JPH07206705A - 生インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、一般に、トリ種に対する生インオ
ボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチンとしての使用に好適な改変
微生物に関する。本発明の生インオボワクチンは、改変
微生物の毒性形もしくは改変微生物に免疫学的に関連す
る微生物、または生ワクチンにおける改変微生物によっ
て発現された抗原決定基をもっている毒性の生物もしく
はウイルスに対して、孵化前もしくは孵化直後に免疫を
誘起するために有用である。 【効果】 主題の生インオボワクチンは、特に、孵化し
たばかりの家禽類の生存率を高めるのに効果がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般に、トリ種に対す
る生インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチンとしての使用に
好適な改変微生物に関する。本発明の生インオボワクチ
ンは、改変微生物の毒性形（ビルレントフォーム）もし
くは改変微生物に免疫学的に関連する微生物、または生
ワクチンにおける改変微生物によって発現された抗原決
定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対し
て、孵化前もしくは孵化直後に免疫を誘起するために有
用である。主題の生インオボワクチンは、特に、孵化し
たばかりの家禽類の生存率を高めるのに効果がある。

【０００２】

【従来の技術】微生物、ウイルス、蠕虫類、酵母および
原虫類によるトリ種の感染は、深刻な環境的、生態学的
そして商業的意味をもつことができる。鳥類自身が危険
であるだけでなく、またヒトを含む他の動物へも広がる
伝染因子となる可能性がある。家禽産業は、特に、飼育
用トリの感受性、および特に孵化したばかりの飼育用ト
リにおいて急速に蔓延する伝染により、重大な経済的損
失を蒙りやすい。家禽類において、一般にサルモネラ症
といわれるサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ
ｅｃｉｅｓ）による感染は、高い死亡率を引き起こす最
も普通の感染形態である。サルモネラの多くの種は、ま
た、ヒトおよび他の動物にも感染し、それゆえに家禽類
におけるサルモネラ症の制御は、特別な重要性をもつ。
家禽類から分離されたサルモネラの最も普通の２種は、
サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびサルモネラ・エンテリ
チヂス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉ
ｓ）である。両細菌は、サルモネラ症の発生に重大に関
与しており、事実、Ｓ．エンテリチヂス ファージタイ
プ４が、１９８０年半ばの英国における公衆衛生に対し
て重大な脅威を生んだ。

【０００３】化学療法および化学予防法は、サルモネラ
症のような家禽病を駆逐するための予防手段の形態とし
て使用されてきた。しかしながら、そのような方法は、
常に成功するとは限らず、非常に高価であり、感染因子
に対する薬剤耐性を発生させることもあり、そしてヒト
もしくは動物の消費のために使われる鳥類についての公
衆衛生担当省にとって必ずしも受け入れられるものでは
ない。これらのおよびその他の関連した理由により、ト
リ種の別な形態の予防は、強力な科学的研究の主題であ
った。

【０００４】提案された一つの予防形態は、家禽病に対
するワクチンの開発である。生の弱毒化されたサルモネ
ラのワクチンが、ニワトリを防御することが示されてい
る（Cooper et al., Microb. Pathog., 9: 255-265, 19
90; Hassan and Curtiss III, Res. Microbiol., 141:
839-850, 1990）。さらに,芳香族生合成経路のａｒｏＡ
にもしくはその近傍に挿入されたトランスポゾンをもつ
サルモネラ株が、弱毒化されていることを示したが、ま
だなお免疫応答を刺激する十分な時間、組織内で生存す
る力をもつことが示された（Stocker, Vaccine, 6: 141
-145, 1988; 米国特許第4,735,801号; 米国特許第5,21
0,035号）。Cooperら（ Vaccine 10: 247-254, 1992）
は、ａｒｏＡ遺伝子に変異をもつＳ．エンテリチヂスフ
ァージタイプ４の２株を作製した。これらの変異株は、
経口および静脈内攻撃に対する生の経口ワクチンとして
使用された。Cooperら（前出）によって提案された結果
は、Ｓ．エンテリチヂスワクチンが、経口摂取されたニ
ワトリにおいて予防的であった。

【０００５】予防するニワトリにおいてサルモネラ種を
含んでなる生の経口ワクチンの意図された効果にもかか
わらず、孵化したばかりのトリは、特に、サルモネラ感
染に感受性であり、孵化直後の高い死亡率は、深刻な経
済的結果をもたらす。さらに、経口生ワクチンの投与
は、常に都合がよいとは言えず、確実に、十分な投与量
が鳥類に受け入れられようにすることは困難である。

【０００６】欧州特許出願公開第0 291 173号は、孵化
前の胚において免疫を誘起するように計画された非複製
抗原の投与を提案した。その方法は、胞子形成したアイ
メリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）の
オーシスト抽出物を用いてトリのコクシジウム症に対し
て鳥類を免疫するために、特に有用であると言われた。
米国特許第4,458,630号は、また、鳥類が、孵化前の卵
に増殖ウイルスワクチンを注射することによってマレッ
ク病に対して免疫できることを示している。しかしなが
ら、両方の場合において、接種は、卵黄嚢もしくは漿尿
膜液中のような胚体内であった。もし、細菌が、そのよ
うな方法で接種されたならば、その細菌は、卵を“ブロ
ー（ｂｌｏｗ）”して、腐敗させ、胚を死滅させてしま
うであろう。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】それ故、トリ種が、サ
ルモネラの毒性株のような毒性生物による攻撃に対して
防御され得るような、インオボワクチンに関連する技術
を改良することが必要である。本発明により、発明者ら
は、弱毒化もしくは無毒化された微生物が、インオボの
一定の組織に接種され、そして孵化する鳥類が、対応す
る野性タイプの微生物による攻撃から防御されることを
見出だした。本発明の方法は、また、他のトリ病原体の
免疫原の形で抗原エピトープをもつように改変された微
生物に、その病原体に対する免疫を誘起ことを可能にす
る。本発明は、孵化したばかりの鳥類の防御についての
優れた突破口を表し、家禽管理に対して有意義な商業的
利益を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明の一
つの態様は、弱毒化された微生物を含んでなり、かつそ
の弱毒化微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり； （ｂ）孵化前の胚において一種以上の組織にコロニー形
成させることができ；そして （ｃ）該微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差反応性
の微生物、または該弱毒化微生物によって発現された抗
原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対
して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答を誘起
することができる、トリ種のための生インオボワクチン
を提供するものである。

【０００９】本発明のもう一つの態様は、弱毒化された
サルモネラを含んでなる家禽類に対する生インオボワク
チンを意図するものであって、その弱毒化サルモネラ
が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり； （ｂ）孵化前の胚において一種以上の組織にコロニー形
成させることができ；そして （ｃ）該サルモネラの毒性形もしくは免疫学的に交差反
応性のサルモネラ、または該無毒化サルモネラによって
発現された抗原決定基をもっている毒性の生物もしくは
ウイルスに対して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免
疫応答を誘起することができる。

【００１０】本発明のさらに他の態様は、病原微生物に
よる感染に対してトリ種を免疫する方法であって、弱毒
化された微生物をインオボに投与することを含んでな
り、かつその弱毒化微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能である；そして （ｂ）該弱毒化微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差
反応性の微生物、または該弱毒化微生物によって発現さ
れた抗原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイル
スに対して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答
を誘起するのに効果的な量ならびに条件において、孵化
前の胚において一種以上の組織にコロニー形成すること
ができる、方法に向けられる。

【００１１】本発明のさらなる他の態様は、病原体微生
物による感染に対して家禽類を免疫する方法であって、
弱毒化されたサルモネラを含んでなるワクチンのインオ
ボ投与を含んでなり、かつその弱毒化サルモネラが： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり；そして （ｂ）該サルモネラの毒性形、または該弱毒化サルモネ
ラによって発現された抗原決定基をもっている毒性の生
物もしくはウイルスに対して、孵化前もしくは孵化直後
に胚内で免疫応答を誘起するのに効果的な量ならびに条
件において、孵化前の胚において一種以上の組織にコロ
ニー形成することができる、方法に関する。

【００１２】本発明のその他の態様は気嚢を有する家禽
類からの受精卵であって、気嚢が改変された微生物で接
種され、かつその改変微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能である；そして （ｂ）胚が気嚢を突破した後、孵化前の胚における一種
以上の組織にコロニー形成することができ；そして （ｃ）該微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差反応性
の微生物、または該無毒化微生物によって発現された抗
原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対
して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答を誘起
することができる、受精卵を意図する。

【００１３】本発明の一つ態様は、微生物感染からトリ
種の防御を助けるか、または生ワクチンで発現された免
疫原に対してトリ種を免疫することができる生のインオ
ボワクチンの形態にある改変微生物を提供する。本願の
明細書および請求の範囲において使用される用語“生イ
ンオボワクチン（ｌｉｖｅ ｉｎ ｏｖｏ ｖａｃｃｉ
ｎｅ）”は、その広義の意味において考えるべきであ
り、特に、孵化前のインオボの胚組織にコロニー形成す
る能力を保持しているが、最少培地では増殖不可能な弱
毒化もしくは無毒化微生物を包含する。この点につい
て、好適な胚組織は、気嚢と結合しており、特に、気嚢
膜である。孵化後もしくは孵化直前に、弱毒化もしくは
無毒化微生物は、結腸、気道および肺のような組織にコ
ロニー形成する。本発明の生インオボワクチンは、ま
た、孵化したばかりのトリから病原微生物を競合的に排
除するというさらなる利点を提供し、そのワクチンの存
在は、一般に、他の潜在的抗原に対して鳥類の免疫系を
刺激することもできる。

【００１４】本発明によって意図されるトリ種は、ニワ
トリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウ
ズラおよびハトを包含する。最も好適なトリ種は、ニワ
トリ、アヒルおよびシチメンチョウのような商業的に重
要な家禽類である。

【００１５】生インオボワクチンを使用する候補は、要
求される防御を基に選択できる。例えば、防御が特定の
微生物種もしくは微生物属に対して要求される場合に
は、次に、その種もしくは属の弱毒化もしくは無毒化株
が選択される。そのような選択は、弱毒化もしくは無毒
化微生物は、対応する野生株と交差反応的な免疫応答を
誘起する能力を保持しているが、一方、トリ種またはヒ
トのような他の動物のいずれにも病原性がないというこ
とを要求する。しかしながら、生インオボワクチンが、
免疫原および一般に組み換え免疫原のキャリヤーとして
使用されている場合には、弱毒化もしくは無毒化微生物
が、対応する野生タイプの微生物に対する交差反応性免
疫応答を誘起することは、必ずしも必須ではない。弱毒
化もしくは無毒化微生物によって担持される免疫原もし
くは抗原エピトープが、免疫原もしくは抗原エピトープ
に対する免疫応答を誘起するのに十分な程度に、細胞表
面に露出されるか、または細胞によって合成され、遊離
されることは、有利であると思われるけれども、それは
必ずしも必須ではない。次いで、そのような免疫応答
が、天然に免疫原を発現している微生物もしくは他の病
原因子による感染からトリ種を保護する。

【００１６】本発明のこの態様によって意図されるトリ
の病原因子は、微生物、蠕虫類、原虫類、酵母およびウ
イルスから選ばれる一種もしくは複数種の因子を包含す
る。適切な免疫原もしくは抗原エピトープは、トリ白血
症、細網内皮症、伝染性気管支炎、伝染性粘液嚢病、ニ
ューカッスル病、アデノウイルス病、レオウイルス病、
ポックス病、喉頭気管支炎、トリインフルエンザ、伝染
性コリーザ、鳥禽腸チフス、コクシジウム症、クリプト
スポリジウム症および鳥禽コレラの原因因子からのもの
である。その他の適切な免疫原もしくは抗原エピトープ
は、アイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃ
ｅｒｖｕｌｉｎａ）、アイメリア・ミバチ（Ｅｉｍｅｒ
ｉａ ｍｉｖａｔｉ）、アイメリア・ミチス（Ｅｉｍｅ
ｒｉａｍｉｔｉｓ），アイメリア・プラエコックス（Ｅ
ｉｍｅｒｉａ ｐｒａｅｃｏｘ），アイメリア・ハガニ
（Ｅｉｍｅｒｉａ ｈａｇａｎｉ），アイメリア・ネカ
トリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ ｎｅｃａｔｒｉｘ）、ア
イメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍ
ａ），アイメリア・ブルネッチ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｂｒ
ｕｎｅｔｔｉ），アイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｔｅｎｅｌｌａ）からのようなアイメリア種からのも
のである。最も好適な種は、Ｅ．テネラである。

【００１７】生インオボワクチンに使用する候補微生物
を選択するために用いられる基準にかかわらず、主題の
微生物は、同様に弱毒化もしくは無毒化し（その生物が
病原性である場合には）、そして／または実質的に復帰
できない一種以上の変異を誘導するように処理されねば
ならない。実質的に非復帰性変異体は、ここでは、≦１
０^-8、より好ましくは≦１０^-9および一層好ましくは≦
１０^-10の復帰頻度を有すると考えられる。最も好適な
実施態様においては、本発明は、実際上、復帰確率ゼロ
の変異を意図する。

【００１８】適切な変異は、候補微生物のゲノム中の標
的遺伝子配列についての単一もしくはより好ましくは複
数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を包含
する。本明細書中では、ゲノムは、プラスミドＤＮＡの
ような染色体外要素を包含する。変異は、その生物が、
微生物の増殖に必須な一ないし多数個の因子を合成でき
ないために、最少培地では増殖できないことを確立する
ために計画される。そのような変異生物は、栄養要求性
変異体として知られている。栄養要求性への変異は、ま
た、微生物の弱毒化もしくは無毒化に結果するかもしれ
ず、また後者は、栄養培地を通しての連続的継代のよう
な付加的な段階を必要とすることもある。生インオボワ
クチンにおける栄養要求性変異体の使用は、本質的に環
境中で増殖できない微生物を放出するトリによって、そ
の生物の蔓延を減らすことにある。

【００１９】本発明の方法は、胚組織、および特に気嚢
組織にコロニー形成することができるが、一方胚に対し
ては実質的に非病原性である弱毒化もしくは無毒化微生
物の使用に関して一部分は述べられる。好適な接種部位
は、気嚢膜のような気嚢に結合した組織であり、本発明
の改変生物は、気嚢膜の気嚢側にコロニー形成すること
ができるが、発生する胚には本質的に非病原性である、
すなわち胚の死を起こさないか、野生タイプの生物と比
較して胚の死を減少できるものと考えられる。しかしな
がら、そのような生物は、もし胚組織の異なる部分に接
種されるならば、ある程度の病原性を示すかも知れな
い。

【００２０】本発明において実用上有用な適切な生物
は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ），シゲラ（Ｓ
ｈｉｇｅｌｌａ），クレブジーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ），エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ），セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ），プロテウス（Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ），エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ），ビ
ブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏ
ｎａｓ），パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アシネトバ
クター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），モラキセラ
（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ），フラボバクテリウム（Ｆｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），マイコプラズマ（Ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍａ）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の種である。弱毒化もしくは
無毒化された後のそのような微生物は、野生タイプ株も
しくは本明細書で述べられる組み換え抗原のような抗原
に対して免疫を誘起するために有用である。より好適な
微生物は、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ），サルモネラ・パ
ラチフィＡまたはＣ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａ
ｔｙｐｈｉ Ａ ｏｒ Ｃ），サルモネラ・ショットム
レリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅ
ｒｉ），サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ），サルモネラ・モン
テビデオ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｏｎｔｅｖｉｄｅ
ｏ），サルモネラ・ニューポルト（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｎｅｗｐｏｒｔ），サルモネラ・エンテリチヂス
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ），
サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａ
ｌｌｉｎａｒｕｍ），サルモネラ・プロルム（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｐｕｌｌｏｒｕｍ），サルモネラ・アボ
ルツソビ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓｏｖ
ｉ），サルモネラ・アボルタス−エクイ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ），サルモネラ・
ダブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ），サ
ルモネラ・ソフィア（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｏｆｉ
ａ），サルモネラ・ハバナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｈ
ａｖａｎａ），サルモネラ・ボビスモルビフィカンス
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃ
ａｎｓ），サルモネラ・ハダール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｈａｄａｒ），サルモネラ・アリゾナエ（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ａｒｉｚｏｎａｅ）およびサルモネラ・
アナタム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎａｔｕｍ）のよ
うなサルモネラ種，ならびにトリ種、特に家禽類に伝染
することが知られているその他の種を包含する。交差種
の防御を容易にするために、一ないし複数のその他のサ
ルモネラ種に免疫的に関連した抗原を発現するサルモネ
ラの種を選択することが、特に適切である。

【００２１】好適なサルモネラ種は、リポ多糖類抗原の
血清学的試験に基づくグループＢ，Ｃ（Ｃ₁およびＣ₂を
含む）およびＤサルモネラである。なお一層好適なサル
モネラは、Ｓ．チフィムリウムおよびＳ．エンテリチヂ
スを含む。最も好適な微生物は、Ｓ．チフィムリウムで
ある。

【００２２】サルモネラ種のような微生物および特に
Ｓ．チフィムリウムは、例えば、アミノ酸もしくはビタ
ミンもしくはその他の必須分子の生合成経路における変
異を誘発することによって改変される。その変異は、ア
ラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、
システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒ
スチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニ
ン、トリプトファン、チロシンおよび／またはバリンの
一個ないし多数個の生合成に影響することもある。好適
な変異部位は、芳香族ビタミンの生合成経路、特に、ａ
ｒｏ経路において存在する。この経路においては、ホス
ホエノールピルビン酸およびエリスロース−４−リン酸
は、３−デオキシアラビノヘプツロン酸−７−リン酸を
生成するために縮合する。その経路は、シキミ酸、コリ
スミン酸およびアントラニル酸のような中間体を通して
Ｌ−トリプトファンを生成するために続く。コリスミン
酸からは、ｐ−アミノ安息香酸（葉酸へ導く）、ｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸（ユビキノンへ導く）、３，４−ジヒ
ドロキシ安息香酸（ビタミンＫへ導く）およびプレフェ
ン酸（Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンへ導
く）のような分子が生成される。好適な変異部位は、コ
リスミン酸以前の遺伝子にあり、好ましくはａｒｏＡ，
ａｒｏＢ，ａｒｏＣもしくはａｒｏＤの一個ないし多数
個に存在する。最も好適な変異部位は、生物を弱毒化も
しくは無毒化するが、なおその生物が組織に侵入し、コ
ロニー形成をさせるように選択される。そのような変異
は、ａｒｏＡ遺伝子におけるものである。

【００２３】種々の技術が、生合成経路における変異を
誘発して、微生物を改変するために用いられる。一つの
好適な技術は、トランスポゾンのような易動性要素の使
用を伴う。トランスポゾンは、微生物のゲノム中の一個
以上の部位にトランスポゾンを挿入させるために必要な
遺伝子とともに、通常、抗生物質もしくはその他の選択
マーカー耐性に関する遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡのセグ
メントである。主題の微生物のゲノム中に挿入されるト
ランスポゾンの位置は、その生物の栄養要求性を決定す
ることによって、そして／または、遺伝学的に例えば、
適切なプローブを用いるハイブリダイゼーションによっ
て、機能的に決定することもできる。改変微生物は、標
的遺伝子に挿入されるトランスポゾンとともに使用する
こともできるし、またはそのトランスポゾンの欠失は、
例えば、抗生物質耐性の欠失もしくは選択マーカーの欠
失によって選択され得る。しばしば、トランスポゾンの
切除は、隣接するＤＮＡの切除を随伴して、標的の塩基
配列の欠失を起こす。これに関して、好適な欠失のタイ
プは、２個以上のヌクレオチドの欠落であり、好ましく
は２〜５ヌクレオチド、より好ましくは５個以上の隣接
するヌクレオチドの欠落である。

【００２４】特定の微生物の変異は、形質導入、接合お
よび形質転換のような技術によって容易に行うことがで
きる。例えば、一般的な形質導入ファージ（例えば、Ｐ
１もしくはＰ２２）は、その起源の宿主からのトランス
ポゾンを新しい標的微生物に挿入（もしくは切除）する
ことによって不活化する場合のように、その非機能性の
生合成遺伝子を形質導入するために使用される。Ｐ１も
しくはＰ２２のようなファージは広範な宿主範囲をもつ
ので、その潜在力は、同じ変異を作る生物の範囲を増大
させる。接合は、生合成遺伝子における目的の非復帰変
異をもつ非毒性株と毒性株との接合的交雑を伴って用い
られる。変異遺伝子の伝達は、ＨｆｒもしくはＦ⁺株か
ら、Ｆ^-毒性株とそれとを交雑することによって起き、
結果的に、変異遺伝子によって野生タイプ遺伝子が組み
換え的に置換される。そのような技術の使用は、特に、
２以上の生合成経路において、２以上の独立した変異を
誘発するのに有用である。これらの技術は、また、その
他の種もしくはトリ病原体からの異種抗原を形質導入す
るために使うことができる。

【００２５】例示される最も好適な微生物は、家禽類に
おける使用のためにはＳ．チフィムリウムＳＴＭ−１株
である。驚くべきことに、Ｓ．チフィムリウムのこの株
は、気嚢膜の気嚢側にコロニー形成することができる
が、このコロニー形成後に胚には特に病原性ではないこ
とが分かった。また、驚くべきことに、この株は、その
胚および孵化したばかりのトリの組織に侵入し、コロニ
ー形成して、その生物もしくは免疫学的に関連する微生
物の毒性形に対する免疫応答を確立せしめることが分か
った。Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１株の例示は、微生
物について本発明を限定することを意図しないし、本発
明は、本明細書に記載されるような生インオボワクチン
に用いられる全ての改変生物にわたるものである。

【００２６】サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１株
のサンプルは、オーストラリアン・ガバメント・アナリ
ティカル・ラボラトリーズ［Australian Goverment Ana
lytical Laboratories (ブダペスト条約寄託）］, 1 Su
akin Street, Pymble, New South Wales, 2037, Austra
lia に、１９９３年１０月２６日に寄託され、受託番号
Ｎ９３／４３２６６を与えられた。その親の野生株は、
初めに、サルモネラに感染したニワトリの群れから単離
された。次いで、ファージＰ２２形質導入が、Ｓ．チフ
ィムリウムＳＴＭ−１株中に、Ｓ．チフィムリウムＬＴ
２からのａｒｏＡ遺伝子中のトランスポゾンＴｎ：１０
挿入を形質導入するために使用された。またａｒｏＡ^-
であるトランスポゾン欠失変異株が、次に選択された。
Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１は、またセリンについて
栄養要求性である。

【００２７】本発明のこの態様にしたがって、生インオ
ボワクチンとしての使用に好適な改変サルモネラ微生物
が提供される。この改変サルモネラ微生物は、生合成経
路の酵素をコードしている遺伝子に実質的に非復帰変異
をもっている。より具体的には、本発明は、生インオボ
ワクチンとしての使用に好適なＳ．チフィムリウムの変
異株を提供する。この変異株は、該微生物におけるコリ
スミン酸生合成に必要な酵素をコードしている遺伝子
に、実質的に非復帰変異をもっている。好ましくは、そ
の変異は、ａｒｏＡ，ａｒｏＢもしくはａｒｏＣに存在
する。より好ましくは、その変異は、ａｒｏＡに存在
し、そしてなお一層好ましくは、その微生物は、セリン
に関する生合成経路のようなその他の生合成経路に、一
つ以上の変異を有する。最も好ましくは、その生物は、
Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１である。

【００２８】本発明の改変微生物は、インオボワクチン
の調製に使用される。本発明のこの態様によって、生合
成経路の酵素をコードしている遺伝子に、実質的に非復
帰変異をもっている改変サルモネラ微生物を含んでなる
インオボワクチンが提供される。より具体的には、本発
明は、該微生物のコリスミン酸生合成に要求される酵素
をコードしている遺伝子に、実質的に非復帰変異を有す
るＳ．チフィムリウムの変異株を含んでなるインオボワ
クチンを提供する。好ましくは、その変異およびその微
生物は、先に定義されたとおりである。より一層好まし
くは、そのインオボワクチンは、Ｓ．チフィムリウムＳ
ＴＭ−１を含む。

【００２９】本発明のワクチン組成物は、卵中に注入し
て使用するために適せねばならない。そのワクチンは、
単一タイプの改変微生物を含んでもよく、また多価ワク
チンが要求されるか否かによって、２種以上のタイプを
含有してもよい。さらに、その組成物は、注射針で容易
に扱えるように十分な流動性をもたねばならない。この
点において、一つの都合のよいアプローチは、特定の抗
生物質に耐性である改変微生物を使用し、次いでワクチ
ン組成物中のその抗生物質の存在下で、その生物を維持
することである。抗生物質の存在は、汚染する生物を殺
すか、増殖を阻止であろう。

【００３０】用語“多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）”
ワクチンは、最も一般的な意味において使用され、改変
微生物上にもしくは改変微生物によって、発現される少
なくとも２種の抗原エピトープに対する免疫応答を刺激
できる改変微生物まで広がる。この点において、多価ワ
クチンは、例えば、２種以上のエピトープが改変微生物
に固有である場合、改変微生物上にもしくは改変微生物
によって、２種の異なる抗原エピトープに対する抗体応
答を誘起することができる微生物を包含する。しかしな
がら、より普通には、多価ワクチンは、該微生物によっ
て発現され、その微生物に固有ではない異種抗原（例え
ば、組み換え抗原または形質導入、接合もしくは形質転
換によって導入されるもの）に対すると同様に、該微生
物の毒性形に対する免疫応答を誘起することができる微
生物を包含する。この点において、多価ワクチンは、２
種以上の病原因子に向けられる。

【００３１】好適な多価ワクチンは、１種以上のサルモ
ネラに対して、ならびに微生物、蠕虫類、原虫類、酵母
およびウイルスから選ばれる１種以上のトリ病原因子か
らの少なくとも１種の抗原エピトープに対して、免疫応
答を誘起することができるものである。本発明のこの態
様によって意図されるサルモネラ種は、１種以上のサル
モネラ・チフィムリウム，サルモネラ・パラチフィＡま
たはＣ，サルモネラ・ショットムレリ，サルモネラ・コ
レレスイス，サルモネラ・モンテビデオ，サルモネラ・
ニューポルト，サルモネラ・エンテリチヂス，サルモネ
ラ・ガリナルム，サルモネラ・プロルム，サルモネラ・
アボルツソビ，サルモネラ・アボルタス−エクイ，サル
モネラ・ダブリン，サルモネラ・ソフィア，サルモネラ
・ハバナ，サルモネラ・ボビスモルビフィカンス，サル
モネラ・ハダール，サルモネラ・アリゾナエおよびサル
モネラ・アナタムを包含する。

【００３２】より好ましくは、免疫応答は、Ｓ．チフィ
ムリウムおよび／またはＳ．エンテリチヂスに関してで
ある。本発明のこの態様によって意図されるサルモネラ
種以外のトリ病原因子は、トリ白血症、細網内皮症、伝
染性気管支炎、伝染性粘液嚢病、ニューカッスル病、ア
デノウイルス病、レオウイルス病、ポックス病、喉頭気
管支炎、トリインフルエンザ、伝染性コリーザ、鳥禽腸
チフス、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症およ
び鳥禽コレラの１種以上の原因因子から１種以上の抗原
エピトープの原因因子を含んでなりそして包含する。

【００３３】適切な原因因子は、アイメリア・アセルブ
リナ、アイメリア・ミバチ、アイメリア・ミチス，アイ
メリア・プラエコックス，アイメリア・ハガニ，アイメ
リア・ネカトリックス、アイメリア・マキシマ，アイメ
リア・ブルネッチおよびアイメリア・テネラのようなア
イメリアの種である。最も好適なアイメリア種は、Ｅ．
テネラである。

【００３４】都合よいことには、改変微生物は、凍結乾
燥形態で維持され、または凍結状態において維持されて
もよい。そのような条件は、例えば、グリセロールまた
は他の適切な媒体中、−７０℃での保存を包含する。一
般に、保存された場合の改変微生物は、再調製されたワ
クチンの用量当たり最少生存濃度１０⁶〜１０¹²細胞を
含む。保存された改変微生物は、栄養ブイヨンもしくは
酵母エキス添加のトリプティックソイブロスのような単
純な増殖培地で容易に再構成される。トリプティックソ
イブロスは、デキストロース、塩化ナトリウムおよびリ
ン酸二カリウムとともにカゼインおよび大豆粉の消化物
を含む。大量のワクチン培養を行う場合には、特に、２
００−７００ｍｌ培養液で先ず増殖を行い、これを増殖
培地７−１５リットルに接種するために使用することが
都合がよい。次いで、これらの大量培養液は、生産ファ
ーメンターへの接種に使用される。ファーメンター中で
の培養の増殖は、光学濃度のようないずれか都合のよい
方法でモニターされる。光学濃度が、増殖パラメーター
である場合には、ピークの濃度における培養菌体が、保
持され、純度がチェックされ、次いで冷却され、濃縮さ
れ、凍結乾燥前に適切なキャリヤーと混和される。保存
技術が凍結乾燥である場合には、無菌の窒素ガスが、培
養菌体を含んでなるサンプルの外部を満たすために使用
してもよい。凍結乾燥された培養物は、いずれか適切な
希釈剤中に再構成され、次いで卵中への直接注射のため
に使用される。いかなる適切なキャリヤーも使用される
が、最も好適なキャリヤーは、スキムミルク末である。
使用できるその他のキャリヤーは、水、エタノール、ポ
リオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコー
ルおよび液体ポリエチレングリコールおよびそれに類す
るもの）、植物油およびそれらの適切な混合液を包含す
る。

【００３５】さらに、本発明は、病原微生物による感染
に対して、孵化したばかりのトリを免疫するための方法
を意図している。さらに、または別に、その方法は、組
み換え抗原に対する免疫応答の開発のために提供され
る。本発明の方法は、対応する“野生タイプ”微生物に
対して、免疫学的に交差反応性の微生物および／または
弱毒化もしくは無毒化された改変微生物で発現されるい
ずれか異種または非固有の（例えば、組み換え）抗原に
対して、免疫応答を誘起することができる１種以上の弱
毒化もしくは無毒化された改変微生物の一定量のインオ
ボ投与によって行われる。改変微生物は、また、組織中
の他の生物を競合的に排除し、および／または一般に、
トリ宿主の免疫応答性を促進することができる。

【００３６】好適な実施態様においては、弱毒化もしく
は無毒化改変微生物は、接種量において、孵化前後のト
リの組織にコロニー形成することができるが、孵化率お
よび／またはその後のヒナの生存率に本質的に逆効果を
及ぼすことはない。本発明のこの適切な態様によって、
孵化したばかりのトリにおいて１種以上の病原微生物に
対する免疫を誘起する方法が提供され、該方法は、該ト
リ中の１種以上の組織にコロニー形成するために効果的
な弱毒化もしくは無毒化微生物の量をインオボ投与する
ことを含んでなる方法であって、この場合の該弱毒化も
しくは無毒化微生物は、該微生物のコリスミン酸生合成
に必要な酵素をコードしている遺伝子中に変異（例え
ば、ヌクレオチドの欠失、置換もしくは付加）を有して
いる。

【００３７】好適にコロニー形成される組織は、心臓、
肝臓、腸、ファブリカス（ｆａｂｒｉｃｕｓ）の粘液嚢
および気嚢を包含するが、それに限定されるものではな
い。最良の結果のために、効果的な種菌量は、卵当たり
１０²〜１０¹⁴コロニー形成単位（ｃｆｕ）の範囲内で
ある。種菌量は、コロニー形成の程度および孵化後の免
疫応答の長さを決定し、また使用される生物の種類によ
り変化する。好適な種菌は、約１０¹、１０²、１０³、
１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、
１０¹¹、１０¹²および１０¹³ｃｆｕ／卵を含む。一層好
ましい種菌量は、約１０²〜１０¹⁰ｃｆｕ／卵を含む。
最良の結果は、ワクチンの微生物が、気嚢膜の気嚢側に
コロニー形成を進めるべく、気嚢内にそのワクチンが接
種される場合に得られる。孵化前に、その胚は、気嚢膜
に穴を開け、微生物に曝され、次いで、その微生物は、
孵化前、孵化中および／または孵化後の胚における１種
以上の組織にコロニー形成を進行する。

【００３８】弱毒化もしくは無毒化微生物は、一般に、
インキュベーション（孵卵）期間の後半に、卵中に接種
される。例えば、ニワトリの場合、卵は、一般に、イン
キュベーション日数約１２〜２０に接種される。好まし
くは、その接種は、１４日〜約１９日の間に行われる。
より好ましくは、ニワトリの卵は、約１５〜１８日に接
種される。アヒル卵のためには、好適な接種時間は、約
１６日〜約２７日、より好ましくは、約１８〜２６日、
一層好ましくは、約２２〜２４日である。

【００３９】本発明は、また、インキュベーション前
に、ワクチンを接種される受精卵にも広げられる。その
卵は、それに続くインキュベーションについての指示の
有無にかかわらず、販売のために都合よく包装される。

【００４０】本発明のこの態様によれば、気嚢が改変微
生物により接種されている気嚢を有する家禽類からの受
精卵が、提供されるのであって、その改変微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり； （ｂ）胚が気嚢を突き破った後、孵化前の胚において一
種以上の組織にコロニー形成することができ；そして （ｃ）該微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差反応性
の微生物、または該無毒化微生物によって発現された抗
原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対
して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答を誘起
することができる。

【００４１】種菌の投与は、注入、一般には気嚢中への
注射によって都合よく行われる。その生物は、気嚢にコ
ロニー形成し、トリは、孵化前に気嚢を突き破った後そ
の生物に曝される。次いで、トリは、呼吸路および／ま
たは口を通してその生物を取り込む。気嚢が、好適なイ
ンオボ投与経路であるにもかかわらず、卵黄嚢もしくは
漿尿膜液のような他の領域もまた、注射によって接種で
きる。卵黄嚢もしくは他の液への接種の場合には、より
低い種菌量が、一般に好ましく、および／または低下し
た増殖速度をもつ弱毒化もしくは無毒化生物が、胚の弊
死を減少するために使用される。いかなる場合でも、気
嚢が接種の標的でない時には、必ずしも商業的に受容で
きないレベルではないが、孵化率はやや低下することが
ある。注射の機構は、注射針が、卵、または、発生過程
の胚もしくは胚を囲う胚体外膜の組織および器官に過度
の損傷を引き起こさないことが好ましいけれども、本発
明の実用上決定的なものではない。

【００４２】一般に、約２２ゲージ針を固定された皮下
注射器が、適切である。本発明の方法は、特に、米国特
許第4,903,635号、第5,056,464号および第5,136,979号
に記載されたような自動注射システムによる使用に良く
適している。

【００４３】本発明は、サルモネラ種による感染からニ
ワトリのような家禽類を防御するために、特に良く適し
ている。本発明の好適な態様によれば、弱毒化されたサ
ルモネラを含んでなる家禽類に対する生インオボワクチ
ンが提供され、その弱毒化サルモネラは： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり； （ｂ）孵化前の胚において一つもしくは複数の組織にコ
ロニー形成することができ；そして （ｃ）該サルモネラの毒性形もしくは免疫学的に交差反
応性のサルモネラ、または該無毒化サルモネラによって
発現された抗原決定基をもっている毒性の生物もしくは
ウイルスに対して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免
疫応答を誘起することができる。

【００４４】好ましくは、そのワクチンは、胚が、気嚢
を突き破った後に、実質的にワクチンに曝されるよう
に、気嚢中への接種のために採用される。改変微生物と
して使用に好適なサルモネラ種は、サルモネラ・チフィ
ムリウム，サルモネラ・パラチフィＡまたはＣ，サルモ
ネラ・ショットムレリ，サルモネラ・コレレスイス，サ
ルモネラ・モンテビデオ，サルモネラ・ニューポルト，
サルモネラ・エンテリチヂス，サルモネラ・ガリナル
ム，サルモネラ・プロルム，サルモネラ・アボルツソ
ビ，サルモネラ・アボルタス−エクイ，サルモネラ・ダ
ブリン，サルモネラ・ソフィア，サルモネラ・ハバナ，
サルモネラ・ボビスモルビフィカンス，サルモネラ・ハ
ダール，サルモネラ・アリゾナエおよびサルモネラ・ア
ナタムである。より好ましくは、改変微生物は、Ｓ．チ
フィムリウムもしくはＳ．エンテリチヂスである。都合
良いのは、変異は、ａｒｏＡ、ａｒｏＢ、ａｒｏＣもし
くはａｒｏＤにおけるような芳香族生合成経路において
存在する。

【００４５】本発明のこれらおよび他の態様は、次の非
限定的な実施例によってさらに例示される。

【００４６】

【実施例】

（実施例１）サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１ 起源 Ｓ．チフィムリウムの親の野生株は、Veterinary Resea
rch Institute, Parkville, Victoria, Melbourne, Aus
tralia において、サルモネラ種に感染されたニワトリ
群から単離された。単離株は、凍結培養物として保存さ
れた。変異株Ｓ．チフィムリウムＬＴＤ菌株１５４５
（ａｒｏＡ Ｔｎ：１０）は、Dr. J Roth, University
of Utah, USA から得たものである。ＳＴＭ−１変異株
は、菌株１５４５から、ニワトリ群から単離された野生
タイプＳ．チフィムリウムへの、ａｒｏＡ Ｔｎ：１０
のＰ２２形質導入を用いるファージ形質導入によって創
製された。トランスポゾンＴｎ：１０挿入変異株が選択
され、次いで、トランスポゾン欠失ａｒｏＡ欠失変異株
が単離された。この変異株は、Ｓ．チフィムリウムＳＴ
Ｍ−１と命名され、サンプルは、Australian Goverment
Analytical Laboratories, 1 Suakin Street, Pymble,
New South Wales, 2037, Australia に寄託され、１９
９３年１０月２６日に寄託され、受託番号Ｎ９３／４３
２６６を与えられた。

【００４７】培地 酵母エキス（１％ｗ／ｖ）を添加したトリプティックソ
イブロス（ＴＳＢ）は、種菌培養の調製および生ワクチ
ンの生産の両方に使用される。ＴＳＢは、デキストロー
ス、塩化ナトリウムおよびリン酸二カリウムとともにカ
ゼイン消化物および大豆粉を含有する。その培地は、使
用前に１２１℃でオートクレーブして殺菌される。スキ
ムミルクは、凍結乾燥のための凍結保護物質として用い
られる。カゼインを含有する増殖培地は、使用前に１２
１℃でオートクレーブして殺菌される。オーストラリア
製スキムミルクが、ワクチンの凍結乾燥に使用される。
この物質は、非滅菌状態で受け入れ、使用前に２．５ｍ
ｅｇａｒａｄでのガンマ線照射のために、Ansell-Steri
tech facility in Sydney, Australia に急送される。

【００４８】粉末増殖培地は、蒸留水中に溶解され、１
２１℃で少なくとも１５分間殺菌される。スキムミルク
粉末は、２．５ｍｅｇａｒａｄでのガンマ線照射のため
に、厚紙の箱に１．６ｋｇ量づつパックされる。ガンマ
線照射インジケーターが、滅菌の間に変色したことを確
認した後、ガンマ線照射から帰ったものに“滅菌済み
（Ｒｅｌｅａｓｅｄ Ｓｔｅｒｉｌｅ）”のステッカー
が張られる。滅菌されたスキムミルクは、発酵し、凍結
乾燥前に濃縮した後の培養物とともに撹拌によって混合
される。

【００４９】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１の特徴 サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１は、ａｒｏＡ^-
およびｓｅｒ^-である。その生物は、最少培地では増殖
しないであろう。ＳＴＭ−１は、増殖のためにパラアミ
ノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびパラヒドロキシ安息香酸
（ＰＨＢＡ）の両方を要求するａｒｏＡ欠失生物と同一
の増殖プロフィルをもつ。Ｔｎ：１０トランスポゾンの
挿入、および次に続くＳＴＭ−１のａｒｏＡ遺伝子近傍
でのその欠失は、セリン生合成経路に沿ったその他の変
異を結果的に起こした。このことは、セリンまたはいず
れかグリシンおよびシスチンが培地に添加される場合に
のみ起きる増殖とともに、全ての芳香族経路の最終産物
を補った最少培地で増殖しないことによって支持され
る。セリン欠失は、生体内でのその変異株の増殖を制限
しない。

【００５０】ＳＴＭ−１は、Ｈ₂Ｓ陰性であることによ
って、その親株および関連株から生化学的に容易に区別
することができる。ＸＬＤ寒天上でのＳＴＭ−１の増殖
は、桃色コロニーの出現によって示される。マッコンキ
ー寒天上での増殖は、特徴的なサルモネラ出現の明瞭な
ｌａｃ陰性コロニーとして見られる。

【００５１】ＳＴＭ−１株は、その親株と共通して、ス
トレプトマイシン耐性、ノボビオシン耐性およびフザリ
ン酸耐性である。それは、ペニシリンおよびサルファフ
ラゾールに、より大きな感受性を示す点で、親株とは異
なる。

【００５２】血清学的に、ＳＴＭ−１のコロニーおよび
ブロスは、ポリ“Ｏ”抗原およびグループＢサルモネラ
抗原に対する試験が陽性である。

【００５３】ＳＴＭ−１微生物は、２３ｋｂ，２７．５
ｋｂのプラスミド（図１参照）および６０〜１００ｋｂ
範囲の２個のより大きいプラスミドをもち、その野生タ
イプの親株と同じ検出可能なプラスミド組成物を有す
る。野生タイプおよびＳＴＭ−１の両方は、１１ＫＤａ
の陰性（ｃｒｙｐｔｉｃ）のプラスミドを発現する。

【００５４】サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１
は、事実上非毒性であり、その親株より１０，０００倍
以上低い毒性である。野生タイプ親株およびＳＴＭ−１
の侵入能力の比較では、変異株が、侵入し、そして臨床
症状を起こすことなしに数日間、脾臓に生き残ることさ
えできるということを、マウスのモデルにおいて示した
（図２）。１０日間を通じて、ＳＴＭ−１に感染したマ
ウスは、全く死なず、全てがその毛並による判定で健康
に見えた。これに反して、感染後５日で全ての野生タイ
プ感染マウスは、背を丸め、ルーズな不健康な毛並みの
兆候を示した。感染８日後で、全ての野生タイプ感染マ
ウスは死んだ。野生タイプ感染マウスの脾臓中の野生タ
イプ株の増殖は、生存数をカウントすると、６日で投与
種菌のそれを越えたが、これに反して、ＳＴＭ−１の増
殖は、１０⁵ＣＦＵ／ｍｌより高いカウントには決して
達しなかった。結果は、表１に示される。

【００５５】

【表１】

【００５６】（ ）は、対照マウスと比較した脾臓サイ
ズの増大を表す。

【００５７】ＳＴＭ−１によって経口もしくは腹腔内に
ワクチン投与され、次いで、１０ｘＬＤ₅₀において野生
株によって攻撃されたマウスは、サルモネラ症に対して
防御された。脾腫のデータが、接種後１０日間記録され
た。脾腫は、野生タイプ感染マウスで顕著であるが、Ｓ
ＴＭ−１においては、それは軽度であり、３日でピーク
に達し、１０日目には急速に正常サイズに減退した。対
照株は、脾臓サイズに何ら増大を示さなかった。図２〜
５は、ＳＴＭ−１および野生タイプ株両方の増殖特性を
比較した。

【００５８】本発明により、ＳＴＭ−１は、経口、皮下
（ＳＣ）および腹腔内（ＩＰ）経路によって投与される
広範なニワトリでの試行において使用されてきた。１．
２ｘ１０¹⁰までの経口タイターが適用され、疾病効果を
起こさないことが分かった。事実、ワクチン投与された
トリは、対応する接種対照ニワトリよりも一致して、有
意に体重が重いことが示された。

【００５９】（実施例２）マスター（ｍａｓｔｅｒ）および生産シードの調製 サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１培養液は、次の
ように増殖される。培養液は、１％ｗ／ｖ酵母エキスを
補ったＴＳＢを含んでなる増殖培地１００ｍｌに植菌す
るために使用される。そのブロスは、３７℃で一夜振盪
しつつ培養される。培養物は、血液寒天、ＸＬＤ寒天、
マッコンキー寒天およびトリプルシュガーアイアン（Ｔ
ＳＩ）ブロスの増殖でのグラム染色によって純粋性が確
認される。その培養物は、各アンプルが、１０⁹菌体を
含むように、滅菌スキムミルクの存在で凍結乾燥され
る。これがマスターシードである。

【００６０】次に、マスターシードのアンプルが、生産
シードのロットを作るために同じ方法で使用される。マ
スターおよび生産シードのアンプルは、−２０℃で保存
される。

【００６１】（実施例３）ワクチンの調製 生産シードの２本のアンプルが、２個の吸引びんに接種
するために使用される。各吸引びんは、増殖過程を開始
するために増殖培地（ＴＳＢ＋酵母エキス）約５００ｍ
ｌを含有する。各５００ｍｌ培養液が、パイレックスの
大型ガラスびん中の増殖培地約１０リットルに接種する
ために使用される。その大型ガラスびんは、さらに生産
ファーメンターに接種するために使用される。大型ガラ
スびん培養段階までの全ての操作は、無菌箱もしくは層
流キャビネット中で無菌的に実施される。生産ファーメ
ンターへの大型ガラスびん培養液の添加は、蒸気殺菌さ
れたチューブ／硬質鉛管連結器具を通して行われる。

【００６２】６〜８時間後に、種菌の濁度は濃厚にな
り、グラム染色および純度試験プレートによって微生物
的に純粋である種菌が添加される。その培養液が、蒸気
殺菌された連結器具を通してステンレス製ファーメンタ
ーに連結され、そのファーメンター内容物に接種するた
めに使用される。光学濃度が、ファーメンター中の培養
増殖を追跡するために使用される。最高濃度において、
その培養液は、連続流動遠心機を通して菌体を濃縮し、
純粋性を再チェックする。培養液は、その操作の間冷却
される。冷却濃縮液は、滅菌スキムミルク粉末と混合さ
れ、その混合物は、凍結乾燥用の医薬品グレードガラス
びんに注入される。滅菌乾燥窒素ガスが、ゴム栓で密閉
して、凍結乾燥機から出す前の凍結乾燥サイクルの最後
において、そのびんに充填するために使用される。アル
ミニウム輪形シールが、各びんに固着される。続いて、
びんは、ラベルが張られ、急送用のカートンに包装され
る。許可前に、そのワクチンは、力価、安全性、湿度、
純度および同一性について試験される。

【００６３】（実施例４）ワクチンの安全性および有効性 ＳＴＭ−１の毒性欠如に関するデータは、実施例１にお
いて提供される。ＳＴＭ−１の経口および皮下注射の両
方を目的とする一連の実験が、その生物の安全性および
有効性の両方を示すために以下に述べられる。

【００６４】実験１ 用量反応実験は、ニワトリに悪影響を与えることなく、
ニワトリにおいて強い抗体（ＩｇＧ）応答を誘起するた
めに経口的に必要なＳＴＭ−１の用量範囲を確認するた
めに計画された。２５羽のニワトリの４群： ニワトリ
当たりリン酸バファー生理食塩水（ＰＢＳ）（０．１４
５ＭＮａＣｌ，０．０１Ｍリン酸ナトリウム［ｐＨ７．
１］）１００ｍｌを投与した対照群、およびニワトリ当
たり１０⁴、１０⁶もしくは１０¹⁰ＳＴＭ−１を投与した
３接種群、を用いた。これらのニワトリは、１日齢にお
いて接種された。血液は、接種後７，１４，２１，およ
び２８日に、各群における５羽のニワトリから採取され
た。これらの血液から得た血清が、酵素結合免疫吸着剤
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、音波破砕されたＳＴ
Ｍ−１に対する体液性応答について実験された。細菌の
低用量（１ｘ１０⁴）は、有意なＩｇＧ応答を生じず、
中間用量（１ｘ１０⁶）は、接種後２１および２８日の
トリにおいて有意な応答を生じ、そして高用量（１ｘ１
０¹⁰）は、接種後７，１４，２１および２８日のニワト
リにおいて有意な応答を生じた。

【００６５】実験２ 実験１において集められた情報は、１０⁹ＳＴＭ−１を
経口的および皮下に接種されたニワトリからの血清およ
び消化管洗液におけるＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ応答
を試験するために使用された。経口的および皮下に接種
されたニワトリにおける体液姓応答のこの試験は、これ
らの投与経路によって引き出された抗体応答のレベルに
おける情報を提供することであった。４群のニワトリ
は、１日齢において接種された。３０羽のニワトリの２
群は、１群は経口的にそして他は皮下に、ＳＴＭ−１を
接種された。２２羽のニワトリの他の２群は、ＰＢＳを
経口的もしくは皮下に接種された。血液は、接種後７，
１４，２１および２８日に、各群における５羽のニワト
リから採取された。全てのニワトリが屠殺され、腸管が
消化管洗液調製のために除去される前に、血液の場合と
同じ日に、経口接種されたニワトリからの糞が綿棒で採
られた。これらのニワトリからの血清および消化管洗液
は、ＳＴＭ−１抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇ
Ａ応答に関して、ＥＬＩＳＡによって試験された。

【００６６】抗体応答は、７日齢のニワトリからの血清
および消化管洗液には検出されなかった。検出された最
初の統計学的に有意な抗体応答は、１４日齢のニワトリ
からの血清における、音波破砕ＳＴＭ−１に対するＩｇ
Ｇ応答およびＳＴＭ−１のリポ多糖類（ＬＰＳ）に対す
るＩｇＭ応答であった。ＳＴＭ−１のＬＰＳに対する最
初の有意なＩｇＡ応答は、２１日齢のニワトリからの血
清において検出された。経口的に接種されたニワトリか
らの消化管洗液における抗体応答は、ＩｇＧおよびＩｇ
Ａに限られ、検出された応答は、２１日齢のニワトリか
らの消化管洗液におけるＳＴＭ−１ ＬＰＳに対するＩ
ｇＧ応答であった。興味あることに、有意なＩｇＭ応答
は、血清におけるＳＴＭ−１のポーリンに対して、また
は消化管洗液におけるＳＴＭ抗原のいずれに対しても検
出されなかった。

【００６７】表２、および図６，７および８は、これら
の知見を総括している。表２、および図９および１０
は、また、ＳＴＭ−１によって皮下接種で免疫されたニ
ワトリにおける体液姓応答を示す。

【００６８】

【表２】

【００６９】最初の統計学的に有意なＩｇＧ、ＩｇＭお
よびＩｇＡ応答は、７，１４および２１日齢のニワトリ
からの血清において検出された。ＩｇＧ応答は、ＳＴＭ
−１ポーリンを含む全３種の抗原に対するものであっ
た。抗体応答は、消化管洗液においては検出できなかっ
た。消化管洗液におけるＳＴＭ−１ポーリンに対する高
いＩｇＧ応答および血清におけるＳＴＭ−１ポーリンに
対するＩｇＭ応答は、２８日齢の対照ニワトリにおいて
見られた。しかしながら、抗体応答のレベルにおけるこ
の上昇は、ＳＴＭ−１ ＬＰＳが、ＥＬＩＳＡにおける
抗原として使用された場合には、検出できなかった。

【００７０】ＳＴＭ−１の１ｘ１０⁸によって皮下にワ
クチン接種され、毒性のＳ．チフィムリウム１ｘ１０⁸
によって７日後に皮下に攻撃されたニワトリは、全てそ
の攻撃から生き残ったが、毒性のＳ．チフィムリウム１
ｘ１０⁸によって皮下に攻撃されたワクチン未接種群
は、全て死亡した。毒性のＳ．チフィムリウムによって
経口攻撃される前に、ＳＴＭ−１によって経口的にワク
チン接種されたニワトリは、ワクチン接種されなかった
ニワトリより前に、その生物の排出を止めた。ニワトリ
は、実験中に死ななかったが、全てが、攻撃の後毒性生
物を排出した。しかしながら、攻撃後３５日で、綿棒の
糞は、全てのワクチン接種ニワトリが、毒性生物を排出
するのを止めるが、３０羽のワクチン接種されなかった
ニワトリ中１０羽が、なお生物を排出していることを証
明した。

【００７１】（実施例５）体重増加に及ぼすＳ．チフィムリウムＳＴＭ−１の影響 ニワトリの体重増加に及ぼすＳＴＭ−１の経口接種の影
響を試験するために、ニワトリが、経口的に接種され、
体重測定された。その結果は、表３に示される。

【００７２】接種されたニワトリが、同年齢の対照より
も有意に大きい体重をもっていたので、ＳＴＭ−１の１
ｘ１０⁹もしくは５ｘ１０⁹によるニワトリの経口接種
は、ニワトリの体重増加に対して悪影響はなかった。実
験室レベルで経験され、表３に示された体重増加は、ま
た、野外試行においても見られた。

【００７３】

【表３】

【００７４】（実施例６）ワクチン菌株の蔓延および残存 鳥類が、高密度飼育に維持される場合、ワクチンは鳥類
に拡散することが知られていた。１群中わずか２羽に接
種された実験室内のニワトリについて、その１群中への
ＳＴＭ−１の蔓延の研究は、その群が、密接して、固定
床に養われている場合には、急速にその生物が蔓延する
ことを明らかにした。綿棒の糞の試験は、全てのニワト
リは、５日間その生物を排出し続けるが、その生物は、
１４日目にはニワトリから消失した。

【００７５】しかしながら、床が変化し、トリの間隔が
より広い野外の条件下では、トリからトリへの伝達は、
有意に減少した。事実、トリからトリへの伝達率は、防
御応答の誘起には十分ではなかった。囲いでの試行では
接触するトリの６０％のみが、ＳＴＭ−１蔓延を示した
が、防御応答を与えるために十分なレベルではなかっ
た。

【００７６】ＳＴＭ−１は、もし１日齢のニワトリに投
与された場合には、実験室では２８日後には分離するこ
とができなかった。接種後７，１４，２１および２８日
に採取された綿棒での糞は、経口接種されたニワトリ
が、試験された最初の２回のサンプリング時間において
のみ、その生物を排出することを明らかにした。野外の
結果は、同様なパターンを示した。

【００７７】表４の表示は、３０，０００羽の野外試行
におけるＳＴＭ−１分離率である。

【００７８】

【表４】

【００７９】¹ 直接およびブロス集積培養を通して培
養された死体からの肝臓のみ² 直接および集積培養において陽性³ 亜セレン酸塩集積のみで陽性⁴ 一つは異常過増殖のために捨てられた⁵ 小屋の床から選ばれた排出糞⁶ ワクチン接種の小屋および対照の小屋：サルモネラ
・ソフィアとして同定された各４株から分離された。Ｓ
ＴＭ−１は発見されなかった。

【００８０】⁷ ワクチン接種の小屋からサルモネラ・
ソフィア３／３０⁸ 対照の小屋からサルモネラ・ソフィア６／３０ 環境浄化の結果および、ＳＴＭ−１を見出だした１回の
試験小屋および２回の商業的ブロイラー小屋試行からの
ＳＴＭ−１分離は、ＳＴＭ−１が、環境中もしくはトリ
中でワクチン接種後２１日以上は残存しないことを示し
た。

【００８１】ＳＴＭ−１は、１％ｗ／ｖ酵母エキス添加
のＴＳＢ中で１０代の間、連続継代培養された。１０ｍ
ｌ培養の一部が、新鮮な予め暖められた培地５００ｍｌ
に添加され、一夜３７℃で培養された。この操作は、連
続１０日間、毎日行われた。各代毎に、培養は、純粋
性、ａｒｏＡ欠失の有無および細胞数について評価され
た。各代の細胞濃度は、約５ｘ１０⁹／ｍｌであった。
１０代の終了後、その生物は、ＳＴＭ−１であることを
確認された。トリ間の継代で３代以降、十分な数におい
てその生物を直接継代する力がないので、継代の間に集
積を入れたプロトコールが、ニワトリの戻し継代のため
に利用される。５ｘ１０⁹の細胞濃度でのＳＴＭ−１
が、２４日齢のニワトリに経口接種された。２４時間
後、綿棒で糞が、集められ、亜セレン酸ブロスで集積さ
れ、ＳＴＭ−１が選択された。次に、再分離されたＳＴ
Ｍ−１は、１％ｗ／ｖ酵母エキス添加のＴＳＢ中で３７
℃一夜増殖され、５ｘ１０⁹（一夜培養の約１ｍｌ）
が、トリ２に（そして同様にして）１０代の間接種され
た。各代において得られた分離株および全てのサルモネ
ラ様分離株は、完全に、特徴を調べられ（サルモネラ変
種は見いだされなかった）、最終分離株はＳＴＭ−１で
あることが確認された。

【００８２】本研究は、ＳＴＭ−１が、サルモネラ症を
制御する方法として、そして腸内病原体からの抗原につ
いての表現媒体として使用できることを示している。消
化管のコロニー形成は、選択された抗原が、長期間、宿
主の防御機構に接近し続けることを確実にする。高接種
量（１．２ｘ１０¹⁰）によっても認められた逆効果の欠
如および細菌の可能な増殖促進効果は、ＳＴＭが、プロ
ビオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）としての可能性を
もつことを示している。

【００８３】（実施例７）インキュベーション１８日目に、インオボで気嚢にワク
チン接種した後のサルモネラ・チフィムリウム変異株Ｓ
ＴＭ−１によるニワトリの“孵化後”および“孵化前”
の器官でのコロニー形成 この実験の目的は、１８日におけるインオボ投与に続い
て、種々のワクチン接種レベルにおけるＳＴＭ−１の組
織でのコロニー形成および糞への放散を測定することで
ある。

【００８４】インキュベーション１６日の卵は、１日２
回の規則的反転をさせつつ孵卵器中に保たれた。孵化し
たばかりのニワトリは、ニワトリ飼育用標準赤外ランプ
の下で、個々の群として飼育された。水は、自由に摂取
され、薬剤無添加飼料が用いられた。インキュベーショ
ン１８日において、そのニワトリ胚は、Ｓ．チフィムリ
ウムＳＴＭ−１増殖菌体の１０⁸コロニー形成単位（ｃ
ｆｕ）もしくは１０⁴ｃｆｕによってインオボにワクチ
ン接種された。投与は、卵の気嚢内に直接接種して行わ
れた。別の試行においては、ＳＴＭ−１変異株の１０⁶
もしくは１０⁴ｃｆｕが、卵に投与された。

【００８５】結果 孵化したヒナは、１０⁴、１０⁶、もしくは１０⁸ｃｆｕ
を接種されたけれども、孵化後初めて３日目にワクチン
菌株を放散した。３〜１２日の間は、ＳＴＭ−１菌株を
ワクチン接種されたヒナからは有意な放散があった。Ｓ
ＴＭ−１変異株は、８日までの間、卵当たり１０⁸ｃｆ
ｕを投与された全てのヒナおよび卵当たり１０⁴、１０⁶
ｃｆｕを投与された大部分のヒナの全器官から培養され
た。実施例によれば、１０⁴ｃｆｕのＳＴＭ−１を接種
された卵からの４日齢ヒナ（５羽）は、次の組織のコロ
ニー形成を示した： ４／５ 心臓 ５／５ 肝臓 ５／５ 腸 ５／５ 盲腸 これらの結果は、変異株ＳＴＭ−１が、孵化率とその後
のヒナ生存率に悪影響を与えることなく、卵当たり１０
⁴〜１０⁸ｃｆｕで卵に対して１８日目に投与することが
できることを示している。１８日目のインオボワクチン
接種の後、その生物は、ニワトリの広い範囲の器官およ
び組織にコロニー形成し、孵化後少なくとも８日間、そ
の生物の放散があった。

【００８６】（実施例８）毒性サルモネラ・チフィムリウムによる皮下攻撃に対す
るＳＴＭ−１のインオボ投与の効果 この実験の目的は、ＳＴＭ−１を用いるインオボワクチ
ン接種が、孵化後７日に皮下に投与されたＳ．チフィム
リウムの臨床上の影響からヒナを防御するか否かを決定
することである。

【００８７】材料および方法 効果の主たる基準は、死亡率である。第２は、糞中放散
および器官のコロニー形成の差を測定する。

【００８８】卵は、インキュベーション１８日に、１０
⁴もしくは１０⁶ＳＴＭ−１によってワクチン接種され、
ヒナは、野生タイプＳ．チフィムリウムのＬＤ₅₀より１
〜１００倍以上の用量によって孵化後７日目に攻撃され
た。各ワクチン用量について、１０羽２群が、１０⁶も
しくは１０⁸ｃｆｕによって皮下に攻撃され、１０羽の
第３群が、未攻撃のまま残された。ワクチン未接種の１
０羽の３群は、対照として使用され、２群は、攻撃さ
れ、１群は、未攻撃で残された。健康状態は、全トリに
ついて１日２回検査された。糞への放散は、指定日に全
トリについての排出汚物を培養することによって検査し
た。器官のコロニー形成は、弊死した全トリ、および各
群の生存しているトリを屠殺して測定し、指定された器
官が、攻撃後１４日目に培養された。

【００８９】攻撃株は、サルモネラ・チフィムリウム８
２／６９１５株であった。

【００９０】ヒナは、１０ｋｇの真空密封された多層ペ
ーパーおよびＰＶＣコンテナー中でガンマー線照射（Ba
rastoc Stock Feeds, St Arnaud, Victoria, Australi
a）により処理された薬剤無添加飼料を摂取した。各箱
は、サルモネラの存在に関して個々に試験された。

【００９１】孵化したヒナは、常法に従って、赤外線加
温ランプ下で飼育された。飼料および水は、試行期間を
通して自由に利用された。

【００９２】４０個の卵各々が、用量当たり最少３０羽
を、孵化後７日における攻撃用に確保するために、卵当
たり１０⁴ｃｆｕおよび卵当たり１０⁶ｃｆｕのＳＴＭ−
１によって、それぞれワクチン接種された。

【００９３】結果 １．孵化率 卵当たり１０⁴ｃｆｕ、卵当たり１０⁶ｃｆｕをワクチン
接種した卵および未接種卵の孵化率は、表５に示され
る。

【００９４】

【表５】

【００９５】２．サルモネラ・チフィムリウムによる攻
撃 野生タイプＳ．チフィムリウムのヒナ当たり１０⁸ｃｆ
ｕにより攻撃されたワクチン未接種のトリは、最初の７
２時間内に急速に弊死した。１１羽中１０羽が弊死し
た。Ｓ．チフィムリウムのヒナ当たり１０⁶ｃｆｕによ
り攻撃されたワクチン接種されたトリにおいては、９羽
中２羽が、最初の７２時間内に弊死した。１０⁸ｃｆｕ
により攻撃されたワクチン接種されたトリについては、
８羽中４羽が、攻撃後の最初の７２時間内に弊死した。
１０⁴もしくは１０⁶ＳＴＭ−１でのワクチン接種の間に
は、殆ど差はなかった。

【００９６】両群についての結果は、ワクチン未接種群
と比較した場合、ワクチン接種法によって起きる防御に
は有意差があることを示唆する。

【００９７】皮下投与されたヒナ当たり１０⁸ｃｆｕの
攻撃用量は、このサルモネラ分離株の１００倍のＬＤ₅₀
で評価され、驚くべきことに、攻撃生物は、インオボワ
クチン接種されたヒナの免疫系を完全に抑制することは
なかった。病原性サルモネラのヒナ当たり１０⁶ｃｆｕ
のより低い攻撃用量が使用された場合の群では、臨床上
の影響は、より緩和なものとなった。これらの結果に基
づき、ＳＴＭ−１によるインオボワクチン接種は、毒性
の野生タイプのサルモネラ・チフィムリウムによる皮下
攻撃から、明らかにニワトリを防御すると結論される。

【００９８】微生物学的データは、１０⁴および１０⁶Ｓ
ＴＭ−１によるインオボワクチン接種の後、孵化後４日
のヒナにおいて、ＳＴＭ−１のコロニー形成は１００％
であったことを示した。この生物は、ワクチン接種のト
リ糞中に、１０日までに排出されたが、１４日では、ワ
クチン接種のトリ３８羽中わずか１羽が、腸内において
ＳＴＭ−１陽性であった。したがって、ＳＴＭ−１は、
インオボワクチン接種後に、ヒナの全身系コロニー形成
を確立した。

【００９９】（実施例９）毒性サルモネラ・エンテリチヂスによる皮下の攻撃に対
するサルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１のインオボ
投与の効果 この実験の目的は、ＳＴＭ−１を用いるインオボワクチ
ン接種が、皮下投与によって攻撃された野生タイプＳ．
エンテリチヂスからヒナを防御するか否かを決定するこ
とである。

【０１００】材料および方法 効果の主たる基準は、死亡率である。第２の測定は、糞
中放散および器官のコロニー形成の差異である。

【０１０１】そのワクチンは、卵当たり１０⁴もしくは
１０⁶ｃｆｕにおいて、インオボ投与され、攻撃は、ヒ
ナ当たり５ｘ１０⁷ｃｆｕにおいて皮下に投与された。
ヒナは、１０ｋｇの真空密封された多層ペーパーおよび
ＰＶＣコンテナー中でガンマー線照射（Barastoc Stock
Feeds, St Arnaud, Victoria）により処理された薬剤
無添加飼料を摂取した。各箱は、サルモネラの存在に関
して個々に試験された。

【０１０２】孵化したニワトリは、常法に従って、赤外
線加温ランプ下で飼育された。飼料および水は、試行期
間を通して自由に利用された。攻撃菌株は、Ｓ．エンテ
リチヂス４４６３０２株であった。

【０１０３】卵は、インキュベーション１８日に、卵当
たり１０⁴もしくは１０⁶ｃｆｕによってワクチン接種さ
れ、ヒナは、孵化後７日に攻撃された。

【０１０４】結果 ワクチン未接種群の卵、卵当たり１０⁴ｃｆｕワクチン
接種群および卵当たり１０⁶ｃｆｕ接種群の孵化率％
は、それぞれ８７．２％、９５．６％および６９．６％
であった。それぞれの体重は、４９．０ｇ，４８．３ｇ
および４５．０ｇであった。孵化率は、孵卵器の状態に
依存し、卵当たり１０⁶ｃｆｕワクチン接種の低孵化率
は、多分ワクチン接種よりもむしろ孵卵器に原因がある
と思われた。 野生タイプＳ．エンテリチヂスによるヒ
ナ当たり５ｘ１０⁷ｃｆｕにおいて攻撃されたワクチン
未接種のヒナにおいては、急速な弊死があった（５日目
に１２羽中１１羽）。同量のＳ．エンテリチヂスにより
攻撃されたワクチン接種されたヒナにおいては、長期間
にわたってヒナの死には異なるパターンがあった。卵当
たり１０⁶ｃｆｕを接種され、次いで攻撃された卵は、
最初の６日間に８羽中４羽が弊死し、８日後には１羽で
あった。卵当たり１０⁴ｃｆｕを接種された卵は、攻撃
後４〜６日に１１羽中４羽が弊死し、１１日には１羽、
そして１３日には１羽であった。これらの結果は、ワク
チン未接種群と比較した場合、ワクチン接種法によって
起きる交差防御には著しい差があることを示している。

【０１０５】皮下投与されたヒナ当たり５ｘ１０⁷ｃｆ
ｕの攻撃用量は、このサルモネラ分離株の１００倍のＬ
Ｄ₅₀で評価された。

【０１０６】孵化ヒナにおける血清ＩｇＧレベルの解析
は、ワクチン未接種トリに比較してワクチン接種トリに
おいてより高い平均ＩｇＧレベルを示した。この結果
は、いかなるインオボワクチンも、ヒナにおけるＩｇＧ
応答を刺激する効果があり、得られた結果は、野生タイ
プサルモネラの攻撃に生き残ったヒナにおいて認められ
るものと、少なくとも同じくらい良好であることを示し
ている。

【０１０７】その研究は、ＳＴＭ−１の１０⁴もしくは
１０⁶ｃｆｕのいずれかによる１８日目のヒナ胚への接
種が、孵化時点でワクチン接種ヒナの１００％に効果的
なコロニー形成を起こすことを確認した。インオボワク
チン接種は、皮下に投与された用量５ｘ１０⁷ｃｆｕに
より攻撃されたＳ．エンテリチヂスの攻撃に対して、交
差防御を確立した。

【０１０８】（実施例１０）毒性サルモネラ・エンテリチヂスによる経口の攻撃に対
するサルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１のインオボ
投与の効果 この実験の目的は、Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を用
いる１７日目にインオボワクチン接種されたヒナが、
Ｓ．エンテリチヂスによる７日および１４日後の経口攻
撃において、その生物による組織のコロニー形成が低下
するか否かを確認することである。

【０１０９】材料および方法 効果の主たる基準は、糞中放散および器官のコロニー形
成の差異の測定である。そのワクチンは、卵当たり１０
²もしくは１０⁴ｃｆｕにおいて、インオボ投与され、攻
撃は、ヒナ当たり１ｘ１０⁷ｃｆｕもしくは６ｘ１０⁸ｃ
ｆｕにおいて経口的に投与された。

【０１１０】ヒナは、１０ｋｇの真空密封された多層ペ
ーパーおよびＰＶＣコンテナー中でガンマー線照射（Ba
rastoc Stock Feeds, St Arnaud, Victoria）により処
理された薬剤無添加飼料を摂取した。各箱は、サルモネ
ラの存在に関して個々に試験された。

【０１１１】孵化したヒナは、常法に従って、赤外線加
温ランプ下で飼育された。飼料および水は、試行期間を
通して自由に利用された。攻撃菌株は、サルモネラ・エ
ンテリチヂス４４６３０２株であった。

【０１１２】結果 孵化率および平均体重に及ぼすワクチンの効果は、表６
に示される。孵化率もしくは体重における差異は、明ら
かではない。

【０１１３】

【表６】

【０１１４】毒性生物（サルモネラ・エンテリチヂス）
による攻撃に続き、その攻撃後の期間には、１羽のみが
弊死した。この孵化ヒナは、卵当たり１０²ｃｆｕによ
りワクチン接種された。これは、サルモネラの感染によ
るよりもむしろ突発的死であろう。

【０１１５】体重増加に関しては、そのニワトリは、試
行期間を通じ同一であった。孵化後４日目に、ＳＴＭ−
１をインオボワクチン接種された５０羽中４９羽が、ワ
クチン菌株を放出した。その結果は、表７に示される。

【０１１６】

【表７】

【０１１７】− Ｓ．エンテリチヂス検出なし その結果は、ワクチン接種方法は、安全であり、孵化率
もしくはヒナ生存率には影響しないと思われ、そして大
量のブロイラー孵化に対して理想的に適切であることを
示している。

【０１１８】（実施例１１）インキュベーション１７日における投与後、サルモネラ
・チフィムリウムＳＴＭ−１菌のインオボでの増殖能の
測定 この実験の目的は、気嚢を通してのＳＴＭ−１菌の卵当
たり１０²ｃｆｕもしくは卵当たり１０⁴ｃｆｕの投与
後、４日のインキュベーション期間（インキュベーショ
ン１７〜２１日）にわたり、ホモジナイズされたインオ
ボの組織からの回復可能なＳ．チフィムリウムＳＴＭ−
１菌体量を算定することであった。

【０１１９】材料および方法 ＳＴＭ−１菌は、インキュベーション１７日に卵殻を通
して気嚢間隙に投与された。主な測定は、インキュベー
ション後の一連の指定間隔において、卵殻内組織のＳＴ
Ｍ−１のコロニー形成単位を評価することであった。

【０１２０】インキュベーション７日目の卵は、次のよ
うに培養された： 卵当たり１０²ｃｆｕにおいて１８個の卵； 卵当たり１０⁴ｃｆｕにおいて１８個の卵。

【０１２１】気嚢中への投与は、２６ゲージ注射針を通
して行った。ワクチン接種後、２．５、２６，４５，６
９および１００時間において、卵は、ホモジナイズさ
れ、培養された。

【０１２２】ホモジナイゼーションは、ウォーリングブ
レンダーによって行った。１％ｗ／ｖ酵母エキス添加の
栄養ブイヨン５０ｍｌおよびＰＢＳ５０ｍｌを含んでな
るブレンド液１００ｍｌの一定分量が添加された。その
内容物は、低速度で６０秒間ホモジナイズされ、培養の
ために保存された。

【０１２３】結果 ＳＴＭ−１コロニーは、２．５時間にアッセイされた場
合には、いかなる希釈においても存在しなかった。イン
キュベーション後２６時間の１個の卵（卵当たり１０⁴
ｃｆｕをワクチン接種）において、ＳＴＭ−１は、１０
０μｌおよび１．０ｍｌプレート（２および８コロニ
ー、それぞれ１．２ｘ１０³の評価された卵のカウント
を与える）において認められた。供試された全ての卵に
おいてこの時間後に、ＳＴＭ−１の増殖における劇的な
増加が起きた。結果は、表８に示される：

【０１２４】

【表８】

【０１２５】その結果は、インオボのＳＴＭ−１菌の増
殖の証拠のない初めの少なくとも４５時間は、開始定常
期であることを示している。４５〜１００時間の期間内
に、ＳＴＭ−１は、有意な増殖を示した。

【０１２６】（実施例１２）インキュベーション１４日における卵中への投与後、サ
ルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１菌のインオボでの
増殖能の測定 この実験の目的は、７日のインキュベーション期間（気
嚢内に卵当たり１０²ｃｆｕの投与後の１４〜２１日）
にわたり、卵からの回復可能なＳＴＭ−１菌体量を算定
することであった。

【０１２７】材料および方法 ＳＴＭ−１菌は、卵殻を通して気嚢内に投与された。主
な測定は、インキュベーション後の一連の指定間隔にお
いて、卵殻内組織のＳＴＭ−１のコロニー形成単位を評
価することであった。

【０１２８】１４日インキュベーションされた卵は、次
のように植菌された： １． 卵当たり１０²ｃｆｕにおいて３６個の卵； ２． ＰＢＳ ０．１ｍｌにより植菌された９個の卵 ７日インキュベーションされた卵は、次のように植菌さ
れた： １． 卵当たり１０²ｃｆｕにおいて３０個の卵 ２． 卵当たり１０¹ｃｆｕにおいて１５個の卵。

【０１２９】無処理の１０個の卵は、対照として持続さ
れた。

【０１３０】細菌増殖は、植菌（示された用量で）後、
２４，７２，９６および１６８時間において実施例１１
のように卵をホモジナイズし、その後菌の存在数を計数
することによって算定された。２個の卵が、各時点で分
析された。

【０１３１】結果

【０１３２】

【表９】

【０１３３】投与された菌は、胚に毒性をもたなかっ
た。前記結果は、最初の２４時間において、卵中のＳＴ
Ｍ−１菌の有意な増殖の証拠を示している。

【０１３４】受精後１４日の早い時期に、卵当たりＳＴ
Ｍ−１の１０¹ｃｆｕを接種された卵は、２１日（１６
８時間増殖）の孵化前に１０⁶菌を含有し、そのＳＴＭ
−１菌は、最初の低い種菌で存在する場合でさえも、卵
中で有意な増殖をすることができる。

【０１３５】気嚢と同様に胚組織が、インキュベーショ
ン期間の間、細菌増殖について分析された。そのＳＴＭ
−１菌は、インオボの間は器官／組織中には入らなかっ
た。細菌増殖は、気嚢内で起きることが示された。ヒナ
が、孵化前に気嚢膜を貫く時に、発育ヒナ内でＳＴＭ−
１の急速な増殖が起きる。ＳＴＭ−１は、孵化後４日目
および８日目に試験された全ての器官において分離され
たが、勿論、対照は例外として、卵もしくはそこから得
られるヒナにＳＴＭ−１が存在しなかった。

【０１３６】（実施例１３）卵の種々の部位におけるサルモネラ菌のインオボ接種に
続く発育胚の生存率 この実験の目的は、気嚢、卵黄嚢および漿尿膜（ＣＡ
Ｍ）中へのサルモネラ菌のインオボ接種に続く発育ヒナ
胚の生存率を比較することであった。

【０１３７】材料および方法 植菌は、ＳＴＭ−１、またはサルモネラ・チフィムリウ
ムもしくはサルモネラ・エンテリチヂスの毒性株の１ｘ
１０⁶ｃｆｕを用いて、気嚢、卵黄嚢およびＣＡＭ中に
行われた。１７日インキュベートされた卵が、この実験
で使用された。使用された毒性サルモネラ種は、サルモ
ネラ・チフィムリウム８２／６９１５およびサルモネラ
・エンテリチヂス４４６３０２であった。

【０１３８】結果 この実験の結果は、次の通りであった：気嚢接種 ＳＴＭ−１ 孵化７羽中７羽 Ｓ．チフィムリウム 孵化４羽中２羽 Ｓ．エンテリチヂス 孵化８羽中６羽卵黄嚢 ＳＴＭ−１ 孵化７羽中１羽（２
０日において生きていた１個の卵が割られた） ２１日において７羽中５羽弊死 Ｓ．チフィムリウム ２４時間において７
羽中７羽弊死 Ｓ．エンテリチヂス ２４時間において７
羽中７羽弊死ＣＡＭ接種 ＳＴＭ−１ 孵化７羽中２羽 ２１日において７羽中５羽弊死 Ｓ．チフィムリウム ２４時間において７
羽中７羽弊死 Ｓ．エンテリチヂス ２４時間において７
羽中７羽弊死 その結果は、２種の既知のサルモネラ病原菌、すなわち
サルモネラ・チフィムリウム８２／６９１５およびサル
モネラ・エンテリチヂス４４６３０２の投与が、卵黄嚢
およびＣＡＭ経路を通して、急速な胚の死をもたらすこ
とを示した。これらの投与経路は、孵化したヒナ中への
皮下投与のような非経口的投与によく似ている。

【０１３９】その結果は、また、２種の既知の病原体
が、気嚢を通して投与された場合には、同用量の植菌に
よって等価の影響を発揮しないことを示している。Ｓ．
エンテリチヂスの場合には、ヒナ生存率に対して悪影響
を与えないと考えられる。

【０１４０】その菌は気嚢内で生きて、増殖すること、
およびヒナは、孵化前２４時間の間に、気嚢膜を突き破
るまで感染されないことが、主張される。

【０１４１】その結果は、また、サルモネラ・チフィム
リウムＳＴＭ−１が、他の２種の既知病原性菌株よりも
低い病原性であることを示している。卵黄嚢およびＣＡ
Ｍ中へのＳＴＭ−１植菌後は、ヒナ生存率は、危うくさ
れるけれども、その植菌の影響は、既知病原性菌株の植
菌に比べて胚の生存率には有害のようではなかった。 （実施例１４）サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１における抗原エ
ピトープの発現 本発明は、サルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１を包
含するタイプのサルモネラ種を含んでなる、同じ細菌も
しくは免疫学的に交差反応性の細菌の毒性形に対してヒ
ナを免疫するためのワクチンまで拡大する。本発明は、
また、その他のトリ病原性種からの抗原のような組み換
え的に発現される抗原をもっているサルモネラ種の使用
まで広がる。

【０１４２】そのようなベクターは、Schodel et al.,
Vaaine, 11: 143-148, 1993 およびSchodel et al., J.
Immunol., 12: 4317-4321, 1990 に記載されるものを
包含する。あるいはまた、形質導入、接合および／また
は形質転換のような技術が、その特定の菌株とは通常は
関連しない抗原を発現するサルモネラ菌株を創製するた
めに使用されてもよい。そのような改変サルモネラ菌株
は、多価ワクチンとして有用である。

【０１４３】遺伝的に改変されたサルモネラ・チフィム
リウムＳＴＭ−１菌株が、一度作製されれば、それは、
本明細書記載の方法により気嚢に投与される。一般に、
植菌は、インキュベーション期間１７もしくは１８日に
行われる。孵化後、接種を受けたニワトリは、抗原決定
基が単離され、および／または血清学的分析が行われ、
および／または微生物学的解析が行われる原因因子によ
って攻撃される。そのようなワクチン接種されたニワト
リは、ＳＴＭ−１のみが、卵をワクチン接種するために
使用される場合に起きるような毒性形の抗原エピトープ
の起源に対して、同じような防御率を発揮するであろ
う。

【０１４４】（実施例１５）ａｒｏ変異株の作製 ａｒｏ 欠失変異株は、米国特許第4,735,801号、第5,21
0,035号および第4,837,151号記載のような方法により調
製され、それらの全ては、全体的に引用することによっ
て本明細書に組み入れられる。野生タイプのエンテロバ
クター、セラチア、プロテウス、エルシニア、ビブリ
オ、アエロモナス、パスツレラ、シュードモナス、アシ
ネトバクター、モラキセラ、フラボバクテリウムおよび
エシェリヒア・コリが、ａｒｏＡ，ａｒｏＢ，ａｒｏＣ
もしくはａｒｏＤ中に挿入されたＴｎ１０トランスポゾ
ンを担持するファージを用いるファージ形質導入に使わ
れる。得られた変異株は、テトラサイクリン耐性につい
て選択される。

【０１４５】サルモネラ菌株のような遺伝的に改変され
た細菌は、本明細書記載の方法により、気嚢に投与され
る。孵化後、接種を受けたニワトリは、野生株によって
攻撃される。ワクチン接種されたニワトリは、毒性の野
生株に対して防御を発揮する。

【０１４６】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【０１４７】１． 弱毒化された微生物を含んでなり、
かつその弱毒化微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり； （ｂ）孵化前の胚において一種以上の組織をコロニー形
成させることができ；そして （ｃ）該微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差反応性
の微生物、または該弱毒化微生物によって発現された抗
原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対
して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答を誘起
することができる、トリ種用の生インオボワクチン。

【０１４８】２． トリ種が、ニワトリ、アヒル、シチ
メンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラおよびハトから
選ばれる、前記１に記載の生インオボワクチン。

【０１４９】３． トリ種が、ニワトリである前記２に
記載の生インオボワクチン。

【０１５０】４． 弱毒化された微生物が、サルモネラ
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ），シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ），クレブジーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ），エンテ
ロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），セラチア
（Ｓｅｒｒａｔｉａ），プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ），エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ），ビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ），アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ），
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），アシネトバクター（Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ），モラキセラ（Ｍｏｒａｘ
ｅｌｌａ），フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ），マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａ）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）からなる群から選ばれる、前記１に記載
の生インオボワクチン。

【０１５１】５． 弱毒化された微生物が、サルモネラ
・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ），サルモネラ・パラチフィＡまたはＣ
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ ｏ
ｒ Ｃ），サルモネラ・ショットムレリ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ），サルモネラ
・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅｓｕｉｓ），サルモネラ・モンテビデオ（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ），サルモネラ・
ニューポルト（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒ
ｔ），サルモネラ・エンテリチヂス（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ），サルモネラ・ガリナ
ルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕ
ｍ），サルモネラ・プロルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｐｕｌｌｏｒｕｍ），サルモネラ・アボルツソビ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ），サルモネ
ラ・アボルタス−エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂ
ｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ），サルモネラ・ダブリン（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ），サルモネラ・ソフ
ィア（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｏｆｉａ），サルモネ
ラ・ハバナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｈａｖａｎａ），
サルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｂｏｖｉｓｍｏｒｂｉｆｉｃａｎｓ），サルモ
ネラ・ハダール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｈａｄａ
ｒ），サルモネラ・アリゾナエ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ａｒｉｚｏｎａｅ）およびサルモネラ・アナタム（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａａｎａｔｕｍ）からなる群から選ば
れる、サルモネラである前記１に記載の生インオボワク
チン。

【０１５２】６． 弱毒化された微生物が、実質的にコ
リスミン酸を合成できない、前記１に記載の生インオボ
ワクチン。

【０１５３】７． 弱毒化された微生物が、ａｒｏＡ、
ａｒｏＢ、ａｒｏＣおよびａｒｏＤからなる群から選ば
れる一個ないし複数個の遺伝子において、ヌクレオチド
置換、欠失および／または挿入を担持する、前記８に記
載の生インオボワクチン。

【０１５４】８． 弱毒化された微生物が、ａｒｏＡ、
ａｒｏＢ、ａｒｏＣおよびａｒｏＤからなる群から選ば
れる少なくとも一個の遺伝子において欠失を担持する、
前記７に記載の生インオボワクチン。

【０１５５】９． ａｒｏ経路以外の生合成経路の酵素
をコードしている遺伝子における変異をさらに含んでな
る、前記７に記載の生インオボワクチン。

【０１５６】１０． 他の生合成経路がセリンの生合成
経路である、前記９に記載の生インオボワクチン。

【０１５７】１１． 胚が、気嚢を突き破った後に、実
質的にワクチンに曝されるような卵の気嚢内投与のため
に適応された前記１に記載の生インオボワクチン。

【０１５８】１２． 弱毒化された微生物が、孵化した
ばかりのトリから病原性微生物を競合的に排除する、前
記１に記載の生インオボワクチン。

【０１５９】１３． 弱毒化された微生物が、微生物、
蠕虫類、原虫類、酵母およびウイルスから選ばれる一種
以上のトリ病原因子からの抗原エピトープを発現する、
前記１に記載の生インオボワクチン。

【０１６０】１４． 弱毒化された微生物が、アイメリ
ア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種からの一種以上の抗原エピトー
プを発現する、前記１に記載の生インオボワクチン。

【０１６１】１５， 弱毒化された微生物が、トリ白血
症、細網内皮症、伝染性気管支炎、伝染性粘液嚢病、ニ
ューカッスル病、アデノウイルス病、レオウイルス病、
ポックス病、喉頭気管支炎、トリインフルエンザ、伝染
性コリーザ、鳥禽腸チフス、コクシジウム症、クリプト
スポリジウム症および鳥禽コレラの１種以上の原因因子
からの１種以上の抗原エピトープを発現する、前記１３
に記載の生インオボワクチン。

【０１６２】１６． 病原微生物による感染に対してト
リ種を免疫する方法てせあって、弱毒化された微生物を
インオボに投与することを含んでなり、かつこの弱毒化
微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
可能であり；そして （ｂ）該弱毒化微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差
反応性の微生物、または該弱毒化微生物によって発現さ
れた抗原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイル
スに対して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答
を誘起するのに効果的な量ならびに条件において、孵化
前の胚において一種以上の組織にコロニー形成すること
ができる、前記方法。

【０１６３】１７． トリ種が、ニワトリ、アヒル、シ
チメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラおよびハトか
ら選ばれる、前記１６に記載の方法。

【０１６４】１８． 弱毒化された微生物が、サルモネ
ラ，シゲラ，クレブジーラ，エンテロバクター，セラチ
ア，プロテウス，エルシニア，ビブリオ，アエロモナ
ス，パスツレラ，シュードモナス，アシネトバクター，
モラキセラ，フラボバクテリウム，マイコプラズマおよ
びエシェリヒア・コリからなる群から選ばれる、前記１
６に記載の方法。

【０１６５】１９． 弱毒化された微生物が、サルモネ
ラ・チフィムリウム，サルモネラ・パラチフィＡまたは
Ｃ，サルモネラ・ショットムレリ，サルモネラ・コレレ
スイス，サルモネラ・モンテビデオ，サルモネラ・ニュ
ーポルト，サルモネラ・エンテリチヂス，サルモネラ・
ガリナルム，サルモネラ・プロルム，サルモネラ・アボ
ルツソビ，サルモネラ・アボルタス−エクイ，サルモネ
ラ・ダブリン，サルモネラ・ソフィア，サルモネラ・ハ
バナ，サルモネラ・ボビスモルビフィカンス，サルモネ
ラ・ハダール，サルモネラ・アリゾナエおよびサルモネ
ラ・アナタムからなる群から選ばれるサルモネラであ
る、前記１６に記載の方法。

【０１６６】２０． 弱毒化された微生物が、実質的に
コリスミン酸を合成できない、前記１６に記載の方法。

【０１６７】２１． 胚が、気嚢を突き破った後に実質
的にワクチンに曝されるように、弱毒化された微生物が
卵の気嚢に投与される、前記１６に記載の方法。

【０１６８】２２． オーストラリアン・ガバメント・
アナリティカル・ラボラトリーズ（Australian Goverme
nt Analytical Laboratories）に寄託された、受託番号
Ｎ９３／４３２６６のサルモネラ・チフィムリウムＳＴ
Ｍ−１株。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１および野生タイ
プの親株におけるプラスミドのプロフィルを示す電気泳
動図に代る写真である。列１：ＨｉｎｄＩＩＩ分解のラ
ムダ標準； 列２：野生タイプ； 列３：ＳＴＭ−１。

【図２】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１およびその野生
タイプ親株によって誘導された脾腫のグラフである。

【図３】野生タイプＳ．チフィムリウムによって感染さ
れたマウス脾臓における生菌数のグラフである。

【図４】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１によって感染さ
れたマウス脾臓における生菌数のグラフである。

【図５】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１およびその野生
タイプによって感染されたマウス脾臓における生菌数の
グラフである。

【図６】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を接種されたニ
ワトリにおける抗体力価（ＩｇＧ）のグラフである。

【図７】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を経口的に接種
されたニワトリにおける抗体力価のグラフである。

【図８】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を経口的に接種
されたニワトリにおける抗体力価のグラフである。

【図９】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を皮下に接種さ
れたニワトリにおける抗体力価のグラフである。

【図１０】Ｓ．チフィムリウムＳＴＭ−１を皮下に接種
されたニワトリにおける抗体力価のグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】弱毒化された微生物を含んでなり、かつそ
   の弱毒化微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
   該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
   可能であり； （ｂ）孵化前の胚において一種以上の組織をコロニー形
   成させることができ；そして （ｃ）該微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差反応性
   の微生物、または該弱毒化微生物によって発現された抗
   原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイルスに対
   して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答を誘起
   することができる、トリ種用の生インオボワクチン。
2. 【請求項２】弱毒化された微生物が、サルモネラ（Ｓａ
   ｌｍｏｎｅｌｌａ），シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ），ク
   レブジーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ），エンテロバクタ
   ー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ），セラチア（Ｓｅｒｒ
   ａｔｉａ），プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ），エルシニ
   ア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ），ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ），
   アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ），パスツレラ（Ｐ
   ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ），シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｓ），アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂ
   ａｃｔｅｒ），モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ），フ
   ラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ），
   マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびエシェ
   リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）か
   らなる群から選ばれる、請求項１記載の生インオボワク
   チン。
3. 【請求項３】病原微生物による感染に対してトリ種を免
   疫する方法であって、弱毒化された微生物をインオボに
   投与することを含んでなり、かつこの弱毒化微生物が： （ａ）一種以上の成長因子について栄養要求性を示し、
   該一種以上の成長因子欠乏の最少培地においては増殖不
   可能であり；そして （ｂ）該弱毒化微生物の毒性形もしくは免疫学的に交差
   反応性の微生物、または該弱毒化微生物によって発現さ
   れた抗原決定基をもっている毒性の生物もしくはウイル
   スに対して、孵化前もしくは孵化直後に胚内で免疫応答
   を誘起するのに効果的な量ならびに条件において、孵化
   前の胚において一種以上の組織にコロニー形成すること
   ができる、前記方法。
4. 【請求項４】弱毒化された微生物が、サルモネラ，シゲ
   ラ，クレブジーラ，エンテロバクター，セラチア，プロ
   テウス，エルシニア，ビブリオ，アエロモナス，パスツ
   レラ，シュードモナス，アシネトバクター，モラキセ
   ラ，フラボバクテリウム，マイコプラズマおよびエシェ
   リヒア・コリからなる群から選ばれる、請求項３記載の
   方法。
5. 【請求項５】オーストラリアン・ガバメント・アナリテ
   ィカル・ラボラトリーズ（Australian Goverment Analy
   tical Laboratories）に寄託された、受託番号Ｎ９３／
   ４３２６６のサルモネラ・チフィムリウムＳＴＭ−１
   株。