JPH07222593A - Ｎ−カルバミル−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインをＮ−
カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する能力を有す
るバチルス属に属する微生物の菌体または菌体処理物を
ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインに作用せしめるこ
とを特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンの
製造方法。 【効果】 本発明によれば、ラセミ体の５−tert−ブチ
ルヒダントインから安価かつ効率的にＮ−カルバミル−
Ｌ−tert−ロイシンを製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−カルバミル−Ｌ−
tert−ロイシンの製造方法に関する。Ｎ−カルバミル−
Ｌ−tert−ロイシンは、化学的に容易に脱カルバミル化
することが可能であり、脱カルバミル化されたＬ−tert
−ロイシン（（Ｓ）−２−アミノ−３，３−ジメチル酪
酸）は光学分割剤等として有用である。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−tert−ロイシンは、非天然型アミノ
酸であるため発酵法や抽出法によって生産することはで
きない。また、光学活性アミノ酸の製造方法として、有
機化学合成によって生成したＤＬ−アミノ酸をアシラー
ゼを用いて光学分割する方法がよく知られている（Bul
l. Agr. Chem. Soc. Jap., 21, 304 (1957)、Methods i
n Enzymology, 44, 746 (1981)）。しかしながら、ＤＬ
−tert−ロイシンのアシル化体にはアシラーゼが作用で
きず、アシラーゼを用いた光学分割によるＬ−tert−ロ
イシンの製造は不可能であった。

【０００３】さらに、ＤＬ−アミノ酸の光学分割法とし
て、カンファースルフォン酸等の光学分割剤を用いる方
法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 56, 3744 (1983)）がある
が、これら光学分割剤は高価であるため、この方法では
Ｌ−tert−ロイシンを安価に製造することはできない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、化学
的に容易にＬ−tert−ロイシンに変換できるＮ−カルバ
ミル−Ｌ−tert−ロイシンを安価かつ効率的に製造する
方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｎ−カル
バミル−Ｌ−tert−ロイシンが化学的に容易にＬ−tert
−ロイシンに変換できることに着目し、安価かつ効率的
なＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンの製造方法を開
発するために鋭意検討を重ねた結果、化学合成法によっ
て得られるＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインにバチ
ルス属に属する微生物を作用せしめることにより、その
ヒダントイン環が光学特異的に開裂加水分解され、Ｎ−
カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンが効率よく生成される
こと、また、該微生物の代謝エネルギー源となる物質の
存在下にてＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインに該微
生物を作用せしめることによりＮ−カルバミル−Ｌ−te
rt−ロイシンの蓄積量がさらに向上することを見いだ
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、ＤＬ−５−tert−ブ
チルヒダントインをＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシ
ンに変換する能力を有するバチルス属に属する微生物の
菌体または菌体処理物をＤＬ−５−tert−ブチルヒダン
トインに作用させ、生成するＮ−カルバミル−Ｌ−tert
−ロイシンを採取することを特徴とするＮ−カルバミル
−Ｌ−tert−ロイシンの製造方法を提供するものであ
る。また、本発明は、ＤＬ−５−tert−ブチルヒダント
インをＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する
能力を有するバチルス属に属する微生物の菌体または菌
体処理物を該微生物の代謝エネルギー源となる物質の存
在下にてＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインに作用せ
しめることを特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロ
イシンの製造方法を提供するものである。

【０００７】以下、本発明を逐次説明する。本発明で使
用する、ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインをＮ−カ
ルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する能力を有する
バチルス属に属する微生物としては、例えば特開昭６３
−２４８９５号公報記載のバチルス・ブレビス ＡＪ１
２２９９（ＦＥＲＭ Ｐ−８８３７）を例示することが
できる。また、この微生物より自然変異、化学変異剤に
よる処理、または紫外線照射等の方法により誘導された
変異株であっても、ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントイ
ンをＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する能
力を有する限り差し支えないことはもちろんである。

【０００８】このような微生物の菌体を得るには、当該
微生物を適当な液体培地中にて培養増殖せしめるとよ
い。そのような培地には格別の制限はなく、当該微生物
が利用可能な炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要
に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。

【０００９】炭素源としては、グルコース等の炭水化
物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が
適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無
機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオ
ン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その
他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、
ビタミン、アミノ酸等、またはこれらを含有する酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、
カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。

【００１０】培地にはさらに５−ブチルヒダントイン等
の５−置換ヒダントインを少量添加すれば、ＤＬ−５−
tert−ブチルヒダントインをＮ−カルバミル−Ｌ−tert
−ロイシンに変換する活性の高い菌体が得られる場合が
ある。

【００１１】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下にて、pH５ないし８、温度25ないし40℃の
範囲内でpH及び温度を適当に制御しつつ、12ないし48時
間程度培養を行なえばよい。

【００１２】かくして得られる菌体または菌体処理物を
適当な水性媒体中にて５−tert−ブチルヒダントインに
作用せしめることにより、そのヒダントイン環が光学特
異的に開裂加水分解され、Ｎ−カルバミル−Ｌ−tert−
ロイシンが効率よく生成される。

【００１３】５−tert−ブチルヒダントインに作用せし
めるべき菌体としては、菌体を含む培養液をそのまま用
いてもよい。また、菌体を一旦培養液より分離して洗浄
または洗浄せずに使用してもよい。菌体処理物として
は、凍結乾燥菌体、アセトン処理菌体、界面活性剤やト
ルエン等で処理した菌体、その他が適宜用いられる。さ
らには、菌体をカラギーナンなどの高分子に包括させて
固定化した固定化菌体としても使用できる。菌体または
菌体処理物の使用量は所与の反応の場合において目的と
する効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有
効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求め
られるが、例えば洗浄湿潤菌体の場合は反応液１dl当り
１ないし40ｇである。

【００１４】ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインの濃
度は、反応混合物全量（重量）の0.1ないし30％、好ま
しくは0.1ないし10％であるが、必要ならば、例えば高
濃度だと反応を阻害するような場合には、ＤＬ−５−te
rt−ブチルヒダントインを反応の間、追補添加すること
ができる。

【００１５】また、本発明で使用する微生物の代謝エネ
ルギー源となる物質を反応混合物に添加し、さらに振と
うもしくは通気攪拌操作によって酸素を供給しつつ反応
を行うことによりＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシン
の生成収率が上昇する場合がある。

【００１６】添加する代謝エネルギー源となる物質とし
ては、当該微生物が代謝エネルギー源として利用でき、
反応中に消費されたＡＴＰを菌体内を含めて反応液中で
再生できるような物質であれば、炭水化物、アルコール
類、有機酸等のいずれでもよく、グルコース、フルクト
ース、グリセロール、エタノール、マンニトール、コハ
ク酸、フマル酸、クエン酸、酢酸及びこれらの混合物を
例示することができる。代謝エネルギー源となる物質の
使用量も所与の反応の場合において目的とする効果を発
揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者
であれば簡単な予備実験により容易に求めることができ
る。エネルギー源物質は、反応開始時に添加してもよい
し、反応途中で添加してもよい。

【００１７】さらに、反応混合物には界面活性剤、有機
溶媒、補酵素、ヒドロキシルアミン、コバルトイオンそ
の他の金属イオン等を添加すると反応収率が向上する場
合がある。

【００１８】反応温度は10ないし70℃、好ましくは20な
いし50℃、反応pHは５ないし11、好ましくは6.5ないし
９であり、かくして５ないし100時間程度反応を行なう
ことにより、Ｌ体の５−tert−ブチルヒダントインが光
学特異的に加水分解される一方、残存するＤ体の５−te
rt−ブチルヒダントインはラセミ化反応によりＬ体へと
変換される結果、反応混合物中に著量のＮ−カルバミル
−Ｌ−tert−ロイシンが生成蓄積する。

【００１９】このようにして生成蓄積したＮ−カルバミ
ル−Ｌ−tert−ロイシンは、必要に応じ反応終了混合物
より分離採取した後に、例えば塩酸存在下にて亜硝酸ナ
トリウムで処理することにより脱カルバミル化されてＬ
−tert−ロイシンに変換することができる。Ｎ−カルバ
ミル−Ｌ−tert−ロイシンを分離採取するには、本発明
の方法によればＮ−カルバミル−Ｄ−tert−ロイシンが
副生しないので、合成吸着樹脂を用いる方法、等電点に
て沈澱せしめる方法等の方法が採用できる。

【００２０】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。なお、Ｎ−カルバミル−Ｌ−tert-ロイシンの定量
は、反応液1.0mlに発色試薬（ρ−ジメチルベンズアル
デヒドを10％(W/V)となるように６Ｎ塩酸に溶解）0.2ml
を添加し、420nmにおける吸光度を測定することにより
行なった。また、Ｎ−カルバミル−tert−ロイシンの光
学純度は、反応液に１／10量(v/v)の濃塩酸と同量の150
mM NaNo₂を添加し４℃にて24時間反応することによりＮ
−カルバミル−tert−ロイシンを化学的に脱カルバミル
化し、tert−ロイシンに変換した後、高速液体クロマト
グラフィー（カラム：三菱化成社製 MCI GEL CRS 10W、
溶離液：２mM CuSO₄／メタノール＝９／１、流速1.0m
l、温度25℃、検出254nm）により行った。

【００２１】実施例１ マルトース 0.2g/dl、(NH₄)₂SO₄ 0.5g/dl、KH₂PO₄ 0.1g
/dl、K₂HPO₄ 0.3g/dl、MgSO₄・7H₂O 0.05g/dl、FeSO₄・
7H₂O １mg/dl、MnSO₄・4H₂O １mg/dl、酵母エキス 1.0g
/dl、ポリペプトン 1.0g/dl、ＤＬ−５−ブチルヒダン
トイン 0.3g/dlを含む培地（pH7.0）を500ml容フラスコ
に50ml入れ、120℃で15分間加熱殺菌した。

【００２２】これに予めブイヨン寒天培地で30℃にて24
時間培養したバチルス・ブレビスＡＪ１２２９９（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−８８３７）の菌体を一白金耳量接種し、30℃
にて16時間振とう培養した。この培養液より菌体を遠心
分離し、培養液と同量の0.1Ｍリン酸緩衝溶液（pH7.0）
で二回洗浄し、再び遠心分離して菌体を集めた。この菌
体をＤＬ−５−tert−ブチルヒダントイン 0.3g/dl、グ
ルコース 1.0g/dl、MgSO₄・7H₂O 0.05g/dlを含む0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH7.0）に添加し、50mlとした後、30℃
にて24時間振とう反応した。この結果、0.3g/dlのＮ−
カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンが生成していた。

【００２３】実施例２ 実施例１と同様に菌体を調製し、この菌体をＤＬ−５−
tert−ブチルヒダントイン 1.0g/dl、MgSO₄・7H₂O 0.05
g/dl、各種代謝エネルギー源物質 1.0g/dlを含む0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH7.0）に添加し、50mlとした後、30℃
にて72時間振とう反応した。その結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ＤＬ体のtert−
ブチルヒダントインより効率よくＬ体のＮ−カルバミル
−tert−ロイシンを製造することができ、しかも工業生
産に適した高い濃度で得ることができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインを
   Ｎ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する能力を
   有するバチルス属に属する微生物の菌体または菌体処理
   物をＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインに作用せしめ
   ることを特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシ
   ンの製造方法。
2. 【請求項２】 ＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインを
   Ｎ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシンに変換する能力を
   有するバチルス属に属する微生物の菌体または菌体処理
   物を該微生物の代謝エネルギー源となる物質の存在下に
   てＤＬ−５−tert−ブチルヒダントインに作用せしめる
   ことを特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−tert−ロイシン
   の製造方法。