JPH0721479B2 - 酵素電極及びこれを用いたセンサ、定量分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、導電性基板の上に酵素が固定化されて成り特
異的な基質の存在下でその酵素の触媒活性に電気的に応
答する酵素電極に関するものである。

〔従来の技術〕

生体触媒として酵素を導入した電流検出型バイオセンサ
の利点は、これまでにアストンおよびターナー（Aston
and Turner）「バイオテクノロジー・アンド・ジェネテ
ィクス・イングリッシュ・レビュー（Biotec.Genet.En
g.Rev.）,G.ラッセル編（ed.G.Russell）」（1984年，
第１巻,89-120ページ，インターセプトニューキャッス
ル・アポン・タイン（Intercept,Newcastle-upon-Tyn
e））あるいはG.デービス（Davis G.）「バイオセンサ
（Biosensors）」（1985年，第１巻,161-178ページ）に
よりある程度論じられている。これらの技術は信号変換
方式が異なっており、大別すれば（ａ）電極表面で起こ
る酵素反応の生成物の酸化に起因する電気的応答が検出
されるタイプ、（ｂ）酸化還元試薬によって電子が酵素
から電極へと輸送される「メディエータ関与型」と呼ば
れるタイプ、及び（ｃ）上述のようなメディエータを必
要としない「直接電子輸送型」と呼ばれるタイプの三者
となる。以下これらのタイプ（ａ）〜（ｃ）の反応につ
き、順に概要を述べる。

上記（ａ）について このタイプの反応は、反応の進行に伴って過酸化水素を
生成するある種のオキシダーゼ（たとえばグルコースオ
キシダーゼ，アルコールオキシダーゼ等）を例にとる
と、次のように表わされる。

基質＋O₂…（オキシダーゼ）酸化生成物＋H₂O₂ この方法では、過酸化水素は定電位電極の表面にて酸化
される。

H₂O₂O₂＋2H⁺＋2e このような過酸化水素から電極への電子の移動に伴って
電気信号が生成され、条件が適当に選ばれれば酵素反応
により生ずる電流の強さは被検物質の濃度に比例するよ
うになる。

グルコースの定量を行う装置としてはこれまでに様々な
ものが提案されているが、それらの多くは再現性，応答
速度，グルコース濃度の適用範囲に制限があった。商業
ベースである程度の成功を収めたものとしては、グルコ
ースを基質，グルコノ−1,5−ラクトンを生成物とする
系において上述の過酸化水素を利用した例がある。ま
た、過酸化水素の二次反応（たとえば比色分析）やコン
ダクタンス等の物理化学的測定にもとづいた方法も知ら
れている。しかしながら、これらの方法は一般に応答速
度が遅いうえ、試料中の酸素圧に非常に影響されやすい
という欠点を有している この酸素圧は時として大きく変動するものであり、分析
を簡便化しようとして酸素圧を低くすると、電流応答の
直線性が劣化して上限付近において予想値よりも低い値
がでる虞れがある。同様のことは、グルコース以外の基
質を使用する間接分析法についても言える。

上記（ｂ）「メディエータ関与型バイオセンサ」につい
て このタイプの反応では、濃度測定の対象である基質と酵
素が反応することにより、酵素が常に還元型（高電子密
度型）に保たれる。この種の反応に基づくセンサを実用
化するには、電子供給源（酵素分子内の電子密度の高い
活性部位など）と電極本体の間の電気的接続を達成する
ことが要件となる。ところが酵素の活性部位は一般に巨
大分子構造の中の割れ目やひだに埋もれて存在している
ため、このような部位へ電極本体が接近することは不可
能であるか、あるいは非常に難しい。従って、信頼性が
高く鋭敏な信号変換を行うためには両者の電気的接続が
必要であるにもかかわらず、これを実際に達成すること
は難しいのである。しかし、ここで電子の担体、すなわ
ち「メディエータ」を使用すれば、酵素−電極間の電子
移動は容易となる。この「メディエータ」は酸化型の時
には酵素から電子を取り込んで還元型となり、次に電子
を電極に供与することにより自身は再び酸化型に戻る。

近年、グルコースオキシダーゼを固定化した炭素電極を
利用したバイオセンサがいくつか報告されているが、上
述のメディエータをここに応用することができる。たと
えば、塩化シアヌル法により酵素を共有結合により固定
化し、数ヶ月間安定に使用した例をジョンソンおよびゴ
ートン（Jonsson and Gorton）が報告している「バイオ
センサーズ（Biosensors）」，（1985年第１巻,355-369
ページ）。しかし、このセンサにメディエータとして使
用されているＮ−メチルフェナジニウムイオン（メト硫
酸フェナジン）は不安定で洗浄により失われやすく、使
用するたびに交換しなければならないのが重大な欠点で
ある。また、このセンサにおいてメディエータを介して
行われる電気化学的変換は酵素の還元反応と良く拮抗す
ることが実証されているものの、この電極は酸素濃度の
影響を受けやすい。この他にも、フェロセンあるいはそ
の誘導体をメディエータとし、固定化グルコースオキシ
ダーゼ電極を有するバイオセンサが、キャス（Cass et
al.）らにより報告されている〔アナリティカル・ケミ
ストリー（Analyt.Chem.）56巻,667-673ページ,1984年
及び欧州特許第0,078,636号〕。この場合、メディエー
タを介した電極への電子移動は次のように進行する。

この電極反応機構の詳細については明らかではない。特
に、どのようにして不溶性の還元型フェロセンが電荷を
電極へ運び、環状化合物であるメディエータの活性を維
持しているのかはわかっていない。もっともこの難問は
イオン性のフェロセン誘導体には無関係かも知れない。
更に、本反応における応答速度は同じ酵素反応における
既知の反応速度から予想される電位応答速度よりもかな
り遅く、また電極の寿命も限られている。これらは恐ら
く酵素の安定性の限界に起因しているものである。

メディエータを信号変換に使用すると、いくつかの問題
点が付随的に生ずる。まず第一はメディエータが生体触
媒を含有する部位から漏出しやすいこと、第二は酸化
型，還元型、あるいはその両方の型のメディエータが拡
散しにくいこと、第三はメディエータ自身が本来的に不
安定なことである。

上記（ｃ）「直接電子輸送型バイオセンサ」について メディエータを使用しないバイオセンサを作成する試み
についてはタラセビッチ（Tarasevich）が生物学的電気
触媒作用に関する最近の総説の中で示唆している「バイ
オエレクトロケミストリー（Bioelectrochemistry）」
（第10巻,231-295ページ,1985年）。

かかるバイオセンサは、「無試薬型」あるいは「メディ
エータレス型」と呼ぶことができる。前出のタラセビッ
チの総説の中にはメディエータレス型酵素電極の例が幾
つか紹介されている。これらの電極にはメチルビオロゲ
ンに類似した構造単位やNMP⁺TCNQ^-（Ｎ−メチルフェナ
ジニウムテトラシアノ−４−キノジメタン）等の有機導
電性塩のいずれかあるいは両方を含む有機導電性ポリマ
ーが使用されており、これらが電極の性能を改善し、メ
ディエータの役目を果たしている。このような修飾電極
を介して酸化還元タンパクから電子を変換する方法の多
くはこの範疇に属するものである。

ここで問題となるのは、有機導電性ポリマーや有機導電
性塩の本来的な不安定性である。例えば、アルコール検
出用のバイオセンサとして使用されるNMP/TCNQ修飾電極
の寿命半減期は約15日である。この種の電極は、また酸
素の影響を受けやすい。

これまでの報告をみると、炭素基板電極を使用している
例がほとんどであるが、本当の意味でメディエータレス
と言える酵素電極はごく僅かであり、失敗例の多いのが
実情である。前出のジョンソン及びゴートンがグルコー
スオキシダーゼの利用に関する最近の論文の中で示唆し
たところによると、問題の主因は酵素の固定化自体にあ
る。つまり、酵素を固定化すると立体障害をはじめとす
る種々の障害により電子移動能が阻害されやすく、どう
してもメディエータが必要になるのである。

一方、非常に活性の高いオキシダーゼが炭素電極あるい
は白金電極上に固定化された珍しい例も報告されてい
る。たとえばイアニエロ（Ianiello）ら「アナリティカ
ル・ケミストリー（Analyt.Chem.）」（第54巻,1098-11
01ページ,1982年）は、グルコースオキシダーゼとＬ−
アミノ酸が塩化シアヌル法により炭素電極上に共有結合
されているメディエータレス型センサを紹介している。

しかし、イアニエロとヤシニッチ（Yacynych）によると
「アナリティカル・ケミストリー（Analyt.Chem.）」
（第53巻,2090-2095ページ,1981年）、このセンサの寿
命半減期は20〜30日と短い。また、酸素の影響について
は明らかにされていない。

上述のような原理に基づいて機能するバイオセンサ、特
にグルコースセンサは従来数多く開示されており、その
代表的な選択方法も広く受け入れられている。ここで
は、松下電器産業株式会社が日本国特開昭第56−163447
号公報に開示した技術を特に検討する。この公報は、間
接型グルコース電極を開示したものである。ここでは、
グルコースオキシダーゼの存在下でグルコースが酸化さ
れて生成された過酸化水素を白金電極上で酸化させて、
試料の基質（この場合はグルコース）の濃度に比例した
酸化電流を得ている。

この電極は固定化グルコースオキシダーゼ等の固定化酵
素層を支持する導電性の炭素基板より構成されている。
この導電性基板自体はフルオロカーボン樹脂をバインダ
ーとして10重量％以内の割合で含むグラファイト粒子に
より成形されており、当該基板の上には厚さ１μｍ以下
の白金薄膜が電解作用若しくは蒸着により析出されてい
る。前出の日本国特開昭第56-163447号に開示された発
明においては、白金の表面に直接酵素を固定化させるこ
とに伴う不都合が回避され、応答性が５秒と速く、高感
度で持続性あることを特徴とする酵素電極が紹介されて
いる。しかし最近の実験でかかる酵素電極を使用して
も、上記の種々の効果を得るには至らなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、主としてグルコースバイオセンサに用いられ、
信頼性，再現性，早い応答速度と高感度性，及び長期に
わたる安定性を有する酵素電極は依然として必要とされ
ているのである。

本発明は、かかる実情に鑑みて提案されたものであっ
て、新規な炭素基板を酵素電極として用い、電極上にグ
ルコースオキシダーゼ等の酵素をより効果的な方法で固
定化することにより、応答性，安定性の優れた電流検出
型センサを提供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明が提供する改良された酵素電極は、特に所望しな
い限りメディエータを用いなくてもすむほか、非常に低
濃度の溶存酸素の存在下でも機能する。また、上記酵素
電極１cm²あたりの電流密度は10mMグルコース溶液中に
て数百マイクロアンペアと、電流応答特性にも優れる。
かかる電流応答特性は従来の電流検出型バイオセンサに
比して優れているため、電極面積が１mm²以下で０〜100
nAの電流を発生できるようなマイクロプローブ型バイオ
センサの製造にも適している。

当該電極はまた非常に微量の固定化酵素を用いて構成す
ることもできる。すなわち保護膜なしの場合には１〜２
秒、保護膜がある場合でも10〜30秒と、従来のいかなる
グルコースセンサよりも速いグルコース応答特性を有す
る。また、この電極は浸漬した状態で保管されれば室温
においても優れた安定性を発揮する。

この電極の応答特性は数ヵ月使用した後でも、優れてい
た。適用濃度範囲は広く、通常よりもかなり低い電位で
機能し（通常の650mVに対して本電極は325mV）、動作電
位におけるバックグラウンド電流値は非常に低い。

本発明にかかる酵素電極あるいはバイオセンサは、特異
的基質の存在下において酵素の触媒活性に電気的に応答
することが可能な酵素電極において、予め高純度の白金
族金属と均一に混合させるか，あるいは該白金族金属を
個々の粒子の表面に析出または吸着させたカーボン粒子
もしくはグラファイト粒子を樹脂バインダーを用いて成
形することにより形成され、実質的に不均一な樹脂固着
カーボン層あるいは樹脂固着グラファイト層中に白金族
金属が均一に分散されてなる多孔質導電性基板層により
導電性支持体の少なくとも一部が構成されてなり、該多
孔質導電性基板層の表面に酵素が固定化または吸着され
て成るものである。従って、本発明にかかる酵素電極は
前出の日本国特開昭第56−163447号公報に開示されてい
る積層型均一白金被膜炭素電極とは異なり、樹脂バイン
ダーにより結合されたカーボン粒子あるいはグラファイ
ト粒子から成る極めて不均一な層を少なくとも有し、こ
の層の中に白金族元素が極めて均一に分散されたもので
ある。上記樹脂バインダーにより結合されたカーボン粒
子の層は、成形して基板とされる前にコロイド状の白金
またはパラジウムを予め析出あるいは吸着させたカーボ
ン粒子を使用して形成されることがより望ましい。ま
た、本発明において白金被膜付きカーボン粒子を成形し
て電極基板とする際に使用される樹脂バインダーとして
は、ポリテトラフルオロエチレンが特に好ましい。

本発明にかかる酵素電極の構成をもう少し詳しく論ずる
と、まず電極はたとえば白金やパラジウム等の白金族元
素を予め表面に吸着させたカーボン粉末が樹脂バインダ
ーで結合されている層を少なくとも有する導電性基板か
ら成ることが望ましい。

上記カーボン粉末としては、後に行われる酵素の固定化
に支障を来さないものであればいかなるものを使用して
も良く、このためにはカルボキシル基、アミノ基、含イ
オン基等の官能基を表面に多く有するものが使用され
る。このようなカーボン粉末は、酵素を良く吸着するこ
とのできないガラス状カーボンとは全く対照的なもので
ある。粒径は３〜50nm、より好ましくは５〜30nmであ
る。

上記カーボン粒子上へ白金（あるいはパラジウム）を析
出させる方法としては、蒸着、電気化学的析出、あるい
はコロイド懸濁液からの単純吸着等が好適であるが、カ
ーボン粒子と白金族金属を単に混合してもよい。いずれ
の場合にも、白金族金属の割合の範囲は、炭素の重量を
基準として１〜20重量％、より望ましくは５〜15重量％
である。しかし、上記範囲は絶対的なものではなく、実
用上の観点から定められたものである。白金族金属の割
合が１重量％未満の場合には、よほど感度の高い装置を
使用しない限り信号強度が低下して測定困難となる。ま
た白金族金属の割合が20重量％よりも大きいと、コスト
高となる割には応答速度や感度の改善効果が少なく、実
際のところ白金族金属の割合が極端に多いときにはかえ
って感度が低下する。したがって、カーボン粒子上に白
金族金属被膜あるいはパラジウム被膜を形成するには、
たとえば塩化白金酸等の化合物の酸化分解によるか、あ
るいはたとえば英国特許第1,357,494号，米国特許第4,0
44,193号，同第4,166,143号等に開示されているよう
に、酸化されやすい配位子を有する白金あるいはパラジ
ウムの錯体を使用してコロイド状の白金あるいはパラジ
ウムを直接にカーボン粒子表面へ析出させることが好ま
しい。

このようにして白金あるいはパラジウムの被膜を形成し
たカーボン粒子を、次に適当な撥水性樹脂バインダーを
使用して成形する。このときの撥水性樹脂バインダーと
してはポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂が特
に好ましい。これにより、樹脂をバインダーとして上記
の白金被膜付きあるいはパラジウム被膜付きカーボン粒
子を主体とする完全な自立型多孔質体を成形するか、あ
るいはより一般的には樹脂をバインダーとする粒子から
なる多孔質層を金属，炭素，グラファイト等の導電性基
板の表面に成形する。樹脂をバインダーとする上記白金
被膜付きカーボン粒子層を形成する基板の材料として特
に好ましいものとしては、たとえば米国特許第4,229,49
0号に開示されているカーボン紙や、米国特許第4,293,3
96号に開示されている開孔型カーボン布が挙げられる。
空孔率をできるだけ大きくとるためには、バインダーと
して使用する樹脂の量を電極層の構造性と安定性を確保
するために必要最小限とする。このときの電極層の厚さ
は例外もあるが0.1〜0.5mm程度かあるいはこれ以下とさ
れるのが普通である。構造性，機械強度，および空孔率
を適正化する観点から、樹脂バインダーの量は白金被膜
付きあるいはパラジウム被膜付きカーボン粉末の重量を
基準として、最低でも５〜10重量％、多くとも80重量％
に選ばれ、通常は30〜70％の範囲とされる。樹脂バイン
ダーの量が５重量％未満であるとカーボン粒子，グラフ
ァイト粒子を互いに結びつけるに不十分である。逆に80
重量％を越えるとカーボン粒子あるいはグラファイト粒
子の含有量が相対的に小さくなり過ぎて出力信号が非常
に弱くなるので記録装置として非常に高感度のものが必
要になってしまう。

樹脂としては導電性，半導電性のものも含めてあらゆる
種類のものが使用できるが、合成フッ素樹脂、特にポリ
テトラフルオロエチレンが好ましい。ここで、酸化の過
程を考慮するとこのバインダーは酸素透過性であること
が必要である。このため、上記バインダーは大気圧下で
酸素溶解度が最小でなければならず、その値は常温常圧
下でバインダー１cm³あたり少なくとも酸素２×10^-3cm³
とする。

使用できるバインダーおよびそれらの酸素溶解度を「ポ
リマー・ハンドブック（The Polymer Handbook）」〔J.
ブランドラップ及びE.H.イマーグート編（Ed.J.Brandru
p and E.H. Immergut）（第１版,1967年，インターサイ
エンス社刊（Interscience））〕から抜粋すると以下の
ようになる。

溶解度 ×10²（cm³） ポリテトラフルオロエチレン（PTFE） 0.276 PTFE以外のフッ素樹脂 0.2以上（変動あり） ポリメタクリル酸エチル 8.6 ポリスチレン 18.2（計算値） ポリ酢酸ビニル 6.3 ポリ塩化ビニル 2.92 ポリカーボネート 0.51 ポリ（４−メチルペンテン−１） 24.3 ポリイソプレン 10.3 ポリクロロプレン 7.5 ポリ1,3−ブタジエン 9.7 シリコンゴム 31.1 本発明において使用される電極基板として好ましいもの
は、プロトテック社（米国，マサチューセッツ州）から
プロトテック（Prototech）の商標名で市販され、燃料
電池の電気触媒型気体拡散電極として使用されている一
連の材料がある。これらの材料の調製法は前出の米国特
許第4,044,193号、同第4,166,143号、同第4,293,396
号、および米国特許第4,478,696号に詳述されており、
これらの参照文献まで入手できれば完璧である。概要を
述べると、粒径50〜300Å（５〜30nm）カーボン粒子表
面に粒径15〜25Å（1.5〜2.5nm）のコロイド状白金が吸
着されたものであり、この吸着の様式はたとえばカーボ
ン粒子自身が核形成剤となってその場ですぐに白金ゾル
が形成されるといったものである。

次にこの白金被膜付きカーボン粒子は、合成樹脂バイン
ダーを使用してカーボン紙等の導電性支持体上に成形さ
れる。このとき、上記合成樹脂バインダーがフッ素樹
脂、特にポリテトラフルオロエチレンであればなお好ま
しい。

また別の技術として、白金被膜付きカーボン粒子を予め
成形された多孔質カーボン布に含浸させ、フッ素樹脂，
特にポリテトラフルオロエチレンを用いて結合させたも
のが前出の米国特許第4,293,396号に開示されている。
これに対し、本発明において使用される材料はプロトテ
ックに限られず、白金被膜付きあるいはパラジウム被膜
付きカーボン粒子が樹脂結合剤を使用して成形された類
似の材料も含むものである。特に、米国特許第4,229,49
0号に開示されている燃料電池の電極のような材料、す
なわちポリテトラフルオロエチレン等の撥水性樹脂を含
浸させたカーボン紙を支持体とし、この上にスクリーン
印刷等により白金黒とカーボン粒子あるいはグラファイ
ト粒子との均一混合物にやはりポリテトラフルオナエチ
レン等の撥水性の樹脂をバインダーとして混入した触媒
層が形成されたものも使用できるものと思われる。

上述のような樹脂バインダーを有する白金被膜付きある
いはパラジウム被膜付き炭素基板の表面に酵素を固定化
する方法としては、カルボジイミドやカルボニルジイミ
ダゾールを介した共有結合法、1,6−ジニトロ−3,4−ジ
フルオロベンゼン（DFDNB）を介した共有結合法、グル
タルアルデヒドを利用した架橋法等を始めとする従来公
知のあらゆる方法を採用することができる。

一例として、グルコースオキシダーゼの固定化の手順を
以下に示す。

A.カルボジイミド処理 1.プロトテック電極用シートから適当な大きさの電極を
切り出す。

2.切り出した電極を約５分間エタノールに浸漬し、ポリ
テトラフルオロエチレンでコーティングされたバインダ
ーや裏打ち層に十分に含浸させる。

3.電極をエタノールから引き上げ、エタノールが残存し
ないよう蒸留水で完全に洗浄する。

4.1−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリノ）カル
ボジイミドのｐ−メチルトルエンスルホン酸塩を0.1M酢
酸緩衝液（pH4.5）中に0.15M濃度に溶解した溶液5ml
（あるいはこれ以下）を用意し、上記電極をこの溶液中
に室温にて90分間浸漬する。このときシェーカーを利用
して穏やかに震盪しても良い。電極が溶液表面に浮き上
がって良く浸漬しなかった場合には、以上の処理を上記
操作２から再度繰り返す。

5.電極を引き上げ、蒸留水で完全に洗浄する。次にグル
コースオキシダーゼを5.0mg/mlの割合でpH5.6の酢酸緩
衝液に新しく溶解し、この溶液中に上記の電極を室温に
て90分間浸漬し、穏やかに震盪する。

6.酵素溶液から電極を引き上げ、0.1M酢酸緩衝液で完全
に洗浄する。これで電極は完成である。

7.電極の保存は、0.1M酢酸緩衝液（pH5.6）中、４℃で
行う。

B.カルボニルジイミダゾール処理 1.上記操作１を行う。上記操作２および操作３は省略す
る。

2.N,N'−カルボニルジイミダゾールを無水ジメチルホル
ムアミドに40mg/mlの割合で溶解する。

3.この溶液中に上記電極を室温にて90分間浸漬する。必
要があれば穏やかに震盪する 4.電極を引き上げ、余分のカルボニルジイミダゾール溶
液を乾燥除去する。次に、この電極を新たに調製したグ
ルコースオキシダーゼ溶液に90分間浸漬する。

5.上記操作６および操作７を行う。

C.DFDNB処理 1.上記Ａの操作１ないし操作３を行う。

2.電極を0.1Mホウ酸ナトリウム溶液（pH8.5）で完全に
洗浄する。

3.1,6−ジニトロ−3,4−ジフルオロベンゼンをメタノー
ルに0.1021g/5mlの割合で溶解する。この溶液中に電極
を室温にて10分間浸漬する。

4.電極を引き上げ、ホウ酸ナトリウム溶液で完全に洗浄
する。次に、この電極をグルコースオキシダーゼ溶液に
室温にて90分間浸漬する。

5.上記操作６および操作７を行う。

かかる固定化の工程には、他にも種々の鎖長を有する二
官能基系の試薬を使用することができ、たとえばジメチ
ルマロニミデートやジメチルスベリミデートといったジ
ミデート類が用いられる。

また、酵素の種類によっては、架橋法等によらなくとも
樹脂バインダーにより固着された白金被膜付きあるいは
パラジウム被膜付きカーボン粒子の支持体の上に単に酵
素を吸着させるだけでも有効であることがわかってお
り、グルコースオキシダーゼを用いて確かめられてい
る。

固定化酵素の表面の層は通常ポリカーボネート等の適当
な多孔質の保護フィルム若しくは保護膜を設けることに
より物理的に保護することができる。もっとも上記の保
護フィルム・保護膜は、定量されるグルコース等の酵素
基質を透過させ得るものでなければならないことは言う
までもない。これらの保護膜を設けるとセンサの応答速
度がやや遅くなるので、その点不利といえなくもない
が、本発明にかかる酵素電極あるいはバイオセンサの応
答速度はかかる保護膜が設けられていても従来の酵素電
極の応答速度と同等か、もしくはそれ以上である。

上述したように、本発明はグルコースオキシダーゼを固
定化酵素とするグルコースオキシダーゼ電極を念頭にお
いたものであるが、他の酸化還元酵素（オキシドリダク
ターゼ）を使用することも無論可能である。しかし、他
の酸化還元酵素を使用した場合には常に本件と同等の効
果を挙げられるとは限らない。これは、それらの酵素が
本来無効であるからでは必ずしもなく、別の要因による
ものである。たとえば、シュウ酸オキシダーゼを用いて
シュウ酸の定量を行う場合、基質であるシュウ酸自体が
電極基板上で電気化学的に酸化されて、酵素作用の大部
分をマスキングしてしまう。

しかし、ラクテートオキシダーゼ、ガラクトースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の過酸化物生成
酵素は好適である。

また、複合酵素系も可能であり、たとえば第一の基質に
作用してオキシダーゼのための第二の基質を生成する非
オキシダーゼと、上記第二の基質に作用して第一の基質
の濃度に比例した電流を発生させるオキシダーゼとを組
み合わせた系が考えられる。このような組み合わせの例
としては、β−ガラクトシダーゼとグルコースオキシダ
ーゼからなる二酵素系（ラクトース定量用）、β−グル
カン分解酵素とβ−グルコシダーゼとグルコースオキシ
ダーゼからなる三酵素系（β−グルカン定量用）、イン
ベルターゼとムターゼとグルコースオキシダーゼからな
る三酵素系（シュクロース定量用）等がある。

さらにセンサの別の応用形態としては、まず前駆体反応
により第一の基質に作用し、その生成物を本発明にかか
る酵素電極の基質とするような試薬（酵素であってもな
くても可）やプロセスを利用するものも可能である。

このような前駆体反応の例は免疫反応の分野に多く見ら
れるものである。免疫センサも含めた各種センサを構築
するうえで、上述のような反応に基づく酵素電極を使用
することは、当業者であれば容易であろう。

しかしながら本発明にかかる酵素電極は、特に血液，血
清，血漿，尿，汗，涙，唾液等の臨床試料中に存在する
グルコース等の還元性基質を検出または定量するための
バイオセンサとしてまず適用されることを念頭においた
ものである。

非臨床分野への応用としては、次のようなものが考えら
れる。

（ａ）醗酵過程の監視 （ｂ）産業工程管理 （ｃ）環境モニタリング、即ち排ガスや排液による汚染
の管理 （ｄ）食品検査 （ｅ）獣医学的応用、特に上述の臨床的応用に類似する
もの 本発明にかかる酵素電極材料を採用しているバイオセン
サ等の各種センサにおいては、その他の構造部材、電
線、非導電（絶縁）支持体やプローブ等に従来公知のも
のを使用することができ、詳述するまでもない。しかし
敢えて言うならば、電極材料は一般に紙製の薄手シート
かウェハである。バイオセンサの場合は、絶縁支持体あ
るいはプローブの上に電極材料が搭載され、サンプル中
に浸漬できるようになっているのが普通である。このよ
うな場合の電極材料の大きさは実際には非常に小さく、
数平方mmを越えることはまずない。電極材料との電気的
接触はいろいろな方法でとることができ、たとえばこの
電極材料を白金や銀等の適当な導電体からなる電気接点
や端子と対向接触させることが考えられる。

この場合、電極材料はそれを保持するための絶縁支持体
や担体が無くとも自立できる程度に十分な厚みと強度を
有することが必要であり、電線は該電極材料の表面に直
接接続される。

支持体としては、カーボン紙以外にも電界効果トランジ
スタ等の半導体面や非導電性面等を使用することができ
る。後者を使用する場合には、電気的接続は白金族元素
の被膜を有する樹脂バインダー入りカーボン粒子層ある
いはグラファイトの層に対して直接に行われる。

〔実施例〕

以下の例において、本発明にかかる酵素電極材料の調製
と性質を説明する。

例１（比較例となる従来技術） まず、酵素電極を従来技術にしたがっで作成した。すな
わち、公称粒径30nmのカーボンブラック粒子（バルカン
XC−72）を市販のグラファイト化カーボン紙上に10重量
％のポリテトラフルオロエチレンをバインダーとして塗
布した多孔質カーボン紙を導電性基板とし、この上に電
解析出法により白金薄膜（厚さ１μｍ未満）を形成し
た。このような白金被膜カーボン紙を各種調製した。

次に、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus nige
r）由来のグルコースオキシダーゼを前述のカルボジイ
ミド処理およびグルタルアルデヒド架橋により固定化し
た。すなわち、白金被膜を施した電極表面をまずグルコ
ースオキシダーゼの水溶液で処理した後、乾燥させ、析
出したグルコースオキシダーゼを室温（25℃）にてグル
タルアルデヒドで架橋した。

この電極材料を直径2mnのディスク状に切り抜き、試験
用の試料とした。

例２（グルコース電極） プロトテック社（米国，マサチューセッツ州）から「プ
ロトテック」（Prototech）の商標名で市販されている
プラチナ被膜付きカーボン紙上に、アスペルギルス・ニ
ジェール（Aspergillus niger）由来のグルコースオキ
シダーゼを固定化した。ここで、上記白金被膜付きカー
ボン紙に使用されている白金被膜付きカーボン粒子（バ
ルカンXC−72）は、前出の米国特許第4,044,193号の実
施例１に開示されている如く、過酸化水素による白金
（II）亜硫酸錯体の酸化的分解によりコロイド状白金
（粒径1.5〜2.5nm）をカーボン粒子（公称粒径30nm）の
表面に析出させたものである。このカーボン粒子は、さ
らに市販のグラファイト化カーボン紙の表面に約50重量
％のポリテトラフルオロエチレンを使用して成形・結合
されている。最終的な白金含量は0.24mg/cm²（カーボン
粒子に対して7.5〜10重量％）である。

このようなプロトテック電極を各種調製し、これらの上
に前述の各種の方法、すなわちカルボジイミド処理、カ
ルボニルデイミダゾール処理あるいはDNDFB処理により
グルコースオキシダーゼを固定化した。

上述の電極の他、グルタルアルデヒド架橋あるいは単な
る吸着によりグルコースオキシダーゼをプロトテック電
極に固定化したものも作成した。後者の場合は、グルコ
ースオキシダーゼを酢酸緩衝液（pH5.6）に5.0mg/mlの
割合で新たに溶解し、この溶液中にプロトテック電極を
室温にて90分間浸漬した。またこのような方法によらな
くとも、電極基板を酵素溶液中に浸漬して陽極とし、60
分間の電気泳動を行って酵素を簡便に吸着させることも
できる。

例３ 予め白金被膜を施したカーボン粒子層をポリテトラフル
オロエチレンをバインダーとしてカーボン紙上に成形し
た（前出の米国特許第4,044,193号）プロトテック白金
被膜カーボン紙上に、前述のカルボジイミド処理により
次に挙げる酵素を固定化した。

ラクテートオキシダーゼ ガラクトースオキシダーゼ グルコースオキシダーゼ／β−ガラクトシダーゼ 従来技術と比較した本発明の利点および酵素電極材料の
性質を明らかにするため、上述の各例で作成された各酵
素電極を改良型ランク酸素電極システム〔ランク・ブラ
ザース社（Rank Brothers）ボティシャム，ケンブリッ
ジ（Bottisham,Cambridge）〕を搭載したセルにセット
し、電流応答特性を調べた。このシステムは、添付図面
およびアナリティカ・キミカ・アクタ，（Analytica Ch
imica Acta）（183巻,59〜66ページ,1986年）に図示さ
れているとおりである。本システムにおいては、その膜
の代わりに本発明にかかるカーボン紙を支持体とする酵
素電極（直径5mm）が採用されており、この酵素電極は
さらにボタン型の白金電極に支持されている。対極（白
金箔）はセルのカバーを通して挿入し、また参照電極と
して銀−塩化銀電極を使用した。これとは別に、対極と
参照電極とを酵素電極を取り巻く塩化銀のリングとして
一体型に構成した二電極系の実験も行った。この場合、
保護膜を新たに設けるが、攪拌装置は設けない。通常
は、試験に使用するpH7.0の緩衝溶液は磁気攪拌装置に
より攪拌し、作用電極の電位はポテンショスタットを用
いて参照電極に対して600mVとなるように設定する。但
し、二電極系の場合はこの電位を325mVとした。電流の
バックグラウンド値が低くなるまで十分に待ってから、
基質溶液をシリンジから注入した。

電流応答はチャートに記録した。

以下、この実験結果を図面を用いて詳述する。ここで、
図面の内容は以下のとおりである。

第１図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極と
従来型の炭素電極材料を使用したグルコースオキシダー
ゼ電極の電流応答特性を比較して示す特性図である。

第２図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の
安定性を示す特性図である。

第３図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の
電流応答特性とグルコース濃度との関係を示す特性図で
ある。

第４図は酸素圧を変化させた場合の本発明にかかるグル
コースオキシダーゼ電極の電流応答特性の変化を示す特
性図である。

第５図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極を
室温で保存した場合の安定性を示す特性図である。

第６図は比較例として従来技術にかかるグルコースオキ
シダーゼ電極を室温で保存した場合の安定性を示す特性
図である。

第７図は本発明および従来技術にかかるグルタルアルデ
ヒド架橋型グルコースオキシダーゼ電極の電流応答特性
を比較して示す特性図である。

第８図は本発明および従来技術にかかるカルボジイミド
処理型グルコースオキシダーゼ電極の電流応答特性を比
較して示す特性図である。

第９図は本発明および従来技術にかかるカルボジイミド
処理型ラクテートオキシダーゼ電極の電流応答特性を比
較して示す特性図である。

第10図は本発明にかかるガラクトースオキシダーゼ電極
の電流応答特性を示す特性図である。

第11図は本発明にかかるラクテートオキシダーゼ電極の
電流応答特性を示す特性図である。

第12図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ／β−
ガラクトシダーゼ複合電極の電流応答特性を示す特性図
である。

第13図は白金被膜付きカーボン粒子に対するバインダー
としてポリテトラフルオロエチレンの代わりにポリ酢酸
ビニルを使用した本発明にかかるグルコースオキシダー
ゼ電極の電流応答特性を示す特性図である。

第14図はポリテトラフルオロエチレンをバインダーとし
てカーボン紙上に形成されたパラジウム被膜付きカーボ
ン粒子層の上にグルコースオキシダーゼが固定化されて
なる本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の電流
応答特性を示す特性図である。

第15図は本発明にかかる酵素電極の動作特性を測定する
ための改良型ランク電気化学セルの概略断面図である。

第16図は一部の測定で使用された二電極系の実験装置を
示す概略断面図である。

上記のデータの多くは第15図に示す電気化学セルを使用
して得られたものである。このセルは基台（１）、およ
び貯水室（ｈ）を内蔵し水を循環させることによりセル
の温度を制御する環状ジャケット（２）という２つの主
要部から構成されており、これら両者はねじを切った専
用の継輪（３）で互いに連結される。上記基台（１）の
中央には白金接点（ｄ）があり、この上に酵素を固定化
したカーボン紙電極の試験用ディスク（ａ）が置かれ
る。この試験用ディスク（ａ）は、上記２つの主要部が
組み合わされた時にゴム製のＯリング（ｅ）および
（ｆ）により定位置に固定される。

酵素溶液を満たしたセルの頂部からは可調整継輪（ｇ）
の付いたストッパ（４）が挿入され、該ストッパ（４）
を貫いて白金製の対極（ｂ）および銀−塩化銀参照電極
（ｃ）が装着される。すでに述べたように測定時には作
用電極の電位を600mVに調整し、電流出力は基質溶液と
接触する電極の見掛けの表面積を0.14cm²として測定し
た。測定結果は、上述の各特性図において電流密度、す
なわち基質と接触している電極（ａ）の単位面積当たり
の電流出力として表した。

第16図に示す構成では、白金接点（Ｂ）は絶縁スリーブ
（Ｇ）を介して参照／対極複合電極（Ｃ）に囲まれてい
る。Ｏリング上に装着された多孔質ポリカーボネート膜
は試験用ディスク（Ｅ）（酵素が固定化されたカーボン
紙電極）を上記白金接点上に正しく保持するためのもの
である。試料室（Ｆ）は開放型となっており、ポリカー
ボネート膜上に試料が滴下できるようになっている。作
用電極の電位は325mVに設定し、電流はポテンショスタ
ット（Ａ）により検出される。作用電極の電位を325mV
とする二電極系は、同電位を600mVとする三電極系より
も使い易さおよびバックグラウンド電流値の低い点で優
れている。しかしどちらの電極系を選択しても、本発明
にかかる酵素電極の保存安定性，動作安定性，応答の直
線性，酸素濃度依存性等の諸特性に大きな差は現れな
い。

以下に、本実験の結果をさらに詳しく述べる。

電流応答特性の直線性および時間依存性 第１図は、攪拌装置付きの三電極系において連続的にグ
ルコースを添加し、最終濃度を35mMまでの範囲で変化さ
せた場合の電流応答特性の一例を示したものである。電
極A,B,およびＣはいずれも前述の方法Ａによりグルコー
スオキシダーゼが固定化されているものであり、電極Ａ
は本発明にかかる白金被膜付き活性炭素支持体、すなわ
ち、白金被膜付きカーボン粒子がポリテトラフルオロエ
チレンをバインダーとしてカーボン紙上に塗布されてい
る電極材料（商標名：プロトテック）、電極Ｂはグラフ
ァイト棒を輪切りにした導電性支持体、電極Ｃは白金被
膜を有しない市販のカーボン紙を切り取って作成した導
電性支持体からそれぞれなるものである。この図をみる
と、電極Ｂおよび電極Ｃの電流応答は全体的に低レベル
で変動が少なく、従来の文献によくみられるメディエー
タ型電極の結果に近いものである。これに対し電極Ａの
電流応答はより信頼性が高く安定しており、応答時間は
約１秒である。（ここで、応答の初期にシグナルの頭に
みられる鋭い突起はグルコースの注入操作に起因するも
のであって特に重要な意味は持たない。平坦部がグルコ
ース濃度に依存するシグナルとしての意味を持つ部分で
ある。）これら３種類の電極の電流応答は、第２図に示
すようにいずれもグルコース濃度に対して高い直線性を
示した（但し、第２図には電極Ａと電極Ｃの結果のみを
示す）。したがって、たとえばグルコースの血中濃度を
直接測定する場合等の適用濃度範囲が広くとれるように
なる（０〜30mM）。

この電極Ａにおけるグルコースオキシダーゼが前述のＢ
の方法により固定化された場合にも同様の結果が得られ
ることから、この方法によれば一層広い濃度範囲にわた
り良好な直線性が実現されることが示唆される。

第２図から明らかなように、電極Ａの応答特性は23日後
でも事実上変化しなかったが、他の電極（図には電極Ｃ
のみ示す。）の応答特性は時間とともに劣化した。同様
の挙動は前述の他の酵素固定化方法を採用した場合にも
みられ、いずれの方法によっても電極Ａと同じ活性炭素
材料を使用した場合には応答性に優れかつ安定性の高い
電極が得られたが、不活性炭素材料を使用した場合には
良好な電極は得られなかった。また電極Ａの応答時間は
23日間不変であったが、他の電極は初期の応答時間が23
〜30秒であったのに対し、８日後には２〜３分に延び
た。電極Ａのような活性型電極も一般に第１日目で若干
の応答性の低下を起こすが、その後は安定し、経時変化
はほとんどみられない。さらに、電極Ａの応答特性はpH
5.6の緩衝液中に４℃で６ヶ月以上保存した後でも最初
の数日間はほとんど変化しなかった。６ヶ月以降は徐々
に応答特性が低下するものの、12ヶ月後にも初期値の70
％の応答性が維持されていた。

以上、第１図および第２図は、第15図に示すような三電
極系において作用電極の電位を600mVとした場合の酵素
電極の電流出力をμA/cm²の単位で示したものである。

第５図は上記電極をさらに長期間保存し、安定性を調べ
た結果を示すものである。すなわち、カルボジイミド処
理により酵素を固定化したグルコースオキシダーゼ電極
を室温にてpH5.6の酢酸緩衝液中で180日間保存した後、
5mMのグルコースを基質として応答特性を調べた。比較
のため、従来技術にかかる電極（例１）の結果を第６図
に示す。第５図の結果は三電極系において作用電極の電
位を600mVとした測定から得られたものであり、第６図
の結果は二電極系において作用電極の電位を325mVとし
た測定から得られたものである。

さらに第７図乃至第９図には、使用する酵素およびその
固定化方法の異なる各種の電極を使用して従来技術（例
１）と本発明の比較を行った結果を示す。これらの測定
はすべて二電極系，作用電極電位325mVにて行った。

第10図乃至第12図には、ガラクトース，ラクテート，ラ
クトースをそれぞれ基質とする場合の応答特性を示す。
これらの測定はすべて三電極系，作用電極電位600mVに
て行った。

電極の再利用：繰り返し測定の可能性 本発明にかかる酵素電極は、連続的に基質が供給されて
いる間はいずれもこれまでの電極では達成できなかった
長寿命を有している。このことは、以下の一連の厳密な
試験により実証された。

まず、グルコースオキシダーゼ電極（例２）をグルコー
ス溶液を満たした攪拌装置付きの密閉型セルにセット
し、初期濃度5mM,初期電流100μＡとして電流を検出さ
せた。この状態で電極を連続18時間使用すると、シグナ
ルは徐々に低下して10μＡ以下となる。検出された電流
の積算値は、１分子のグルコースから２個の電子が生成
するとして理論的に算出される値の約75％である。

同じ電極に対してグルコース溶液を交換して上記実験を
直ちに繰り返すと、初期電流の値が回復し、連続的に供
給される基質も同様に減少した。

また、ある連続実験では、大型の貯液槽から連続的に溶
液を循環させることによってグルコース濃度を5mMに維
持し、電流の発生をさらに5.7日間持続させた。100時間
の間に電流出力は徐々に低下して45μＡに落ち着き、こ
の状態が40時間続いた。これは、しっかり結合されてい
なかった酵素が電極基板からこの期間中に脱落したか
（ただし、電流出力と攪拌速度の間には相関はみられな
かった。）、あるいは他の要因が働いた結果であると考
えられる。

上記の長期試験を行った後、前述の方法にしたがってあ
るグルコース濃度範囲における酵素電極の電流応答特性
を測定した。信号増幅度は新しい基質溶液を使用した場
合に比べて低かったものの、０〜30mMのグルコース濃度
範囲において非常に鋭敏な階段状の変化を示し、この酵
素電極は一定の基質濃度のもとで長期間使用した場合に
も電流応答特性が劣化しないことが確認された。この結
果は、上記酵素電極を４℃にて１週間保存した後,8週間
保存した後，あるいはさらに4.7日間一定の基質濃度下
で使用するという３通りの実験によっても確認され、い
ずれの実験においてもグルコース濃度による応答特性の
変化はみられなかった。

これらの試験結果から、この酵素電極は少なくとも合計
250時間（15,000分以上）は使用でき、あるいは極めて
長寿命を有していることがわかる。従来技術における酵
素電極の動作寿命は本発明にかかる酵素電極の寿命より
も遥かに短かく、多くの場合それはわずか数時間である
〔ターナー（Turner）「プロシーディングス・オブ・バ
イオテクノロジー（Proceedings Biotech）」（85巻,19
85年，（ヨーロッパ）（Europe），オンライン・パブリ
ケーションズ，ピナー，（Online Publications,Pinne
r）英国,181-192ページ〕。たとえば、フェロセンとカ
ップリングさせたグルコースオキシダーゼを使用したグ
ルコース電極の半寿命は一般に24時間程度であり（ター
ナー，前出）、キャス等（Cass et al）〔アナリティカ
ル・ケミストリー，（Analyt.Chem.）第56巻,667〜673
ページ,1984年〕（前出）は同じ電極で安定に50時間使
用できるものを発表している。この電極は、50mM濃度の
グルコース溶液について50回の連続測定行っても標準偏
差は１％以下であった。

連続測定への適用性 上述の繰り返し使用試験で確認された最終的な応答信号
レベル（5mMのグルコース溶液について45μＡ）はグル
コース溶液を曝気しても変化せず、また数週間保存した
後でも変化しなかった。

この電極の電流出力は、細菌汚染によるグルコース濃度
の低下を生じさせないような条件下で滅菌されたグルコ
ース溶液を使用して測定を行った結果、12時間は安定に
取り出せることが確認された。このときの信号レベルは
測定期間全般にわたって一定であった。この電極は数日
間にわたって攪拌あるいは循環させた溶液中で「コンデ
ィショニング」を行っており、このことが好結果をもた
らしたと言える。このように、電極のコンディショニン
グあるいは洗浄を適切に行えばグルコースの連続測定も
可能である。

バッチ内における再現性 清浄で適切な作成条件が整ってさえいれば、本発明にか
かる酵素電極は繰り返し使用に耐え、グルコースに対し
て高い応答性を示す。同じ方法で同じ大きさの電極を何
組も作成したところ、それらの性能は非常に近似してお
り、同一条件下で電流応答特性を測定しても数％の誤差
しか生じなかった。さらに、このようにして作成された
電極はすべて、上述のように従来の電極と比べて寿命が
非常に長くまた高い信頼性を有していた。本発明にかか
る電極は保存中にも性能が変化せず、何週間にもわたっ
て使用できるのに対し、従来の電極は単一のバッチ内で
も性能がばらついていることが多い。たとえば前出のタ
ーナーは、１バッチ内には半寿命が600時間にも及ぶよ
うな極めて寿命の長いグルコースオキシダーゼ電極がご
く少数あるが、大多数の電極の半寿命は24時間と短いと
述べている。したがって、これらの電極を24時間を大幅
に上回って使用しても信頼性は保証できない。

電流応答性能の酸素濃度依存性 溶存酸素の影響を調べるため、試験用セルを改良し、グ
ルコース電極に加えて新たに酸素電極を設けた。一連の
実験では、アルゴンを吹き込むことにより溶存酸素を系
外へ除去した。このような条件下では上述の電極Ａはグ
ルコースの添加に対して鋭敏に応答し、この応答機構は
溶存酸素濃度にはほぼ依存せず、むしろ適切な酵素固定
化方法とあいまった電極の表面構造に特有の性質に起因
していることが示唆された。このような結果は過去に報
告されていない。

さらに、前述の方法Ａにより作成した電極Ａの電位を60
0mVに設定し、連続的にアルゴンを吹き込みながら出力
信号を測定する実験を行った。このとき、試料中の酸素
濃度も同時に測定した。

この結果を第４図に示す。この図をみると、電流信号
（上のグラフ）はほぼ一定しており、実質的に試料中の
酸素濃度（下のグラフ）には依存していないことが明ら
かである。また別の実験により、この電流信号は酸素濃
度が急速に低下しても10分間はほとんど変化しないこと
が確認された。これに対し前述の方法Ｂにより作成した
電極Ｂでは３分間に５％以内の電流信号の低下が生じ、
この間に酸素濃度が90％減少していた。この場合、酸素
を再び系内に導入すると比較的ゆっくりではあるが電流
応答が回復した。アルゴンの吹き込みを続けるとこれら
の電極は限られたグルコース濃度範囲でしか働かなくな
ることから、基質から水素を抜き取るという酵素機能の
一部を発現させるためには極微量の酸素が必要であるも
のと思われる。また、酵素電極では検出できないほど微
量の酸素が電極に吸着されて何らかの役割を担っている
可能性も否定できない。

酵素の固定化量 グルコースの減少速度と最大電流密度をそれぞれ測定し
た結果、電極Ａに失活せずに固定化された酵素の量は電
極表面積１cm²当たり約７μｇの活性酵素が固定化され
ているに等しいことがわかった。（バイオセンサにおけ
るグルコースオキシダーゼの固定化量を論じた文献は過
去にもほとんどない。）上述の各固定化方法では、酵素
溶液を10倍以上に希釈してもなお非常に活性の高い電極
が作成できることがわかった。

電流応答特性の温度依存性 グルコース濃度範囲を０〜30mMとし、電極Ａの電流応答
特性を10〜37℃の温度範囲で調べた。温度係数は１℃当
たり２〜３％であった。これは、アーレニウスの活性化
エネルギー（約24kJ/モル）に対応している。これに対
し、フェロセンとカップリングさせたバイオセンサ（前
出のキャス等による文献参照）では温度係数は１℃あた
り４％と報告されている。

pH依存性 電流応答性のpH依存性は若干認められたが、pH7.0〜8.0
の領域ではグルコース濃度が非常に高い場合（25mM以
上）を除いて実質的にpH依存性は無いとみて良い。

保護膜を有する電極の電流応答特性 溶液攪拌を伴う実験系では、ポリカーボネート膜が信号
波形と大きさにはほとんど影響を与えずに使用できるこ
とがわかった。溶液攪拌を行わない系では応答時間は約
20秒であった。

全血試料分析への応用 ポリカーボネート保護膜を有する電極は、グルコースの
血中濃度の直接測定に好適であった。5mM濃度のグルコ
ース溶液について測定した場合、0.2mMのアスコルビン
酸により妨害された信号は2.5％であった。

各種分析用バイオセンサへの応用 本発明にかかる酵素電極を改良型クラーク電極を使用し
たランク型セルに適用して好結果が得られたことは上述
のとおりであるが、プローブのような他の応用形態にお
いても非常に良い結果が得られることがわかった。

一例として、上記電極を電線に接続してガラス管に封入
し、従来一般的に用いられているような直径2mmのプロ
ーブを作成した。ビーカー等の容器にグルコースの被検
液を入れて攪拌し、この中に上述のようなプローブを参
照電極および対極と共に挿入すると、溶存酸素を除去し
なくても信頼性の高い濃度測定を行うことができる。上
記プローブ、あるいは同じ構造のこれよりさらに小型の
プローブを用いて測定を行ったところ、グルコース濃度
が同じであれば電流応答性はおおよそ電極の見掛けの面
積あるいは重量に比例することがわかった。

さらに小型化（面積約0.25〜0.50mm²，重量30〜60μ
ｇ）した電極と使用したプローブも作成した。ここで電
線の接続部はプラスチック製のスリーブで覆い、このプ
ローブを直径1.5mmのカテーテル針に組み込んだ。この
カテーテル針は、ゴム製のシールを貫通して被検液の入
った醗酵槽，廃液溜め等の容器に挿入し、液中のグルコ
ース濃度を測定するプローブ型センサーとして使用する
ことができる。このような構成をとると、挿入時には電
極がカテーテル針で保護されているうえ、カテーテル針
を清浄に保つこともできる。

上述のような小型電極からは通常１〜10μＡの電流信号
が取り出されるが、装置の工夫次第では１〜100nAの範
囲で精密な測定をすることも可能である。このような範
囲の信号電流を取り出す酵素電極は非常に小型なものと
なる（面積約0.005mm²，重量１μｇ）ため、生体測定で
使用されているような細い針型のマイクロプローブ等に
組み込んで使用する。

本発明にかかる酵素電極の動作機構については必ずしも
明らかでないが、実験結果からある程度の結論を引き出
すことはできる。

これまでに、高温下で表面酸化を行って炭素の表面に形
成された活性基が酵素の固定化の場合と同様な架橋反応
に関与し、このような表面基の数および種類は白金（あ
るいはパラジウム等の白金属元素）が薄層型の表面触媒
として存在すると増加することが知られている〔木下お
よびストンハート（Stonehart）「モダン・アスペクツ
・オブ・エレクトロケミストリー（Modern Aspects of
Electrochemistry）」（No.12,ボックリス−コンウェイ
共編（Ed. Bockris and Conway），プレナム・プレス
（Plenum Press）社刊，ニューヨーク,183-266ページ,1
977年〕。固定化方法が異なれば酵素の結合状態が異な
るのは明らかである。たとえば、これまでに報告されて
いるところでは酵素中の様々なアミノ酸残基が固定化に
利用されている例が多いが、塩化シアヌルで活性化され
た材料と酵素とが結合される場合には、酵素のリジン残
基のみが固定化に利用されることが知られている（前出
のイアニエロおよびヤシニッチ「アナリティカル・ケミ
ストリー」53巻,2090〜2095ページ,1981年参照）。固定
化に起因する酵素の三次構造の変化もすべての固定化方
法について同じとは考えられず、このような多様性がこ
の種の研究において酵素活性および安定性に大きな差異
を生ずる原因となっているものと思われる。

本発明で使用した電極基板材料は、例えば前出の日本国
特開昭56−163447号公報に開示されているような積層型
の均一な材料とは違って極めて不均一な性質を有してい
る。このことは、それだけ架橋構造に多様性をもたら
し、三次元構造にも様々な配向が現れる可能性を高める
ものである。架橋剤を使用しない場合でも、表面吸着は
強く現れる。このような炭素質基板の空孔には酸素が入
り込むことができ、酵素の表面積を広げ、安定性および
活性に支障をきたさない立体配座をとらせるのに役立
つ。この点は、白金，ガラス状カーボンあるいはグラフ
ァイトといった比較的平坦ではるかに表面積も小さい面
上に酵素が結合されており、結果として酵素のとり得る
立体配座が制限されているような従来の結合様式との大
きな違いである。しかも、本発明にかかる酵素電極の応
答性は１〜２秒と極めて速く、酵素活性の高いことはも
ちろん、電極自身に電子受容部位が多く存在することに
より電子移動が極めて速やかに行われていることを物語
っている。このことは、微細構造中の非常に広い面積に
わたって白金被膜付きカーボン粒子が高密度に存在し、
表面の白金と酵素の活性部位とが首尾良く接近できるよ
うになっているためである。

本発明にかかる酵素電極において、樹脂バインダーの量
がどのような影響を及ぼすか、他の樹脂がバインダーと
して利用できるか否か、また他の白金属元素が適用でき
るか否かを検討するため、樹脂バインダーの量を変えた
グルコースオキシダーゼ電極、バインダーとしてポリ酢
酸ビニルを使用したグルコースオキシダーゼ電極、ある
いは白金族元素としてパラジウムを使用したグルコース
オキシダーゼ電極を作成した。

樹脂バインダーの量に関しては、本発明者等が実際に30
〜70重量％（白金族金属と均一に混合されるか、あるい
は該白金族金属が個々の粒子表面に析出または吸着され
たカーボン粒子，グラファイト粒子を基準とした値。）
の範囲について実験を行った。

ポリテトラフルオロエチレンが30重量％の場合、4.8ミ
リモルのグルコース濃度に対する電流出力は106μＡで
あり、グルコース濃度33.3ミリモルでは589μＡに上昇
した。一方、ポリテトラフルオロエチレンが70重量％の
場合、4.8ミリモルのグルコース濃度に対する電流出力
は65μＡまで低下し、グルコース濃度が33.3ミリモルで
も330μＡまでしか上昇しなかった。

このように樹脂バインダーの量を増すと電流出力が低下
することについては二つの原因が考えられる。第一に
は、疎水性のバインダーの量が増すと電極自体の疎水性
も高くなり、被検溶液に対する濡れが低下するためであ
る。第二には、ポリテトラフルオロエチレンは非導電体
であるため、その量を増すと電極の導電性が低下して出
力信号が弱くなるためである。

また、バインダーとしてポリ酢酸ビニルを使用したグル
コースオキシダーゼ電極については、グルコースオキシ
ダーゼの固定化方法として前述の方法Ａを採用し、また
上記グルコースオキシダーゼが固定化される白金被膜カ
ーボン紙電極はバインダーとしてポリテトラフルオロエ
チレンの代わりに50重量％のポリ酢酸ビニルを使用した
以外はほぼ前述の例２の方法にしたがって作成した。

この電極の電位を325mVとして同様に改良型ランク電極
システムで測定した結果、第13図に示すようにほぼ直線
的な電流応答特性が達成された。

さらに白金族元素としてパラジウムを使用したグルコー
スオキシダーゼ電極については、グルコースオキシダー
ゼの固定化方法として前述の方法Ａを採用し、また上記
グルコースオキシダーゼが固定化されるパラジウム被膜
カーボン紙電極はコロイド状パラジウムをカーボン粒子
（公称粒径30nm,商標名バルカンXC−72）表面に析出さ
せた後、このパラジムウ被膜付きカーボン粒子に対して
50重量％のポリテトラフルオロエチレンをバインダーと
してこれを導電性カーボン紙上に厚さ0.1mmの薄層に成
形することにより作成した。

このパラジウム被膜カーボン紙電極から直径2mmのディ
スクを切り抜いて第16図に示すような二電極系セルの白
金接点上にセットし、電位を325mVとしてグルコースに
対する応答性を調べた。この結果は第14図に示すとおり
であり、この場合もグルコース濃度に対してほぼ直線的
な応答特性が確認された。

気体拡散電極に使用される白金族元素が互いに非常に類
似した挙動を示すことが前出の米国特許第4,293,396号
等に開示されていることから類推して、本発明にかかる
酵素電極においてもルテニウムやロジウム等の他の白金
族元素が白金やパラジウムの代用となり得るものと考え
られる。

最後に、実用上の意義が大きいと考えられるコレステロ
ール電極，シュクロース電極への応用例について述べ
る。

例４（コレステロール電極） 上述の例２において使用したプロトテック社製の白金被
膜付カーボン紙を、リン酸緩衝液（pH7.4）にコレステ
ロールオキシダーゼ（EC1.1.3.6.）を5mg/mlの濃度に溶
解させた溶液に22℃で３時間含浸させた。

次に、コレステロールオキシダーゼを吸着した上記白金
被膜付カーボン紙を直径1.5mmのディスク状に切り抜い
て電極とし、これを第16図に示すような二電極系のセル
にセットして銀−塩化銀電極に対して340mVの電位に設
定し、コレステロール標準液に対する応答性を調べた。

上記コレステロール標準液は、５％の界面活性剤（トリ
トンX-100、登録商標名）を含むリン酸緩衝液（pH7.4）
にコレステロールを50,100,200mg/dlの割合で添加し、
超音波攪拌後、70℃に加熱することにより調製した。

コレステロールに対する上記電極の応答性は以下の表の
通りである。

例５（シュクロース電極） このシュクロース電極は、３種類の酵素からなり複合酵
素系を適用したものであり、これら酵素は、シュクロー
スをα−グルコースに転換するインベルターゼ、α−グ
ルコースをα−およびβ−グルコースの混合物に転換す
るムターゼ、およびβ−グルコースに作用してシュクロ
ースの初期濃度に比例した出力信号を発生させるグルコ
ースオキシダーゼである。

上述の例２において使用したプロトテック社製の白金被
膜付カーボン紙を、リン酸緩衝液（pH7.0）に以下の酵
素を溶解させた酵素混合溶液に室温で90分間含浸させ
た。

グルコースオキシダーゼ（EC1.1.3.4.）6mg/ml インベルターゼ （EC3.2.1.26.）6mg/ml ムタロターゼ （EC5.1.3.3.）2mg/ml 次に、これらの酵素を吸着した上記白金被膜付カーボン
紙を直径5mmのディスク状に切り抜いて電極とし、これ
を第15図に示すような三電極系のセルにセットして銀−
塩化銀電極に対して400mVの電位に設定し、シュクロー
スを含む水溶液に対する応答性を調べた。なお、上記電
極の被検溶液との接触面積は0.16cm²である。

また、カルボジイミド処理あるいはグルタルアルデヒド
架橋法により上記白金被膜付カーボン紙にこれら３種類
の酵素を同時に固定化して作成した電極についても、同
様の測定を行った。

これら３種類の電極のシュクロース溶液に対する応答曲
線を第17図に示す。

この第17図より、吸着，カルボジイミド処理，グルタル
アルデヒド架橋のいずれを行った場合にもほぼ直線的な
応答性が得られることがわかった。

〔発明の効果〕

本発明は、新規な炭素基板を酵素電極として用い、電極
上にグルコースオキシダーゼ等の酵素をより効果的な方
法で固定化することにより、応答性，安定性の優れた電
流検出型センサを提供することができる。本発明が提供
する改良された酵素電極は、特に所望しない限りメディ
エータを用いなくてもすむほか、非常に低レベルの溶存
酸素の存在下でも機能する。のみならず、10mM濃度のグ
ルコース溶液中１平方cmあたりの電流密度は数百マイク
ロアンペアと、電流応答特性にも優れる。かかる電流応
答特性は従来の電流検出型バイオセンサに比して優れて
いるため、電極面積が1mm以下で０〜100nAの電流出力を
発揮するマイクロプローブ型バイオセンサの製造にも適
している。

当該電極はまた非常に微量の固定化酵素を用いて構成す
ることもできる。すなわち保護膜なしの場合には１〜２
秒、保護膜がある場合には10〜30秒と、従来のいかなる
グルコースセンサよりも速いグルコース応答特性を有す
る。また、この電極は浸漬した状態で保管されれば室温
においても優れた安定性を発揮する。

この電極の応答特性は数ヵ月使用した後でも、優れてい
た。適用濃度範囲は広く、通常よりもかなり低い電位で
も機能し（通常の650mVに対して本電極は325mV）、動作
電位におけるバックグラウンド電流値は非常に低い。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極と
従来型の炭素電極材料を使用したグルコースオキシダー
ゼ電極の電流応答特性を比較して示す特性図である。 第２図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の
安定性を示す特性図である。 第３図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の
電流応答特性とグルコース濃度との関係を示す特性図で
ある。 第４図は酸素圧を変化させた場合の本発明にかかるグル
コースオキシダーゼ電極の電流応答特性の変化を示す特
性図である。 第５図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極を
室温で保存した場合の安定性を示す特性図である。 第６図は比較例として従来技術にかかるグルコースオキ
シダーゼ電極を室温で保存した場合の安定性を示す特性
図である。 第７図は本発明および従来技術にかかるグルタルアルデ
ヒド架橋型グルコースオキシダーゼ電極の電流応答特性
を比較して示す特性図である。 第８図は本発明および従来技術にかかるカルボジイミド
処理型グルコースオキシダーゼ電極の電流応答特性を比
較して示す特性図である。 第９図は本発明および従来技術にかかるカルボジイミド
処理型ラクテートオキシダーゼ電極の電流応答特性を比
較して示す特性図である。 第10図は本発明にかかるガラクトースオキシダーゼ電極
の電流応答特性を示す特性図である。 第11図は本発明にかかるラクテートオキシダーゼ電極の
電流応答特性を示す特性図である。 第12図は本発明にかかるグルコースオキシダーゼ／β−
ガラクトシダーゼ複合電極の電流応答特性を示す特性図
である。 第13図は白金被膜付きカーボン粒子に対するバインダー
としてポリテトラフルオロエチレンの代わりにポリ酢酸
ビニルを使用した本発明にかかるグルコースオキシダー
ゼ電極の電流応答特性を示す特性図である。 第14図はポリテトラフルオロエチレンをバインダーとし
てカーボン紙上に形成されたパラジウム被膜付きカーボ
ン粒子層の上にグルコースオキシダーゼが固定化されて
なる本発明にかかるグルコースオキシダーゼ電極の電流
応答特性を示す特性図である。 第15図は本発明にかかる酵素電極の動作特性を測定する
ための改良型ランク電気化学セルの概略断面図である。 第16図は一部の測定で使用された二電極系の実験装置を
示す概略断面図である。 第17図は本発明を適用したシュクロース電極の電流応答
性を示す特性図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェレミー・リチャード・メイスン 英国、ロンドン ダブリュウ３、フライア ズ・プレイス・レイン 45番地 (72)発明者 クリストファー・フランク・サーストン 英国、ロンドン ダブリュウ５、ランレ イ・ロード 26番地 (72)発明者 ジョン・レイング・スティアリング 英国、ロンドン ダブリュウ３、ツウィフ ォード アベニュウ 78番地 (72)発明者 デヴィット・ロバート・ディケイザー 英国、サレイ ジーユー22、８エルエー、 オールド・ウォーキング、パウンドフィー ルド・コート ４番地 (56)参考文献 特開 昭55−129745（ＪＰ，Ａ) 特公 昭58−53745（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭59−12135（ＪＰ，Ｂ２) 「蛋白質、核酸、酵素」，Ｖｏｌ．30, Ｎｏ．４（1985），Ｐ．247〜276

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】樹脂バインダー結合したカーボン粒子又は
   グラファイト粒子の層からなり白金又は白金族金属を含
   有する導電性支持体と、この導電性支持体上に固定又は
   吸着された酸化還元酵素からなり、特異的基質の存在下
   において酵素の触媒活性に電気的に応答することが可能
   な酵素電極において、 導電性支持体は、表面に白金族金属がカーボン又はグラ
   ファイトを基準として１〜20重量％の割合で予め吸着さ
   れた粒径３〜50nmのカーボン粒子又はグラファイト粒子
   が樹脂バインダーにより結合された多孔質層からなり、
   白金族金属がこの多孔質層に均一に分散され、 樹脂バインダーは、常温常圧下で１cm³当り２×10^-3cm³
   以上の酵素溶解度を有し、カーボン粒子又はグラファイ
   ト粒子を基準として５〜80重量％の割合で多孔質層に存
   在し、 酸化還元酵素は、表面に白金族金属が吸着されたカーボ
   ン粒子又はグラファイト粒子に接触して多孔質層に含浸
   され、メディエータや電子輸送剤を介さず導電層への直
   接電子輸送を行なう酸化還元酵素であることを特徴とす
   る酵素電極。
2. 【請求項２】白金族金属が白金又はパラジウムであるこ
   とを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
3. 【請求項３】樹脂バインダーがフルオロカーボン樹脂又
   はポリビニルアセテートであることを特徴とする請求項
   １又は２記載の酵素電極。
4. 【請求項４】樹脂バインダーがポリテトラフルオロエチ
   レンであることを特徴とする請求項３記載の酵素電極。
5. 【請求項５】酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼで
   あることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか
   一記載の酵素電極。
6. 【請求項６】白金族金属粒子が予め表面に吸着されたカ
   ーボン粒子又はグラファイト粒子を樹脂バインダーで結
   合させてなる多孔質層が、カーボン紙からなる導電性片
   の表面に堆積されていることを特徴とする請求項１乃至
   請求項５のいずれか一記載の酵素電極。
7. 【請求項７】多孔質層が、粒径1.5〜2.5nmのコロイド白
   金がカーボン粒子の表面に予め吸着された粒径５〜30nm
   のカーボン粒子からなる白金カーボン粉を含むことを特
   徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか一記載の酵素
   電極。
8. 【請求項８】酸化還元酵素が、共有結合を持たずに単に
   多孔質層に吸着されることを特徴とする請求項１乃至請
   求項７のいずれか一記載の酵素電極。
9. 【請求項９】導電性支持体の表面が基質に対して透過性
   を有する微細多孔質膜により保護されていることを特徴
   とする請求項１乃至請求項７のいずれか一記載の酵素電
   極。
10. 【請求項１０】微細多孔質膜がポリカーボネート膜であ
    ることを特徴とする請求項８記載の酵素電極。
11. 【請求項１１】請求項１乃至請求項７のいずれか一記載
    の酵素電極を組み込んだセンサ。
12. 【請求項１２】サンプル中の分析対象基質の定量分析方
    法において、上記分析対象基質自体をそのまま、あるい
    はこの分析対象基質を酸化還元酵素に対して反応性を示
    しこれによってその濃度に比例する測定可能な電流を発
    生し得る基質種へ変換した後、請求項１乃至請求項９の
    いずれか一記載の酵素電極に接触させることを特徴とす
    る定量分析方法。
13. 【請求項１３】サンプルが臨床サンプルであることを特
    徴とする請求項12記載の定量分析方法。
14. 【請求項１４】サンプルが血液サンプルであり、分析剤
    がグルコースであり、酸化還元酵素がグルコースオキシ
    ダーゼであることを特徴とする請求項13記載の定量分析
    方法。