JPH07209303A - 発蛍光標識用試薬 - Google Patents
発蛍光標識用試薬Info
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- JPH07209303A JPH07209303A JP6180768A JP18076894A JPH07209303A JP H07209303 A JPH07209303 A JP H07209303A JP 6180768 A JP6180768 A JP 6180768A JP 18076894 A JP18076894 A JP 18076894A JP H07209303 A JPH07209303 A JP H07209303A
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】カルボン酸のように、従来の試薬との反応性が
低かった被検試料化合物を容易に誘導体化し、対掌体を
高感度に分離分析でき、且つ入手し易い原料から容易に
製造できる発蛍光標識用キラル誘導体化試薬の提供。 【構成】下記式（Ｉ）で示される、光学活性化合物１−
（４−ダンシルアミノフェニル）エチルアミン及びこれ
を用いたカルボン酸の標識方法。 【化１】
低かった被検試料化合物を容易に誘導体化し、対掌体を
高感度に分離分析でき、且つ入手し易い原料から容易に
製造できる発蛍光標識用キラル誘導体化試薬の提供。 【構成】下記式（Ｉ）で示される、光学活性化合物１−
（４−ダンシルアミノフェニル）エチルアミン及びこれ
を用いたカルボン酸の標識方法。 【化１】
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、カルボン酸、殊にカル
ボン酸対掌体の分離及び高感度分析等の際に有用な発蛍
光標識用試薬に関する。
ボン酸対掌体の分離及び高感度分析等の際に有用な発蛍
光標識用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】高速液体クロマトグラフィーを用いる光
学異性体の分離分析において、光学対掌アミンをターゲ
ットにしたキラル誘導体化試薬は、アミノ基の反応性の
ゆえに、有用なものが幾つか開発され、実用化されてい
る。これに対して、カルボン酸をはじめとする他の官能
基は比較的反応性が低く、このような官能基を指向せね
ばならない場合のキラル誘導体化試薬の開発は遅れてお
り、対掌体の分離と高感度検出とを可能にする、実用的
なキラル誘導体化試薬の報告は殆ど知られていない。
学異性体の分離分析において、光学対掌アミンをターゲ
ットにしたキラル誘導体化試薬は、アミノ基の反応性の
ゆえに、有用なものが幾つか開発され、実用化されてい
る。これに対して、カルボン酸をはじめとする他の官能
基は比較的反応性が低く、このような官能基を指向せね
ばならない場合のキラル誘導体化試薬の開発は遅れてお
り、対掌体の分離と高感度検出とを可能にする、実用的
なキラル誘導体化試薬の報告は殆ど知られていない。
【０００３】事実、カルボキシル基を対象とする通常の
標識試薬としては、一般的に反応性に富んだアルキル化
剤、ジアゾアルカン類等が用いられているが、これらに
キラリティーを持たせることは、合成上極めて困難であ
る。そのため、カルボン酸対掌体の分離等に用いられる
キラル誘導体化試薬は、合成の比較的容易なアミノ化合
物やアルコール誘導体、より具体的には例えば光学活性
アミンが使用されている程度である。しかしながら、い
ずれの場合も、充分な感度が得られた例は殆どなく、実
際のカルボン酸対掌体分析時に於いて適当な発蛍光標識
用試薬を選択し得る余地は皆無に等しい。
標識試薬としては、一般的に反応性に富んだアルキル化
剤、ジアゾアルカン類等が用いられているが、これらに
キラリティーを持たせることは、合成上極めて困難であ
る。そのため、カルボン酸対掌体の分離等に用いられる
キラル誘導体化試薬は、合成の比較的容易なアミノ化合
物やアルコール誘導体、より具体的には例えば光学活性
アミンが使用されている程度である。しかしながら、い
ずれの場合も、充分な感度が得られた例は殆どなく、実
際のカルボン酸対掌体分析時に於いて適当な発蛍光標識
用試薬を選択し得る余地は皆無に等しい。
【０００４】上記した如き問題を解決するために、豊岡
らによりベンゾフラザン系のカルボン酸対掌体用キラル
誘導体化試薬が開発されている［Analyst,117,727(199
2)］。該試薬は、蛍光性を有しており充分な分析感度は
得られるものの、発蛍光団であるベンゾフラザン誘導体
が非常に高価なため結果的に分析の経費がかさむという
問題を有しており、手軽に利用し得る試薬とは言い難
い。
らによりベンゾフラザン系のカルボン酸対掌体用キラル
誘導体化試薬が開発されている［Analyst,117,727(199
2)］。該試薬は、蛍光性を有しており充分な分析感度は
得られるものの、発蛍光団であるベンゾフラザン誘導体
が非常に高価なため結果的に分析の経費がかさむという
問題を有しており、手軽に利用し得る試薬とは言い難
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、カルボン酸等の対掌体の
分離及び高感度分析を同時に可能にするのみならず安価
に実施し得る発蛍光性キラル誘導体化試薬の開発をその
課題とする。
き状況に鑑みなされたもので、カルボン酸等の対掌体の
分離及び高感度分析を同時に可能にするのみならず安価
に実施し得る発蛍光性キラル誘導体化試薬の開発をその
課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、式（Ｉ）で示
される、光学活性１−（４−ダンシルアミノフェニル）
エチルアミン（以下ＤＡＰＥＡと略称する）の発明であ
る。
される、光学活性１−（４−ダンシルアミノフェニル）
エチルアミン（以下ＤＡＰＥＡと略称する）の発明であ
る。
【化２】 また、本発明は、上記ＤＡＰＥＡからなる、カルボン酸
の発蛍光標識用試薬の発明である。更にまた、本発明
は、上記ＤＡＰＥＡを、縮合剤の存在下カルボン酸と反
応させることを特徴とする、カルボン酸の発蛍光標識方
法の発明である。尚、ここにいうダンシル基が、5-ジメ
チルアミノナフタレンスルホニル基であることは周知の
通りである。
の発蛍光標識用試薬の発明である。更にまた、本発明
は、上記ＤＡＰＥＡを、縮合剤の存在下カルボン酸と反
応させることを特徴とする、カルボン酸の発蛍光標識方
法の発明である。尚、ここにいうダンシル基が、5-ジメ
チルアミノナフタレンスルホニル基であることは周知の
通りである。
【０００７】即ち、本発明者らは、上記課題を解決する
ために鋭意研究の途上、産業上合成が比較的容易である
アミノ化合物及びアルコール誘導体を選択することが好
ましく、他方発光収率が高いとされているダンシル骨格
に注目すべきであると考え研究を行った結果、本発明化
合物が発蛍光標識用試薬として優れた性質を有すること
を見出し本発明を完成するに至った。また、本発明者ら
は更に研究を行った結果、本発明化合物は、発蛍光性の
みならず化学発光特性をも有しており、化学発光用標識
試薬として用いればカルボン酸対掌体の分離分析を、発
蛍光標識用試薬として用いた場合よりも更に高感度に行
えることを見出した。尚、蛍光分析に於いて有用な発蛍
光標識用試薬が化学発光標識用試薬としても良好な性質
を有するとは必ずしも限らないのでこのような結果が得
られたことは意外なことであった。
ために鋭意研究の途上、産業上合成が比較的容易である
アミノ化合物及びアルコール誘導体を選択することが好
ましく、他方発光収率が高いとされているダンシル骨格
に注目すべきであると考え研究を行った結果、本発明化
合物が発蛍光標識用試薬として優れた性質を有すること
を見出し本発明を完成するに至った。また、本発明者ら
は更に研究を行った結果、本発明化合物は、発蛍光性の
みならず化学発光特性をも有しており、化学発光用標識
試薬として用いればカルボン酸対掌体の分離分析を、発
蛍光標識用試薬として用いた場合よりも更に高感度に行
えることを見出した。尚、蛍光分析に於いて有用な発蛍
光標識用試薬が化学発光標識用試薬としても良好な性質
を有するとは必ずしも限らないのでこのような結果が得
られたことは意外なことであった。
【０００８】本発明化合物は、以下のようにして容易に
合成し得る。即ち、出発原料として容易に入手できる
（Ｒ）−（−）−又は（Ｓ）−（＋）−１−（４−ニト
ロフェニル）エチルアミン塩酸塩を使用し、先ずそのア
ミノ基を公知方法により保護する。尚、この際に使用す
る保護基としては、接触還元の際に脱離しないものであ
れば特に限定されないが、例えばtert-ＢＯＣ基、即ち
第三ブトキシカルボニル基等が好ましく挙げられる。次
いで、該化合物のニトロ基を例えばパラジウム炭素等の
存在で接触還元してアミノ基とし、このアミノ基を常法
によりダンシル化した後、アミノ保護基（例えばtert-
ＢＯＣ基）を酸で処理して除去するという、通常の方法
を組み合わせることにより、容易にまた高収率で製造す
ることができる。
合成し得る。即ち、出発原料として容易に入手できる
（Ｒ）−（−）−又は（Ｓ）−（＋）−１−（４−ニト
ロフェニル）エチルアミン塩酸塩を使用し、先ずそのア
ミノ基を公知方法により保護する。尚、この際に使用す
る保護基としては、接触還元の際に脱離しないものであ
れば特に限定されないが、例えばtert-ＢＯＣ基、即ち
第三ブトキシカルボニル基等が好ましく挙げられる。次
いで、該化合物のニトロ基を例えばパラジウム炭素等の
存在で接触還元してアミノ基とし、このアミノ基を常法
によりダンシル化した後、アミノ保護基（例えばtert-
ＢＯＣ基）を酸で処理して除去するという、通常の方法
を組み合わせることにより、容易にまた高収率で製造す
ることができる。
【０００９】こうして得られた本発明化合物は、カルボ
ン酸の発蛍光標識用試薬或いは化学発光標識用試薬とし
て、殊にカルボン酸対掌体の発蛍光性或いは化学発光性
キラル誘導体化試薬として極めて有用である。
ン酸の発蛍光標識用試薬或いは化学発光標識用試薬とし
て、殊にカルボン酸対掌体の発蛍光性或いは化学発光性
キラル誘導体化試薬として極めて有用である。
【００１０】本発明化合物を用いてカルボン酸を発蛍光
標識或いは化学発光標識するには、アミノ基とカルボキ
シル基の縮合剤を存在させる常法により本発明化合物と
カルボン酸とを反応させれば足りる。
標識或いは化学発光標識するには、アミノ基とカルボキ
シル基の縮合剤を存在させる常法により本発明化合物と
カルボン酸とを反応させれば足りる。
【００１１】上記反応に用いられる縮合剤としては、ア
ミノ基とカルボキシル基の縮合剤として通常用いられる
ものであれば何れにてもよく、例えばホスホロシアニド
酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル
カルボジイミド（ＤＣＣ）、２，２’−ジピリジルジス
ルフィド（ＤＰＤＳ）／トリフェニルホスフィン（ＴＰ
Ｐ）系等が代表的なものとして挙げられるが、中でもＤ
ＰＤＳ／ＴＰＰ系は誘導体化の反応率が極めて高く、ま
た、反応も非常に穏和なので特に好ましい。
ミノ基とカルボキシル基の縮合剤として通常用いられる
ものであれば何れにてもよく、例えばホスホロシアニド
酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル
カルボジイミド（ＤＣＣ）、２，２’−ジピリジルジス
ルフィド（ＤＰＤＳ）／トリフェニルホスフィン（ＴＰ
Ｐ）系等が代表的なものとして挙げられるが、中でもＤ
ＰＤＳ／ＴＰＰ系は誘導体化の反応率が極めて高く、ま
た、反応も非常に穏和なので特に好ましい。
【００１２】このようにして、分離分析すべきカルボン
酸対掌体と本発明化合物とを縮合させて得られたジアス
テレオマーは何れも、クロマトグラムにおいて完全なシ
ングルピークを描く。このことは、上記反応時にラセミ
化が生じないことを意味することに他ならない。
酸対掌体と本発明化合物とを縮合させて得られたジアス
テレオマーは何れも、クロマトグラムにおいて完全なシ
ングルピークを描く。このことは、上記反応時にラセミ
化が生じないことを意味することに他ならない。
【００１３】また、上記の如くして得られたジアステレ
オマーのいずれも、反応溶液中で少なくとも２４時間は
安定であり、自動分析への適用が充分に可能であること
が認められる。
オマーのいずれも、反応溶液中で少なくとも２４時間は
安定であり、自動分析への適用が充分に可能であること
が認められる。
【００１４】本発明化合物からなる試薬を使用し、対掌
体と縮合させて得られたジアステレオマーは、ＯＤＳ
（オクタデシルシリル化シリカゲル）カラムを用いた逆
相高速液体クロマトグラフィーにより、通常、十数分程
度で完全分離が可能であり、このときの定量性も検出限
界も、極めて優れている。
体と縮合させて得られたジアステレオマーは、ＯＤＳ
（オクタデシルシリル化シリカゲル）カラムを用いた逆
相高速液体クロマトグラフィーにより、通常、十数分程
度で完全分離が可能であり、このときの定量性も検出限
界も、極めて優れている。
【００１５】但し、キラルセンターの近くに嵩高い基が
あり、コンホメーションが固定化されているものに比較
して、嵩高い基がキラルセンターから離れているもの
は、分子内回転の自由度が大きくなるので、一般のＯＤ
Ｓカラムではジアステレオマー間の差が認識されにくく
なるため、良好な分離が得られないのは、通常のことで
あり、本発明試薬の場合も例外ではない。
あり、コンホメーションが固定化されているものに比較
して、嵩高い基がキラルセンターから離れているもの
は、分子内回転の自由度が大きくなるので、一般のＯＤ
Ｓカラムではジアステレオマー間の差が認識されにくく
なるため、良好な分離が得られないのは、通常のことで
あり、本発明試薬の場合も例外ではない。
【００１６】しかし、本発明化合物の絶対配置の違いに
よる分離への影響は、溶出順序が入れ替わるのみで、分
離能に対しては全く認められない。これは、過剰量のエ
ナンチオマー中に極く微量含まれる対のエナンチオマー
を検出するとき、微量成分を先に溶出させることが自由
にできるため、むしろ検出限界の向上を示唆するもので
ある。
よる分離への影響は、溶出順序が入れ替わるのみで、分
離能に対しては全く認められない。これは、過剰量のエ
ナンチオマー中に極く微量含まれる対のエナンチオマー
を検出するとき、微量成分を先に溶出させることが自由
にできるため、むしろ検出限界の向上を示唆するもので
ある。
【００１７】また、本発明化合物は、シュウ酸ジエステ
ル類と過酸化水素との反応により生じる発光中間体
（１，２−ジオキセタンジオン類）により励起発光され
るので化学発光標識用試薬としても使用することが出来
る。
ル類と過酸化水素との反応により生じる発光中間体
（１，２−ジオキセタンジオン類）により励起発光され
るので化学発光標識用試薬としても使用することが出来
る。
【００１８】本発明化合物を化学発光標識用試薬として
使用してカルボン酸対掌体の検出を行う方法としては、
シュウ酸ジエステルと過酸化水素の反応により生じる発
光中間体を利用する化学発光検出方法に準じて操作を行
えばよく、使用する試薬類も通常この分野で使用される
試薬類の中から適宜選択して用いれば良く、その使用濃
度も通常この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択す
れば足りる。
使用してカルボン酸対掌体の検出を行う方法としては、
シュウ酸ジエステルと過酸化水素の反応により生じる発
光中間体を利用する化学発光検出方法に準じて操作を行
えばよく、使用する試薬類も通常この分野で使用される
試薬類の中から適宜選択して用いれば良く、その使用濃
度も通常この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択す
れば足りる。
【００１９】より具体的な一例を示せば、例えば以下の
如くである。
如くである。
【００２０】即ち、本発明化合物からなる試薬を使用
し、対掌体と結合させて得られたジアステレオマーをＯ
ＤＳカラムを用いて逆相高速液体クロマトグラフィーに
より分離した後に、シュウ酸ジエステル類と過酸化水素
を含む反応液と反応させて化学発光を生じさせ、その化
学発光を適当な化学発光検出器で検出する、いわゆるポ
ストカラム法により検出を行えば良い。
し、対掌体と結合させて得られたジアステレオマーをＯ
ＤＳカラムを用いて逆相高速液体クロマトグラフィーに
より分離した後に、シュウ酸ジエステル類と過酸化水素
を含む反応液と反応させて化学発光を生じさせ、その化
学発光を適当な化学発光検出器で検出する、いわゆるポ
ストカラム法により検出を行えば良い。
【００２１】ここで使用されるシュウ酸ジエステル類と
しては、シュウ酸ジエステル系化学発光反応において通
常用いられるものであれば何れでもよく、例えばビス
（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート（Ｔ
ＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキザレ
ート（ＤＮＰＯ）、ビス〔２−（３，６−ジオキサオク
チルオキシカルボニル）−４−ニトロフェニル〕オキザ
レート（ＤＯＰＯ）、ビス〔４−ニトロ−２−（３，
６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）−フェニ
ル〕オキザレート（ＴＤＰＯ）等が好ましく挙げられ
る。尚、本発明化合物を使用して得られる発光強度は溶
離液のｐＨ及びシュウ酸ジエステルの種類によって異な
る為、使用するシュウ酸ジエステルは、溶離液のｐＨを
考慮の上目的の感度が得られるシュウ酸ジエステルを適
宜選択すればよい。また、これらシュウ酸ジエステルを
溶解するための溶媒としては、例えば酢酸エチル、ジオ
キサン、酢酸メチル、アセトニトリル、アセトン等の有
機溶媒が好ましく用いられるが、これら有機溶媒のうち
２種類以上のものを混合したものを使用しても良いこと
は言うまでもない。尚、シュウ酸ジエステル類の使用濃
度としては、目的の測定感度が得られる濃度であれば良
い。但し、シュウ酸ジエステル類の各有機溶媒への溶解
度（例えば、アセトニトリルに溶解する場合、ＴＣＰＯ
は数mM、ＴＤＰＯは１Mまで溶解し得る。）の関係から
所望の濃度とし得ない場合もあるが、その場合でもシュ
ウ酸ジエステルの溶解度の範囲内で使用濃度を適宜選択
することにより測定は可能である。
しては、シュウ酸ジエステル系化学発光反応において通
常用いられるものであれば何れでもよく、例えばビス
（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート（Ｔ
ＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキザレ
ート（ＤＮＰＯ）、ビス〔２−（３，６−ジオキサオク
チルオキシカルボニル）−４−ニトロフェニル〕オキザ
レート（ＤＯＰＯ）、ビス〔４−ニトロ−２−（３，
６，９−トリオキサデシルオキシカルボニル）−フェニ
ル〕オキザレート（ＴＤＰＯ）等が好ましく挙げられ
る。尚、本発明化合物を使用して得られる発光強度は溶
離液のｐＨ及びシュウ酸ジエステルの種類によって異な
る為、使用するシュウ酸ジエステルは、溶離液のｐＨを
考慮の上目的の感度が得られるシュウ酸ジエステルを適
宜選択すればよい。また、これらシュウ酸ジエステルを
溶解するための溶媒としては、例えば酢酸エチル、ジオ
キサン、酢酸メチル、アセトニトリル、アセトン等の有
機溶媒が好ましく用いられるが、これら有機溶媒のうち
２種類以上のものを混合したものを使用しても良いこと
は言うまでもない。尚、シュウ酸ジエステル類の使用濃
度としては、目的の測定感度が得られる濃度であれば良
い。但し、シュウ酸ジエステル類の各有機溶媒への溶解
度（例えば、アセトニトリルに溶解する場合、ＴＣＰＯ
は数mM、ＴＤＰＯは１Mまで溶解し得る。）の関係から
所望の濃度とし得ない場合もあるが、その場合でもシュ
ウ酸ジエステルの溶解度の範囲内で使用濃度を適宜選択
することにより測定は可能である。
【００２２】過酸化水素を溶解するための溶媒として
は、例えば、アセトニトリル、アセトン、アルコール等
の有機溶媒が好ましく用いられる。また、過酸化水素の
使用濃度としては、通常シュウ酸ジエステルの50〜100
倍モル量の範囲で使用される。
は、例えば、アセトニトリル、アセトン、アルコール等
の有機溶媒が好ましく用いられる。また、過酸化水素の
使用濃度としては、通常シュウ酸ジエステルの50〜100
倍モル量の範囲で使用される。
【００２３】尚、シュウ酸ジエステルを含む溶液と、過
酸化水素を含む溶液とは別々に調製しておき使用時に適
宜混合して用いる方が試薬の安定性上は好ましいが、こ
れらを一緒に含む溶液を調製しても良いことは言うまで
もない。
酸化水素を含む溶液とは別々に調製しておき使用時に適
宜混合して用いる方が試薬の安定性上は好ましいが、こ
れらを一緒に含む溶液を調製しても良いことは言うまで
もない。
【００２４】以下実施例によって本発明を説明するが、
本発明はこれによって限定されるものでない。
本発明はこれによって限定されるものでない。
【００２５】
実施例 １（本発明化合物の製造） 出発原料として（Ｒ）−（−）−体を使用すれば、これ
に対応した本発明化合物が得られ、同じく（Ｓ）−
（＋）−体を使用すれば、これに対応した本発明化合物
が得られるので、以下の説明では単に１−（４−ニトロ
フェニル）エチルアミン塩酸塩という表現を用いる。１
−（４−ニトロフェニル）エチルアミン塩酸塩（東京化
成(株)製）２．０ｇとトリエチルアミン１．１ｇとをア
セトニトリル２０mlに溶解し、これにジ−ｔｅｒｔ−ブ
チルジカルボネート２．２ｇを氷冷下攪拌しながら滴下
し、更に室温で１時間攪拌した後、減圧下濃縮した。残
渣に酢酸エチル５０mlを加え、１０％クエン酸及び水で
洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮し
て、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−（４−ニ
トロフェニル）エチルアミン２．４ｇを得た（収率：９
０％）。 ｍｐ：Ｒ体；８５〜８７℃。 Ｓ体；８６〜８９℃。 得られた結晶２．０ｇをメタノール４０mlに溶解し、パ
ラジウム炭素２００mg存在下水素ガスで３時間接触還元
を行った。反応後、触媒を瀘去し、ニトロ基がアミノ基
に還元された油状の化合物１．４ｇを得た。得られた油
状物１．４ｇをアセトニトリル１０mlに溶解し、０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム５０mlを加えた後、ダンシルクロ
リド１．９ｇをアセトニトリル３０mlに溶解した溶液
を、室温で攪拌しながら滴下した。その後２０分間攪拌
し、更に４５℃で２時間攪拌の後、酢酸エチルで抽出
し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧下に濃
縮、残渣をベンゼン／ヘキサンで結晶化した（収率：８
１％）。 ｍｐ：Ｒ体；９７〜１００℃。 Ｓ体；９７〜１０１℃。 質量分析：ＥＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ ４６９（Ｍ+）。1 ＨＮＭＲ（CDCl3）δppm：6.8-8.8(10H,m,Ar-H)、4.85
(1H,q,J=7Hz,=CH-)、2.93(6H,s,-N(CH3)2)、1.37(9H,s,-
C(CH3)3)、1.20(3H,d,J=7Hz,-CH3)。 得られた結晶１．５ｇを濃塩酸／メタノール（１：４）
１０mlに溶解し、３０分間室温で攪拌した後、減圧下濃
縮した。残渣に水を加え、炭酸水素ナトリウムで中和し
た後、酢酸エチルで抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後減圧下に濃縮した。得られた粗結晶をエタノ
ールで再結晶し、本発明化合物１．０ｇを得た（収率：
８５％）。 融点：Ｒ体；１５９〜１６１℃。 Ｓ体；１５７〜１６０℃。 旋光度：Ｒ体：［α］D 23 ＝ １０．４°（ＣＨ3Ｃ
Ｎ，ｃ＝０．２）。 Ｓ体：［α］D 25 ＝−１０．２°（ＣＨ3ＣＮ，ｃ＝
０．２）。 質量分析：ＥＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ ３６９（Ｍ+）。 元素分析（Ｃ20Ｈ23Ｎ3Ｏ2Ｓ）： 理論値（％）； Ｃ：65.02、Ｈ：6.27、Ｎ：11.3
7。 実測値（％）；Ｒ体 Ｃ：65.01、Ｈ：6.21、Ｎ：11.2
3。 Ｓ体 Ｃ：65.13、Ｈ：6.30、Ｎ：11.27。1 ＨＮＭＲ（CD3OD）δppm：6.9-8.6(10H,m,Ar-H)、3.90
(1H,q,J=7Hz,=CH-)、2.80(6H,s,-N(CH3)2)、1.27(3H,d,J
=7Hz,-CH3)。
に対応した本発明化合物が得られ、同じく（Ｓ）−
（＋）−体を使用すれば、これに対応した本発明化合物
が得られるので、以下の説明では単に１−（４−ニトロ
フェニル）エチルアミン塩酸塩という表現を用いる。１
−（４−ニトロフェニル）エチルアミン塩酸塩（東京化
成(株)製）２．０ｇとトリエチルアミン１．１ｇとをア
セトニトリル２０mlに溶解し、これにジ−ｔｅｒｔ−ブ
チルジカルボネート２．２ｇを氷冷下攪拌しながら滴下
し、更に室温で１時間攪拌した後、減圧下濃縮した。残
渣に酢酸エチル５０mlを加え、１０％クエン酸及び水で
洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮し
て、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−（４−ニ
トロフェニル）エチルアミン２．４ｇを得た（収率：９
０％）。 ｍｐ：Ｒ体；８５〜８７℃。 Ｓ体；８６〜８９℃。 得られた結晶２．０ｇをメタノール４０mlに溶解し、パ
ラジウム炭素２００mg存在下水素ガスで３時間接触還元
を行った。反応後、触媒を瀘去し、ニトロ基がアミノ基
に還元された油状の化合物１．４ｇを得た。得られた油
状物１．４ｇをアセトニトリル１０mlに溶解し、０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム５０mlを加えた後、ダンシルクロ
リド１．９ｇをアセトニトリル３０mlに溶解した溶液
を、室温で攪拌しながら滴下した。その後２０分間攪拌
し、更に４５℃で２時間攪拌の後、酢酸エチルで抽出
し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧下に濃
縮、残渣をベンゼン／ヘキサンで結晶化した（収率：８
１％）。 ｍｐ：Ｒ体；９７〜１００℃。 Ｓ体；９７〜１０１℃。 質量分析：ＥＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ ４６９（Ｍ+）。1 ＨＮＭＲ（CDCl3）δppm：6.8-8.8(10H,m,Ar-H)、4.85
(1H,q,J=7Hz,=CH-)、2.93(6H,s,-N(CH3)2)、1.37(9H,s,-
C(CH3)3)、1.20(3H,d,J=7Hz,-CH3)。 得られた結晶１．５ｇを濃塩酸／メタノール（１：４）
１０mlに溶解し、３０分間室温で攪拌した後、減圧下濃
縮した。残渣に水を加え、炭酸水素ナトリウムで中和し
た後、酢酸エチルで抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後減圧下に濃縮した。得られた粗結晶をエタノ
ールで再結晶し、本発明化合物１．０ｇを得た（収率：
８５％）。 融点：Ｒ体；１５９〜１６１℃。 Ｓ体；１５７〜１６０℃。 旋光度：Ｒ体：［α］D 23 ＝ １０．４°（ＣＨ3Ｃ
Ｎ，ｃ＝０．２）。 Ｓ体：［α］D 25 ＝−１０．２°（ＣＨ3ＣＮ，ｃ＝
０．２）。 質量分析：ＥＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ ３６９（Ｍ+）。 元素分析（Ｃ20Ｈ23Ｎ3Ｏ2Ｓ）： 理論値（％）； Ｃ：65.02、Ｈ：6.27、Ｎ：11.3
7。 実測値（％）；Ｒ体 Ｃ：65.01、Ｈ：6.21、Ｎ：11.2
3。 Ｓ体 Ｃ：65.13、Ｈ：6.30、Ｎ：11.27。1 ＨＮＭＲ（CD3OD）δppm：6.9-8.6(10H,m,Ar-H)、3.90
(1H,q,J=7Hz,=CH-)、2.80(6H,s,-N(CH3)2)、1.27(3H,d,J
=7Hz,-CH3)。
【００２６】実施例 ２（誘導体化法） ２−アリールプロピオン酸類のラセミ体のアセトニトリ
ル溶液（０．２mg／ml）１００mlに、（Ｓ）−（−）−
或は（Ｒ）−（＋）−ＤＡＰＥＡの２mMアセトニトリル
溶液１００μl、ＤＰＤＳの３mMアセトニトリル溶液１
００μl、及びＴＰＰの３mMアセトニトリル溶液１００
μlを、順次加えて混和した。混合液を室温に３時間放
置して、ＤＡＰＥＡ誘導体化物のアセトニトリル溶液を
得た。 実施例 ３ 実施例２に示した誘導体化条件で、表１に記載の６種の
被検試料化合物２−アリールプロピオン酸類を本発明化
合物で誘導体化し、得られたジアステレオマーをＯＤＳ
カラムを用いて逆相高速液体クロマトグラフィーで分離
し、表１の結果を得た。
ル溶液（０．２mg／ml）１００mlに、（Ｓ）−（−）−
或は（Ｒ）−（＋）−ＤＡＰＥＡの２mMアセトニトリル
溶液１００μl、ＤＰＤＳの３mMアセトニトリル溶液１
００μl、及びＴＰＰの３mMアセトニトリル溶液１００
μlを、順次加えて混和した。混合液を室温に３時間放
置して、ＤＡＰＥＡ誘導体化物のアセトニトリル溶液を
得た。 実施例 ３ 実施例２に示した誘導体化条件で、表１に記載の６種の
被検試料化合物２−アリールプロピオン酸類を本発明化
合物で誘導体化し、得られたジアステレオマーをＯＤＳ
カラムを用いて逆相高速液体クロマトグラフィーで分離
し、表１の結果を得た。
【００２７】
【表１】 表中、k'は質量分布比を、αは分離係数を、Rsは一対の
ジアステレオマーの分離度の値を夫々示す（各値は日本
薬局方解説書「液体クロマトグラフ法」の項に記載の計
算式により求めた。以下同じ。）。また、溶離液のアセ
トニトリル濃度は容量／容量％を示す。 分析条件：ｔ0＝１．４分、移動相（溶離液）＝５０mM
酢酸ナトリウム／アセトニトリル、流速＝１．０ml／
分、２−アリールプロピオン酸類ラセミ体注入量＝各２
５０ng
ジアステレオマーの分離度の値を夫々示す（各値は日本
薬局方解説書「液体クロマトグラフ法」の項に記載の計
算式により求めた。以下同じ。）。また、溶離液のアセ
トニトリル濃度は容量／容量％を示す。 分析条件：ｔ0＝１．４分、移動相（溶離液）＝５０mM
酢酸ナトリウム／アセトニトリル、流速＝１．０ml／
分、２−アリールプロピオン酸類ラセミ体注入量＝各２
５０ng
【００２８】この場合、すべて１５分程度で完全分離が
行なわれ、このときの定量性は被検試料化合物１．０×
１０2〜３．０×１０-1pmole の範囲で原点を通る良好
な直線性を示し、その検出限界は２００fmole／inj.
（Ｓ／Ｎ＝３）であり、再現性は被検試料化合物１．２
５ng／inj.で２．２％以下（ｎ＝７）と良好な値であっ
た。尚、高速液体クロマトグラフィー及び測定装置は、
Ｌ−６２００インテリジェントポンプ（日立製作所(株)
製）、モデル７１２５ループインジェクター（Ｒｈｅｏ
ｄｙ−ｎｅ）、ＯＤＳ−８０ＴM （粒径：５μm、東ソ
ー(株)製）を充填したカラム（１５０×４．６Ｉ．Ｄ．
mm）、及びＦ−１２００分光蛍光検出器（日立製作所
(株)製）より成るシステムを使用し、励起、蛍光波長は
それぞれ３３８nm及び５３５nmで検出した。
行なわれ、このときの定量性は被検試料化合物１．０×
１０2〜３．０×１０-1pmole の範囲で原点を通る良好
な直線性を示し、その検出限界は２００fmole／inj.
（Ｓ／Ｎ＝３）であり、再現性は被検試料化合物１．２
５ng／inj.で２．２％以下（ｎ＝７）と良好な値であっ
た。尚、高速液体クロマトグラフィー及び測定装置は、
Ｌ−６２００インテリジェントポンプ（日立製作所(株)
製）、モデル７１２５ループインジェクター（Ｒｈｅｏ
ｄｙ−ｎｅ）、ＯＤＳ−８０ＴM （粒径：５μm、東ソ
ー(株)製）を充填したカラム（１５０×４．６Ｉ．Ｄ．
mm）、及びＦ−１２００分光蛍光検出器（日立製作所
(株)製）より成るシステムを使用し、励起、蛍光波長は
それぞれ３３８nm及び５３５nmで検出した。
【００２９】参考例 １ 実施例２に示した誘導体化条件で、表２に記載の６種の
被検試料化合物２−アリールプロピオン酸類を本発明化
合物で誘導体化し、得られたジアステレオマーを図１に
示す如き構成からなるＯＤＳカラムを用いた逆相高速液
体クロマトグラフィーにより分離（検出は化学発光検
出）し、表２の結果を得た。尚、図１中、は溶離液槽
を、はＬ−６２００インテリジェントポンプ（日立製
作所(株)製）を、はモデル７１２５ループインジェク
ター（Ｒｈｅｏｄｙ−ｎｅ）を、はWakosil II 3C18
（和光純薬工業（株）製）を充填したカラム（１５０×
４．６Ｉ．Ｄ．mm）を、は０．５ｍＭビス（２，４，
６−トリクロロフェニル）オキザレート（ＴＣＰＯ）／
１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリル溶液槽及びその注入
ポンプを（流速：１．０ml／分）、はミキシングコイ
ル（４００×０．２５Ｉ．Ｄ．mm）を、は化学発光検
出器（相馬光学（株）製、Ｓ−３４００型）を、はＤ
−２５００型記録計（日立製作所（株）製）をそれぞれ
示す。
被検試料化合物２−アリールプロピオン酸類を本発明化
合物で誘導体化し、得られたジアステレオマーを図１に
示す如き構成からなるＯＤＳカラムを用いた逆相高速液
体クロマトグラフィーにより分離（検出は化学発光検
出）し、表２の結果を得た。尚、図１中、は溶離液槽
を、はＬ−６２００インテリジェントポンプ（日立製
作所(株)製）を、はモデル７１２５ループインジェク
ター（Ｒｈｅｏｄｙ−ｎｅ）を、はWakosil II 3C18
（和光純薬工業（株）製）を充填したカラム（１５０×
４．６Ｉ．Ｄ．mm）を、は０．５ｍＭビス（２，４，
６−トリクロロフェニル）オキザレート（ＴＣＰＯ）／
１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリル溶液槽及びその注入
ポンプを（流速：１．０ml／分）、はミキシングコイ
ル（４００×０．２５Ｉ．Ｄ．mm）を、は化学発光検
出器（相馬光学（株）製、Ｓ−３４００型）を、はＤ
−２５００型記録計（日立製作所（株）製）をそれぞれ
示す。
【００３０】
【表２】 表中、k'は質量分布比を、αは分離係数を、Rsは一対の
ジアステレオマーの分離度の値を夫々示す（各値は日本
薬局方解説書「液体クロマトグラフ法」の項に記載の計
算式により求めた。以下同じ。）。また、溶離液のアセ
トニトリル濃度は容量／容量％を示す。 分析条件：ｔ0＝１．９分、移動相（溶離液）＝１００m
Mイミダゾール緩衝液（pＨ 6.5）／アセトニトリル、流
速＝０．８ml／分、化学発光用試液＝０．５ｍＭ ＴＣ
ＰＯ／１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリル溶液、流速：
１．０ml／分、２−アリールプロピオン酸類ラセミ体注
入量＝各２５０ng
ジアステレオマーの分離度の値を夫々示す（各値は日本
薬局方解説書「液体クロマトグラフ法」の項に記載の計
算式により求めた。以下同じ。）。また、溶離液のアセ
トニトリル濃度は容量／容量％を示す。 分析条件：ｔ0＝１．９分、移動相（溶離液）＝１００m
Mイミダゾール緩衝液（pＨ 6.5）／アセトニトリル、流
速＝０．８ml／分、化学発光用試液＝０．５ｍＭ ＴＣ
ＰＯ／１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリル溶液、流速：
１．０ml／分、２−アリールプロピオン酸類ラセミ体注
入量＝各２５０ng
【００３１】この場合、すべて１０〜１５分程度で完全
分離が行なわれ、このときの定量性は被検試料化合物
１．０×１０2〜１．５×１０-1pmole の範囲で原点を
通る良好な直 線性を示し、その検出限界は２０〜５０f
mole／inj.（Ｓ／Ｎ＝３）であり、再現性 は被検試料
化合物１２５pg／inj.で３．０％以下（ｎ＝１０）と良
好な値であった。また、これらの結果から、本発明の化
合物を化学発光標識用試薬として用いれば、発蛍光標識
用試薬として用いた場合よりもより高感度に目的の化合
物の分析を行うことができることが判る。
分離が行なわれ、このときの定量性は被検試料化合物
１．０×１０2〜１．５×１０-1pmole の範囲で原点を
通る良好な直 線性を示し、その検出限界は２０〜５０f
mole／inj.（Ｓ／Ｎ＝３）であり、再現性 は被検試料
化合物１２５pg／inj.で３．０％以下（ｎ＝１０）と良
好な値であった。また、これらの結果から、本発明の化
合物を化学発光標識用試薬として用いれば、発蛍光標識
用試薬として用いた場合よりもより高感度に目的の化合
物の分析を行うことができることが判る。
【００３２】
【発明の効果】以上述べたとおり、本発明化合物は、入
手し易い原料から通常の方法によって容易に製造でき、
発蛍光標識用試薬或は化学発光標識用試薬として、従来
の試薬では反応性が低く誘導体化が難しかったカルボキ
シル基を有する化合物を極めて容易に誘導体化し得るの
で、カルボン酸対掌体の高感度分離分析に、極めて有用
である。
手し易い原料から通常の方法によって容易に製造でき、
発蛍光標識用試薬或は化学発光標識用試薬として、従来
の試薬では反応性が低く誘導体化が難しかったカルボキ
シル基を有する化合物を極めて容易に誘導体化し得るの
で、カルボン酸対掌体の高感度分離分析に、極めて有用
である。
【００３３】
【図１】参考例１でジアステレオマーを分離するために
使用した、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）
カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーの構成
を示す。
使用した、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）
カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーの構成
を示す。
図１中、は溶離液槽を、はＬ−６２００インテリジ
ェントポンプ（日立製作所(株)製）を、はモデル７１
２５ループインジェクター（Ｒｈｅｏｄｙ−ｎｅ）を、
はWakosil II 3C18（和光純薬工業（株）製）を充填
したカラム（１５０×４．６Ｉ．Ｄ．mm）を、は０．
５ｍＭビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザ
レート（ＴＣＰＯ）／１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリ
ル溶液槽及びその注入ポンプを（流速：１．０ml／
分）、はミキシングコイル（４００×０．２５Ｉ．
Ｄ．mm）を、は化学発光検出器（相馬光学（株）製、
Ｓ−３４００型）を、はＤ−２５００型記録計（日立
製作所（株）製）をそれぞれ示す。
ェントポンプ（日立製作所(株)製）を、はモデル７１
２５ループインジェクター（Ｒｈｅｏｄｙ−ｎｅ）を、
はWakosil II 3C18（和光純薬工業（株）製）を充填
したカラム（１５０×４．６Ｉ．Ｄ．mm）を、は０．
５ｍＭビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザ
レート（ＴＣＰＯ）／１５ｍＭ過酸化水素アセトニトリ
ル溶液槽及びその注入ポンプを（流速：１．０ml／
分）、はミキシングコイル（４００×０．２５Ｉ．
Ｄ．mm）を、は化学発光検出器（相馬光学（株）製、
Ｓ−３４００型）を、はＤ−２５００型記録計（日立
製作所（株）製）をそれぞれ示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ）で示される、光学活性１−
（４−ダンシルアミノフェニル）エチルアミン。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載の化合物からなる、カルボ
ン酸の発蛍光標識用試薬。 - 【請求項３】 請求項１記載の化合物を縮合剤の存在下
カルボン酸と反応させることを特徴とする、カルボン酸
の発蛍光標識方法。 - 【請求項４】 2、2'ージピリジルジスルフィド／トリフ
ェニルホスフィン系縮合剤を用いる請求項３に記載の標
識方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6180768A JPH07209303A (ja) | 1993-07-08 | 1994-07-08 | 発蛍光標識用試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-193188 | 1993-07-08 | ||
| JP19318893 | 1993-07-08 | ||
| JP6180768A JPH07209303A (ja) | 1993-07-08 | 1994-07-08 | 発蛍光標識用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07209303A true JPH07209303A (ja) | 1995-08-11 |
Family
ID=26500166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6180768A Withdrawn JPH07209303A (ja) | 1993-07-08 | 1994-07-08 | 発蛍光標識用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07209303A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004517037A (ja) * | 2000-06-23 | 2004-06-10 | メデイノックス，インコーポレイテッド | 修飾された形の薬理活性薬物およびそれらの用途 |
| JP2005314398A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-11-10 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 重窒素化ニトロベンゼンスルホンアミド、その誘導体及びこれらの製造法 |
| CN115656385A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-01-31 | 中轻检验认证有限公司 | 一种检测白酒中l-乳酸和d-乳酸手性异构体含量的方法 |
-
1994
- 1994-07-08 JP JP6180768A patent/JPH07209303A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004517037A (ja) * | 2000-06-23 | 2004-06-10 | メデイノックス，インコーポレイテッド | 修飾された形の薬理活性薬物およびそれらの用途 |
| JP2005314398A (ja) * | 2004-03-30 | 2005-11-10 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 重窒素化ニトロベンゼンスルホンアミド、その誘導体及びこれらの製造法 |
| CN115656385A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-01-31 | 中轻检验认证有限公司 | 一种检测白酒中l-乳酸和d-乳酸手性异构体含量的方法 |
| CN115656385B (zh) * | 2022-11-14 | 2023-03-21 | 中轻检验认证有限公司 | 一种检测白酒中l-乳酸和d-乳酸手性异构体含量的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20011002 |