JPH07213185A - 含硫アミノ酸含量の改良植物および改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】（１）植物中で機能可能な転写および翻訳開始
領域の下流に、（２）イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質
のシグナル配列領域を含むアミノ酸配列における１０８
番目から１２１番目までの１４個の高含硫アミノ酸配列
（配列番号１）を含む翻訳可能な構造遺伝子を持ち、
（３）植物中で機能可能なポリ（Ａ）シグナルと転写終
結領域を機能可能な形で有する発現カセットを含む改良
植物。 【効果】本発明により、従来の交雑を主体とする品種改
良と比較して短期間で、かつ省力的に、植物中の含硫ア
ミノ酸含量を向上させることができるようになり、食用
・飲料作物といった多くの植物の栄養価の改良が可能と
なった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、含硫アミノ酸含量の改
良植物および改良方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】人や家畜は、蛋白質源として食用・飲料
作物といった多くの植物に依存している。しかし主要な
蛋白質源作物であるマメ科植物の種子中の蛋白質は、人
や家畜にとっての必須アミノ酸の含量を比較した場合、
メチオニン、システイン等の含硫アミノ酸含量が他の必
須アミノ酸含量と比較して低く、このことは直接栄養価
の低下に結びついている。このために、家畜飼料では魚
粉（フィッシュミール）や合成アミノ酸の添加を行うこ
とでメチオニン、システイン欠乏を補っているのが現状
である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ような配合飼料の場合、配合する手間もかかるうえ、加
える魚粉（フィッシュミール）や合成アミノ酸の価格や
供給量の影響もうける。また、飼料作物そのものの改良
は、いままで蛋白質そのものの含量を高めることである
程度改善されてきていたが、従来の交雑を主体とする品
種改良では、特に重要なアミノ酸だけを高含量化した
り、また短期間・省力的な改良はきわめて難かしかっ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者らは鋭意検討を行った結果、含硫アミノ酸含量の
高い蛋白質遺伝子を有する発現カセットを構築し、これ
を植物に導入し、発現させることに成功した。すなわ
ち、本発明は、（１）植物中で機能可能な転写および翻
訳開始領域の下流に、（２）イネ由来１０Ｋプロラミン
蛋白質のシグナル配列領域を含むアミノ酸配列における
１０８番目から１２１番目までの高含硫アミノ酸配列
（配列番号１）を含む翻訳可能な構造遺伝子を持ち、
（３）植物中で機能可能なポリ（Ａ）シグナルと転写終
結領域を機能可能な形で有する発現カセットを含む改良
植物（以下、本発明植物と記す。）および上記発現カセ
ットを植物に導入し、発現させることを特徴とする植物
における含硫アミノ酸含量の改良方法（以下、本発明方
法と記す。）を提供するものである。

【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。本
発明で用いる遺伝子工学的手法は、例えば、J.Sambroo
k、E.F.Frisch、T.Maniatis著；モレキュラー クロー
ニング 第２版（Molecular Cloning 2nd edition)、コ
ールドスプリング ハーバー ラボラトリー (Cold Spr
ing Harbor Laboratory)発行、1989年等に記載される通
常の方法に準じて実施できる技術である。

【０００６】本発明において用いられる「イネ由来１０
Ｋプロラミン蛋白質のシグナル配列領域を含むアミノ酸
配列における１０８番目から１２１番目までの１４個の
高含硫アミノ酸配列（配列番号１）を含む翻訳可能な構
造遺伝子」は、その遺伝子がコードするアミノ酸のうち
含硫アミノ酸が８個含まれており、そのアミノ酸含量と
して５０％を越えるものである。なお、この高含硫アミ
ノ酸配列を含み、かつイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質
に限定されない蛋白質のアミノ酸配列を含む翻訳可能な
構造遺伝子も本発明に含まれる。たとえば、以下の方法
によって調製することができる。 １．イネからのゲノムＤＮＡの調製方法 イネゲノムＤＮＡは、多くの植物組織において使用され
ている強力な界面活性剤であるＣＴＡＢ（cetyltrimeth
ylammonium bromide）を用いてイネの葉組織より調製す
ることができる。たとえば、内宮博文著：植物遺伝子操
作マニュアル，講談社サイエンティフィック発行，１９
９０年、Rogers S.O. and A.J.Bedich,Plant Molecular
Biology,5,69-76,1985 等に記載される通常の方法をあ
げることができる。 ２．ＰＣＲによる増幅 上記の遺伝子領域を含む任意の塩基配列からなるＤＮＡ
をＰＣＲ法で増幅するためのプライマーは、主としてＤ
ＮＡを化学的に合成することによって得られる。あるい
はプライマーとして機能し得る制限酵素断片等によって
得られたＤＮＡ断片を用いることもできる。このとき、
プライマーは任意の塩基配列の両端に対する一対のプラ
イマーを用いる。ここで述べる「プライマー」とは、着
目するＤＮＡ配列の合成しようとする一方の鎖の5'- 末
端配列を含み、相補鎖を鋳型としたＤＮＡポリメラーゼ
によるＤＮＡ合成に必要なＤＮＡのことを示す。得られ
たプライマーを用いてＤＮＡを増幅するには、たとえ
ば、Innis M.A.,Gelfand D.H. and J.J.Sninsky 編：PC
R PROTOCOLS,Academic Press Inc. 発行，１９９０年等
に記載される通常の方法を用いることができる。 ３．イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子のクローニ
ング イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子のクローニング
のために用いられるクローニングベクターとしては、す
でに知られている多くのクローニングベクターをあげる
ことができる。具体的には、例えばpBR322,pUC18,pUC1
9,pACYC177,pACYC184等の公知なプラスミドベクターと
その誘導体、あるいはＭ１３ファージ由来のファージベ
クターやその誘導体等があげられる。クローニングは、
任意のクローニングベクターに存在する制限酵素のクロ
ーニングサイトとＰＣＲで増幅することによって得られ
たＤＮＡ断片に存在する制限酵素切断部位との組合せに
より用いる制限酵素を選択し、選択された制限酵素を用
いてクローニングベクターを開裂し、これに選択された
制限酵素の切断部位を有するＤＮＡ断片をリガーゼによ
り結合・閉環させることによって行なうことができる。
クローニングされたＤＮＡ断片が目的の遺伝子を有する
ものであるか否かは制限酵素による切断、あるいはＰＣ
Ｒなどにより確認することができる。塩基配列はマキサ
ム・ギルバート法あるいはサンガー法に準じた方法によ
り、放射性標識あるいは蛍光標識を用いて決定すること
ができる。このようにして目的の遺伝子、すなわちイネ
由来１０Ｋプロラミン蛋白質のシグナル配列領域を含む
アミノ酸配列における１０８番目から１２１番目までの
１４個の高含硫アミノ酸配列（配列番号１）を含む翻訳
可能な構造遺伝子、を有することが確認されたクローニ
ングＤＮＡ断片、あるいは該ＤＮＡ断片を保持するベク
ターに存在する適当な制限酵素切断部位を制限酵素で切
断することにより目的の遺伝子を有する任意のＤＮＡ断
片、を調製することができる。あるいはその塩基配列そ
のものを化学合成により全合成することもできる。さら
にこのようにして得られたＤＮＡ断片を他の構造遺伝子
中のイン・フレームに導入することで新規遺伝子を調製
することもできる。

【０００７】本発明において用いられる「植物中で機能
可能な転写および翻訳開始領域」を有する遺伝子として
は、たとえば、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）プロモータ
ーやオクトパピン合成酵素（ｏｃｓ）プロモーター等の
Ｔ−ＤＮＡ由来のプロモーターあるいはカリフラワーモ
ザイクウィルス（CaMV）由来の１９Ｓおよび３５Ｓプロ
モーター等の植物ウィルスプロモーター等の通常のプロ
モーターをあげることができる。また、たとえば、エン
ドウマメあるいはダイズのリブロース−１，５−二リン
酸カルボキシラーゼの小サブユニットプロモーター、ト
ウモロコシのゼインプロモーター、ダイズの７Ｓα’コ
ングリシニンプロモーター、ダイズのグリシニンプロモ
ーター、フランス豆のファゼオリンプロモーター等もあ
げることができる。

【０００８】本発明において用いられる「植物中で機能
可能なポリ（Ａ）シグナルと転写終結領域」を有する遺
伝子としては、Ｔ−ＤＮＡ由来のノパリン合成酵素のタ
ーミネーター、ダイズのグリシニンターミネーター等の
植物由来のターミネーター、ニンニクウィルスＧＶ１、
ＧＶ２のターミネター等のウィルス由来のターミネータ
ー等をあげることができる。

【０００９】つぎに本発明において、（１）植物中で機
能可能な転写および翻訳開始領域（プロモーター領域）
の下流に、（２）着目する翻訳可能な構造遺伝子を持
ち、（３）植物中で機能可能なポリ（Ａ）シグナルと転
写終結領域（ターミネーター領域）を機能可能な形で有
する発現カセットを構築するには、必要に応じて、リン
カーあるいはアダプター等を用いることによって上記の
各遺伝子（１) 、（２）および（３）をリガーゼの作用
により連結する方法等をあげることができる。ここで述
べる「リンカー」とは、着目するＤＮＡ末端に結合さ
せ、目的とする制限酵素認識配列を導入することを可能
とする２本鎖の合成ＤＮＡを示す。また、「アダプタ
ー」とは、一方が平滑末端であり、もう一方は付着末端
の２本鎖の合成ＤＮＡあるいは異なる付着末端を両端に
もつ２本鎖合成ＤＮＡを示し、着目する２種の異なった
末端同志の結合を可能とする。

【００１０】このようにして構築された発現カセット
は、着目する翻訳可能な構造遺伝子と発現調節領域が機
能可能な形で結合し、目的とする含硫アミノ酸含量の高
い蛋白質を発現することのできる遺伝子構築体である。
なお、特定植物中で機能する、あるいは特定植物器官で
特異的に機能することができる発現調節領域を選択する
ことにより任意の発現形態の植物体を得ることも可能と
なる。たとえば、種子特異的に発現するプロモーターな
どの調節領域と着目する翻訳可能な構造遺伝子とを機能
可能な形で結合することにより、種子特異的含硫アミノ
酸含量の高い蛋白質の発現カセットを構築することもで
きる。あるいは組織特異性のない植物ウィルス由来の発
現調節領域と着目する翻訳可能な構造遺伝子とを結合し
て植物全体で発現させる含硫アミノ酸含量の高い蛋白質
の発現カセットも構築できる。さらに、必要に応じて、
翻訳可能な構造遺伝子の上流に機能可能な分泌シグナル
配列をコードする領域を機能可能な形で結合させること
もできる。

【００１１】構築された発現カセットを、たとえば、ト
ウモロコシ、モロコシ、ライ麦、ライ小麦、大麦、オー
ト麦、小麦、タマネギ等の単子葉植物、または、ダイ
ズ、バーズフットトレフォイル、エンドウ等の豆類、ア
ルファルファ、タバコ、ナタネ等のアブラナ属、メロ
ン、キュウリ、カボチャ属のウリ科植物、バレイショ、
コショウ、トマト等のナス科植物、ニンジン、セロリ等
のセリ科植物等の双子葉植物に導入する方法としては、
植物種によって異なっているが、土壌細菌であるアグロ
バクテリウムの感染を利用する系やプロトプラストへの
エレクトロポレーションにより遺伝子を導入する系、植
物組織あるいはプロトプラストへのパーティクルガンに
より遺伝子を導入するなどをあげることができる。そし
て、構築された発現カセットが導入された植物は、植物
組織培養技術において通常用いられる方法に準じて再生
され、植物体を得ることができる。このような方法は、
例えば、Gelvin,S.B.,R.A.Schilperoort and D.P.S.Ver
ma. 著；プラント モレキュラー バイオロジー／マニ
ュアル（Plant Molecular Biology/Manual.)、ルワーア
カデミック パブリシャーズ（Kluwer Academic Publis
hers) 発行、1988年等に記載されている。さらに具体的
には、たとえば、 １．ダイズにおける形質転換 ダイズグリシニン−プロラミンキメラ遺伝子を持つ後述
のプラスミドpSUM-GY1-prolamin を、選抜用 GUS/HPT同
時発現ベクターpSUM-GH:NotIと混合し、これらの混合プ
ラスミドを、たとえば、飯田朝子、山下稔哉、服部悦
子、森川弘道著、遺伝子導入実験法１−パーティクルガ
ン法−，植物細胞工学，２，631-637,1990記載の方法に
準じてダイズ不定胚にパーティクルガンによるボンバー
ドメントにより導入する。導入後、ハイグロマイシンを
含む液体培地で培養を続け、形質転換不定胚を選抜す
る。選抜されるハイグロマイシン耐性ダイズ不定胚から
植物個体の再生を行い、グリシニン−プロラミンキメラ
遺伝子による形質転換体ダイズを得る。 ２．バーズフットトレフォイルにおける形質転換 バーズフットトレフォイルにおける形質転換を、たとえ
ば、Petit, A.,J.Stougaard 、A.Kuhle, K.A.Marcker a
nd J.Tempe. “Transformation and regeneration of t
he legume Lotus corniculatus: A system for molecul
ar studies ofsymbiotic nitrogen fixation." Molecul
ar and General Genetics、207 、245-250 、1987記載
の方法に準じて土壌細菌Agrobacterium rhizogenesを用
いる方法で行う。無菌化処理されたバーズフットトレフ
ォイルの種子をホルモンを含まないＭＳ培地の上で発芽
成長させる。発芽後８日目の幼植物の胚軸に、グリシニ
ン−プロラミンキメラ遺伝子をプラスミド（抗生物質耐
性マーカー）として持つ土壌細菌Agrobacterium rhizog
enesを感染させる。形質転換された毛状根を選抜用抗生
物質を含むＭＳ培地上で選抜を行う。毛状根中から再生
してくる抗生物質耐性のシュートを抗生物質を含むＭＳ
培地に移す。発現した植物体を酸洗浄を行った砂に移
し、２２℃の植物培養機の中で増殖させる。 ３．アルファルファにおける形質転換 アルファルファにおける形質転換は、たとえば、Shahi
n, E.A.、A.Spielmann、K.Sukhapinda、R.B.Simpson an
d M.Yashar. “Cell Biology & Molecular Genetics: T
ransformation of Cultivated Alfalfa Using Disarmed
Agrobacteriumtumefaciens." CROP SCIENCE ，26，123
5-1239 ，1986記載のシャヒンらの方法に準じて行うこ
とができる。アルファルファの茎の切片（約５cmくら
い) を次亜塩素酸によって無菌化処理した後、無菌的に
２〜３mmの厚さに切る。得られる切片にカリフラワーモ
ザイクフイルス由来の３５Ｓプロモーター／ノパリン合
成酵素（ｎｏｓ）のターミネーターとプロラミンキメラ
遺伝子を連結して構築されるプラスミド（抗生物質耐性
マーカー）を持つ土壌細菌Agrobacterium tumefaciens
を感染させる。形質転換されたカルスを選抜用抗生物質
を含むＭＳ培地上で選抜を行う。選抜されたカルスを再
生培地上で再生させ、組換え体植物を得る。

【００１２】

【実施例】以下、実施例についてより詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１３】実施例１ （イネ由来１０Ｋプロラミン蛋
白質遺伝子のクローニング） 約１ｇのイネ（品種名：日本晴）葉組織を液体窒素中で
乳鉢を用いてすりつぶした。５０ｍｌのファルコンチュ
ーブに１０ｍｌの２×ＣＴＡＢ液（2% cetyltrimethyla
mmonium bromide,100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA,1.
4M NaCl,1% polyvinylpyrrolidone)を入れ、６０℃にし
て保温した。葉を少量ずつチューブに入れ、軽く振とう
した後、さらに６０℃で、３０分間保温した。１０ｍｌ
のクロロホルム：イソアミルアルコール(24:1)を加えて
１５分間振とうした後、遠心分離（10,000g,10min,20
℃) を行うことにより得られた上層を新しい５０ｍｌチ
ューブに移した。この中に７ｍｌのイソプロピルアルコ
ールを加え、混合した。遠心分離（10,000g,15min,20
℃) でＤＮＡを沈澱させ、得られたＤＮＡを１ｍｌのＴ
Ｅ（10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA)に溶解した。１０
μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で、約４５分
静置した。フェノール抽出を１回行った後、１／２容の
フェノールと等容のクロロホルムを加えて再度抽出を行
った。遠心分離（10,000g,10min,20℃) を行うことによ
り得られた上層を１５ｍｌファルコンチューブに移し
た。さらに１回クロロホルム抽出を行った後、１／１０
容の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.2) と２．５容のエタノー
ルを加え、混合した後、遠心分離（10,000g,15min,4
℃) によりゲノムＤＮＡを得た。得られたゲノムＤＮＡ
50μｇを試料として、下記の塩基配列を有する２つの
合成プライマーＤＮＡ（配列番号２および３） Ｎ−１（２８mer)： ５’−GATGGTACCGTCTACACCATCTGG
AATC−３’ Ｃ−１（２９mer)： ３’−TCCGTCGACGCAAGTCTGAAAATG
ATTGA −５’ によるＰＣＲ法を用いてイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白
質遺伝子の増幅を行なった（図１参照）。増幅された遺
伝子は KpnＩと SalＩ部位で切断され、得られた遺伝子
断片は、同じく KpnＩと SalＩ部位で切断した市販のク
ローニングベクターpUC 119(宝酒造社製）に連結され、
プラスミド pUC−prolaminを得た。なお、 KpnＩと Sal
Ｉ部位で切断された遺伝子断片については、ダイデオキ
シ法に基づくApplied Biosystems社のモデル373A蛍光Ｄ
ＮＡシークエンサーによってその塩基配列を検討するこ
とにより、イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子の塩
基配列（配列番号７: 塩基配列の位置番号５１−４５５
参照）と一致していることを確認した。

【００１４】実施例２ （発現カセットの構築） 実施例１によって得られたイネ由来１０Ｋプロラミン蛋
白質遺伝子の断片の BglII部位から SalＩ部位までを、
種子特異的発現ベクターpSUM−GY１（工業技術院 生命
工学工業技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４１
３１：Escherichia coli HB101/pSUM-GY1 ）のダイズ種
子貯蔵蛋白グリシニン遺伝子ＧＹ１のプロモーターとタ
ーミネーターの間、すなわち、NcoI部位と SalＩ部位の
間に合成リンカーNcoBgl（配列番号６）と共にT4ＤＮＡ
リガーゼを用いて導入し、目的とする発現カセットであ
るプラスミドpSUM−GY１−prolaminを得た（図２参
照）。得られた発現カセットには、単一な BglII部位が
存在し、クローニングしたイネ由来１０Ｋプロラミン蛋
白質遺伝子の BglII− SalＩ fragment が確認された。
またpSUM−GY１由来のEcoRI-HindIII fragment、EcoRI-
SalI fragment も確認され、得られた発現カセットが目
的とするプラスミドpSUM−GY１−prolaminであることを
確認した。

【００１５】実施例３ （発現カセットの植物への導
入） 実施例２によって得られたプラスミドpSUM−GY１−prol
aminを制限酵素EcoRIで消化した後、末端をT4ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて平滑末端化した。得られた平滑末端
にHind III linker (CCAAGCTTGG)をT4ＤＮＡリガーゼを
用いて導入したプラスミドpSUM−GY１−prolamin（Hin
d) を制限酵素Hind IIIで消化した。この消化により切
り出された遺伝子断片を市販のバイナリーベクターであ
るpBI 121(クロンテック社製）のHind III部位に導入
し、２種類のプラスミド（プラスミドpBI−GY１−prola
min、プラスミド pBI−GY１−prolamin R）を得た（図
３参照）。得られた２種類のプラスミド各々によって、
あらかじめ塩化カルシウム処理でcompetent な状態にし
たAgrobacterium tumefaciens (LBA4404株：ストレプト
マイシン耐性リファンピシン耐性）を形質転換した。形
質転換体は、導入されたプラスミドが有するカナマイシ
ン耐性遺伝子（neomycin phosphotransferase: NPTII)
により付与されるカナマイシンに対する耐性の形質を利
用してストレプトマイシン３００μg/ml、リファンピシ
ン１００μg/ml、カナマイシン２５μg/mlを含むＬ−培
地〔bacto-tryptone １０ｇ、yeast extract ５ｇ、Na
Cl ５ｇ、dist. water 1L（pH7.0)〕で選択することに
より得られた。得られた形質転換体であるアグロバクテ
リウム（Agrobacterium tumefaciensLBA4404株: SmR Ri
fR) をストレプトマイシン３００μg/ml、リファンピシ
ン１００μg/ml、カナマイシン２５μg/mlを含むＬ−培
地で２８℃一昼夜培養し、得られた菌液をGelvin,S.B.,
R.A.Schilperoort and D.P.S.Verma. 著；プラントモレ
キュラー バイオロジー／マニュアル（Plant Molecula
r Biology/Manual.)、ルワー アカデミック パブリシ
ャーズ（Kluwer Academic Publishers) 発行、1988年等
に記載される通常の方法によるタバコの葉部ディスク片
への感染に用いた。感染した葉部ディスク片をＭＳ−Ｎ
Ｂ寒天培地で４日間培養した。４日目にＭＳ−ＮＢ＋セ
フォタキシム（５００μg/ml）寒天培地に移し、アグロ
バクテリウムの除菌を行った。１１日目にＭＳ−ＮＢ＋
セフォタキシム（５００μg/ml）＋カナマイシン（２０
０μg/ml）寒天培地に移し、形質転換体タバコ細胞の選
択を開始した。約４週間後、緑色の分化した幼植物体を
切り分け、ホルモンを含まないＭＳ＋セフォタキシム
（３００μg/ml）＋カナマイシン（５０μg/ml）寒天培
地に移植した。さらに植え継ぎながらカナマイシンによ
る選抜を行った後、組換え体植物を得た。

【００１６】実施例４ （発現したイネ由来１０Ｋプロ
ラミン蛋白質の検出：電気泳動による分析） 実施例３によって得られた組換え体植物の種子１０mgに
１００μｌの抽出液（６０％ｎ−propanol、５％２−me
rcaptoethanol 、１mM phenylmethanesufonylfuloride)
を加え、組織を破壊した後、遠心分離（15,000rpm,5mi
n,4℃）を行い、上澄みを抽出サンプル（アルコール可
溶性プロラミン蛋白質画分）として回収した。回収され
た抽出サンプルを２０％のSDS-PAGEし、銀染色によりゲ
ル中の蛋白質の検出を行った。その結果を図４に示す。
組換え体植物の種子（本発明区）では、イネ由来１０Ｋ
プロラミン蛋白質のバンド（分子量約１０Ｋ dal) を検
出した。一方、イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子
を持たない植物の種子（コントロール区）では、対応す
るバンドは存在しなかった。

【００１７】実施例５ （発現したイネ由来プロラミン
蛋白質の検出：Western blotによる免疫学的な分析) プロラミン蛋白質に対する抗体を作成するための抗原と
してイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質のシグナル配列を
除いた成熟蛋白質領域をグルタチオンＳトランスフェラ
ーゼに融合した蛋白質遺伝子を以下の手順により構築し
た。まず、プラスミド pUC−prolamin 1.4ｎg 試料とし
て、下記の塩基配列を有する２つの合成プライマーＤＮ
Ａ（配列番号４および５） Ｎ（３５mer)： 5'−GGTGAATTCATCACCACTATGCAGTATTTC
CCACC −3' Ｃ（３９mer)： 3'−GGTGAATTCAAGCTTTCAACAACAACCACA
GGAAGAGAG −5' によるＰＣＲ法を用いて成熟蛋白質領域の遺伝子の増幅
を行った。増幅された遺伝子はEcoRI 部位で切断され、
得られた遺伝子断片は、同じくEcoRI 部位で切断した市
販の融合蛋白作成ベクターpGEX−１λＴ（Pharmacia 社
製）に連結され、プラスミドpGEX−１λＴ−prolaminを
得た。なお、導入した遺伝子断片の方向は制限酵素によ
る解析と合成プライマーＤＮＡを用いたＰＣＲ法により
確認した。得られた融合蛋白質発現プラスミドpGEX−１
λＴ−prolaminを導入した大腸菌HB101 をＬ−培地で培
養し、常法に従ってIPTGによる発現誘導を行い、融合蛋
白質の大量発現を行った。培養により得られた菌体を氷
水上で超音波破壊（40W,10min,4 ℃) した後、遠心分離
（10,000ｇ,20min,4℃）により不溶性蛋白質画分を得
た。得られた不溶性蛋白質画分を２０％のSDS-PAGEして
融合蛋白質を分離した。このようにして分離された融合
蛋白をゲルから切り出した後、５０mM Tris-HCl(pH8.
0)、 0.1％ＳＤＳ、１％２−mercaptoethanol で該融合
蛋白質を抽出し、さらにアセトン沈澱によって融合蛋白
質を回収した。つぎに、回収された融合蛋白質を抗原と
して、Freundのアジュバントとともに、マウスBalb/cに
静脈注射シタ。このようにして、免疫されたマウスBalb
/cから全血を採取し、融合蛋白質に対する抗体を含有す
る抗血清を調製した。実施例４と同様にして、組換え体
植物から抽出したアルコール可溶性プロラミン蛋白質画
分を２０％のSDS-PAGEした後、分離された蛋白質を電気
的にニトロセルロースメンブレンに転写した。そして転
写された蛋白質を上記のように調製された抗血清と抗原
−抗体反応させた後、検出を行った。その結果を図５に
示す。実施例４において銀染色により検出されたバンド
が、免疫学的検出方法においても同様に検出され、発現
した蛋白質がイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質であるこ
とが確認された。

【００１８】実施例６ （組換え体植物のアミノ酸分
析） 実施例３によって作製された組換え体植物の種子１ｇを
氷上で冷やした乳鉢中で擦り潰した後、１０mlの抽出用
液（６０％ n-propanol 、５％２−ＭＥ、１mMPMSF)で
懸濁し、氷中で約１時間放置した。該懸濁液を遠心分離
（10,000g,10min,4 ℃）によって分離後、上澄みを回収
した。さらに沈澱物に１０mlの同抽出用液を加え、１０
分間放置後、同様にして上澄みを回収した。回収された
上澄みを合わせ、これに生じた油状物をピペットで除去
することにより、植物抽出物を得た。該植物抽出物１０
mlを６Ｎ塩酸で加水分解（１１０℃・２２時間）した。
加水分解後、処理液を乾固し、0.02Ｎ塩酸で１０mlに定
容し、分析用試料溶液とした。この試料溶液４０μｌに
ついてアミノ酸分析を行った。その結果を図６に示す。
pBI−GY1 −prolamin Rによる組換え体植物（本発明
区）は、pBI121による組換え体植物（コントロール区）
と比較して有意にメチオニン含量が上昇していることが
明らかとなった。

【００１９】実施例７ （ダイズにおける形質転換） ダイズ品種「Fayett」不定胚を６cmの寒天プレートの中
央部、直径２０mmの円周内に一層にして並べた。ダイズ
グリシニン−プロラミンキメラ遺伝子を持つ、実施例２
によって得られたプラスミドpSUM-GY1-prolamin を、選
抜用β−グルクロニダーゼ(GUS)/ハイグロマイシン耐性
遺伝子(HPT) 同時発現ベクターpSUM-GH:NotIと混合し、
これらの混合プラスミドを上記のダイズ不定胚にパーテ
ィクルガンによるボンバードメント（800mg/コーティン
グ金粒子 200μg/shot，プロジェクタイルストッパー/
試料間距離100mm の条件）により導入した。導入後、ハ
イグロマイシン ２５〜５０μｇ／ｍｌを含むＭＳ改変
増殖液体培地（Sigma 社)を用い、２５℃、１６時間照
明下で旋回培養し、形質転換不定胚を選抜した。約３ヵ
月後に選抜された黄緑色で増殖能を保持したハイグロマ
イシン耐性ダイズ不定胚について、合成ＤＮＡ NcoBg1
（配列番号６）およびＣ−１（配列番号３）をプライマ
ーとしてＰＣＲを行なうことにより、イネ由来１０Ｋプ
ロラミン蛋白質遺伝子領域の増幅有無を調べ、ダイズ染
色体へのイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子の挿入
を確認した。さらに得られた不定胚から植物個体の再生
を行い、約４ヵ月後にグリシニン−プロラミンキメラ遺
伝子による形質転換体ダイズを得た。

【００２０】実施例において用いられたＭＳ培地および
ＭＳ−ＮＢ培地の組成を下記に示す。 １．ＭＳ培地 〔ＭＳ−１ １００培液〕 Na2EDTA 1865mg 、 FeSO4 ・7H2O 1390mg、 dist.water 500ml 〔ＭＳ−２ １００培液〕 MgSO4・7H2O 18500mg、 MnSO4 ・4H2O 1115mg、 ZnSO4・7H2O 430mg、 CuSO4 ・5H2O 1250μl(１mg／ml stock) 、 dist.water 500ml 〔ＭＳ−３ １００培液〕 CaC12・2H2O 22000mg、 KI 42mg 、 CoC12・6H2O 1250 μl(１mg／ml stock) 、 dist.water 500ml 〔ＭＳ−４ １００培液〕 KH2PO4 8500mg 、 H3BO3 310mg、 Na2MoO4・2H2O 12500μl(１mg／ml stock) 、 dist.water 500ml 〔ＭＳ−５ ５０培液〕 KH4N03 82500mg、 dist.water 1000ml 〔ＭＳ−６ ５０培液〕 KN03 95000mg、 dist.water 1000ml 〔ＭＳ−７ １００培液〕 m −イノシトール 5000mg、 塩化チアミン 5mg 塩酸ピリドキシン 25mg、 ニコチン酸 25mg グリシン 100mg 、 dist.water 500ml 〔MS-1 100培液〕を１０ml、〔MS-2 100培液〕を１０m
l、〔MS-3 100培液〕を１０ml、〔MS-4 100培液〕を１
０ml、〔MS-5 50 培液〕を２０ml、〔MS-6 50 培液〕を
２０ml、〔MS-7 100培液〕を１０ml、混合し、ｐＨ5.8
に調製後最終的な液量を1000mlにした。 ２．ＭＳ−ＮＢ培地 上記のＭＳ培地にＮＡＡ（１−ナフタリン酢酸） 0.1mg
／ｌ、ＢＡ（ベンジルアデニン） 1.0mg／ｌを添加した
もの。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、従来の交雑を主体とする
品種改良と比較して短期間で、かつ省力的に、植物中の
含硫アミノ酸含量を向上させることができるようにな
り、食用・飲料作物といった多くの植物の栄養価の改良
が可能となった。

【配列表】

【００２２】配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 起源 生物名：イネ（Oryza sativa L.) 品種名：日本晴 組織の種類：種子 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．１４（１０８．．１２１） 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Met Met Lys Met Ala Met Gln Met Pro Tyr Met Cys Asn Met 1 5 10 14 (108) (121)

【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGGTACCG TCTACACCAT CTGGAATC ２８

【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCGTCGACG CAAGTCTGAA AATGATTGA ２９

【００２５】配列番号：４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGAATTCA TCACCACTAT GCAGTATTTC CCACC ３５

【００２６】配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGAATTCA AGCTTTCAAC AACAACCACA GGAAGAGAG ３９

【００２７】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATGGCAGCATACACCAGCAA CGTCGTATGTGGTCGTTCTAG

【００２８】配列番号：７ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 起源 生物名：イネ（Oryza sativa L.) 品種名：日本晴 組織の種類：種子 特徴を表す記号：peptide 存在位置：５１．．４５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGTCTACACC ATCTGGAATC TTGTTTAACA CTAGTATTGT AGAATCAGCA 50 ATG GCA GCA TAC ACC AGC AAG ATC TTT GCC CTG TTT GCC TTA ATT GCT 98 Met Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile Phe Ala Leu Phe Ala Leu Ile Ala 5 10 15 CTT TCT GCA AGT GCC ACT ACT GCA ATC ACC ACT ATG CAG TAT TTC CCA 146 Leu Ser Ala Ser Ala Thr Thr Ala Ile Thr Thr Met Gln Tyr Phe Pro 20 25 30 CCA ACA TTA GCC ATG GGC ACC ATG GAT CCG TGT AGG CAG TAC ATG ATG 194 Pro Thr Leu Ala Met Gly Thr Met Asp Pro Cys Arg Gln Tyr Met Met 35 40 45 CAA ACG TTG GGC ATG GGT AGC TCC ACA GCC ATG TTC ATG TCG CAG CCA 242 Gln Thr Leu Gly Met Gly Ser Ser Thr Ala Met Phe Met Ser Gln Pro 50 55 60 ATG GCG CTC CTG CAG CAG CAA TGT TGC ATG CAG CTA CAA GGC ATG ATG 290 Met Ala Leu Leu Gln Gln Gln Cys Cys Met Gln Leu Gln Gly Met Met 65 70 75 80 CCT CAG TGC CAC TGT GGC ACC AGT TGC CAG ATG ATG CAG AGC ATG CAA 338 Pro Gln Cys His Cys Gly Thr Ser Cys Gln Met Met Gln Ser Met Gln 85 90 95 CAA GTT ATT TGT GCT GGA CTC GGG CAG CAG CAG ATG ATG AAG ATG GCG 386 Gln Val Ile Cys Ala Gly Leu Gly Gln Gln Gln Met Met Lys Met Ala 100 105 110 ATG CAG ATG CCA TAC ATG TGC AAC ATG GCC CCT GTC AAC TTC CAA CTC 434 Met Gln Met Pro Tyr Met Cys Asn Met Ala Pro Val Asn Phe Gln Leu 115 120 125 TCT TCC TGT GGT TGT TGT TGA TCAAA CGTTGGTTAC ATGTACTCTA 480 Ser Ser Cys Gly Cys Cys *** 130 GTAATAAGGT GTTGCATACT ATCGTGTGCA AACACTAGAA ATAAGAACCA TTGAATAAAA 540 TATCAATCAT TTTCAGACTT GC

【図面の簡単な説明】

【図１】 イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子のＰ
ＣＲ法による増幅 ＰＣＲ法において用いた合成プライマーＤＮＡの塩基配
列を上部に示す。この塩基配列に示された矢印「5'−pr
olamin」、「3'−prolamin」は、各々イネ由来１０Ｋプ
ロラミン蛋白質遺伝子の上流側、下流側の末端を示して
おり、「matureprolamin 」は、最終的なイネ由来１０
Ｋプロラミン蛋白質をコードする遺伝子領域を示す。矢
印の方向はイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子の転
写される方向を示す。下部にイネ由来１０Ｋプロラミン
蛋白質遺伝子の構造を示してある。合成プライマーＤＮ
Ａが各々どの位置に相当するかを示してあり、各々の合
成プライマーＤＮＡから合成されるＤＮＡの方向を矢印
で示した。「signal sequence 」（シグナル配列）は、
蛋白質が小胞体から分泌されるために必要な配列を示
し、「mature prolamin 」（成熟蛋白質）は、最終的な
イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質をコードする遺伝子領
域を示す。

【図２】 種子特異的発現ベクターであるプラスミドpS
UM−GY1 による発現カセットの構築 プラスミドpSUM−GY1 は、種子特異的発現ベクターであ
り、EcoRI とNcoI部位にはさまれた領域はダイズグリシ
ニン遺伝子のプロモーター領域、SalIとHindIII 部位に
はさまれた領域はグリシニン遺伝子の転写終結領域を示
している。上部に示した塩基配列は、NcoBglリンカーと
して合成した二本鎖ＤＮＡを示している。プラスミドpU
C-prolaminは、イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子
がクローニングされたプラスミドである。最終的に得ら
れたグリシニン−プロラミンキメラ遺伝子を持つプラス
ミドpSUM-GY1-prolamin を下部に示す。GY1-pro, GY1-t
erは、各々ダイズグリシニン遺伝子のプロモーター領域
と転写終結領域を示す。

【図３】 Agrobacterium 感染による遺伝子の導入用プ
ラスミドの構築 pBI-GY1-prolamin、pBI-GY1-prolamin Rで示される２つ
の図は、遺伝子導入用バイナリーベクターであるpBI121
に導入したグリシニン−プロラミンキメラ遺伝子の導入
された方向を示している。ここで、「prolamin」は、イ
ネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質のシグナル配列領域を含
む蛋白質をコードする遺伝子を示している。「GY1-pro
」、「GY1-ter 」は、各々ダイズグリシニン遺伝子の
プロモーター領域と転写終結領域を示している。「NPTI
I 」は、大腸菌トランスポゾンTn５由来カナマイシン耐
性遺伝子（neomycin phosphotransferase)を示す。「β
−Glucuronidase 」は、大腸菌由来β−グルクロニダー
ゼ遺伝子を示す。「NOS pro」、「NOS ter 」は、各々
アグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼのプロモー
ター領域と転写終結領域を示し、「CaMV35S 」は、カリ
フラワーモザイクウイルス35S プロモーター領域を示
す。

【図４】 組換え体植物の種子中におけるイネ由来１０
Ｋプロラミン蛋白質の電気泳動による分析 写真左に示した数字は標準蛋白質の分子量を示す。レー
ン「pBI121」は、遺伝子導入用バイナリーベクターであ
るpBI121が導入された組換えタバコ種子からアルコール
抽出された蛋白質を、レーン「GYI-prolamin R」、レー
ン「GYI-prolamin」は、各々の発現カセットを含むプラ
スミドで形質転換された組換えタバコ種子からアルコー
ル抽出された蛋白質を示す。右の矢印は、発現したイネ
由来１０Ｋプロラミン蛋白質の泳動位置を示す。

【図５】 Westen blot による免疫学的な分析 写真左に示した数字は標準蛋白質の分子量を示す。右の
矢印は発現したイネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質の泳動
位置を示す。

【図６】 イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子が導
入された組換え体タバコ種子からアルコール抽出された
蛋白質画分におけるアミノ酸含量の変化 縦軸には、縦軸に記した１６種類のアミノ酸含量の総和
を１００％とした場合の各々のアミノ酸含量を示した。
横軸には、イネ由来１０Ｋプロラミン蛋白質遺伝子が導
入された組換え体タバコ（本発明区）におけるアミノ酸
含量値（％）を、遺伝子導入用バイナリーベクターであ
るpBI121が導入された組換え体タバコ（コントロール
区）における同値で割った値を示した。黒と白で示され
るグラフは、同じ株に関して独立した２回の実験結果を
示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大江田 憲治 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（１）植物中で機能可能な転写および翻訳
   開始領域の下流に、（２）イネ由来１０Ｋプロラミン蛋
   白質のシグナル配列領域を含むアミノ酸配列における１
   ０８番目から１２１番目までの１４個の高含硫アミノ酸
   配列（配列番号１）を含む翻訳可能な構造遺伝子を持
   ち、（３）植物中で機能可能なポリ（Ａ）シグナルと転
   写終結領域を機能可能な形で有する発現カセットを含む
   改良植物。
2. 【請求項２】翻訳可能な構造遺伝子が、イネ由来１０Ｋ
   プロラミン蛋白質のシグナル配列領域を除く成熟蛋白質
   領域をコードする構造遺伝子の全てである請求項１記載
   の改良植物。
3. 【請求項３】改良植物が、植物細胞、植物種子または植
   物体である請求項１記載の改良植物。
4. 【請求項４】（１）植物中で機能可能な転写および翻訳
   開始領域の下流に、（２）イネ由来１０Ｋプロラミン蛋
   白質のシグナル配列領域を含むアミノ酸配列における１
   ０８番目から１２１番目までの１４個の高含硫アミノ酸
   配列（配列番号１）を含む翻訳可能な構造遺伝子を持
   ち、（３）植物中で機能可能なポリ（Ａ）シグナルと転
   写終結領域を機能可能な形で有する発現カセットを植物
   に導入し、発現させることを特徴とする植物における含
   硫アミノ酸含量の改良方法。