JPH0721455B2 - 液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法 - Google Patents

液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法

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JPH0721455B2
JPH0721455B2 JP63306435A JP30643588A JPH0721455B2 JP H0721455 B2 JPH0721455 B2 JP H0721455B2 JP 63306435 A JP63306435 A JP 63306435A JP 30643588 A JP30643588 A JP 30643588A JP H0721455 B2 JPH0721455 B2 JP H0721455B2
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    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、液体試料、とりわけ全血、血清、血漿、尿お
よび髄液のような体液中の特定成分を迅速かつ簡便に分
析するための用具および方法に関する。
［従来の技術］ 液体試料中の特定成分の分析には、穏やかな条件下に行
なうことのできる酵素的分析法が従来から広範に用いら
れている。臨床検査においては、例えば、特定成分を酸
化する酸化酵素、色素前駆体および要すればパーオキシ
ダーゼを含む試薬溶液を用いる体液分析が行なわれてき
た。このような酵素的分析法においては、酸化酵素作用
下の特定成分の酸化によって生成する過酸化水素が、被
酸化型色素前駆体を直接酸化するか、またはパーオキシ
ダーゼ作用下に色素前駆体を酸化カップリングすること
により、色素が生成する。この色素を、吸光光度法、蛍
光法、発光法などによって比色的に測定することによっ
て、特定成分を間接的に測定することができる。
臨床検査上特に重要な酸化酵素は、グルコースオキシダ
ーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、コリンオキシダー
ゼ、アシルCoAオキシダーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、各種アミノ酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダー
ゼ、ラクテートオキシダーゼ、ラクトースオキシダー
ゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダー
ゼ、グリセロールオキシダーゼなどである。
色素前駆体としては、いわゆるトリンダーの試薬［アナ
ルズ・オブ・クリニカル・バイオケミストリー（Ann.Cl
in.Biochem.）、６巻、24頁、1960年］や、ｏ−アニン
ジン、ベンジジン、ｏ−トリジン、テトラメチルベンジ
ジンなどの被酸化型色素前駆体がよく知られている。
このような酵素的分析法の大きな利点は、分析の対象と
なる成分が変わっても、酸化酵素の種類を変えさえすれ
ば同じ発色系を用いることができる点にあり、各種分析
項目への応用が検討されている。
近年、分析を迅速かつ簡便に行なうために、上記の分析
用試薬溶液の代わりに、固体支持に固定した試薬を用い
ることが有用視されてきた。
例えば、前記のような酸化酵素および過酸化水素を含む
検出系をポリマー中に分散させてプラスチックフィルム
に塗布した耐水性の試験フィルムが、特公昭49−33800
号明細書に開示されている。この試験フィルムを用いる
分析においては、生成した色素をフィルムの試料供給側
から測定するので、試料（全血、血清等）を、試薬層と
一定時間接触後に脱脂綿等で拭き取り除去する必要があ
る。さらに試料の拭き取り後、酵素を充分に供給して発
色させるために、空気中に一定時間放置しなければなら
ない。
特公昭53−21677号明細書には、液体不浸透性光透過性
支持体上に、試薬層および展開層を設けた多層試験フィ
ルムが開示されている。このフィルムの展開層に試料を
点着すると、試料は展開層で広がった後、試薬層に移行
する。試薬層において試料中の成分と試薬とが反応して
生成した色素を、光透過性支持体側より測定する。従っ
て、点着した試料を除去する必要がない。しかし、試薬
層は支持体と展開層とに挟まれているため、大気が試薬
層に達しにくく、特に試薬層に酸化酵素が含まれている
場合、酸素不足により充分な反応を行わせることができ
なかった。
この欠点を解決するために、特開昭60−82859号に、一
体型多層化学分析要素が開示された。この分析要素は、
展開層と試薬層との間に、酸素透過性蛋白質不透過性光
遮蔽層を有しており、大気と試薬層との接触を向上させ
ている。しかし、試薬層の支持体側は大気と接触できな
いので、試薬層への酵素の供給は充分とは言えなかっ
た。
本出願人による特開昭60−205364号に開示されている分
析用具は、試薬層と支持体との間に多孔質疎水性の酸素
供給層を有するので、酸化酵素を含有する試薬層の反応
性を著しく向上させることができる。しかし、この酵素
供給層は、充分量の酸素を保有するための厚みを有して
いるため、支持体側からの光透過性が得られず、試料を
除去して試料供給側から生成した色素を測定しなければ
ならなかった。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、前記のような従来技術の問題点を解決
し、迅速かつ簡便に精度良く特定成分を分析するための
用具および方法を提供することである。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、液体試料中の特定成分を分析するための用具
であって、 直径２〜10mmの貫通穴を有する支持体、 貫通穴を覆うように支持体上に固定した光透過性多孔性
フィルム、 多孔性フィルムの支持体に接していない側の面上に固着
した試薬層、および 試薬層を覆うように支持体上に固定した試料保持層 から成る用具に関する。
更に、本発明は、本発明の分析用具を用いて液体試料中
の特定成分を分析する方法であって、液体試料を試料保
持層に滴下することによって試薬層に浸透させ、試薬層
中で生成した色素を、支持体の貫通穴を通して多孔性フ
ィルム側から、例えば反射率計を用いて比色測定するこ
とを含んで成る方法にも関する。
本発明の分析用具は、試薬液を塗布および乾燥した多孔
性フィルムを、支持体の貫通穴を覆うように配置して支
持体上に固定し、次いで試料保持層を、試薬層を覆うよ
うに配置して、支持体上に固定することによって製造し
得る。多孔性フィルムおよび試料保持層の支持体上への
固定は、例えば熱可塑性樹脂を用いて熱圧着するか、ま
たは両面テープを用いて行うことができる。
支持体の試料保持層のみに覆われている部分に、貫通穴
を更に１個設けてもよい。これにより、血液などの試料
が試料保持層に滴下されたことを測定側から確認するこ
とができるので、例えば試料滴下から測定までの時間を
一定にして自動測定するために有利である。
試料保持層の上に、貫通穴を有する支持体を更に設け
て、その貫通穴から試料を滴下してもよい。
本発明に使用する多孔性フィルムの空孔率は２〜70％、
孔サイズは0.01〜20μｍ、厚さは５〜30μｍである。こ
のような多孔性フィルムは、空気透過性であるので、酸
化反応に要する酸素を空気中から試薬層に充分供給する
ことができる。より空孔率が高く、および／またはより
厚い多孔性フィルムは、空気透過性であっても透明度が
低いので、そのような多孔性フィルムを用いると、多孔
性フィルム側からの色素の測定が不可能または困難とな
る。従って、本発明は使用する光透過性多孔性フィルム
の透明度は30％以上、好ましくは60％以上である。本発
明に適当な多孔性フィルムは、例えばニュークリポア
（ニュークリポア社製）およびジュラガード（ポリプラ
スチック社製）の商品名で市販されている。しかし、本
発明に使用する多孔性フィルムは、光透過性および酸素
透過性であればどのようなものであってもよい。
試薬は、特定成分に対する酸化酵素、パーオキシダーゼ
および色素前駆体を含有する。
本発明において、試薬は、光を遮蔽する光反射性不溶性
粒子を更に含有する。それにより、例えば血液のような
着色試料の分析においても、着色成分による妨害が少な
く、多孔性フィルム側からより正確な測定を行うことが
可能となる。光反射性不溶性粒子は、例えば血液試料の
分析において、試薬層に血球が浸透するのを防止する機
能をも有することが好ましい。光反射性不溶性粒子とし
ては、二酸化チタン、酸化亜鉛、硫酸バリウムおよび酸
化マグネシウムなどの白色顔料が適当であるが、液体試
料に溶解せず光を遮蔽する物質であればどのようなもの
でもよい。例えば、フルオロカーボン、ポリスチレンラ
テックス粒子、炭酸カルシウム、タルク、アルミ粉末、
デキストラン、アクリル系ポリマー粒子、ポリスチレン
系ラテックス粒子などが挙げられる。
試薬液の塗布性能を高めるために、試薬液に親水性高分
子をも添加し得る。親水性高分子としては、ヒドロキシ
プロピルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナ
トリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルポロリド
ン、ゼラチン、修飾ゼラチン、寒天等が適当である。更
に、これら親水性高分子に乳化エマルジョン系接着剤や
ラテックス粒子を添加すると、浸透性が向上する。
試薬液に、非イオン性界面活性剤、可塑剤および／また
は安定化剤を加えることによっても、塗布性能および反
応性を向上させることができる。
試薬層を酸素発色剤層と白色顔料などの光反射性水不溶
性粒子層の２層に分けることも可能である。
試料保持層は、滴下された液体試料を試料保持層前面に
広げ、かつその試料が振動などにより流出するのを防ぐ
という機能を有する。このような試料保持層の材料とし
ては、繊維性多孔性材料が好ましく、例えば濾紙、織
物、不織布、メッシュ等が適当である。試料保持層に、
抗凝固剤、アスコルビン酸オキシダーゼ（共存し得るア
スコルビン酸の酸化による測定妨害を除く）、コレステ
ロールエステラーゼ（トータルコレステロールを測定す
る場合に、エステル型のコレステロールを遊離型に変え
る）等を予め保持させておくことも可能である。
［作用］ 以下、本発明の分析用具について図面を参照しながら説
明する。
第１図は、貫通穴を有する支持体１上に、貫通穴を覆う
ように固定した多孔性フィルム２、多孔性フィルム上に
固着した試薬層３、および試薬層を覆うように支持体に
固定した試料保持層４を有する分析用具の断面図であ
る。多孔性フィルムおよび試料保持層は、熱可塑性樹脂
または両面テープ（図示せず）でベースフィルム上に固
定されている。
第２図は、第１図に示す分析用具の、支持体１の試料保
持層４のみに覆われている部分に、貫通穴を更に１個設
けた態様を示す。例えば自動測定において、血液などの
試料が滴下されたことを矢印Ａの位置において検出し、
検出後一定時間後に矢印Ｂの位置において試薬層２の反
射率を測定することができる。
第３図は、多孔性フィルム２、多孔性フィルム上に固着
した試薬層３、および試料保持層４をマウント５内に有
する分析用具の断面図である。マウントは、多孔性フィ
ルム側および試料保持層側のいずれにも貫通穴を有す
る。
なお、第１〜３図は、わかり易くするために上下方向を
拡大してある。
［実施例］ 実施例１ 血中グルコースの定量 厚さ10μｍの光透過性多孔性フィルム（ニュークリポ
ア）に、下記の組成の試薬液を100μｍの厚さに塗布
し、40℃で１時間乾燥後、7mm幅に切断した。
試薬液組成： グルコースオキシダーゼ 10ku パーオキシダーゼ 20ku ４−アミノアンチピリン 150mg N-エチル‐N-（2-ヒドロキシ‐3-スルホプロピル）‐3,
5-ジメチルアニリン 200mg 0.15Mリン酸緩衝液（pH7.0） 2ml ４％ヒドロキシプロピルセルロース 3g 50重量％二酸化チタン溶液 1g 熱可塑性樹脂でコーティングされ、直径4mmの貫通穴の
列を有する支持体上に、貫通穴の例を覆うように、前記
多孔性フィルム片を試薬層を上にして重ね、熱圧着し
た。その上に10mm幅の濾紙を重ね、サイドで支持体に熱
圧着した。最後に、１貫通穴毎に貫通穴の列に対して垂
直に支持体を切断して分析用具を作成した。
対照として、前記光透過性多孔性フィルムの代わりに、
光透過性非多孔性ポリエステルフィルムを用いて、同様
に分析用具を作成した。
前記のように作成した分析用具の試料保持層に、種々の
グルコース濃度の全血を20μｌずつ滴下し、１分後に、
支持体の貫通穴を通して多孔性フィルム側から積分球式
反射率計で630nmにおける反射率を測定した。反射率か
ら、クベルカームンク（Kubelka−Munk）の式の簡略
型： K/S＝（１−Ｒ）2/2×Ｒ K:定数 S:散乱係数 に従ってK/S値を求めた。K/S値は、モル濃度に一時的に
比例する。［グスタフ−コルトゥム（Gustav−Kortu
m）、「リフレクタンス・スペクトロスコーピー（Refle
ctance Spectroscopy）」、106〜111頁、シュプリンガ
ー・フェルラーク（Springer−Verlag）、1969年］ 測定結果を第１表に示す。
本発明の分析用具（光透過性多孔性フィルムを有する）
を用いて測定した場合は、グルコース濃度に比例してK/
S値が高くなった。しかし、対照の分析用具（光透過性
非多孔性フィルムを有する）を用いると、試料中のグル
コース濃度が約150mg/dlを越えると、発色の増強は認め
られなくなった。
実施例２ 血中乳酸の定量 厚さ25μｍの光透過性多孔性フィルム（ジュラガード）
に、下記の組成の試薬液を200μｍの厚さに塗布し、40
℃で１時間送風乾燥し、実施例１と同様に分析用具を作
成した。対照の分析用具は、前記光透過性多孔性フィル
ムの代わりに、光透過性非多孔性ポリエステルフィルム
を用いて同様に作成した。
試薬液組成： 乳酸オキシダーゼ 990u パーオキシダーゼ 23ku ４−アミノアンチピリン 50mg N-エチル‐N-（2-ヒドロキシ‐3-スルホプロピル）‐m-
トルイジン 200mg ４％ヒドロキシプロピルセルロース 3.7 g 50％二酸化チタン溶液 1.2 g 0.3Mリン酸緩衝液（pH7.0） 2ml 非イオン性界面活性剤（10％トリトン（Triton）Ｘ−10
0） 0.5ml 前記のように作成した分析用具の試料保持層に種々の乳
酸濃度の全血を20μｌずつ滴下し、１分後に多孔性フィ
ルム側から積分球式反射率計で560nmにおける反射率を
測定し、K/S値を求めた。
全血を遠心分離して得た血漿についても同様に測定を行
った。
結果を第２表に示す。
本発明の分析用具（光透過性多孔性フィルムを有する）
を用いて測定した場合は、試料が全血であっても血漿で
あっても、乳酸濃度に比例してK/S値が高くなった。し
かし、対照の分析用具（光透過性非多孔性フィルムを有
する）を用いると、試料中の乳酸濃度が約75mg/dlを越
えると、発色の増強は認められなくなった。
以上、本発明の好適な実施例について述べたが、本発明
の技術思想の範囲内で種々の変更が可能である。
［発明の効果］ 以上、詳述したように、本発明の分析用具を用いると、
体液中の特定成分を迅速かつ簡便に測定することができ
るので、臨床検査に絶大な効果をもたらすことができ
る。
【図面の簡単な説明】
第１〜３図は、それぞれ本発明の液体試料分析用具の態
様の断面図である。 １……支持体、２……多孔性フィルム、３……試薬層、
４……試料保持層、５……マウント。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体試料中の特定成分を分析するための用
    具であって、 直径２〜10mmの貫通穴を有する支持体、 貫通穴を覆うように支持体上に固定した光透過性多孔性
    フィルム、 多孔性フィルムの支持体に接していない側の面上に固着
    した試薬層、および 試薬層を覆うように支持体上に固定した試料保持層 から成る用具。
  2. 【請求項２】多孔性フィルムの空孔率は２〜70％、孔サ
    イズは0.01〜20μｍ、厚さは５〜30μｍである特許請求
    の範囲第１項記載の用具。
  3. 【請求項３】試薬が、特定成分を酸化する酸化酵素、パ
    ーオキシダーゼおよび色素前駆体を含有する特許請求の
    範囲第１項または第２項記載の用具。
  4. 【請求項４】試薬が、光反射性不溶性粒子を更に含有す
    る特許請求の範囲第３項記載の用具。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
    載の用具を用いて液体試料中の特定成分を分析する方法
    であって、液体試料を試料保持層に滴下することによっ
    て試薬層に浸透させ、試薬層中で生成した色素を、支持
    体の貫通穴を通して多孔性フィルム側から測定すること
    を含んで成る方法。
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