製
した（ＤｅＷｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２８，１９９０年１１月；
およびＳｊｏｂｒｉｎｇｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ２８，１９９０年１０
月、ｐｐ．２２００−２２０４を参照されたい）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、検出される
核酸を含む微生物の生物学的サンプルから非標的核酸を
除去する方法において、慣用的技術の、時間を浪費し、
退屈であり、且つ労力を要する点を克服するものであ
り、本発明の方法は、エンドヌクレアーゼおよびエキソ
ヌクレアーゼの様式により二本鎖または一本鎖核酸を分
解する酵素の混合物に生物学的サンプルを暴露すること
を含む。
核酸を含む微生物の生物学的サンプルから非標的核酸を
除去する方法において、慣用的技術の、時間を浪費し、
退屈であり、且つ労力を要する点を克服するものであ
り、本発明の方法は、エンドヌクレアーゼおよびエキソ
ヌクレアーゼの様式により二本鎖または一本鎖核酸を分
解する酵素の混合物に生物学的サンプルを暴露すること
を含む。
【０００５】
【課題を解決するための手段】特に有用な酵素混合物の
組み合わせは、（ａ）ＤＮａｓｅＩ；（ｂ）Ｓ１ヌクレ
アーゼ；および（ｃ）マングビーンヌクレアーゼであ
る。生物学的サンプルからの非標的核酸の除去は、通
常、酵素の混合物に暴露する前にサンプルを液化する場
合に、より効果的である。酵素の混合物に暴露した後、
通常、微生物を溶解して核酸を放出させて、それらを検
出前に増幅する。
組み合わせは、（ａ）ＤＮａｓｅＩ；（ｂ）Ｓ１ヌクレ
アーゼ；および（ｃ）マングビーンヌクレアーゼであ
る。生物学的サンプルからの非標的核酸の除去は、通
常、酵素の混合物に暴露する前にサンプルを液化する場
合に、より効果的である。酵素の混合物に暴露した後、
通常、微生物を溶解して核酸を放出させて、それらを検
出前に増幅する。
【０００６】本発明のさまざまな利点および新規な特徴
は、実施例１−７においてより詳しく記載されるとお
り、さまざまな酵素混合物の効果を示すさまざまな電気
泳動写真を示す図１−９を参照することにより、さらに
よく理解されるはずである。
は、実施例１−７においてより詳しく記載されるとお
り、さまざまな酵素混合物の効果を示すさまざまな電気
泳動写真を示す図１−９を参照することにより、さらに
よく理解されるはずである。
【０００７】本発明は、検出される核酸（標的核酸）を
含む微生物の生物学的サンプルから非標的核酸を除去す
る方法に関する。非標的核酸の除去は、異なる様式によ
り核酸を分解する酵素の混合物に生物学的サンプルを暴
露することにより、少なくとも一部は達成される。
含む微生物の生物学的サンプルから非標的核酸を除去す
る方法に関する。非標的核酸の除去は、異なる様式によ
り核酸を分解する酵素の混合物に生物学的サンプルを暴
露することにより、少なくとも一部は達成される。
【０００８】酵素混合物の組み合わせは、エンドヌクレ
アーゼの様式により核酸を分解する少なくともひとつの
酵素と、エキソヌクレアーゼの様式により核酸を分解す
る少なくともひとつの酵素を含む。エンドヌクレアーゼ
の様式の酵素は、内部の位置か、または核酸または断片
の５’末端と３’末端の間で、二本鎖および／または一
本鎖または核酸断片を分断する。対照的に、エキソヌク
レアーゼ様式の酵素は、核酸または断片の５’および／
または３’末端において二本鎖および／または一本鎖核
酸または断片を分断する。
アーゼの様式により核酸を分解する少なくともひとつの
酵素と、エキソヌクレアーゼの様式により核酸を分解す
る少なくともひとつの酵素を含む。エンドヌクレアーゼ
の様式の酵素は、内部の位置か、または核酸または断片
の５’末端と３’末端の間で、二本鎖および／または一
本鎖または核酸断片を分断する。対照的に、エキソヌク
レアーゼ様式の酵素は、核酸または断片の５’および／
または３’末端において二本鎖および／または一本鎖核
酸または断片を分断する。
【０００９】特に効果的な酵素混合物の組み合わせの一
例は、（１）二本鎖核酸を分解する酵素；（２）核酸の
３’末端を分解する酵素；および（３）一本鎖核酸の
５’末端を分解する酵素を含む。核酸の３’末端を分解
する酵素は、一本鎖または二本鎖の核酸に効果的であ
る。核酸が二本鎖の場合、第３の酵素は結果として生じ
る５’末端の一本鎖突出部分を分解する。
例は、（１）二本鎖核酸を分解する酵素；（２）核酸の
３’末端を分解する酵素；および（３）一本鎖核酸の
５’末端を分解する酵素を含む。核酸の３’末端を分解
する酵素は、一本鎖または二本鎖の核酸に効果的であ
る。核酸が二本鎖の場合、第３の酵素は結果として生じ
る５’末端の一本鎖突出部分を分解する。
【００１０】別の酵素混合物の組み合わせは、（１）二
本鎖核酸を分解する酵素；（２）核酸の５’末端を分解
する酵素；および（３）一本鎖核酸の３’末端を分解す
る酵素を含む。この組み合わせにより、核酸が二本鎖の
場合、第３の酵素は結果として生じる３’末端の一本鎖
部分を分解する。以下の酵素の表およびそれらの作用並
びに本明細書の記載および実施例により、当業者であれ
ば、過度に実験を行うことなくエンドヌクレアーゼおよ
びエキソヌクレアーゼの様式により分解する酵素混合物
の効果的な組み合わせを選択できる。
本鎖核酸を分解する酵素；（２）核酸の５’末端を分解
する酵素；および（３）一本鎖核酸の３’末端を分解す
る酵素を含む。この組み合わせにより、核酸が二本鎖の
場合、第３の酵素は結果として生じる３’末端の一本鎖
部分を分解する。以下の酵素の表およびそれらの作用並
びに本明細書の記載および実施例により、当業者であれ
ば、過度に実験を行うことなくエンドヌクレアーゼおよ
びエキソヌクレアーゼの様式により分解する酵素混合物
の効果的な組み合わせを選択できる。
【００１１】上記組み合わせにおける酵素の量は、生物
学的サンプルの量に依存する。通常はしかしながら、酵
素の量は酵素の販売主により規定されたユニットとして
定量される。例えば、ＤＮａｓｅＩのユニットは以下の
とおりに規定される：１ユニットは、Ｋｕｎｉｔｚ．
Ｍ．（１９５０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｖｏｌ
３３，ｐ３４９に特定された条件下で２５℃およびｐＨ
５．０において高頻度でポリメライズされたＤＮＡに作
用させる場合のミリリットルあたりの２６０ｎｍにおけ
る吸光度の０．０１の増加をもたらす。
学的サンプルの量に依存する。通常はしかしながら、酵
素の量は酵素の販売主により規定されたユニットとして
定量される。例えば、ＤＮａｓｅＩのユニットは以下の
とおりに規定される：１ユニットは、Ｋｕｎｉｔｚ．
Ｍ．（１９５０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｖｏｌ
３３，ｐ３４９に特定された条件下で２５℃およびｐＨ
５．０において高頻度でポリメライズされたＤＮＡに作
用させる場合のミリリットルあたりの２６０ｎｍにおけ
る吸光度の０．０１の増加をもたらす。
【００１２】通常、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌ
クレアーゼ様式の酵素のみを用いる場合、ユニット比は
約１０：１の範囲であり、約１：１が好ましい。しかし
ながら、二本鎖核酸を分解する酵素（ａ）と核酸の３’
末端を分解する酵素（ｂ）および一本鎖核酸の５’末端
を分解する酵素（ｃ）の好ましいユニット比は約２：
１：１である。典型的には、処理される生物学的サンプ
ルは０から５００の微生物に相当するＤＮＡを含み、か
つ上記組み合わせにおける３つの酵素は、約１０ユニッ
ト：５ユニット：５ユニットから約５００ユニット：２
５０ユニット：２５０ユニットの量で存在するが、約５
０ユニット：２５ユニット：２５ユニットが好ましい。
クレアーゼ様式の酵素のみを用いる場合、ユニット比は
約１０：１の範囲であり、約１：１が好ましい。しかし
ながら、二本鎖核酸を分解する酵素（ａ）と核酸の３’
末端を分解する酵素（ｂ）および一本鎖核酸の５’末端
を分解する酵素（ｃ）の好ましいユニット比は約２：
１：１である。典型的には、処理される生物学的サンプ
ルは０から５００の微生物に相当するＤＮＡを含み、か
つ上記組み合わせにおける３つの酵素は、約１０ユニッ
ト：５ユニット：５ユニットから約５００ユニット：２
５０ユニット：２５０ユニットの量で存在するが、約５
０ユニット：２５ユニット：２５ユニットが好ましい。
【００１３】本発明の使用に好ましいエンドヌクレアー
ゼおよびエキソヌクレアーゼ酵素の適当な例およびそれ
ぞれの市販者または製造者およびその作用機構を以下の
表１に示す。
ゼおよびエキソヌクレアーゼ酵素の適当な例およびそれ
ぞれの市販者または製造者およびその作用機構を以下の
表１に示す。
【００１４】
【表１】 エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ酵素 酵素 市販者 作用機構 ＤＮａｓｅＩ ベーリンガー マグネシウムまたはカルシウム存在下で マンハイム ０℃−９０℃（最適は３７℃）において 最適ｐＨ７．８でホスホジエステル結合を 切断することにより二本鎖核酸を分解する エキソヌクレ ベーリンガー ホスホジエステル結合の加水分解および アーゼＩＩＩ マンハイム 二本鎖核酸の３’ヒドロキシル末端の５’ モノヌクレオチドの段階除去により二本鎖 核酸の３’末端を分解する（最適温度は ６６ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０ および６ｍＭ ＭｇＣｌ2中で３７℃） エンドヌクレ ベーリンガー 一本鎖の３’および５’末端の分解 アーゼＶＩＩ マンハイムライ フテクノロジー マイクロ ベーリンガー 一本鎖の３’および５’末端の分解 コッカル マンハイム ヌクレアーゼ エキソヌクレ ベーリンガー 一本鎖の３’および５’末端の分解 アーゼＩ マンハイムユナ イテドステーツ バイオケミカル マングビーン ニュー ５’モノヌクレオチドの段階除去により ヌクレアーゼ イングランド 一本鎖核酸の５’末端を分解して平滑末端の バイオラブズ 断片を生じる（最適温度３７℃、３０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ2および０．５ ％グリセロール） Ｂａｌ３１ ベーリンガー 二本鎖核酸の３’ヒドロキシル末端の５’ ヌクレアーゼ マンハイム モノヌクレオチドの段階除去により二本鎖 核酸の３’末端を分解する（最適温度は ６６ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０ および６ｍＭ ＭｇＣｌ2中で３７℃） Ｓ１ ベーリンガー ３７℃において２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ ヌクレアーゼ マンハイム ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ｍＭ ＺｎＣｌ2および０．５％グリセロールにお ける完全分解により一本鎖核酸の３’末端を 分解する 上記の表１はエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレア
ーゼの様式により核酸を分解するすべての酵素を示すこ
とを意図してはおらず、あくまで例示である。当業者で
あれば、市販者および製造者のカタログ、当業界の文献
や一般的知識を基にして同様の酵素を認識することがで
きる。
ーゼの様式により核酸を分解するすべての酵素を示すこ
とを意図してはおらず、あくまで例示である。当業者で
あれば、市販者および製造者のカタログ、当業界の文献
や一般的知識を基にして同様の酵素を認識することがで
きる。
【００１５】好ましくは、生物学的サンプルを適切なイ
ンキュベーションバッファー中で酵素混合物に暴露す
る。好ましいバッファーは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．５）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ2；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；および１％グリセロー
ルからなる。インキュベーション時間および温度は、当
業者であれば過度の実験を行うことなしに決定できる。
ミコバクテリウムツベルクロシスを含む可溶化ヒト痰サ
ンプルに関して、約３７℃における１５分間の酵素混合
物とサンプルとのインキュベートが、十分に非標的核酸
を除去し、続く増幅により、１００マイクログラムのヒ
トＤＮＡを含むサンプル中の１０生物数ほどのミコバク
テリウムツベルクロシスＤＮＡの検出が可能になること
が見いだされた。
ンキュベーションバッファー中で酵素混合物に暴露す
る。好ましいバッファーは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．５）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ Ｚｎ
Ｃｌ2；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；および１％グリセロー
ルからなる。インキュベーション時間および温度は、当
業者であれば過度の実験を行うことなしに決定できる。
ミコバクテリウムツベルクロシスを含む可溶化ヒト痰サ
ンプルに関して、約３７℃における１５分間の酵素混合
物とサンプルとのインキュベートが、十分に非標的核酸
を除去し、続く増幅により、１００マイクログラムのヒ
トＤＮＡを含むサンプル中の１０生物数ほどのミコバク
テリウムツベルクロシスＤＮＡの検出が可能になること
が見いだされた。
【００１６】酵素混合物に暴露される生物学的サンプル
は、微生物を含みうる多くのサンプルであり、即ち、血
液、血漿、痰、尿、精液、唾液、胸膜液、気管支吸引
液、鼻咽頭サンプル、歯頸部粘液、髄液、腹膜液、糞お
よび組織を含む。当業者には理解されるとおり、特定の
生物学的サンプルは特定の微生物を含みやすく、そして
即ち別の生物学的サンプルは別の微生物、例えばバクテ
リア、ウイルス、ミコバクテリア、ミコプラズマ、およ
びカビの核酸の検出に好ましい。例えば、ミコバクテリ
ウムツベルクロシスは、鼻咽頭サンプルおよび気管支吸
引液に共通に見いだされ、そしてウイルス生物、例えば
ＨＩＶは血清および血漿に共通に見いだされる。
は、微生物を含みうる多くのサンプルであり、即ち、血
液、血漿、痰、尿、精液、唾液、胸膜液、気管支吸引
液、鼻咽頭サンプル、歯頸部粘液、髄液、腹膜液、糞お
よび組織を含む。当業者には理解されるとおり、特定の
生物学的サンプルは特定の微生物を含みやすく、そして
即ち別の生物学的サンプルは別の微生物、例えばバクテ
リア、ウイルス、ミコバクテリア、ミコプラズマ、およ
びカビの核酸の検出に好ましい。例えば、ミコバクテリ
ウムツベルクロシスは、鼻咽頭サンプルおよび気管支吸
引液に共通に見いだされ、そしてウイルス生物、例えば
ＨＩＶは血清および血漿に共通に見いだされる。
【００１７】当業者には理解されるとおり、特定の生物
学的サンプルは、微生物の核酸を最適に検出するため
に、酵素混合物に暴露する前に、特定の操作、例えば液
化、希釈、および均一化を必要とする。同様に、酵素混
合物に生物学的サンプルを暴露したあとは、分解された
非標的核酸を、洗浄、遠心分離、アフィニティによる回
収およびまたはハイブリダイゼーションにより、微生物
細胞の溶解前にサンプルから除去することが好ましい。
他の操作によるサンプルの処理と同様に、当業者であれ
ば、加熱、化学的処理、酵素による処理、および物理的
／機械的方法を含む適切な溶解技術を思いつく。
学的サンプルは、微生物の核酸を最適に検出するため
に、酵素混合物に暴露する前に、特定の操作、例えば液
化、希釈、および均一化を必要とする。同様に、酵素混
合物に生物学的サンプルを暴露したあとは、分解された
非標的核酸を、洗浄、遠心分離、アフィニティによる回
収およびまたはハイブリダイゼーションにより、微生物
細胞の溶解前にサンプルから除去することが好ましい。
他の操作によるサンプルの処理と同様に、当業者であれ
ば、加熱、化学的処理、酵素による処理、および物理的
／機械的方法を含む適切な溶解技術を思いつく。
【００１８】細胞の溶解により、検出される微生物の核
酸は放出される。この核酸は、ＤＮＡあるいはＲＮＡで
あり、微生物の特性に依存する。同様に、非標的核酸も
ＤＮＡあるいはＲＮＡであり、二本鎖あるいは一本鎖で
ありうる。
酸は放出される。この核酸は、ＤＮＡあるいはＲＮＡで
あり、微生物の特性に依存する。同様に、非標的核酸も
ＤＮＡあるいはＲＮＡであり、二本鎖あるいは一本鎖で
ありうる。
【００１９】通常、放出された核酸の量は、そのままで
は信頼のおける検出には不十分であり、したがって、適
切な増幅工程に供される。当業者には公知の適切な増幅
工程は、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６
８３，２０２号に教示されたポリメラーゼチェインリア
クション法（ＰＣＲ）；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１（１９９
２）により教示された鎖置換増幅法（ＳＤＡ）；Ｂａｒ
ａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ．８８，１８９−１９３により教示され
たライゲースチェイン反応（ＬＣＲ）；Ｇｕａｔｅｌｌ
ｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．８７，１８７４−８；およ
びＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ ６，１１９７−１２０２により教示されたＱ−
ベータ増幅法を含む。
は信頼のおける検出には不十分であり、したがって、適
切な増幅工程に供される。当業者には公知の適切な増幅
工程は、米国特許第４，６８３，１９５号および４，６
８３，２０２号に教示されたポリメラーゼチェインリア
クション法（ＰＣＲ）；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１（１９９
２）により教示された鎖置換増幅法（ＳＤＡ）；Ｂａｒ
ａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ．８８，１８９−１９３により教示され
たライゲースチェイン反応（ＬＣＲ）；Ｇｕａｔｅｌｌ
ｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．８７，１８７４−８；およ
びＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ ６，１１９７−１２０２により教示されたＱ−
ベータ増幅法を含む。
【００２０】本発明は、以下の実施例によりさらに記載
されるが、いずれにおいても実施例は本発明を例示する
ためのものであり、本発明を限定するものではない。こ
れらの実施例において、すべてのパーセンテージは、固
体の場合は重量％であり、そして液体の場合は体積％で
あり、そして、すべての温度は特に記さない限り摂氏で
ある。
されるが、いずれにおいても実施例は本発明を例示する
ためのものであり、本発明を限定するものではない。こ
れらの実施例において、すべてのパーセンテージは、固
体の場合は重量％であり、そして液体の場合は体積％で
あり、そして、すべての温度は特に記さない限り摂氏で
ある。
【００２１】
実施例１ 非標的ＤＮＡを分解するためのＤＮａｓｅＩによる生物
学的サンプルの前処理目的 この実験は、ＰＣＲに関するＢａｒｋｅｒの公表された
溶解法（Ｓｒｉｔｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｖ
ｏｌ．５（１９９１）ｐｐ．３８５−６）を、ＤＮａｓ
ｅＩを用いて細胞溶解前に非標的ＤＮＡを除去するため
に改良することを意図する。
学的サンプルの前処理目的 この実験は、ＰＣＲに関するＢａｒｋｅｒの公表された
溶解法（Ｓｒｉｔｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｖ
ｏｌ．５（１９９１）ｐｐ．３８５−６）を、ＤＮａｓ
ｅＩを用いて細胞溶解前に非標的ＤＮＡを除去するため
に改良することを意図する。
【００２２】方法 凍らせたヒト痰サンプル（スメアーなＡＦＢ陰性）を室
温にて溶解した。２ｍｌのＢＡＣＴＥＣ（商標名）で培
養されたミコバクテリウムツベルクロシス（８×１
０6）を沈殿させてサンプルに加えた。他のサンプルを
陰性対照として保存した。
温にて溶解した。２ｍｌのＢＡＣＴＥＣ（商標名）で培
養されたミコバクテリウムツベルクロシス（８×１
０6）を沈殿させてサンプルに加えた。他のサンプルを
陰性対照として保存した。
【００２３】次に、サンプルをＮＡＬＣ（１％ Ｎ−ア
セチル−Ｌ−システイン（１００ｍＭ酢酸ナトリウムお
よび０．５Ｎ水酸化ナトリウム中））で液化して室温に
て１５分間インキュベートし、次に、３０００×ｇにお
ける２０分間の臨床遠心分離による遠心の前に、５０ｍ
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）により最終体積５０ｍ
ｌにした。上清をデカントし、沈殿物をミクロ遠心分離
チューブ中の２ｍｌの水に懸濁し、そして１２，０００
×ｇにおいて５分間遠心して沈殿させて、再びデカント
した。
セチル−Ｌ−システイン（１００ｍＭ酢酸ナトリウムお
よび０．５Ｎ水酸化ナトリウム中））で液化して室温に
て１５分間インキュベートし、次に、３０００×ｇにお
ける２０分間の臨床遠心分離による遠心の前に、５０ｍ
Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）により最終体積５０ｍ
ｌにした。上清をデカントし、沈殿物をミクロ遠心分離
チューブ中の２ｍｌの水に懸濁し、そして１２，０００
×ｇにおいて５分間遠心して沈殿させて、再びデカント
した。
【００２４】サンプルの半分を５００μｌのＴＥバッフ
ァー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に
懸濁し、そして１００℃において１５分間インキュベー
トした。残った半分を５００μｌのＤＮａｓｅバッファ
ー（０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび５ｍＭ硫酸マグネシ
ウム、ｐＨ５．０）および１００ユニットのＤＮａｓｅ
Ｉと共に３７℃において１５分間インキュベートし、そ
してＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度１％になるまで
加えた後にサンプルをさらに１００℃において１５分間
インキュベートした。
ァー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０）および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に
懸濁し、そして１００℃において１５分間インキュベー
トした。残った半分を５００μｌのＤＮａｓｅバッファ
ー（０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび５ｍＭ硫酸マグネシ
ウム、ｐＨ５．０）および１００ユニットのＤＮａｓｅ
Ｉと共に３７℃において１５分間インキュベートし、そ
してＴｒｉｔｏｎＸ−１００を最終濃度１％になるまで
加えた後にサンプルをさらに１００℃において１５分間
インキュベートした。
【００２５】両方のセットのサンプルを１／１０，００
０倍まで連続希釈した。次に、５μｌアリコートを標準
ＰＣＲ混合物に加え、ミコバクテリウムツベルクロシス
複合体特異的プライマーを用いて９４℃において１分
間、６２℃において１分間、そして７２℃において１分
間を３０サイクルさせた（ミコバクテリウムツベルクロ
シス複合体は、ミコバクテリウムボビス、ミコバクテリ
ウムボビス−ＢＣＧ、ミコバクテリウムアフリカナムお
よびミコバクテリウムミクロチを含む）。各ＰＣＲ混合
物の一部は１０％アクリルアミドゲルにより電気泳動し
た。
０倍まで連続希釈した。次に、５μｌアリコートを標準
ＰＣＲ混合物に加え、ミコバクテリウムツベルクロシス
複合体特異的プライマーを用いて９４℃において１分
間、６２℃において１分間、そして７２℃において１分
間を３０サイクルさせた（ミコバクテリウムツベルクロ
シス複合体は、ミコバクテリウムボビス、ミコバクテリ
ウムボビス−ＢＣＧ、ミコバクテリウムアフリカナムお
よびミコバクテリウムミクロチを含む）。各ＰＣＲ混合
物の一部は１０％アクリルアミドゲルにより電気泳動し
た。
【００２６】結果 単に加熱しただけのサンプルはＤＮａｓｅＩ処理サンプ
ルと同様の結果を生じた。ＤＮａｓｅＩは非標的ＤＮＡ
を１０００塩基以下に切断した。いずれの方法において
も、感度は、１０ミコバクテリウムツベルクロシスほど
であり、ＰＣＲがＤＮａｓｅＩ処理により妨害されない
ことを示す。
ルと同様の結果を生じた。ＤＮａｓｅＩは非標的ＤＮＡ
を１０００塩基以下に切断した。いずれの方法において
も、感度は、１０ミコバクテリウムツベルクロシスほど
であり、ＰＣＲがＤＮａｓｅＩ処理により妨害されない
ことを示す。
【００２７】実施例２ ３つの酵素の組み合わせによるヒトＤＮＡの処理方法 酵素バッファー（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
５．０、５ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭリン酸カルシ
ウム、１ｍＭ硫化亜鉛）の５０μｌアリコートを０．６
ｍｌの滅菌チューブに加えた。各チューブに２．５μｇ
の胎盤ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）も加えた。
５．０、５ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭリン酸カルシ
ウム、１ｍＭ硫化亜鉛）の５０μｌアリコートを０．６
ｍｌの滅菌チューブに加えた。各チューブに２．５μｇ
の胎盤ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）も加えた。
【００２８】酵素 ＤＮａｓｅＩ，１００ユニット＝１０μｌ（１０，００
０ユニット／ｍｌ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ，１００
ユニット＝１μｌ（１００，０００ユニット／ｍｌ） マングビーンヌクレアーゼ，１０ユニット＝１μｌ（１
０，０００ユニット／ｍｌ）サンプル １．未処理；３７℃において３０分間インキュベート ２．未処理、３７℃において３０分間インキュベート
し、次に１００℃において５分間 ３．１００ユニットのＤＮａｓｅＩ、３７℃において３
０分間インキュベートし、次に１００℃において５分間 ４．１００／１０ユニットのエキソヌクレアーゼＩＩＩ
／マングビーンヌクレアーゼ、３７℃において３０分間
インキュベートし、次に１００℃において５分間 ５．１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓｅＩ／エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼ、
３７℃において３０分間、次に１００℃において５分間 ６．１００℃において５分間インキュベート、次に４℃
に冷却；次に１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓ
ｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレ
アーゼ、３７℃において３０分間、次に１００℃におい
て５分間 ７．１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓｅＩ／エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼ、
３７℃において３０分間 反応後、すべてのサンプルをフェノール／クロロホルム
抽出し、エタノールにより以下の方法で２日間−２０℃
において沈殿させた。
０ユニット／ｍｌ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ，１００
ユニット＝１μｌ（１００，０００ユニット／ｍｌ） マングビーンヌクレアーゼ，１０ユニット＝１μｌ（１
０，０００ユニット／ｍｌ）サンプル １．未処理；３７℃において３０分間インキュベート ２．未処理、３７℃において３０分間インキュベート
し、次に１００℃において５分間 ３．１００ユニットのＤＮａｓｅＩ、３７℃において３
０分間インキュベートし、次に１００℃において５分間 ４．１００／１０ユニットのエキソヌクレアーゼＩＩＩ
／マングビーンヌクレアーゼ、３７℃において３０分間
インキュベートし、次に１００℃において５分間 ５．１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓｅＩ／エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼ、
３７℃において３０分間、次に１００℃において５分間 ６．１００℃において５分間インキュベート、次に４℃
に冷却；次に１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓ
ｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレ
アーゼ、３７℃において３０分間、次に１００℃におい
て５分間 ７．１００／１００／１０ユニットのＤＮａｓｅＩ／エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼ、
３７℃において３０分間 反応後、すべてのサンプルをフェノール／クロロホルム
抽出し、エタノールにより以下の方法で２日間−２０℃
において沈殿させた。
【００２９】フェノール／クロロホルム法：等量の抽出
すべきサンプルに５０：４８：２の緩衝化フェノール、
クロロホルム、イソアミルアルコール溶液を加えた。ボ
ルテックス撹拌し、次にサンプルを１２，０００×にて
１分間遠心分離した。ＤＮＡは上層に存在し、蛋白質は
中間層および下層に存在する。上層に２倍容の７０％氷
冷エタノールおよび１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．５）を加えてエタノール沈殿させた。サンプ
ルを１２，０００×ｇの遠心分離に供し、上清を除去し
た。
すべきサンプルに５０：４８：２の緩衝化フェノール、
クロロホルム、イソアミルアルコール溶液を加えた。ボ
ルテックス撹拌し、次にサンプルを１２，０００×にて
１分間遠心分離した。ＤＮＡは上層に存在し、蛋白質は
中間層および下層に存在する。上層に２倍容の７０％氷
冷エタノールおよび１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．５）を加えてエタノール沈殿させた。サンプ
ルを１２，０００×ｇの遠心分離に供し、上清を除去し
た。
【００３０】サンプルを乾燥し、１７μｌの滅菌水およ
び３μｌの泳動染料（２５％Ｆｉｃｏｌｌ−４００，
０．２５％キシレンシアノールおよび０．２５％ブロモ
フェノールブルー染料）に懸濁して、１％アガロースゲ
ル上で電気泳動した。
び３μｌの泳動染料（２５％Ｆｉｃｏｌｌ−４００，
０．２５％キシレンシアノールおよび０．２５％ブロモ
フェノールブルー染料）に懸濁して、１％アガロースゲ
ル上で電気泳動した。
【００３１】結果 ＤＮａｓｅＩは完全に２．５μｇのヒトＤＮＡを分解し
た。また、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびマングビー
ンヌクレアーゼの組み合わせも顕著にＤＮＡの大きさを
減少させた。３つすべての酵素の使用も図１に示すとお
り一本鎖および二本鎖ＤＮＡを完全に消失させたが、図
１は１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気
泳動写真を示し、各レーンは以下のとおりであった。
た。また、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびマングビー
ンヌクレアーゼの組み合わせも顕著にＤＮＡの大きさを
減少させた。３つすべての酵素の使用も図１に示すとお
り一本鎖および二本鎖ＤＮＡを完全に消失させたが、図
１は１×ＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル電気
泳動写真を示し、各レーンは以下のとおりであった。
【００３２】レーン １．２３ｋｂ ＤＮＡラダー ２．未処理ＤＮＡ（サンプル１） ３．ボイルされたＤＮＡ（サンプル２） ４．ＤＮａｓｅＩ処理ＤＮＡ（サンプル３） ５．エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレア
ーゼ処理ＤＮＡ（サンプル４） ６．ＤＮａｓｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マング
ビーンヌクレアーゼ処理ＤＮＡ（サンプル５） ７．予めボイルされたＤＮＡをＤＮａｓｅＩ／エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼで処理
（サンプル６） ８．ＤＮａｓｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マング
ビーンヌクレアーゼ処置ＤＮＡをボイルしなかった（サ
ンプル７） 実施例３ ３つの酵素の組み合わせが一本鎖および二本鎖ＤＮＡの
両方を消失させる能力およびサンプルＤＮＡに対するＳ
１ヌクレアーゼの評価目的 この実験は、Ｓ１ヌクレアーゼ並びに実施例２の３つの
酵素の混合物が一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を消失
させる能力を試験した。
ーゼ処理ＤＮＡ（サンプル４） ６．ＤＮａｓｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マング
ビーンヌクレアーゼ処理ＤＮＡ（サンプル５） ７．予めボイルされたＤＮＡをＤＮａｓｅＩ／エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ／マングビーンヌクレアーゼで処理
（サンプル６） ８．ＤＮａｓｅＩ／エキソヌクレアーゼＩＩＩ／マング
ビーンヌクレアーゼ処置ＤＮＡをボイルしなかった（サ
ンプル７） 実施例３ ３つの酵素の組み合わせが一本鎖および二本鎖ＤＮＡの
両方を消失させる能力およびサンプルＤＮＡに対するＳ
１ヌクレアーゼの評価目的 この実験は、Ｓ１ヌクレアーゼ並びに実施例２の３つの
酵素の混合物が一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を消失
させる能力を試験した。
【００３３】方法 １４のチューブを用意し、各々のチューブは１０μｌの
体積で５μｇのヒトゲノミックＤＮＡを含む。各サンプ
ルは、１０μｌの１０×濃縮バッファー（各酵素に適切
なバッファー）を含み、そして全チューブは滅菌水で１
００μｌにした。酵素インキュベート前に、チューブ８
−１４を１００℃において５分間インキュベートし、そ
して速やかに２０℃に冷却した。
体積で５μｇのヒトゲノミックＤＮＡを含む。各サンプ
ルは、１０μｌの１０×濃縮バッファー（各酵素に適切
なバッファー）を含み、そして全チューブは滅菌水で１
００μｌにした。酵素インキュベート前に、チューブ８
−１４を１００℃において５分間インキュベートし、そ
して速やかに２０℃に冷却した。
【００３４】サンプル １．未処理ＤＮＡ ２．＋ＤＮａｓｅＩ ３．＋エキソヌクレアーゼＩＩＩ ４．＋マングビーンヌクレアーゼ ５．＋Ｓ１ヌクレアーゼ ６．＋ＤＮａｓｅＩ／Ｓ１ ７．＋ＤＮａｓｅＩ／マングビーン／エキソヌクレアー
ゼＩＩＩ ８．ボイルされたＤＮＡ ９．＋ＤＮａｓｅＩ １０．＋エキソヌクレアーゼＩＩＩ １１．＋マングビーンヌクレアーゼ １２．＋Ｓ１ヌクレアーゼ １３．＋ＤＮａｓｅＩ／Ｓ１ １４．＋ＤＮａｓｅＩ／マングビーン／エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ 以下の酵素量を上記のサンプルに加えた。
ゼＩＩＩ ８．ボイルされたＤＮＡ ９．＋ＤＮａｓｅＩ １０．＋エキソヌクレアーゼＩＩＩ １１．＋マングビーンヌクレアーゼ １２．＋Ｓ１ヌクレアーゼ １３．＋ＤＮａｓｅＩ／Ｓ１ １４．＋ＤＮａｓｅＩ／マングビーン／エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ 以下の酵素量を上記のサンプルに加えた。
【００３５】ＤＮａｓｅＩ＝２５ユニット＝１０，００
０ユニット／ｍｌストックを２５μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ＝１００ユニット＝１００，
０００ユニット／ｍｌストックを１μｌ マングビーンヌクレアーゼ＝１０ユニット＝１０，００
０ユニット／ｍｌストックを１μｌ Ｓ１ヌクレアーゼ＝１０ユニット＝４００ユニット／ｍ
ｌストックを１／１１１に希釈 以下のバッファーを、各々の対応する酵素に用いた。
０ユニット／ｍｌストックを２５μｌ エキソヌクレアーゼＩＩＩ＝１００ユニット＝１００，
０００ユニット／ｍｌストックを１μｌ マングビーンヌクレアーゼ＝１０ユニット＝１０，００
０ユニット／ｍｌストックを１μｌ Ｓ１ヌクレアーゼ＝１０ユニット＝４００ユニット／ｍ
ｌストックを１／１１１に希釈 以下のバッファーを、各々の対応する酵素に用いた。
【００３６】１０×Ｓ１ヌクレアーゼバッファー ２Ｍ 塩化ナトリウム ０．５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５） １０ｍＭ 硫化亜鉛 ５％ グリセロール１０×エキソヌクレアーゼＩＩＩバッファー ０．６６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ６６ｍＭ 塩化マグネシウム１０×マングビーンヌクレアーゼバッファー ３００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５） ５００ｍＭ 塩化ナトリウム １０ｍＭ 硫化亜鉛 ５０％ グリセロール１０×ＤＮａｓｅＩバッファー １Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５） １０ｍＭ 硫酸マグネシウム １０ｍＭ リン酸カルシウム すべてのサンプルを３７℃において３０分間インキュベ
ートし、次に１００℃において５分間インキュベートし
た。次に、すべてのサンプルをフェノール／クロロホル
ム抽出し、そして実施例２のとおりにエタノール沈殿さ
せた。サンプルを２０μｌの滅菌水＋３μｌの泳動染料
に懸濁し、そして１％アガロースゲル上で電気泳動して
エチジウムブロマイドで染色した。
ートし、次に１００℃において５分間インキュベートし
た。次に、すべてのサンプルをフェノール／クロロホル
ム抽出し、そして実施例２のとおりにエタノール沈殿さ
せた。サンプルを２０μｌの滅菌水＋３μｌの泳動染料
に懸濁し、そして１％アガロースゲル上で電気泳動して
エチジウムブロマイドで染色した。
【００３７】結果 酵素はさまざまな量にＤＮＡを分解した。二本鎖ＤＮＡ
に関しては（サンプル１−７）、ＤＮａｓｅＩがもっと
も効果的な酵素であった。一本鎖ＤＮＡに関しては（サ
ンプル８−１４）、エキソヌクレアーゼＩＩＩのみでは
ほとんど効果がなかったが、Ｓ１ヌクレアーゼはよく作
用した。また、ＤＮａｓｅＩとマングビーンヌクレアー
ゼの組み合わせは非常によく作用した。最もよい結果
は、３つの酵素の組み合わせにより得られ、二本鎖ＤＮ
Ａ源または一本鎖ＤＮＡ源のいずれにおいてもすべての
消化を示した。これらの結果から、ＤＮａｓｅＩが二本
鎖ＤＮＡに極めて効果的な酵素であり、マングビーンヌ
クレアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼが一本鎖ＤＮＡに極
めて効果的であったことが示唆された。
に関しては（サンプル１−７）、ＤＮａｓｅＩがもっと
も効果的な酵素であった。一本鎖ＤＮＡに関しては（サ
ンプル８−１４）、エキソヌクレアーゼＩＩＩのみでは
ほとんど効果がなかったが、Ｓ１ヌクレアーゼはよく作
用した。また、ＤＮａｓｅＩとマングビーンヌクレアー
ゼの組み合わせは非常によく作用した。最もよい結果
は、３つの酵素の組み合わせにより得られ、二本鎖ＤＮ
Ａ源または一本鎖ＤＮＡ源のいずれにおいてもすべての
消化を示した。これらの結果から、ＤＮａｓｅＩが二本
鎖ＤＮＡに極めて効果的な酵素であり、マングビーンヌ
クレアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼが一本鎖ＤＮＡに極
めて効果的であったことが示唆された。
【００３８】実施例４ ミコバクテリウムツベルクロシス細胞の溶解前の酵素混
合物を用いた生物学的サンプルの処理方法 ミコバクテリウムツベルクロシスは、１０6細胞／ｍｌ
にて細胞の１ｍｌアリコートを培養し、そして１２００
０×ｇにて５分間遠心分離して上清を捨てることにより
調製した。次に、沈殿物を滅菌水により１０4／ｍｌま
で連続希釈した。希釈されたミコバクテリウムツベルク
ロシスの１０μｌアリコートを１０チューブ各々に加
え、そして２つのストック（０．５μｇ／μｌおよび
２．５μｇ／μｌ）からのヒトＤＮＡを以下のとおりに
各チューブに加えた。
合物を用いた生物学的サンプルの処理方法 ミコバクテリウムツベルクロシスは、１０6細胞／ｍｌ
にて細胞の１ｍｌアリコートを培養し、そして１２００
０×ｇにて５分間遠心分離して上清を捨てることにより
調製した。次に、沈殿物を滅菌水により１０4／ｍｌま
で連続希釈した。希釈されたミコバクテリウムツベルク
ロシスの１０μｌアリコートを１０チューブ各々に加
え、そして２つのストック（０．５μｇ／μｌおよび
２．５μｇ／μｌ）からのヒトＤＮＡを以下のとおりに
各チューブに加えた。
【００３９】チューブ番号 ヒトＤＮＡ量（μｇ） １ ０ ２ １ ３ ５ ４ １０ ５ ２５ ６ ０ ７ １ ８ ５ ９ １０ １０ ２５ 以下の酵素の混合物をチューブ６−１０に加えた。
【００４０】ＤＮａｓｅＩ（２５ユニット） Ｓ１ヌクレアーゼ（１０ユニット） マングビーンヌクレアーゼ（１０ユニット） 酵素添加後、１×バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫
化亜鉛、１％グリセロール）を各チューブに加えて１０
０μｌにした。チューブを３７℃において３０分間イン
キュベートし、その後、各チューブにＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を最終濃度１％まで加えた。次に、すべてのチュ
ーブを１００℃において５分間インキュベートした。
ム、ｐＨ４．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫
化亜鉛、１％グリセロール）を各チューブに加えて１０
０μｌにした。チューブを３７℃において３０分間イン
キュベートし、その後、各チューブにＴｒｉｔｏｎＸ−
１００を最終濃度１％まで加えた。次に、すべてのチュ
ーブを１００℃において５分間インキュベートした。
【００４１】細胞５つのみを含む各サンプルの５μｌア
リコートを標準ＰＣＲ混合物に加えたが、該混合物は５
０μｌの体積であって、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．
０），０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ，４．５ｍＭ ＭｇＣｌ
2，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、２．５ユニ
ットのＴａｑポリメラーゼ、およびミコバクテリウムツ
ベルクロシスのインサーションシークエンス６１１０の
７４塩基対断片をコードするプライマー０．２５μＭを
含んだ。陽性および陰性対照は、以下のパラメーターに
おいて得た。
リコートを標準ＰＣＲ混合物に加えたが、該混合物は５
０μｌの体積であって、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．
０），０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ，４．５ｍＭ ＭｇＣｌ
2，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、２．５ユニ
ットのＴａｑポリメラーゼ、およびミコバクテリウムツ
ベルクロシスのインサーションシークエンス６１１０の
７４塩基対断片をコードするプライマー０．２５μＭを
含んだ。陽性および陰性対照は、以下のパラメーターに
おいて得た。
【００４２】 温度（℃） 時間 処理 ９４ ３分 変成 ９４ １分 変成 ６２ １分 アニーリング ７２ １分 伸長合成 （上記工程を３０回繰り返した） ７２ ７分 伸長合成 ４ 一晩 保存 ＰＣＲに続き、各生成物１０％を取り出し、１０％アク
リルアミドゲル上で電気泳動してエチジウムブロマイド
により視覚化した。残りのサンプルを、実施例２のとお
りにフェノールクロロホルム抽出してエタノール沈殿さ
せ、２０μｌの水および３μｌの染料に懸濁し、そして
１％アガロースゲル上で電気泳動してエチジウムブロマ
イドで視覚化した。
リルアミドゲル上で電気泳動してエチジウムブロマイド
により視覚化した。残りのサンプルを、実施例２のとお
りにフェノールクロロホルム抽出してエタノール沈殿さ
せ、２０μｌの水および３μｌの染料に懸濁し、そして
１％アガロースゲル上で電気泳動してエチジウムブロマ
イドで視覚化した。
【００４３】結果 図２、３および４のゲルの写真は、酵素処理してもしな
くても、ＰＣＲが最初のヒトＤＮＡ２５μｇまでにおい
て生成物を増幅したことを示す。より増幅された生成物
は、酵素処理を受けなかったサンプルにおいて観察され
るが、非特異的生成物（即ち、非標的核酸）は酵素処理
を受けたサンプルにおいてほとんど観察されなかった。
この実施例の酵素混合物は３０分間で５μｇまでのヒト
ＤＮＡを完全に分解し、それにより標的（即ち、ミコバ
クテリウムツベルクロシスの核酸）のみの検出が可能に
なったことが、アガロースゲルの結果から示された。
くても、ＰＣＲが最初のヒトＤＮＡ２５μｇまでにおい
て生成物を増幅したことを示す。より増幅された生成物
は、酵素処理を受けなかったサンプルにおいて観察され
るが、非特異的生成物（即ち、非標的核酸）は酵素処理
を受けたサンプルにおいてほとんど観察されなかった。
この実施例の酵素混合物は３０分間で５μｇまでのヒト
ＤＮＡを完全に分解し、それにより標的（即ち、ミコバ
クテリウムツベルクロシスの核酸）のみの検出が可能に
なったことが、アガロースゲルの結果から示された。
【００４４】特定すれば、図２は、１×ＴＢＥ中の１０
％アクリルアミドゲル上の未処理サンプルを示す。この
ゲルから、ＰＣＲの良好な感度が示されるが、非特異的
なバンドは観察されない。図３は、１×ＴＢＥ中の１０
％アクリルアミドゲル上の処理サンプルを示す。このゲ
ルの結果は図２より低い感度を示すが、非特異的なバン
ドは観察されない。図４は、ゲルの右半分が酵素混合物
によるヒトＤＮＡ２５μｇまでの完全分解を示す。図２
および３のレーンの並びは、以下のとおりである。
％アクリルアミドゲル上の未処理サンプルを示す。この
ゲルから、ＰＣＲの良好な感度が示されるが、非特異的
なバンドは観察されない。図３は、１×ＴＢＥ中の１０
％アクリルアミドゲル上の処理サンプルを示す。このゲ
ルの結果は図２より低い感度を示すが、非特異的なバン
ドは観察されない。図４は、ゲルの右半分が酵素混合物
によるヒトＤＮＡ２５μｇまでの完全分解を示す。図２
および３のレーンの並びは、以下のとおりである。
【００４５】レーン １．バイオマーカー標準 ２．０μｇ ヒトＤＮＡ ３．１μｇ ヒトＤＮＡ ４．５μｇ ヒトＤＮＡ ５．１０μｇ ヒトＤＮＡ ６．２５μｇ ヒトＤＮＡ ７．ミコバクテリウムツベルクロシス複合体ＤＮＡ領域
を含む直鎖状にされたＳＫ４．３プラスミドの１０3コ
ピー ８．ＰＣＲ混合物のみ ９．Ｈ2Ｏ陰性 １０．バッファー（図２においてはユニバーサルバッフ
ァー；図３においてはＴＥバッファー）中の直鎖状ＳＫ
４．３プラスミドの１０3コピー 図４のレーンの並びは以下の通りである。
を含む直鎖状にされたＳＫ４．３プラスミドの１０3コ
ピー ８．ＰＣＲ混合物のみ ９．Ｈ2Ｏ陰性 １０．バッファー（図２においてはユニバーサルバッフ
ァー；図３においてはＴＥバッファー）中の直鎖状ＳＫ
４．３プラスミドの１０3コピー 図４のレーンの並びは以下の通りである。
【００４６】レーン １．２３ｋｂラダー ２．０μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ３．１μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ４．５μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ５．１０μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ６．２５μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ７．ブランク ８．ブランク ９．０μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １０．１μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １１．５μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １２．１０μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １３．２５μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １４．２３ｋｂラダー 実施例５ ミコバクテリウムツベルクロシス細胞の溶解前の酵素混
合物を用いた非標的ＤＮＡの処理方法 以下の量のヒトＤＮＡを２とおりずつ１００μｌの体積
で調製した（すべてのサンプルを以下のユニバーサルバ
ッファー中に入れた：５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
４．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫化亜鉛、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１％グリセロール）。
合物を用いた非標的ＤＮＡの処理方法 以下の量のヒトＤＮＡを２とおりずつ１００μｌの体積
で調製した（すべてのサンプルを以下のユニバーサルバ
ッファー中に入れた：５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
４．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫化亜鉛、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１％グリセロール）。
【００４７】チューブ １．０μｇ ＤＮＡ ２．１０μｇ ＤＮＡ ３．２５μｇ ＤＮＡ ４．５０μｇ ＤＮＡ ５．１００μｇ ＤＮＡ すべてのチューブは、１００のミコバクテリウムツベル
クロシス細胞を含んだ。
クロシス細胞を含んだ。
【００４８】１セットのチューブを３７℃において１５
分間インキュベートし、そしてもう一方のセット下記の
酵素の混合物と共に３７℃において１５分間インキュベ
ートした。
分間インキュベートし、そしてもう一方のセット下記の
酵素の混合物と共に３７℃において１５分間インキュベ
ートした。
【００４９】ＤＮａｓｅＩ ５０ユニット マングビーンヌクレアーゼ ２５ユニット Ｓ１ヌクレアーゼ ２５ユニット 別の５チューブに関しては、各チューブが１００μｇの
ヒトＤＮＡおよび同一のユニバーサルバッファーを含
み、以下の酵素と共に３７℃において１５分間インキュ
ベートした。
ヒトＤＮＡおよび同一のユニバーサルバッファーを含
み、以下の酵素と共に３７℃において１５分間インキュ
ベートした。
【００５０】１．５０ユニットのＤＮａｓｅＩ ２．２５ユニットのマングビーンヌクレアーゼ ３．２５ユニットのＳ１ヌクレアーゼ ４．上記濃度の上記３酵素 ５．酵素非処理 １５分後、すべてのチューブを１００℃において５分間
インキュベートした。最初の２セットのサンプルから
は、各サンプル１０μｌをＰＣＲ混合物に加え、実施例
４のとおりに増幅した。各サンプルの残り（全３セッ
ト）は、実施例２のとおりにフェノールクロロホルム抽
出し、懸濁後、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
次に、各ＰＣＲ増幅産物の１０％を１０％アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで視覚化
した。
インキュベートした。最初の２セットのサンプルから
は、各サンプル１０μｌをＰＣＲ混合物に加え、実施例
４のとおりに増幅した。各サンプルの残り（全３セッ
ト）は、実施例２のとおりにフェノールクロロホルム抽
出し、懸濁後、１％アガロースゲル上で電気泳動した。
次に、各ＰＣＲ増幅産物の１０％を１０％アクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで視覚化
した。
【００５１】結果 酵素処理をしなかった場合、ＰＣＲは１００μｇの非標
的ＤＮＡ存在下における１００のミコバクテリウムツベ
ルクロシス生細胞を検出しなかった。酵素処理をする
と、増幅は観察されなかったが、アガロースゲルの結果
は、上記の３酵素の混合物は１５分間で１００μｇの非
標的ＤＮＡを分解することができたことを示す。特定す
れば、図５のゲルは、３酵素処理が１００μｇまでのヒ
トＤＮＡの分解を示し、そして図６は、全３酵素は完全
分解に必要であることを示す。この実験後、酵素による
標的ＤＮＡの分解を阻害するための可能な別法として、
酵素処理工程後の洗浄工程の必要性が提案された。図５
のレーンの並びは以下のとおりである。
的ＤＮＡ存在下における１００のミコバクテリウムツベ
ルクロシス生細胞を検出しなかった。酵素処理をする
と、増幅は観察されなかったが、アガロースゲルの結果
は、上記の３酵素の混合物は１５分間で１００μｇの非
標的ＤＮＡを分解することができたことを示す。特定す
れば、図５のゲルは、３酵素処理が１００μｇまでのヒ
トＤＮＡの分解を示し、そして図６は、全３酵素は完全
分解に必要であることを示す。この実験後、酵素による
標的ＤＮＡの分解を阻害するための可能な別法として、
酵素処理工程後の洗浄工程の必要性が提案された。図５
のレーンの並びは以下のとおりである。
【００５２】レーン １．２３ｋｂラダー ２．ブランク ３．０μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ４．１０μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ５．２５μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ６．５０μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ７．１００μｇ ヒトＤＮＡ（未処理） ８．ブランク ９．ブランク １０．０μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １１．１０μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １２．２５μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １３．５０μｇ ヒトＤＮＡ（処理） １４．１００μｇ ヒトＤＮＡ（処理） 図６のレーンの並びは以下のとおりである。
【００５３】レーン １．２３ｋｂラダー ２．ブランク ３．１００μｇ ヒトＤＮＡ−ＤＮａｓｅＩのみ ４．１００μｇ ヒトＤＮＡ−マングビーンヌクレアー
ゼのみ ５．１００μｇ ヒトＤＮＡ−Ｓ１ヌクレアーゼのみ ６．１００μｇ ヒトＤＮＡ−ＤＮａｓｅＩ／マングビ
ーンヌクレアーゼ／Ｓ１ヌクレアーゼ ７．ブランク ８．１００μｇ ヒトＤＮＡ−未処理 実施例６ ミコバクテリウムツベルクロシス細胞の溶解前の酵素手
段および次の洗浄工程による非標的ＤＮＡの除去方法 １×ユニバーサルバッファー（実施例５を参照）中に１
００μｇ非標的ヒトＤＮＡを含む８つのチューブ（全体
積１００μｌ）を調製した。チューブ１−４は各々１０
０のミコバクテリウムツベルクロシスを含んだ。以下の
４種の処理をサンプルに対して実施した。
ゼのみ ５．１００μｇ ヒトＤＮＡ−Ｓ１ヌクレアーゼのみ ６．１００μｇ ヒトＤＮＡ−ＤＮａｓｅＩ／マングビ
ーンヌクレアーゼ／Ｓ１ヌクレアーゼ ７．ブランク ８．１００μｇ ヒトＤＮＡ−未処理 実施例６ ミコバクテリウムツベルクロシス細胞の溶解前の酵素手
段および次の洗浄工程による非標的ＤＮＡの除去方法 １×ユニバーサルバッファー（実施例５を参照）中に１
００μｇ非標的ヒトＤＮＡを含む８つのチューブ（全体
積１００μｌ）を調製した。チューブ１−４は各々１０
０のミコバクテリウムツベルクロシスを含んだ。以下の
４種の処理をサンプルに対して実施した。
【００５４】１．チューブ１−５（酵素非処理）：サン
プルを３７℃において３０分間インキュベートし、最終
濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、
そしてサンプルを１００℃において５分間インキュベー
トして１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。
プルを３７℃において３０分間インキュベートし、最終
濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、
そしてサンプルを１００℃において５分間インキュベー
トして１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。
【００５５】２．チューブ２−６：５０ユニットのＤＮ
ａｓｅＩ、２５ユニットのマングビーンヌクレアーゼ、
および２５ユニットのＳ１ヌクレアーゼで３７℃におい
て３０分間処理した。最終濃度１％になるようにＴｒｉ
ｔｏｎＸ−１００を加え、そしてサンプルを１００℃に
おいて５分間インキュベートして１２０００×ｇにて１
５秒間ミクロ遠心分離した。
ａｓｅＩ、２５ユニットのマングビーンヌクレアーゼ、
および２５ユニットのＳ１ヌクレアーゼで３７℃におい
て３０分間処理した。最終濃度１％になるようにＴｒｉ
ｔｏｎＸ−１００を加え、そしてサンプルを１００℃に
おいて５分間インキュベートして１２０００×ｇにて１
５秒間ミクロ遠心分離した。
【００５６】３．チューブ３−７：処理２と同じ酵素で
処理し、最終濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を、そして最終濃度１ｍＭになるようにＥＤＴＡを
加えた、サンプルを１００℃において５分間インキュベ
ートして１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。
処理し、最終濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を、そして最終濃度１ｍＭになるようにＥＤＴＡを
加えた、サンプルを１００℃において５分間インキュベ
ートして１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。
【００５７】４．チューブ４−８：処理２と同じ酵素で
処理し、１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。上清をピペットで捨てて、沈殿物を１００μｌのＴ
Ｅバッファー＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に懸濁し
て、１００℃において５分間インキュベートした。
処理し、１２０００×ｇにて１５秒間ミクロ遠心分離し
た。上清をピペットで捨てて、沈殿物を１００μｌのＴ
Ｅバッファー＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に懸濁し
て、１００℃において５分間インキュベートした。
【００５８】１００μｇのヒト非標的ＤＮＡを各々含む
別の７サンプルを１０6，１０5，１０4，１０3，１
０2，１０1および１０0のミコバクテリウムツベルクロ
シスと混合した。これらのアンプルを処理２のとおりに
処理した。
別の７サンプルを１０6，１０5，１０4，１０3，１
０2，１０1および１０0のミコバクテリウムツベルクロ
シスと混合した。これらのアンプルを処理２のとおりに
処理した。
【００５９】各サンプルの２５μｌアリコート（即ち、
チューブ１−４における２５ミコバクテリウムツベルク
ロシス）を実施例４のとおりにＰＣＲで増幅し、２５μ
ｌの滅菌水を各混合物に加えた。ミコバクテリウムツベ
ルクロシスを入れなかったサンプル（チューブ５−８）
には、ミコバクテリウムツベルクロシス標的配列を含む
１０００コピーのプラスミドを入れた。各ＰＣＲ産物の
１０％を１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、エ
チジウムブロマイドで視覚化した。
チューブ１−４における２５ミコバクテリウムツベルク
ロシス）を実施例４のとおりにＰＣＲで増幅し、２５μ
ｌの滅菌水を各混合物に加えた。ミコバクテリウムツベ
ルクロシスを入れなかったサンプル（チューブ５−８）
には、ミコバクテリウムツベルクロシス標的配列を含む
１０００コピーのプラスミドを入れた。各ＰＣＲ産物の
１０％を１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、エ
チジウムブロマイドで視覚化した。
【００６０】結果 洗浄工程（処理４）を増やしたことによりミコバクテリ
ウムツベルクロシスの核酸の検出が増強されたことが示
される。サンプルを酵素処理（処理１）に供した場合に
増幅は観察されないが、加熱処理実施後に酵素処理のみ
を行った場合（処理２および３）はいくらかの増幅が観
察される。しかしながら、もっともよい結果は、酵素処
理後加熱前に洗浄により酵素を除去した場合に得られ
た。特定すれば、図７は、反応あたり１００コピーのミ
コバクテリウムツベルクロシスゲノミックＤＮＡおよび
ミコバクテリウムツベルクロシスＤＮＡ領域を含むプラ
スミドの両方がレーン６および１０のバンドとして明ら
かなとおりＰＣＲプライマーにより認識されたことを示
す。図７のレーンは以下のとおりである。
ウムツベルクロシスの核酸の検出が増強されたことが示
される。サンプルを酵素処理（処理１）に供した場合に
増幅は観察されないが、加熱処理実施後に酵素処理のみ
を行った場合（処理２および３）はいくらかの増幅が観
察される。しかしながら、もっともよい結果は、酵素処
理後加熱前に洗浄により酵素を除去した場合に得られ
た。特定すれば、図７は、反応あたり１００コピーのミ
コバクテリウムツベルクロシスゲノミックＤＮＡおよび
ミコバクテリウムツベルクロシスＤＮＡ領域を含むプラ
スミドの両方がレーン６および１０のバンドとして明ら
かなとおりＰＣＲプライマーにより認識されたことを示
す。図７のレーンは以下のとおりである。
【００６１】レーン １．ＤＮＡ標準 ２．陽性対照１０2生物 ３．１０2生物を用いた処理１ ４．１０2生物を用いた処理２ ５．１０2生物を用いた処理３ ６．１０2生物を用いた処理４ ７．処理１＋プラスミド ８．処理２＋プラスミド ９．処理３＋プラスミド １０．処理４＋プラスミド 生物数（タイトレーション）の結果を見れば（即ち、付
加された７チューブにおける）、検出された唯一のサン
プルは陽性の増幅対照、および１０6サンプルであっ
た。これはおそらく、過剰の酵素の使用および洗浄工程
の欠如によるものである。図８は、レーン３の陽性対照
およびレーン１０の１０6サンプルを示す。図８中のレ
ーンは以下のとおりである。
加された７チューブにおける）、検出された唯一のサン
プルは陽性の増幅対照、および１０6サンプルであっ
た。これはおそらく、過剰の酵素の使用および洗浄工程
の欠如によるものである。図８は、レーン３の陽性対照
およびレーン１０の１０6サンプルを示す。図８中のレ
ーンは以下のとおりである。
【００６２】レーン １．ＤＮＡ標準 ２．ブランク ３．１０2生物を用いた陽性対照 ４．１０0生物 ５．１０1生物 ６．１０2生物 ７．１０3生物 ８．１０4生物 ９．１０5生物 １０．１０6生物 実施例７ ミコバクテリウムツベルクロシス細胞の溶解および増幅
前の酵素混合物による生物学的サンプルの処理および洗
浄工程の最適化方法 ３つのストックから、以下のサンプルを調製したが、各
々は１×ユニバーサルバッファー（実施例５）中にあ
る。すべてのサンプルは全部で１００μｌであった。
（以下においてミコバクテリウムツベルクロシスをＭ．
ｔｂと表示する） １．１０6 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ２．１０5 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ３．１０4 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ４．１０3 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ５．１０2 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ６．１０1 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ７．１０0 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ８．０ Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ 上記サンプルの各々に対して、以下の酵素の混合物を加
えた。
前の酵素混合物による生物学的サンプルの処理および洗
浄工程の最適化方法 ３つのストックから、以下のサンプルを調製したが、各
々は１×ユニバーサルバッファー（実施例５）中にあ
る。すべてのサンプルは全部で１００μｌであった。
（以下においてミコバクテリウムツベルクロシスをＭ．
ｔｂと表示する） １．１０6 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ２．１０5 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ３．１０4 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ４．１０3 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ５．１０2 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ６．１０1 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ７．１０0 Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ ８．０ Ｍ．ｔｂ＋１００μｇヒト非標的ＤＮＡ 上記サンプルの各々に対して、以下の酵素の混合物を加
えた。
【００６３】ＤＮａｓｅＩ：５０ユニット マングビーンヌクレアーゼ：２５ユニット Ｓ１ヌクレアーゼ：２５ユニット サンプルを３７℃において１５分間インキュベートし、
次に１２０００×ｇにて５分間ミクロ遠心分離した。上
清をピペットで捨てた。各沈殿物はＴＥバッファーおよ
び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて１００μｌに
し、そして１００℃において１５分間インキュベートし
た。サンプルを冷却し、次に各サンプル２５μｌを実施
例４にしたがってＰＣＲ増幅し、そして実施例４にした
がって検出した。
次に１２０００×ｇにて５分間ミクロ遠心分離した。上
清をピペットで捨てた。各沈殿物はＴＥバッファーおよ
び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて１００μｌに
し、そして１００℃において１５分間インキュベートし
た。サンプルを冷却し、次に各サンプル２５μｌを実施
例４にしたがってＰＣＲ増幅し、そして実施例４にした
がって検出した。
【００６４】結果 増幅は、インプットが１０6生物数から１０1生物数まで
の場合に観察された。１０0サンプルは検出されなかっ
たが、陽性および陰性増幅対照は期待したとおりであっ
た。非標的ＤＮＡの残りはゲル上で全く観察されなかっ
た。特定すれば、図９は、最初のヒトＤＮＡ１００μｇ
中の１０のミコバクテリウムツベルクロシスの増幅サン
プルがＤＮＡ分解後に視覚化されたことを示す１０％ア
クリルアミドゲルである。図９中のレーンは以下のとお
りである。
の場合に観察された。１０0サンプルは検出されなかっ
たが、陽性および陰性増幅対照は期待したとおりであっ
た。非標的ＤＮＡの残りはゲル上で全く観察されなかっ
た。特定すれば、図９は、最初のヒトＤＮＡ１００μｇ
中の１０のミコバクテリウムツベルクロシスの増幅サン
プルがＤＮＡ分解後に視覚化されたことを示す１０％ア
クリルアミドゲルである。図９中のレーンは以下のとお
りである。
【００６５】レーン １．ＤＮＡ標準および陽性対照 ２．１０6生物 ３．１０5生物 ４．１０4生物 ５．１０3生物 ６．１０2生物 ７．１０1生物 ８．１０0生物 ９．陰性対照（ヒトＤＮＡ） １０．Ｈ2Ｏ対照 この実施例は、本発明の技術が、初期量１００μｇのヒ
ト非標的ＤＮＡ存在下において１０以下のミコバクテリ
ウムツベルクロシス細胞からのＤＮＡが検出可能である
ことを示す。
ト非標的ＤＮＡ存在下において１０以下のミコバクテリ
ウムツベルクロシス細胞からのＤＮＡが検出可能である
ことを示す。
【００６６】分子生物学および関連分野の当業者には明
らかなとおり、本発明の上記態様の他の修飾は特許請求
の範囲内のものであることを意図する。
らかなとおり、本発明の上記態様の他の修飾は特許請求
の範囲内のものであることを意図する。
【図１】図１は、実施例２の結果を示す電気泳動写真で
ある。
ある。
【図２】図２は、実施例４に記載された処理を行わなか
ったサンプルのポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真
である。
ったサンプルのポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真
である。
【図３】図３は、実施例４に記載された処理を行ったサ
ンプルのポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真であ
る。
ンプルのポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真であ
る。
【図４】図４は、実施例４のすべてのサンプルのアガロ
ースゲルの電気泳動写真である。
ースゲルの電気泳動写真である。
【図５】図５は、実施例５の３酵素処理の結果を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図６】図６は、実施例５の３酵素を各種組み合わせた
処理の結果を示す電気泳動写真である。
処理の結果を示す電気泳動写真である。
【図７】図７は、実施例６の処理１−４の結果を示す電
気泳動写真である。
気泳動写真である。
【図８】図８は、実施例６の対照を示す電気泳動写真で
ある。
ある。
【図９】図９は、実施例７の結果を示す電気泳動写真で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジー・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27709，チャペル・ヒル，マウント・ボラ ス・ロード 209
Claims (10)
- 【請求項１】 検出すべき核酸を含む微生物を含む生物
学的サンプルから混在する核酸を除去するための方法で
あって、酵素混合物に上記生物学的サンプルを暴露する
工程からなるが、その際、上記酵素混合物が、エンドヌ
クレアーゼの様式により核酸を分解する酵素およびエキ
ソヌクレアーゼの様式により核酸を分解する酵素の組み
合わせである、前記方法。 - 【請求項２】 上記酵素混合物が、以下： （ａ）二本鎖核酸を分解する酵素； （ｂ）核酸の３’末端を分解する酵素；および （ｃ）一本鎖核酸の５’末端を分解する酵素； の組み合わせからなる、請求項１記載の方法。
- 【請求項３】 二本鎖核酸を分解する酵素がＤＮａｓｅ
Ｉである、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 核酸の３’末端を分解する酵素が一本鎖
核酸の３’末端を分解する、請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 一本鎖核酸の３’末端を分解する酵素が
Ｓ１ヌクレアーゼである、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 核酸の３’末端を分解する酵素が二本鎖
核酸の３’末端を分解することにより一本鎖核酸の突出
部分を生ずる、請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 二本鎖核酸の３’末端を分解する酵素が
エキソヌクレアーゼＩＩＩである、請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】 一本鎖核酸の５’末端を分解する酵素が
マングビーンヌクレアーゼである、請求項２記載の方
法。 - 【請求項９】 混在する核酸がＤＮＡである、請求項２
記載の方法。 - 【請求項１０】 混在するＤＮＡが二本鎖である、請求
項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16677393A | 1993-12-14 | 1993-12-14 | |
| US166773 | 1993-12-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07204000A true JPH07204000A (ja) | 1995-08-08 |
| JP2601636B2 JP2601636B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=22604659
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6310515A Expired - Lifetime JP2601636B2 (ja) | 1993-12-14 | 1994-12-14 | 生物学的サンプルから非標的核酸を酵素により除去する方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0658621A1 (ja) |
| JP (1) | JP2601636B2 (ja) |
| CA (1) | CA2137728C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018042577A (ja) * | 2009-06-29 | 2018-03-22 | ルミネックス コーポレーション | ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9716664D0 (en) | 1997-08-06 | 1997-10-15 | Norwegian Inst Of Fisheries & | A method of removing nucleic acid contamination reactions |
| JP6105590B2 (ja) | 2011-09-22 | 2017-03-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | Ｄｎａ含有量を減少させる内因性ｄｎアーゼ活性 |
| GB201414745D0 (en) | 2014-08-19 | 2014-10-01 | Articzymes As | Exonucleases |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL78703A (en) * | 1985-05-10 | 1993-02-21 | Benzon Alfred | Method of producing extracellular enzymes, the enzymes produced thereby and compositions containing them; a hybrid plasmid and a dna fragment comprising dna encoding the enzymes; a microorganism harbouring the plasmid; and a method for removing nucleic acids from biological materials |
| DE3939771A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
| AU664050B2 (en) * | 1991-12-18 | 1995-11-02 | Becton Dickinson & Company | Process for lysing mycobacteria |
| CA2121659C (en) * | 1993-05-11 | 2000-11-28 | Michael C. Little | Sample processing method for mycobacteria |
-
1994
- 1994-12-09 CA CA002137728A patent/CA2137728C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-14 EP EP94309336A patent/EP0658621A1/en not_active Withdrawn
- 1994-12-14 JP JP6310515A patent/JP2601636B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018042577A (ja) * | 2009-06-29 | 2018-03-22 | ルミネックス コーポレーション | ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2137728C (en) | 1998-07-14 |
| JP2601636B2 (ja) | 1997-04-16 |
| EP0658621A1 (en) | 1995-06-21 |
| CA2137728A1 (en) | 1995-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7407762B2 (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法 | |
| US11584955B2 (en) | Application of Cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit | |
| US5731150A (en) | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis | |
| US4581333A (en) | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or reactant for the application of this method | |
| US5449603A (en) | Method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| US5773257A (en) | Method for producing primed nucleic acid templates | |
| US8183015B2 (en) | Biological reagents and methods to verify the efficiency of sample preparation and nucleic acid amplification and/or detection | |
| KR100238835B1 (ko) | 클라미디아 트라코마티스 검출용 조성물 및 검출 방법 | |
| AU2011255638B2 (en) | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids | |
| JPH06319599A (ja) | 核酸増幅反応の汚染除去方法 | |
| JP6773651B2 (ja) | ポリｄｎａスペーサー配列を有する配列変換およびシグナル増幅ｄｎａならびにそれらを用いた検出方法 | |
| US5605824A (en) | Composition for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| US5554503A (en) | Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis | |
| US20150057160A1 (en) | Pathogen screening | |
| CN119913238A (zh) | 用于即时核酸检测的组合物和方法 | |
| JP3134940B2 (ja) | 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 | |
| CN113388691A (zh) | 一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用 | |
| JPS6398400A (ja) | Ｄｎａの固定方法 | |
| WO1991006679A1 (en) | An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| US20160348189A1 (en) | Molecular detection of rna | |
| JP5722521B2 (ja) | 淋菌を検出するための試薬及び方法 | |
| JP4625019B2 (ja) | ナイセリア・ゴノロエアエ検出のための試薬および方法 | |
| JP2781749B2 (ja) | マイコバクテリアの溶菌方法 | |
| JP2601636B2 (ja) | 生物学的サンプルから非標的核酸を酵素により除去する方法 | |
| US20020102580A1 (en) | Removal of molecular assay interferences |