JPH07222587A

JPH07222587A - 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法

Info

Publication number: JPH07222587A
Application number: JP6015584A
Authority: JP
Inventors: Yoshimasa Saito; 善正斎藤; Jieemusu Nobusu Teimoshii; ジェームスノブスティモシー; Yoshinori Ishii; 芳則石井
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1995-08-22

Abstract

(57)【要約】【構成】新規な変異型セファロスポリンＣアシラー
ゼ、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する発
現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換体およ
び該形質転換体を培養することによる変異型セファロス
ポリンＣアシラーゼの製造法。上記形質転換体の培養物
またはその処理物を用いる式：【化１】（Ｒ1 はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素。Ｒ2 はカ
ルボン酸アシル。) でされる化合物(I) またはその塩の
製造法。【効果】高い酵素力をもつ変異型セファロスポリンＣ
アシラーゼ、該酵素を高収率発現する発現系並びに該酵
素の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規セファロスポリン
Ｃアシラーゼ（以下、ＣＣアシラーゼという）に関す
る。より詳細には新規な変異型ＣＣアシラーゼ、それを
コードする遺伝子、その遺伝子を含有する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された微生物及び変異型
ＣＣアシラーゼの製造法に関する。更に、本発明は上記
形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセファロ
スポリン化合物の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＣアシラーゼは、一般にセファロスポ
リンＣを７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）
に加水分解する酵素である。今まで、ＣＣアシラーゼと
して分類される酵素としては、セファロスポリンＣアシ
ラーゼＳＥ８３、Ｎ１７６及びＶ２２の三酵素が見つか
っており、それらのアミノ酸配列は、Journal of Ferme
ntation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (199
1) に開示されている。この文献では、ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列の番号表記はそのＮ末端部位のメチオニ
ン基から始まっている。

【０００３】しかし、本明細書においてはＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列の番号表記はＮ末端部のメチオニン基
に隣接するスレオニン基から始まる（後記配列表参
照）。これは原核生物中でＣＣアシラーゼ遺伝子を発現
することによって得られる成熟ＣＣアシラーゼのα−サ
ブユニットのＮ末端部のメチオニンは、通常、宿主細胞
の酵素（例えば、アミノペプチダーゼなど）によって脱
離して、Ｎ末端アミノ酸としてスレオニン基をもつ成熟
ＣＣアシラーゼとなるからである。

【０００４】上記文献は、組換えＤＮＡ技術による天然
型ＣＣアシラーゼの製造についても開示するものであ
り、発現されたＣＣアシラーゼは細胞内でプロセッシン
グを受けてα−サブユニットとβ−サブユニットからな
る活性体となることが知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な変異型ＣＣアシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクターを導入した形質
転換体、及び該形質転換体を培養することによる変異型
ＣＣアシラーゼの製造方法を提供することである。ま
た、本発明の他の目的は、上記形質転換体の培養物また
はその処理物を用いたセファロスポリン化合物の製造法
を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、より高い
酵素活性を有するＣＣアシラーゼを得るべく鋭意研究を
重ねた結果、かかる望ましい性質、就中ＧＬ−７ＡＣＡ
から７ＡＣＡへの高い触媒能（酵素活性）を持つ変異型
ＣＣアシラーゼの製造に成功し、本発明を完成した。

【０００７】即ち本発明は、下記の特徴を有する新規な
変異型ＣＣアシラーゼに関するものである。 (1)天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列３１７位のチ
ロシンがロイシン等の他のアミノ酸で置換されてなる変
異型ＣＣアシラーゼ。 (2)天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列７０５位のチ
ロシンがロイシン等の他のアミノ酸で置換されてなる変
異型ＣＣアシラーゼ。 (3)上記 (1)〜(2) から選択される１もしくは２カ所の
点変異部をもつ変異型ＣＣアシラーゼ。

【０００８】言い換えると、変異型ＣＣアシラーゼは、
α−サブユニットとβ−サブユニットとにプロセッシン
グされる前の前駆体形として次式で示すことができる。Ａ1-316 −Ｘ1 −Ａ318-704 −Ｘ2 −Ａ706-773 式中、式中、Ａ1-316 は、天然型ＣＣアシラーゼのＴｈ
ｒ1 からＬｅｕ316 までのアミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列を示す。Ａ318-704 は、天然型ＣＣアシラーゼの
Ｌｅｕ318 からＴｈｒ704 までのアミノ酸配列と同一の
アミノ酸配列を示す。Ａ706-773 は、天然型ＣＣアシラ
ーゼのＧｌｙ706 からＡｌａ773 までのアミノ酸配列と
同一のアミノ酸配列を示す。Ｘ1 は、Ｔｙｒまたはその
他のアミノ酸を、Ｘ2 は、Ｔｙｒまたはその他のアミノ
酸を示す。但し、Ｘ1 がＴｙｒであるとき、Ｘ2 はＴｙ
ｒ以外のアミノ酸である。また本発明は、上記式中、Ｘ
1 がＬｅｕおよび／またはＸ2 がＬｅｕである変異型Ｃ
Ｃアシラーゼに関する。

【０００９】この明細書では、個々の変異型ＣＣアシラ
ーゼの命名について、この分野の学会で広く用いられて
いる次のような命名法を便宜的に採用する。即ち、天然
型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の７０５位のチロシン
残基をロイシンで置換した変異型ＣＣアシラーゼは変異
型ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌと命名する。ここでＹは置
換されるチロシン（アミノ酸）残基の一文字記号を意味
し、７０５は天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の置
換位置を意味し、Ｌは前記チロシン（アミノ酸）残基を
置換したロイシン（他のアミノ酸）の一文字記号を意味
する。別の例を挙げると、例えば、変異型ＣＣアシラー
ゼＹ３１７Ｌは天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の
３１７位のチロシン残基をロイシン残基で置換した変異
型ＣＣアシラーゼを意味する。そして、変異型ＣＣアシ
ラーゼＹ３１７Ｌ／Ｙ７０５Ｌは天然型ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列の３１７位と７０５位のチロシン残基を
ロイシン残基で置換した変異型ＣＣアシラーゼを意味す
る。

【００１０】かかる特徴を有する本発明の変異型ＣＣア
シラーゼのアミノ酸配列、ならびにそれをコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の具体例を後記配列表に記す。
配列番号１に、プラスミドｐＴＮＹ３１７Ｌで発現され
る、変異型ＣＣアシラーゼＹ３１７Ｌの前駆体をコード
するＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから推定した
アミノ酸配列を示す。配列番号２に、プラスミドｐＴＮ
Ｙ７０５Ｌで発現される変異型ＣＣアシラーゼＹ７０５
Ｌの前駆体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およ
びそれから推定したアミノ酸配列を示す。

【００１１】本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、組換え
ＤＮＡ技術、ポリペプチド合成法などの常法によって調
製することができる。

【００１２】組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、本発
明新規ＣＣアシラーゼは、そのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
を培地中で培養し、該培養物から該ＣＣアシラーゼを採
取することによって調製することができる。

【００１３】この過程について、その詳細を以下に詳し
く説明する。宿主細胞としては、微生物〔細菌（例え
ば、Escherichia coli，Bacillus subtilis など）、酵
母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiaeなど）、動物
細胞系および培養植物細胞など〕が挙げられる。微生物
として好適には、細菌、特にEscherichia 属に属する菌
株（例えば E. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101
ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. col
i 294 ATCC 31446 など）、酵母、特にSaccharomyces
属に属する菌株（例えば、Saccharomyces cerevisiae A
H22 ）、動物細胞（例えばマウスＬ９２９細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）などが挙げ
られる。

【００１４】細菌、特に E. coliを宿主細胞として用い
る場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、本発明ＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、タ
ーミネーター領域および複製可能単位から構成される。
酵母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現
ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シ
グナルペプチドおよび本発明ＣＣアシラーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ、及び終止コドンを含んでいる
ことが好ましい。エンハンサー配列、本発明ＣＣアシラ
ーゼの５’側及び３’側の非翻訳領域、スプライシング
接合部、ポリアデニレーション部位及び複製可能単位も
また発現ベクターに組み込むことが可能である。

【００１５】プロモーター−オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーター及び Shine-Dalgarno(SD) 配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。好ましく
はプロモーター−オペレーター領域は、常套的に用いら
れるプロモーター−オペレーター領域（例えば、E. col
i のＰＬ−プロモーター及びｔｒｐ−プロモーター）及
びＣＣアシラーゼＮ−１７６染色体遺伝子のプロモー
ターを含んでいてもよい。

【００１６】酵母中で本発明新規ＣＣアシラーゼを発現
させるためのプロモーターとしては、S. cerevisiae の
場合、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺
伝子、および酸ホスファターゼ（ｐＨ０５）遺伝子のプ
ロモーターが挙げられる。また、哺乳動物細胞中で本発
明ＣＣアシラーゼを発現させるためのプロモーターとし
ては、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモータ
ー、ＨＴＬＶ−ＬＴＲ−プロモーター、マウスメタロチ
オネインＩ（ＭＭＴ）−プロモーター、ワクシニア−プ
ロモーターなどが例示される。

【００１７】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が例示される。

【００１８】シグナルペプチドとしては、一般に使用さ
れる他の酵素のシグナルペプチド（天然型ｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペ
プチド）などが例示される。

【００１９】本発明の新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡは、従来の方法で調製することが
できる。例えば、ＤＮＡ合成機を用いて一部のまたは全
てのＤＮＡを合成したり、および／または形質転換体
〔例えば、 E. coli JM109（ｐＣＣＮ１７６−２） FER
M BP-3047 〕から得られる適切なベクター（例えば、ｐ
ＣＣＮ１７６−２）に挿入された天然型ＣＣアシラーゼ
をコードする完全なＤＮＡ配列を適切な方法、例えば適
切な酵素（例えば、制限酵素、アルカリホスファター
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮ
Ａポリメラーゼなど）での処理に加えて、常套の変異方
法〔例えば、カセット変異法〔徳永，Ｔら、Eur. J. Bi
ochem. Vol.153, p445-449 (1985) 参照〕、ＰＣＲ変異
法〔樋口，Ｒら、Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7
367 (1988)参照〕、クンケル法〔Kunkel, T. Aら. ，Me
thods Enzymol. Vol. 154, p367 (1987)など参照〕のよ
うな適切な方法で処理することによって調製することが
できる。

【００２０】終止コドンとしては、常用の終止コドン
（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が例示される。

【００２１】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター（例えば、合成ｆｄファージター
ミネーターなど）が挙げられる。

【００２２】複製可能単位とは、宿主細胞中においてそ
の全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮ
Ａ化合物をいい、天然のプラスミド、人工的に修飾され
たプラスミド（例えば、天然のプラスミドから調製され
たＤＮＡフラグメント）および合成プラスミドが含まれ
る。好適なプラスミドとしては、 E. coliではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３
２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグ
メント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵
母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミド p
RSVneo ATCC 37198 、プラスミド pSV2dhfr ATCC 3714
5、プラスミド pdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149 などが挙げられる。

【００２３】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２b.p.）などが例示される。

【００２４】ポリアデニレーション部位としては、ＳＶ
４０のポリアデニレーション部位などが例示される。

【００２５】スプライシング接合部位としては、ＳＶ４
０のスプライシング接合部位等が例示される。

【００２６】発現ベクターはプロモーター、開始コド
ン、本発明ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的
かつ環状に適当な複製可能単位（プラスミド）に連結す
ることによって調製できる。また、この際所望により、
常法（例えば、制限酵素での消化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いるライゲーション）により適当なＤＮＡフラグメ
ント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイト
など）を用いることもできる。

【００２７】形質転換体（形質移入体）は、上述の発現
ベクターを宿主細胞に導入することにより調製できる。
発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転換（形質移
入）〕は従来公知の（例えば、 E. coliの場合は Kushn
er法、哺乳動物細胞の場合はリン酸カルシウム法、マイ
クロインジェクションなど）を用いて行うことができ
る。

【００２８】本発明の新規ＣＣアシラーゼは、上記の如
く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地
で培養することによって製造することができる。

【００２９】栄養培地は、炭素源（例えば、グルコー
ス、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクト
ースなど）および無機窒素もしくは有機窒素源（例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水
分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプト
ン、ビーフ抽出物など）を含んでいてもよい。また所望
により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン
酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カ
リウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カ
ルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ1 ）、抗
生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など〕
を配合していてもよい。哺乳動物細胞の培養には、胎児
ウシ血清および抗生物質を配合した Dulbecco's Modifi
ed Eagle's Minimum Essenntial Medium (DMEM) がしば
しば用いられる。

【００３０】形質転換体（形質移入体）の培養は、通常
ｐＨ５．５〜８．５（好適にはｐＨ７〜７．５）、１８
〜４０℃（好適には２０〜３０℃）で５〜５０時間行わ
れる。

【００３１】本発明新規ＣＣアシラーゼが培養物のうち
培養液中に存在する場合は、該新規ＣＣアシラーゼは以
下のようにして取得できる。すなわち、得られる培養物
を濾過または遠心して培養濾液（上清）を得、そして該
培養濾液から、天然または合成蛋白質を精製並びに単離
するために一般に用いられる常法に従って本発明ＣＣア
シラーゼを単離、精製する。単離、精製方法としては、
透析、ゲル濾過、抗ＣＣアシラーゼモノクローナル抗体
を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー、適
当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィーなどが例示される。

【００３２】一方、新規ＣＣアシラーゼが培養された形
質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合
は、本発明ＣＣアシラーゼは例えば以下の方法により取
得できる。まず、濾過および遠心等の常法により細胞を
集め、当該細胞の細胞壁および／または細胞膜を、例え
ば超音波および／またはライソザイムで処理して細胞破
片を得る。次に、得られる細胞破片を適当な水溶液（例
えば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウム塩水溶液）に
溶解し、該溶液から本発明ＣＣアシーゼを先に例示した
ような常法により単離精製する方法である。

【００３３】本発明は更に、式：

【００３４】

【化３】

【００３５】（式中、Ｒ¹ はアセトキシ、ヒドロキシま
たは水素を示す。Ｒ² はカルボン酸アシルを示す。）で
示される化合物(II)またはその塩を、本発明の新規ＣＣ
アシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形
質転換された微生物の培養物またはその処理物と接触さ
せて、式：

【００３６】

【化４】

【００３７】（式中、Ｒ¹ は前記と同意義である。）で
示される化合物(I) またはその塩の製造方法を提供する
ものである。

【００３８】Ｒ² で示されるカルボン酸アシルとして
は、脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙
げられ、その適切な例としては、アミノ基、カルボキシ
基、Ｃ１〜Ｃ６のアルカノイルアミノ基、ベンズアミド
基およびチエニル基等からなる群から選択される１つも
しくは２つの適当な置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ
６のアルカノイルが挙げられる。

【００３９】化合物（Ｉ）および化合物（II）の適当な
塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩）が挙げられる。

【００４０】本発明で処理物とは、ＣＣアシラーゼ活性
が培養液中に存在する場合には、培養物を遠心または濾
過して得られる上清（濾液）、およびそれにさらに先述
の精製処理を施して得られるものをいう。また、ＣＣア
シラーゼ活性が培養宿主の細胞内に存在する場合には、
培養物を処理して得られる、例えば以下の物質をいう。

【００４１】（１）生細胞；濾過または遠心等の常法に
て培養物から分離される。（２）乾燥細胞；上記（１）の生細胞を凍結乾燥または
真空乾燥等の常法により乾燥させることにより得られ
る。（３）無細胞抽出物；上記（１）の生細胞または上記
（２）の乾燥細胞を常法（例えば、有機溶媒を用いた細
胞の自己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の粉
砕、または超音波にて細胞を処理すること）により破壊
することにより得られる。（４）酵素溶液；上記（３）の無細胞抽出物を常法（例
えば、カラムクロマトグラフィー）により精製または部
分精製することによって得られる。（５）固定化細胞または酵素；上記（１）もしくは
（２）の細胞または上記（４）の酵素を常法（例えば、
アクリルアミド、グラスビーズ、イオン交換樹脂などを
用いた方法）により固定化することにより調製される。

【００４２】本発明の化合物（II）を本発明ＣＣアシラ
ーゼと接触させることからなる化合物（Ｉ）の製造は、
水または緩衝液のような水性媒質中で行うことができ
る。即ち、化合物（Ｉ）の製造は、通常化合物（II）を
含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物また
はその処理物を溶解または懸濁することによって行われ
る。

【００４３】化合物（Ｉ）の製造は、用いる培養物また
はその処理物の性質に応じて適宜好適なｐＨ、化合物
（II）の濃度、反応時間および反応温度を選択して行う
ことができる。ｐＨは通常６〜１０、好ましくはｐＨ７
〜９、反応温度は通常５〜４０℃、好ましくは５〜３７
℃、反応時間は通常０．５〜５０時間である。

【００４４】反応混液中、基質としての化合物（II）の
濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で好適に選択する
ことができる。

【００４５】このようにして製造された化合物（Ｉ）
は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。

【００４６】以下の実施例において、プラスミド、制限
酵素のような酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び他の物
質は市販のものであり常法により使用することができ
る。ＤＮＡのクローニング、宿主細胞の形質転換、形質
転換体の培養、該培養物からの新規ＣＣアシラーゼの採
取などに用いられた操作についても当業者によく知られ
ているものであるか、もしくは文献から採用できるもの
である。

【００４７】

【実施例・実験例】以下の実施例は、本発明を説明する
ことを目的として挙げられているものであり、本発明は
これらにより何ら限定されるものではない。

【００４８】実施例１オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドＳＯ−Ｙ３１７ＬおよびＳＯ−Ｙ７０５Ｌの合成ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｙ３１７Ｌ（５’ＣＧＡＡＣＴ
ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧ３’）を
３９２Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて合成した。そのＤＮＡを、ＣＰＧ（cont
rolled poreglass)ポリマー支持体から２８％アンモニ
ア水で遊離し、その後６０℃で９時間加熱することによ
り全保護基を除去した。その反応混合物を真空下で減圧
留去し、残渣をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ〕２００μｌに溶解した。
得られた粗ＤＮＡ溶液を、逆相ＨＰＬＣ〔カラム； COS
MOSIL C18, 4.6 mm ×150 mm（ナカライテスク）、溶離
液；Ａ：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液
（ｐＨ７．２〜７．４）、Ｂ：アセトニトリル、グラジ
ェント；開始：Ａ（１００％）、終わり：Ａ（６０％）
＋Ｂ（４０％）、２５分間直線グラジェント、流速；
１．２ ml/min 〕に付した。目的のＤＮＡオリゴマーを
含む溶出液を集め、真空下で減圧留去した。精製された
ＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μｌに溶解し、使用まで−２
０℃で保存した。

【００４９】ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｙ７０５Ｌ（５’
ＧＣＡＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＣ
ＣＧＣＴＡＣＧＴＣＴ３’）を、上述と同様の方法で
合成、精製した。

【００５０】実施例２ｔｒｐプロモーター制御下での
天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターの調製（１）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアンピシリン耐
性発現ベクターであるｐＣＣ００２Ａの構築：（ｉ）ｐＣＣ００１Ａの構築：プラスミドｐＣＣＮ１７
６−３（１．０μｇ）〔JOURNAL OF FERMENTATION AND
BIOENGINEERING, Vol. 72, p235 (1991)に、プラスミド
ｐＣＣＮ１７６−２（これは、常法によりＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９ (ｐＣＣＮ１７６−２）ＦＥＲＭＢＰ−３
０４７から入手可能である）からこのプラスミドを調製
する方法が記載されている〕を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄIII で消化し、ＣＣアシラーゼＮ１７６の全てのコー
ディング領域を担持する２．９ｋｂフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動によって単離した。一方、変異型ｔ
−ＰＡの発現ベクターであるｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ
（１．０μｇ）、〔これは、常法により形質転換体であ
るＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１−１６（ｐＴＱｉＰＡΔｔ
ｒｐ）ＦＥＲＭＢＰ−１８７０から得ることができ
る。その調製方法については、欧州特許出願公開明細書
第３０２４５６号に記載されている〕をＸｍａＩとＸｈ
ｏＩで消化し、大きい方のＤＮＡ（５１１３ｂｐ、Ｘｍ
ａＩ／ＸｈｏＩＤＮＡフラグメント）を単離した。

【００５１】一方、合成オリゴマーＣＴ−１（５’−ＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＡ
ＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＴ
ＣＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡ）、ＣＴ−２（５’−ＡＧＣＴＴＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧ
ＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＧＧＴＡＧＴ
ＴＧＧＴＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣ）、ＴＲ−１（５’−ＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣ
ＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＧ）、およびＴＲ−２（５’−ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧ
ＣＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＣ
ＴＣＧＡＧＧＡＣＡ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合して、ＸｍａＩ／ＳａｌＩ
ＤＮＡフラグメント（１１４ｂｐ）を調製した。この
ＤＮＡフラグメントを先に得られたＸｍａＩ／ＸｈｏＩ
ＤＮＡフラグメント（５１１３ｂｐ）に結合してｐＴ
ＱｉＰＡｄｔｒｐを調製した。

【００５２】次に、このｐＴＱｉＰＡｄｔｒｐ（１．０
μｇ）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で消化した。得ら
れたｔｒｐプロモーター、ｔ−ＰＡコーディング領域の
一部分（Ｃｙｓ92からＴｒｐ113 ）、及びｆｄファージ
セントラルターミネーターの複写配列を担持する４．３
ｋｂＤＮＡを単離した。５０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｍ
ＭＡＴＰからなるライゲーション緩衝液４０μｌ中、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）の
存在下、先に得られた２．９ｋｂのＤＮＡフラグメント
と当該４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを混合して、１
６℃、５時間かけて結合した。該結合物を用いて、Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐
性の形質転換体の一つから所望のプラスミドｐＣＣ００
１Ａを取得し、制限酵素マッピングにより、その特性を
調べた。

【００５３】（ii）ｐＣＣ００２Ａの構築 (i) で得られたプラスミドｐＣＣ００１Ａは、ｔｒｐプ
ロモーターとアシラーゼ遺伝子との間のｔ−ＰＡ遺伝子
の一部分（Ｃｙｓ92からＴｒｐ113 ）を含む。この領域
を除去するために、ｐＣＣ００１Ａ（１．０μｇ）をＣ
ｌａＩ及びＭｌｕＩで消化し、得られる６．１ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントを単離した。一方、ｐＣＣＮ１７６−
３（１μｇ）をＭｌｕＩおよびＳａｕ３ＡＩで消化し、
アシラーゼのＡｓｐ7 からＡｒｇ71間をコードする１８
９ｂｐのＤＮＡを単離した。合成ＤＮＡオリゴマー００
２ａ及び００２ｂ（各々０．５ｎｍｏｌ、表１参照）
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１．５ユニット、
宝酒造製）を用いて、緩衝液（キネーション緩衝液；５
０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤ
ＴＴ、１．０ｍＭＡＴＰ）中、３７℃、１時間処理し
てリン酸化し、該反応混合物を５５℃で２０分間加熱し
て酵素を不活性化させた。その結果得られた混合物を、
ライゲーション緩衝液２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ存在下、１５℃で３時間処理して、先に得られた１８
９ｂｐのＳａｕ３ＡＩ／ＭｌｕＩＤＮＡと混合して結
合させた。得られた結合物に、６．１ｋｂＣｌａＩ／
ＭｌｕＩＤＮＡフラグメントを添加し、その混合物を
更に追加したＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）
の存在下で４℃、１６時間インキュベーションした。そ
の結果得られた結合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９を形質転換した。これらの形質転換体の一つから、
ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターである所望のプ
ラスミドｐＣＣ００２Ａを単離して、制限酵素マッピン
グによりその特性を調べた。

【００５４】

【表１】

【００５５】（２）カナマイシン耐性ＣＣアシラーゼＮ
１７６の発現ベクターであるｐＣＫ００２の構築プラスミドｐＣＣ００２ＡをＤｒａＩ（東洋紡績（株）
製）で消化した。その結果得られた混合液をフェノール
で処理して酵素を除去し、エタノールで沈澱させた。回
収されたＤＮＡをライゲーション緩衝液２０μｌに懸濁
し、リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー（２μｇ、ファ
ルマシア製）と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００
ユニット）とともに４℃で１６時間インキュベーション
した。該反応混合物をフェノールで抽出し、エタノール
で沈澱させた。回収したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、
その結果得られたアンピシリン耐性遺伝子を欠失した
５．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって
単離した。一方、プラスミドｐＡＯ９７（１μｇ）〔こ
れは、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＡＯ９
７）ＦＥＲＭＢＰ−３７７２から常法により得ること
ができる。〕をＥｃｏＲＩで消化し、その結果カナマイ
シン耐性遺伝子である１．２ｋｂＤＮＡを単離した。ラ
イゲーション緩衝液５０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３００ユニット）を用いて、当該１．２ｋｂのＥｃｏ
ＲＩＤＮＡを１６℃で２時間反応させ、５．６ｋｂの
ＥｃｏＲＩＤＮＡに結合させた。該結合物を用いて
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、抗生物質マー
カーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプ
ラスミドｐＣＫ００２を得た。

【００５６】実施例３ＣＣアシラーゼＮ１７６の高発
現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築（１）ｐＣＣ０１３Ａの構築（ｉ）ｐＣＣ００７Ａの構築プラスミドｐＣＣ００１ＡをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ
で消化し、その結果得られた６．４ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動により単離した。回収
されたＤＮＡを、予めリン酸化しておいた合成ＤＮＡオ
リゴマー００７ａ及び００７ｂ（各々０．５μｇ、表１
参照）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を
用いて１６℃、５時間処理し、結合させた。得られた混
合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、
所望のプラスミドｐＣＣ００７Ａを得た。

【００５７】（ii）ｐＣＣＮｔ０１３の構築プラスミドｐＣＣ００７Ａ（１．０μｇ）をＣｌａＩと
ＢａｍＨＩで消化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡを５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。該
ＤＮＡを合成オリゴマー０１３ａと０１３ｂ（各々０．
５μｇ、それらの各々はリン酸化されている。表１参
照）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用
いて、結合した。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣＮｔ
０１３をアンピシリン耐性形質転換体から単離した。

【００５８】（iii) ｐＣＣ０１３Ａの構築プラスミドｐＣＣＮｔ０１３をＢａｍＨＩとＭｌｕＩで
消化し、その結果得られる６．１ｋｂのＤＮＡを単離し
た。一方、ｐＣＣ００２Ａ（１．０μｇ）をＭｌｕＩと
Ｓａｕ３ＡＩで消化して１８９ｂｐのＤＮＡフラグメン
トを取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（３００ユニット）を用いて、６．１ｋｂのＢａｍＨＩ
／ＭｌｕＩのＤＮＡフラグメントに結合し、該結合混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。
アンピシリン耐性の形質転換体の一つから、ＡＴリッチ
なＮＨ2 末端側ＤＮＡ配列（天然型ＣＣアシラーゼＮ１
７６のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードす
る）をもつ所望のプラスミドｐＣＣ０１３Ａを単離し
た。

【００５９】（２）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のカ
ナマイシン耐性発現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築（ｉ）ｐΔＮ１７６の構築プラスミドｐＣＫ００２（１．０μｇ）をＡａｔII（東
洋紡績（株）製）で消化し、得られたＤＮＡを自己結合
させる為にＴ４ＤＮＡリガーゼ（１５０ユニット）で
処理した。かかる結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９を形質転換し、ユニークなＡａｔII制限酵素切
断部位を担持する所望のプラスミドｐΔＮ１７６を取得
した。

【００６０】（ii）ｐＣＫ０１３の構築プラスミドｐΔＮ１７６（１．０μｇ）をＡａｔIIで消
化し、線状化したＤＮＡを細菌由来のアルカリホスファ
ターゼ（１ユニット、宝酒造製）で、１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、４２℃にて１時間処理し
た。その脱リン酸化されたＤＮＡを単離して、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてｐＣＣ０１３Ａ由来の２．５ｋｂ
のＡａｔII ＤＮＡに結合した。該結合混合物を用いて
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、マーカーとし
てカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミド
ｐＣＫ０１３を取得した。

【００６１】実施例４ＣＣアシラーゼＮ１７６をコー
ドするＤＮＡのクンケル法によるポイントミューテーシ
ョン（１）ＣＣアシラーゼＮ１７６をコードするＤＮＡのＭ
１３ファージへのサブクローニング（ｉ）ｍｐ１９ｐｆｕ６２の調製プラスミドｐＣＣ０１３ＡをＳｍａＩおよびＨｉｎｄII
I で消化し、ＣＣアシラーゼＮ１７６のＰｒｏ277 から
Ａｌａ773 までをコードする１５６５ｂｐのＤＮＡを単
離した。該ＤＮＡを、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄIII で消
化したＭ１３ｍｐ１９に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結し、該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９を形質転換した。プラークのうちの一つから、所望
のＲＦＤＮＡｍｐ１９ｐｆｕ６２を単離し、制限酵素
マッピングによりその特性を調べた。調製したファージ
溶液は使用するまで４℃で保存した。

【００６２】上述と同様の方法で、ｐＣＣ０１３Ａ由来
の１１６４ｂｐのＨｐａＩ／Ｅｃｏ４７III ＤＮＡとＨ
ｉｎｃIIで消化した７２５０ｂｐのＭ１３ｍｐ１８とか
らＲＦＤＮＡｍｐ１８ｐ１８３を調製した。

【００６３】（ii）一本鎖Ｕ−ｍｐ１９ｐｆｕ６２−Ｓ
Ｓの調製（Kunkel, T.A. et al., Methods Enzyml. 15
4, 367 参照) ：Ｅ．ｃｏｌｉＣＪ２３６（ｄｕｔ
−，ｕｎｇ−，Ｆ’）（バイオ・ラッドラボラトリーズ
製）のシングルコロニーをクロラムフェニコール（３０
μｇ／ｍｌ）を含有する２ＸＴＹブロス２ｍｌ中で３７
℃、１６時間培養した。細胞（０．１ｍｌ）を３０μｇ
／ｍｌクロラムフェニコールを含有する新鮮な２ＸＴＹ
ブロス（５０ｍｌ）に移し、３７℃で培養を継続した。
６００ｎｍでの吸光度が０．３に達したとき、該培養物
にｍｐ１９ｐｆｕ６２のファージ溶液（ＭＯＩ＜０．
２）を添加し、さらに５時間培養を続けた。得られた培
養物を４℃、１７，０００×ｇで１５分間遠心をした
後、再び上清を遠心した。その結果得られた上清（３０
ｍｌ）を室温下、３０分間ＲＮａｓｅ（１５０μｇ／ｍ
ｌ，シグマ社製）で処理し、７．５ｍｌのＰＥＧ溶液
（３．５ＭＮＨ₄ＯＡｃの２０％ポリエチレングリコ
ール８，０００溶液）を添加した。遠心（１７，０００
×ｇ，１５分，４℃）後、残渣を３００ｍＭＮａＣ
ｌ，１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍ
ＭＥＤＴＡからなる緩衝液２００μｌに懸濁した。得
られた溶液をフェノール２００μｌおよびフェノール／
ＣＨＣｌ₃（１／１）２００μｌで抽出し、続いてＣＨ
Ｃｌ₃（２００μｌ）で２回洗浄した。該溶液に、７．
５ＭＮＨ₄ＯＡｃ（１００μｌ）とエタノール（６００
μｌ）を添加してファージＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮ
Ａを遠心により回収し、氷冷９０％エタノール７００μ
ｌで洗浄し、真空下で乾燥した。精製された１本鎖Ｕ−
ＤＮＡ（Ｕ−ｍｐ１９ｐｆｕ６２ｍｐ１８−ＳＳ）をＴ
Ｅ緩衝液２０μｌに懸濁し、使用するまで４℃で保存し
た。クンケルの変異方法に用いる１本鎖Ｕ−ＤＮＡ（Ｕ
−ｍｐ１８ｐ１８３）についてもまた上述と同様の方法
で調製した。

【００６４】（２）変異型ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌを
コードするＲＦＤＮＡの調製（ｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドのリン酸化ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｙ７０５Ｌ（１．８４μｇ，約
１６７ｐｍｏｌ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（４．５ユニット、宝酒造製）を用いて、５０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭＡＴＰ及び
５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる
ライゲーション緩衝液３０μｌ中で３７℃、１時間処理
してリン酸化した。

【００６５】（ii）アニーリング反応１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭＭｇＣｌ
₂及び４０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液９μｌ中にお
いて、(i) でリン酸化されたオリゴマー（１μｌ、約
５．６ｐｍｏｌ）を鋳型Ｕ−ｍｐ１９ｐｆｕ６２−ＳＳ
（０．１０ｐｍｏｌ、約２５０ｎｇ）と混合した。該混
合物を７０℃、５分間加熱して、その後４０分かけて３
０℃で冷却して０℃で静置した。

【００６６】（iii)ｉｎｖｉｔｒｏでの２重鎖ＤＮＡ
の合成得られたアニーリング溶液（１０μｌ）を、合成緩衝液
〔２００ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８．０）−４０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂〕１μｌ、５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）１μｌ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）およびＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（１０ユニット、ファルマシア）と
混合した。該混合物を氷上で５分間、２５℃で５分間、
さらに３７℃で９０分間、順次インキューベーションし
た。１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ
ＥＤＴＡからなる緩衝液９０μｌを添加して、反応を
停止させた。

【００６７】（iv）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の形質転
換（iii)で得られた合成ＤＮＡ溶液（３μｌ）をＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９のコンピテントセル（２００μｌ）に
添加し、該セルを氷上で３０分間インキュベーションし
て、形質転換体を得た。一方、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０
９のシングルコロニーをＬブロス（２ｍｌ）中で１６時
間培養した。該培養物（０．１ｍｌ）を新鮮なＬブロス
（２ｍｌ）に移し、更に２時間培養して、インディケー
ターセルを取得した。形質転換された細胞（２００μ
ｌ）に、インディケーターセル（２００μｌ）を加え
て、それらを５５℃で前加熱したＨ−Ｔｏｐ寒天（１％
バクトトリプトン、０．８％ＮａＣｌ、０．８％寒天）
３ｍｌと混合した。該細胞−寒天混合物をＨプレート
（１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、１．５
％寒天）上に延展し、そのプレートを３７℃で１６時間
培養した。

【００６８】（ｖ）形質転換体から得られたＲＦＤＮ
Ａの特性Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングルコロニーを２ＸＴ
Ｙブロス（１．６％バクトトリプトン、１％酵母抽出
物、０．５％ＮａＣｌ）２ｍｌ中で１６時間培養した。
該培養物（０．１ｍｌ）を新しい２ＸＴＹブロス（２ｍ
ｌ）に移し、更に２時間培養した。ステップ（iv）で調
製されたプレートのプラークを竹製爪楊枝（１５ｃｍ）
で拾い、爪楊枝を直ちに先に培養した２ＸＴＹブロスに
移した。培養を３７℃、５〜６時間続けた。該培養物１
ｍｌを室温下１５秒、１０，０００ｒｐｍで遠心するこ
とにより細胞を収集し、得られた上清（次の実験でのＲ
ＦＤＮＡの大量調製のために使用されるファージ溶
液）を使用するまで４℃で保存した。得られた細胞はＧ
ＴＥ緩衝液〔５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）、２５ｍＭＥＤＴＡ〕１００μｌに懸
濁し、アルカリ−ＳＤＳ溶液（０．２ＮＮａＯＨ、１％
ＳＤＳ）２００μｌと緩やかに混合し、そしてボルテッ
クスＴＭミキサーを用いて高塩緩衝液（３ＭＫＯＡ
ｃ、３ＭＡｃＯＨ）１５０μｌと激しく混合した。得
られた混合液を室温で５分間、１０，０００ｒｐｍで遠
心した。得られた上清（４００μｌ）をイソプロピルア
ルコール３００μｌで処理し、１０，０００ｒｐｍで５
分間遠心した。その上層部（３００μｌ）を分離し、エ
タノール６００μｌと混合した。その混液を遠心（１
０，０００ｒｐｍ、５分）した後、得られた沈澱を氷冷
７０％エタノール５００μｌで洗浄し、真空下で乾燥
し、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）１μｇ／ｍｌを含有する
ＴＥ緩衝液５０μｌに懸濁し、ＲＦＤＮＡｍｐ１９
ｐｆｕ６２Ｙ７０５Ｌ溶液を得た。該ＲＦＤＮＡ溶液の
一部分（１０μｌ）をＡｆｌIIを用いた制限エンドヌク
レアーゼマッピングに用いた。これは、変異を調べるた
め、ＤＮＡオリゴマーＳＯ−Ｙ７０５Ｌがその配列中に
ＡｆｌII認識部位を計画的に含んでいることによる。

【００６９】（３）変異型ＣＣアシラーゼＹ３１７Ｌを
コードするＲＦＤＮＡの調製変異型ＲＦＤＮＡ（ｐ１８３Ｙ３１７Ｌと命名）を上
述の方法と同様にｍｐ１８ｐ１８３の一本鎖Ｕ−ＤＮＡ
（鋳型として）、及びプライマーＳＯ−Ｙ３１７Ｌから
調製した。

【００７０】実施例５発現ベクターの構築（１）ｐＴＮＹ７０５Ｌの構築（図３）実施例４で得られたＲＦＤＮＡ（ｍｐ１９ｐｆｕ６２
Ｙ７０５Ｌと表示）（１０μｇ）をＮｃｏＩ（５ユニッ
ト、東洋紡績（株）製）およびＰｓｔＩ（５ユニット、
東洋紡績（株）製）で消化した。得られた１２７１ｂｐ
のＤＮＡフラグメントを０．８％のアガロースゲル電気
泳動にかけて消化混合物から単離した。一方、ｐＣＫ０
１３（１０μｇ）をＰｓｔＩ（５ユニット）およびＮｃ
ｏＩ（５ユニット、東洋紡績（株）製）で消化し、５５
１９ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。１２７１ｂ
ｐと５５１９ｂｐのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩＤＮＡをライ
ゲーション緩衝液２０μｌ中で４℃、１６時間条件で連
結した。該ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性の形質
転換体の一つから、ｐＴＮＹ７０５Ｌと称する所望のプ
ラスミドを単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化によ
り、その特性を調べた（図１）。

【００７１】（２）ｐＴＮＹ３１７Ｌの構築（図４）実施例４で得られたＲＦＤＮＡ（ｍｐ１８ｐ１８３Ｙ
３１７Ｌと表示）（１０μｇ）をＮｃｏＩ（５ユニッ
ト、東洋紡績（株）製）およびＭｌｕＩ（５ユニット、
東洋紡績（株）製）で消化した。得られた８７２ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを０．８％のアガロースゲル電気泳
動にかけて消化混合物から単離した。一方、ｐＣＣ０１
３Ａ（１０μｇ）をＭｌｕＩ（５ユニット）およびＮｃ
ｏＩ（５ユニット、東洋紡績（株）製）で消化し、５３
７８ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。８７２ｂｐ
と５４０７ｂｐのＮｃｏＩ／ＭｌｕＩＤＮＡをライゲ
ーション緩衝液２０μｌ中で４℃、１６時間条件０連結
した。該ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転
換体の一つから、ｐＴＮＹ３１７Ｌと称する所望のプラ
スミドを単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化により、
その特性を調べた（図２）。

【００７２】実施例７変異型アシラーゼのＤＮＡ配列（１）ｐＴＮＹ７０５Ｌの配列３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて、直接、ＤｙｅＤｅｏｘｙ^TM
法にて決定した。ＤＮＡオリゴマーＳ１（ＣＧＧＧＧＣ
ＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＴ、コーディング鎖：ヌク
レオチド番号２０２８〜２０４７）およびＡ１（ＣＡＴ
ＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＣＡＧＴ、逆鎖：ヌクレオ
チド番号２２６９〜２２５０）をプライマーに用いた。
決定された配列は予想されたものと一致していた。（２）ｐＴＮＹ３１７Ｌの配列上述と同様にしてｐＴＮＹ３１７Ｌの配列を決定した。

【００７３】実施例８組換えＥ．ｃｏｌｉの培養（１）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＴＮＹ３１７Ｌの
培養Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をｐＴＮＹ３１７Ｌ（１ｍ
ｌ）で形質転換して得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
／ｐＴＮＹ３１７Ｌのグリセロールストックを５０μｇ
／ｍｌアンピシリン含有１００ｍｌＬブロス（１％バ
クトトリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）に移し、該混合物を３０℃で８時間
培養した。該培養物（０．２ｍｌ）を５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有２０ｍｌＭＳブロス（１．２％バクト
トリプトン、２．４％酵母抽出物、１．２５％グリセロ
ール、０．１１％ロイシン、０．１１％プロリン、０．
１１％イソロイシン、１．２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．
３８％ＫＨ₂ＰＯ₄、５０μｇ／ｍｌチアミン・塩
酸、２ｍＭＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．２ｍＭＣａ
Ｃｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０５ｍＭＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ）に添加し、該混合液を３０℃で１６時間培養した。
得られた培養物（３．４ｍｌ）を、１％のグリセロール
と２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２％Ｍ９ＣＡ
ブロス（２％カザミノ酸、１．５２％Ｎａ₂ＨＰＯ₄
・１２Ｈ₂Ｏ、０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１％Ｎ
Ｈ₄Ｃｌ、０．０５％ＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ、０．２ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５０
μｇ／ｍｌチアミン・塩酸、ｐＨ７．２）に添加し、そ
の混合液を２０℃で激しく振盪しながら培養した（３５
０〜４００ｒｐｍ／ｍｉｎ）。８時間目に３−インドー
ルアクリル酸を最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように
該培養物に添加し、更に４０時間培養を継続した。得ら
れた培養物のうち２０ｍｌを４℃下、７，０００ｒｐｍ
で５分間遠心することにより、細胞を集め、それをＴＥ
緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌに懸濁し、超音波処理に
より破砕した。該破砕物を４℃、１５，０００ｒｐｍで
２０分間遠心して不溶解物質を除去した。得られた上清
を４℃で保存し、ＣＣアシラーゼ活性およびＧＬ−７Ａ
ＣＡアシラーゼ活性を測定するために、さらには精製さ
れた変異型ＣＣアシラーゼＹ３１７Ｌを調製するために
使用した。

【００７４】（２）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＴＮ
Ｙ７０５Ｌの培養Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をｐＴＮＹ７０５Ｌ（１ｍ
ｌ）で形質転換して得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
／ｐＴＮＹ７０５Ｌのグリセロールストックを５０μｇ
／ｍｌカナマイシン含有１００ｍｌＬブロス（１％バ
クトトリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）に移し、該混合物を３０℃で８時間
培養した。該培養物（０．２ｍｌ）を５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有２０ｍｌＭＳブロス（１．２％バクト
トリプトン、２．４％酵母抽出物、１．２５％グリセロ
ール、０．１１％ロイシン、０．１１％プロリン、０．
１１％イソロイシン、１．２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．
３８％ＫＨ₂ＰＯ₄、５０μｇ／ｍｌチアミン・塩
酸、２ｍＭＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．２ｍＭＣａ
Ｃｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０５ｍＭＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ）に添加し、該混合液を３０℃で１６時間培養した。
得られた培養物（３．４ｍｌ）を１％のグリセロールと
２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２％Ｍ９ＣＡブ
ロス（２％カザミノ酸、１．５２％Ｎａ₂ＨＰＯ₄・
１２Ｈ₂Ｏ、０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１％ＮＨ
₄Ｃｌ、０．０５％ＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ、０．２ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、５０μ
ｇ／ｍｌチアミン・塩酸、ｐＨ７．２）に添加し、その
混合液を２０℃で激しく振盪しながら培養した（３５０
〜４００ｒｐｍ／ｍｉｎ）。８時間目に３−インドール
アクリル酸を最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように該
培養物に添加し、更に４０時間培養を継続した。得られ
た培養物のうち２０ｍｌを４℃下、７，０００ｒｐｍで
５分間遠心することにより細胞を集め、それをＴＥ緩衝
液（ｐＨ８．０）２０ｍｌに懸濁し、超音波処理により
破砕した。該破砕物を４℃、１５，０００ｒｐｍで２０
分間遠心して不溶解物質を除去した。得られた上清を４
℃で保存し、ＣＣアシラーゼ活性およびＧＬ−７ＡＣＡ
アシラーゼ活性を測定するために、更には精製された変
異型ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌを調製するために使用し
た。

【００７５】実施例９ＣＣアシラーゼの精製と特性（１）変異型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌの精製培養物２０ｍｌから得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
／ｐＴＮＹ７０５Ｌの破砕物（２０ｍｌ）に、硫酸アン
モニウム（４．１８ｇ、最終濃度：３５％飽和）を添加
し、該混合物を室温で２０分間攪拌した。得られた混合
液を遠心（２０℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分間）
し、上清を集めて硫酸アンモニウム処理した（５．５６
ｇ、最終濃度：７５％飽和）。遠心（２０℃、１５，０
００ｒｐｍ、２０分間）により沈澱物を集め、それを１
００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）５ｍｌに溶解した。
得られた溶液を４℃で１００ｍＭトリス塩酸緩衝液各々
４リットルに対して２回の透析を行った。得られた透析
物をＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ^TM（０．４５μｍ、ミリポア）
で濾過し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した
〔カラム；ＴＳＫｇｅｌ^TM ＤＥＡＥＴＯＹＯＰＥＡ
ＲＬ−５ＰＷ（東ソー）、溶離液；Ａ：２０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０）、Ｂ：０．５ＭＮａＣｌ−トリス
塩酸（ｐＨ８．０）、グラジェント；始め：Ａ（８０
％）＋Ｂ（２０％）、終わり（３０分後）：Ａ（５０
％）＋Ｂ（５０％）、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕。約
０．１６ＭのＮａＣｌ溶液と共に溶出したメインピーク
を集め、トリス塩酸（ｐＨ９．０）４リットルに対して
透析して、純粋な変異型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼＹ７０
５Ｌを得た。

【００７６】精製された変異型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼ
Ｙ７０５Ｌアシラーゼを逆相ＨＰＬＣカラム〔ＣＯＳＭ
ＯＳＩＬ４．６ｍｍ×５０ｍｍ（ナカライテスク製）、
溶離液；Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、
Ｂ：６０％アセトニトリル含有０．０５％ＴＦＡ、グラ
ジェント；開始：Ａ（４０％）＋Ｂ（６０％）、終わり
（２０分後）：Ａ（０％）＋Ｂ（１００％）〕、および
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。そのようにして
得られたアシラーゼの純度は、ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより、約９５％であった。変異型Ｎ１７６ＣＣ
アシラーゼＹ３１７Ｌについても、上述と同様の方法で
精製、分析をった。

【００７７】（２）比活性の測定（ｉ）ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＧＬ−７
ＡＣＡ溶液２００μｌ〔０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．７）中に１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨは１ＮＮａＯＨで
８．７に再調整した。〕に、実施例９（１）で精製され
た変異型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼＹ３１７Ｌまたは変異
型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌをそれぞれ２０μ
ｌ添加して、該混合液を３７℃で５分間インキュベーシ
ョンした。これに、５％酢酸を２２０μｌ添加すること
により反応を止めた。得られた混合液を遠心し（室温
下、１０，０００ｒｐｍで５分間）、上清を用いてそれ
ぞれの変異型ＣＣアシラーゼによる７ＡＣＡの生成を測
定した。

【００７８】ＨＰＬＣ条件：カラム；ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０ＴＭＣＴＲ
４．４ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍｍ（東ソー製）、溶離液；５％（ｗ／ｖ）酢酸アンモニウム含有３％（ｖ
／ｖ）アセトニトリル、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１０μｌ、検出器；２５４ｎｍなお、１ユニットは、３７℃で１分間にＧＬ−７ＡＣＡ
から１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しうる酵素活性と
して定義した。結果を表２に記載する。

【００７９】

【表２】

【００８０】（２）変異型ＣＣアシラーゼのアミノ末端
配列の決定（ｉ）ＣＣアシラーゼＮ１７６の両鎖の単離：精製され
た変異型Ｎ１７６ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌを逆相ＨＰ
ＬＣに付した〔カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ４
（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３５ｍｍ，ナカライテスク
製）、溶離液；０．０５％ＴＦＡ中、アセトニトリル初
濃度３６％から２０分で６０％の直線グラジェント、流
速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕。変異型Ｎ１７６ＣＣアシラ
ーゼＹ７０５Ｌのβ鎖およびα鎖は、それぞれ約４８％
および約５１％濃度のアセトニトリルと共に溶出され
た。各溶出液を集め、凍結乾燥して、アシラーゼのα
（β）鎖を得た。また、同様に変異型Ｎ１７６ＣＣアシ
ラーゼＹ３１７Ｌについてもアミノ酸末端の決定を行っ
た。

【００８１】（ii）アミノ末端配列の決定当該α（β）鎖のアミノ末端配列を、気相シークエンサ
ー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定
し、予想されたものと一致することを確認した。

【００８２】

【発明の効果】本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、高い
酵素活性をもちＧＬ−７ＡＣＡから７ＡＣＡへの反応を
触媒する新規酵素であり、７ＡＣＡの製造に有用であ
る。また、本発明によると、該変異型ＣＣアシラーゼを
高収率発現する発現系並びに該変異型ＣＣアシラーゼを
用いる効率のよい７ＡＣＡの製造方法を提供することが
できる。

【００８３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２３２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：４．．２３２２特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ存在位置：９５２．．９５４特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC CTT CTA GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Leu Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【００８４】配列番号：２配列の長さ：２３２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：４．．２３２２特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ存在位置：２１１６．．２１１８特徴を決定した方法：Ｅ配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC CTG GGT GCC TTA AGC CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Leu Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【図面の簡単な説明】

【図１】変異型ＣＣアシラーゼＹ７０５Ｌの発現ベクタ
ーｐＴＮＹ７０５Ｌの制限酵素地図を示す図である。

【図２】変異型ＣＣアシラーゼＹ３１７Ｌの発現ベクタ
ーｐＴＮＹ３１７Ｌの制限酵素地図を示す図である。

【図３】プラスミドｐＣＫ０１３とｍｐ１９ｐｆｕ６２
Ｙ７０５Ｌとから発現ベクターｐＴＮＹ７０５Ｌを構築
する手順を示す図である。

【図４】プラスミドｐＣＣ０１３Ａとｍｐ１８ｐ１８３
Ｙ３１７Ｌとから発現ベクターｐＴＮＹ３１７Ｌを構築
する手順を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】宿主細胞中でα−サブユニットとβ−サ
ブユニットにプロセッシングされる前の前駆体形として
のアミノ酸配列が、式：Ａ1-316 −Ｘ1 −Ａ318-704 −Ｘ2 −Ａ706-773 （式中、Ａ1-316 は、天然型セファロスポリンＣアシラ
ーゼのＴｈｒ1 からＬｅｕ316 までのアミノ酸配列と同
一のアミノ酸配列を示す。Ａ318-704 は、天然型セファ
ロスポリンＣアシラーゼのＬｅｕ318 からＴｈｒ704 ま
でのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。Ａ706-
773 は、天然型セファロスポリンＣアシラーゼのＧｌｙ
706 からＡｌａ773 までのアミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列を示す。Ｘ1 は、Ｔｙｒまたはその他のアミノ酸
を、Ｘ2 は、Ｔｙｒまたはその他のアミノ酸を示す。但
し、Ｘ1 がＴｙｒであるとき、Ｘ2 はＴｙｒ以外のアミ
ノ酸である。）で示される、変異型セファロスポリンＣ
アシラーゼ。
【請求項２】Ｘ1 がＬｅｕおよび／またはＸ2 がＬｅ
ｕである請求項１記載の変異型セファロスポリンＣアシ
ラーゼ。
【請求項３】請求項１または請求項２記載の変異型セ
ファロスポリンＣアシラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】請求項３記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
ー。
【請求項５】請求項４記載の発現ベクターによって形
質転換された宿主細胞。
【請求項６】請求項５記載の宿主細胞を培地で培養
し、得られる培養物から変異型セファロスポリンＣアシ
ラーゼを採取することを特徴とする請求項１または請求
項２記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼの製造
方法。
【請求項７】式：【化１】（式中、Ｒ¹ はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素を示
す。Ｒ² はカルボン酸アシルを示す。）で示される化合
物（II）またはその塩に請求項５記載の形質転換された
宿主細胞の培養物またはその処理物を接触させて、式：【化２】（式中、Ｒ¹ は前記と同意義。）で示される化合物
（Ｉ）またはその塩を得ることを特徴とする化合物
（Ｉ）の製造法。