JPH0720432B2 - Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物を利用してDL−α−アミノニトリル化
合物から相当するＬ−α−アミノ酸類を製造する方法に
関する。Ｌ−α−アミノ酸類は、食品、飼料、医薬及び
化粧品等の種々の分野に利用される重要な化学物質であ
る。

従来技術 従来、Ｌ−α−アミノ酸類を製造する方法としては、発
酵法、合成法、酵素法及び抽出法が知られている。これ
らの方法のうち、合成法によるＬ−α−アミノ酸の製造
は、ストレツカー法或はその変法を用いてDL−α−アミ
ノ酸を合成し、次いで該アミノ酸を光学分割してＬ−α
−アミノ酸を製造するものであつて、光学分割の方法と
してアミノアシラーゼを用いる酵素法等を採用している
（「化学」誌増刊「不斉合成と光学分割の進歩」昭和57
年10月15日発行、第175頁）。

しかし、上記合成法によるＬ−α−アミノ酸の製造法
は、光学分割段階においてコスト高となるため、経済的
理由から近年、アミノ酸の製造に占める割合が徐々に低
下してきている。

また、上記ストレツカー法によるα−アミノ酸の合成に
おける合成中間体であるα−アミノニトリルから微生物
を利用してα−アミノ酸を製造しようとする試みも報告
されている〔Y.Fukuda et al.、「ジャーナル オブ
フアーメンテーション テクノロジイ」（J.Ferment.Te
hnol.）49、1011（1971）〕。しかし、この報告では、
コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）に属する
微生物を用いてDL−α−アミノプロピオニトリル並びに
DL−α−アミノイソバレロニトリルを加水分解してDL−
アラニン並びにDL−バリンを製造するものであつて、Ｌ
−α−アミノ酸は直接得られない。また、ブレビバクテ
リウム属（Brevibacterrium sp.）の菌株R312を用いてD
L−α−アミノニトリルを加水分解してアミノ酸を製造
する報告〔Ｊ−C Jallagas et al.「アドバンス オブ
バイオケミカル エンジニアリング」（Adv.Biochem.
Engineering,）14、１（1980）においても、DL−α−ア
ミノニトリルからはDL−α−アミノ酸しか得られていな
い。因に、上記報告は、ブレビバクテリウム属の菌株R3
12から得られた変異株てあるブレビバクテリウムsp.A4
を用いることによりDL−α−アミノニトリルからＬ−α
−アミノ酸とＤ−α−アミノ酸アミドとを生成し得るこ
とを開示しているが、DL−α−アミノニトリルからＬ−
α−アミノ酸のみを直接得ることに関しては、未だ報告
はみられない。

また、特開昭61−162191においてもα−アミノニトリル
化合物からはDL−アミノ酸が産出されることが開示され
ているように、α−アミノニトリル化合物からＬ−α−
アミノ酸を直接得た例は報告されていない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、特定な属から選択されるニトリルの加水分解
能を有する微生物を利用して、DL−α−アミノニトリル
類から直接Ｌ−α−アミノ酸類を製造するための方法を
提供することを課題とする。

本発明は、ロドコッカス属またはミコバクテリウム属に
属するニトリル加水分解能を有する微生物をpH8〜12の
条件下、主としてアムモニア系緩衝液中でDL−α−アミ
ノニトリル類に作用させるとＬ−α−アミノ酸類を選択
的に産出することの知見に基いてなされたものである。

以下本発明を詳しく説明する。

発明の構成 本発明の構成上の特徴は、ロドコッカス属またはミコバ
クテリウム属に属する群から選択されるニトリル加水分
解能を有する微生物を、pH8〜12の条件下、主としてア
ムモニア系緩衝液中でDL−α−アミノニトリル化合物に
作用させてＬ−α−アミノ酸を選択的に生産させること
にある。

課題を解決するための手段 本発明において利用される微生物は、上述のごとく、ロ
ドコッカス属またはミコバクテリウム属に属する群から
選択されるニトリルの加水分解能を有するものであつ
て、下記表１に示すものが例示し得る。

これらの微生物は工業技術院微生物工業技術研究所に表
１に示した寄託受理番号で昭和62年11月５日付で寄託さ
れている。

次に、上掲の各微生物の菌学的性状を表２に示す。

表２にみられるとおり、本発明で利用される微生物はい
ずれもグラム陽性の好気性菌であつて、嫌気状態では全
く生育しない。また、運動性を示さず、カタラーゼは陽
性であつて、耐熱性の胞子を形成しない。また、多形性
を示し、培養初期には菌糸状細胞が多く、分岐した細胞
や球形の細胞も認められる。糖の利用性については、糖
からガスを生成せず、酸生成力は微弱でリトマスミルク
に培養するとアルカリ性を示してミルクを青変する。

上記各微生物のうち、ロドコッカスsp.PC−29は、肉汁
寒天上ではやや乾いたシワ状の集落を作り、培養初期に
は分岐の著しい菌糸状の生育を示し、５〜32℃で生育す
るが、37℃では生育しない。

一方、ロドコッカスsp.PA−34、AB−16並びにBA−１
は、５〜10℃では生育しないが、37〜42℃でも生育し、
いずれも培養初期に菌糸状となり、その後に多数のOidi
ospore（分裂子）様の球状細胞を生ずる。

ミコバクテリウム sp.AB−43は、抗酸性染色（Acid−f
aststain）が陽性で45℃では生育せず、粘性の黄橙色の
集落を作る。

上記微生物は、それらの表２及び上述した性状に鑑み、
バージン マニユアル オブシステイマテイツク バク
テリオロジイ（Bergey′s Manual of Systematic Bacte
riology,第８版に基いて同定した。

本発明において、上記各微生物を利用してＬ−α−アミ
ノ酸を生産するのに用いる基質であるDL−α−アミノニ
トリル化合物（以下原料ニトリルと略記する）は、例え
ば〔「オルガニツク シンセシス コレクテイブ ボリ
ウム（Org.Syu.Col.Vol.）I,p,21、及びIII,p.84」〕並
びに〔Y.Fukuda et al.,「ジャーナル オブ フアーメ
ンテーシヨン テクノロジイ」（J.Ferment.Techno
l.,）49、1011（1971）〕等に記載された方法に従つて
容易に合成し得る。

本発明のDL−α−アミノニトリル化合物の一般式（１）
または（２）におけるＲには特に制限がないが、置換ア
ルキル基等のそれぞれに含まれる置換基は例えばヒドロ
キシ、メトキシ、メルカプト、メチルメルカプト、アミ
ノ、ハロゲン、カルボキシル、カルボクサミド、フエニ
ル、ヒドロキシフエニルあるいはグアニルなどである。

DL−α−アミノニトリル化合物としては、２−アミノプ
ロパンニトリル、２−アミノブタンニトリル、２−アミ
ノ−３−メチルブタンニトリル、２−アミノ−４−メチ
ルペンタンニトリル、２−アミノ−３−メチルペンタン
ニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンニトリ
ル、２−アミノ−３−ヒドロキシブタンニトリル、２−
アミノ−５−グアニジノペンタンニトリル、２−アミノ
−３−メチルカプトプロパンニトリル、2,7−ジアミノ
−4,5−ジチアオクタンニトリル、２−アミノ−４−メ
チルチオブタンニトリル、２−アミノ−３−フエニルプ
ロパンニトリル、３−（４−ヒドロキシフエニル）プロ
パンニトリル、３−アミノ−３−シアノプロパン酸、４
−アミノ−４−シアノブタン酸、３−アミノ−３−シア
ノプロパンアミド、４−アミノ−４−シアノブタンアミ
ド、2,6−ジアミノヘキサンニトリル、2,6−ジアミノ−
５−ヒドロキシヘキサンニトリル、２−アミノ−３−
（３−インドリル）プロパンニトリル、２−アミノ−３
−（４−イミダゾイル）プロパンニトリル、２−シアノ
ピロリジン、２−シアノ−４−ヒドロキシピロリジン、
２−アミノ−２−フエニルエタンニトリル等を例示し得
る。

本発明において、上記各原料ニトリルに、ロドコッカス
属またはミコバクテリウム属に属まするニトリルの加水
分解活性を有する前記の各微生物を作用させてＬ−α−
アミノ酸を生産するには、例えば下記（ａ）乃至（ｃ）
のいずれかの方法を適用するとよい。

すなわち、（ａ）微生物を、ニトリル化合物、例えばプ
ロピオニトリルを含む培地中で培養して増殖して得られ
た菌体に、原料ニトリルを接触させて反応させる方法、
（ｂ）微生物を予め培養し、増殖して得られた菌体をニ
トリル化合物、例えばプロピオニトリルに接触させた
後、該菌体に原料ニトリルを加えて反応させる方法、及
び（ｃ）微生物を予め培養し、増殖して得られた菌体に
原料ニトリルを直接接触させて反応させる方法を適用す
る。

これらの反応方法では、微生物として増殖後の菌体の破
砕物、乾燥菌体、あるいは分離精製されたニトリルの加
水分解酵素などの菌体処理物、あるいは常法に従つて固
定化した菌体および菌体処理物を用いることもできる。

上記（ａ）及び（ｂ）の方法で用いるニトリル化合物と
しては、プロピオニトリルのほかに、アセトニトリル、
ｎ−ブチロニトリル、ｎ−カプロニトリル、メタクリロ
ニトリル、イソブチロニトリル、グルタロニトリル、ト
リアクリロニトリル、クロトノニトリル、ラクトニトリ
ル、サクシノニトリル、アクリロニトリル、ベンゾニト
リル及びフエニルアセトニトリル等を例示し得る。

上記（ａ）の方法では、ニトリル化合物のほかに、炭素
源としてグルコース、シユクロース、糖蜜、澱粉加水分
解物のような糖質、もしくは酢酸等のごとき菌体増殖作
用を有する物質を培地に添加し、更に、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、尿素、アンモニア水、硫酸ナトリウム、アミ
ノ酸及びその他の資化性有機窒素化合物のような窒素
源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、塩化第２鉄、塩化カ
ルシウム、塩化マンガンのごとき無機塩類、及びホウ
素、銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわゆる微量元素、
更には必要に応じてビタミン類、酵母エキス、コーンス
テープリカーの如き成長促進物質を添加した培地に、上
記各微生物の種菌を接種し、好気的条件下で培養して菌
体を増殖させる。このようにして得られた菌体培養物、
又は該培養物から分離した菌体の懸濁液あるいは菌体処
理物に、原料ニトリルを供給して反応させる。

反応は、pH8〜12の範囲で１〜６日間行う。この範囲外
のpHでもＬ−体に富んだα−アミノ酸が生成するが、光
学純度が低く実用的でない。反応には種々の緩衝液を用
い得るが、アムモニア系の緩衝液がよく、アンモニア水
と塩化アンモニウム水溶液の混合物、アンモニア水と硫
酸アンモニウム水溶液の混合物、アムモニア水と酢酸ア
ンモニウム水溶液との混合物、アムモニア水と燐酸アン
モニウム水溶液との混合物等が好ましい。また、pH調節
剤として用いるアルカリとしてはアムモニア水が好まし
い。

反応温度は20〜70℃の範囲が好ましい。また、反応中に
菌体増殖に用いた上記炭素源、窒素源、その他の成分を
適宜添加して菌体濃度や菌体のニトリル加水分解能を維
持し、かつ高めることができる。

また、原料ニトリルの供給方法としては、反応の開始時
に添加する方法および連続的に添加する方法のいずれを
も用いることができる。

上記反応により生成したＬ−α−アミノ酸は、相分離、
濾過、抽出、カラムクロマトグラフイー等の公知の手段
を適用して分離、採取する。

次に、前記（ｂ）の方法では、上記（ａ）の方法におけ
る菌体の培養増殖時にニトリル化合物を加えずに、菌体
の増殖後にニトリル化合物を加えて該菌体微生物のニト
リル加水分解能を活性化した後、原料ニトリルに反応さ
せてＬ−α−アミノ酸を生産させる。

また、前記（ｃ）の方法は、上記（ｂ）の方法における
菌体の増殖後に直ちに原料ニトリルを加えて反応させて
Ｌ−α−アミノ酸を生産させるものである。

なお、上記（ｂ）及び（ｃ）のいずれの方法において
も、培養条件、反応条件及び生成したＬ−α−アミノ酸
の分離、採取には、前記（ａ）の方法におけるものを適
用し得る。

上述のごとくして本発明に従つて得られるＬ−α−アミ
ノ酸は、食品、飼料、医薬及び化粧品等の種々の分野に
おいて利用される。

発明の効果 以上述べたとおり、本発明によると、微生物を利用して
DL−α−アミノニトリル化合物から直接Ｌ−α−アミノ
酸類を選択的に製造し得るので、上記種々の分野におい
て利用されるＬ−α−アミノ酸の製造上有益である。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ 培地の調製 下記組成の培地100mlを、500ml容フラスコに収容して12
0℃で20分間オートクレーブで殺菌した後、0.2μのミリ
ポアフイルターで除菌したプロピオニトリル1mlを加え
て菌体調製用培地とした。

培地組成： グルコース Mml 10 g/l 酵母エキス 0.1 g/l NaHPO₄・12H₂O2.5 g/l KH₂PO₄ 2.0 g/l MgSO₄・7H₂O 0.5 g/l FeSO₄・7H₂O 0.03g/l CaCl₂・2H₂O 0.06g/l pH 7.2 使用菌株： 菌株名 FERM−BPNo ロドコッカス（Rhodococcus）sp./PC−29 1561 ロドコッカス（Rhodococcus）sp./PA−34 1559 ロドコッカス（Rhodococcus）sp./AB−16 1555 ロドコッカス（Rhodococcus）sp./BA−１ 1557 ミコバクテリウム（Mycobacterium sp.）AB−43 1556
菌体の培養増殖 上記培地に下記の７種の菌株の３白金耳をそれぞれ接種
し、30℃の温度に、140rpmで48時間振とう培養を行つ
た。

上記培養により得られた菌体を遠心分離で分離し、NH₄C
1−NH₃の0.1M緩衝液（pH 10）で１回洗浄後、光学的濃
度（OD）が40にとなるようにNH₄C1−NH₃の0.1M緩衝液に
再懸濁した。

反応 上述のようにして得られる各菌体懸濁液5mlを、φ24mm
の試験管に収容し、これにDL−２−アミノ−２−フエニ
ルエタンニトリル50mgを加えて密栓し、30℃の温度に、
300rpmで48時間振とう培養を行つた。

反応終了後、反応液をヘキサン5mlを用いて２回抽出
し、得られた水相を高速液体クロマトグラフイーで分析
した。

生成したＬ−フェニルグリシン定量はアミノ酸分析計
（ベツクマン社製 7300型）を用いて行い、その絶対配
置と光学純度の決定はCHIRALPAK WM（ダイセル化学工業
社製）をカラムとする高速液体クロマトグラフイーを用
いて行つた。結果は表３に示すとおりである。

実施例２ ロドコッカスsp.PA−34を用い、実施例１に記載したと
同様の手順で菌懸濁液を調製した。調製した菌懸濁液50
0mlを1.2lの発酵槽に収容し、これにDL−２−アミノ−
３−メチルブタンニトリル4.9g（50mmol）を加え、PHを
４規定のアンモニア水で10.0±0.1に保ちながら、反応
温度30℃、攪拌回転数700rpmで、48時間反応させた。

反応終了後、反応液を遠心分離して得られる上清を0.45
μのモリポアフイルターで濾過し、得られた水層を高速
液体クロマトグラフイーで分析した。

Ｌ−バリンの蓄濃度は0.5mg/ml、光学純度は67％e.e.で
あつた。なお、このＬ−バリンの定量は、カラム充填剤
として、AsahipakイナートシルODS（旭化成工業製）を
用いて行い、その絶対配置と光学純度の決定には同じく
CHIRALPAK WH（ダイセル化学工業製）を用いて行つた。

次に、対照として比較例を示す。

比較例１ PHを４規定のアンモニア水及び１規定のHC1で7.0±0.1
に調節する以外は実施例２に記載した方法で反応させ、
分析した。Ｌ−バリンの蓄濃度は3.5mg/ml、光学純度は
32％e.e.だつた。

比較例２ 実施例１に記載したと同様の手順で培養して得られた菌
体を遠心分離した後、0.1MのNa₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液（P
H7.0）で２回洗浄した後、光学的濃度（OD）が40となる
ように、0.1MのNa₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液に再懸濁した。
得られた菌懸濁液を用い、比較例１に記載したと同様の
手順で反応を行つた。Ｌ−バリンの蓄濃度は4.3mg/ml、
光学純度は17％e.e.だつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:365）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（１）または（２） （ただし、式中Ｒはアルキル基、置換アルキル基、フエ
   ニル基、置換フエニル基、イミダゾリル基、置換イミダ
   ゾリル基、インドリル基、置換インドリル基、フリル
   基、置換フリル基、ピリジル基、置換ピリジル基、チア
   ゾリル基、置換チアゾリル基のいずれかを示す） で表わされるニトリル化合物に、ロドコッカス属（Rhod
   ococcus sp.）またはミコバクテリウム属（Mycobacteri
   um sp.）に属し、ニトリル加水分解活性を有する微生物
   をpH8〜12の範囲内で作用せしめることを特徴とするＬ
   −α−アミノ酸類の製造方法。
2. 【請求項２】ニトリル加水分解活性を有する微生物とし
   てロドコッカス sp.PC−29（微工研条寄第1561号、FER
   M BP−1561）、ロドコッカス sp.PA−34（微工研条寄
   第1559号、FERM BP−1559）、ロドコッカス sp.AB−16
   （微工研条寄第1555号、FERM BP−1555）、ロドコッカ
   ス sp.BA−１（微工研条寄第1557号、FERM BP−1557）
   及びミコバクテリウム sp.AB−43（微工研条寄第1556
   号、FERM BP−1556）よりなる群から選択される微生物
   の少くとも１種を用いる請求項（１）に記載のＬ−α−
   アミノ酸類の製造方法。