JPH0722509B2 - 温度感受性リプレツサ−とこれを利用した遺伝子の発現方法 - Google Patents
温度感受性リプレツサ−とこれを利用した遺伝子の発現方法Info
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- JPH0722509B2 JPH0722509B2 JP61215094A JP21509486A JPH0722509B2 JP H0722509 B2 JPH0722509 B2 JP H0722509B2 JP 61215094 A JP61215094 A JP 61215094A JP 21509486 A JP21509486 A JP 21509486A JP H0722509 B2 JPH0722509 B2 JP H0722509B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、温度感受性リプレッサーと、これを利用した
遺伝子の発現方法に関する。この方法を用いれば、有用
遺伝子産物の生産を温度によって調節することが可能と
なる。
遺伝子の発現方法に関する。この方法を用いれば、有用
遺伝子産物の生産を温度によって調節することが可能と
なる。
従来の技術 近年、有用な遺伝情報を担うDNAを含有するプラスミド
で微生物を形質転換し、有用な遺伝子産物を微生物に生
産させることが可能となった。現在までに、種々の微生
物由来タンパク質は言うに及ばず、哺乳類の如くきわめ
てかけ離れた種類の生物が生産するペプチド、例えば生
長ホルモン、インシュリン、リンフォカインなどまで生
産させうることが報告されている。この有用遺伝子産物
の生産に際しては、生産を調節並びに制御する系を宿主
に担わせることは極めて好都合なことである。このよう
な調節系が存在しない場合には、有用遺伝子産物の構成
物生産が宿主の増殖速度、あるいは生存そのものにさえ
ダメージを与えることが多いことが知られている。この
ような調節系としては、グラム陰性細菌である大腸菌で
は、lacオペロンのプロモーター／オペレーターを利用
したもの（Itakura,K.,et al.,Science,198,1056.197
7）や、ラムダファージのPLプロモーター／オペレータ
ーを利用したもの（Derynck.,R.,et al.,Nature,287,19
3,1980）など多数報告されている。しかし、グラム陽性
細菌であり、その安全性やタンパク質の生産能力の高さ
及び培地への分泌生産の可能性から工業上重要な微生物
と考えられているBacillus属細菌においては、trpプロ
モーター／オペレーターを利用したもの（Shimotsu,H.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,503,1984）など数
種の例が報告されているにすぎなかった。しかもそれら
はすべて発現調節のために例えばインドールアクリル酸
などのような誘導試薬を添加する必要があり、さらに簡
便で、しかも生産物の精製もより容易となるような調節
方法が望まれた。
で微生物を形質転換し、有用な遺伝子産物を微生物に生
産させることが可能となった。現在までに、種々の微生
物由来タンパク質は言うに及ばず、哺乳類の如くきわめ
てかけ離れた種類の生物が生産するペプチド、例えば生
長ホルモン、インシュリン、リンフォカインなどまで生
産させうることが報告されている。この有用遺伝子産物
の生産に際しては、生産を調節並びに制御する系を宿主
に担わせることは極めて好都合なことである。このよう
な調節系が存在しない場合には、有用遺伝子産物の構成
物生産が宿主の増殖速度、あるいは生存そのものにさえ
ダメージを与えることが多いことが知られている。この
ような調節系としては、グラム陰性細菌である大腸菌で
は、lacオペロンのプロモーター／オペレーターを利用
したもの（Itakura,K.,et al.,Science,198,1056.197
7）や、ラムダファージのPLプロモーター／オペレータ
ーを利用したもの（Derynck.,R.,et al.,Nature,287,19
3,1980）など多数報告されている。しかし、グラム陽性
細菌であり、その安全性やタンパク質の生産能力の高さ
及び培地への分泌生産の可能性から工業上重要な微生物
と考えられているBacillus属細菌においては、trpプロ
モーター／オペレーターを利用したもの（Shimotsu,H.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,503,1984）など数
種の例が報告されているにすぎなかった。しかもそれら
はすべて発現調節のために例えばインドールアクリル酸
などのような誘導試薬を添加する必要があり、さらに簡
便で、しかも生産物の精製もより容易となるような調節
方法が望まれた。
本発明が解決しようとする問題点 本発明は、工業上重要なBacillus属細菌を宿主として、
温度によって有用遺伝子産物の生産をコントロールでき
る系を提供しようとするものである。
温度によって有用遺伝子産物の生産をコントロールでき
る系を提供しようとするものである。
Bacillus licheniformisのpenP遺伝子は、分泌酵素ペニ
シリナーゼをコードする遺伝子であり、そのシグナル配
列を利用して多くのペプチド分泌用ベクターが構築され
ている（Himeno,T.,etal.,FEMS Microbiol.Lett.,35,1
7,1986）。penPの発現は、これと接して存在するpen I
遺伝子の産物であるリプレッサー蛋白質により調節され
ている。リプレッサー蛋白質はpenPオペレーター部位に
結合してプロモーターの機能を停止させる。
シリナーゼをコードする遺伝子であり、そのシグナル配
列を利用して多くのペプチド分泌用ベクターが構築され
ている（Himeno,T.,etal.,FEMS Microbiol.Lett.,35,1
7,1986）。penPの発現は、これと接して存在するpen I
遺伝子の産物であるリプレッサー蛋白質により調節され
ている。リプレッサー蛋白質はpenPオペレーター部位に
結合してプロモーターの機能を停止させる。
本発明者らは、野生型のpen I遺伝子に突然変異処理を
ほどこし、温度感受性リプレッサーをコードするように
なったpen I（pen Its）を誘導した。温度感受性リプレ
ッサーは温度の変化によってその高次構造が変化し、そ
の機能を失なう蛋白質である。この蛋白質の遺伝情報を
担う遺伝子pen ItsをpenPプロモーター／オペレーター
を挿入したプラスミドに組み込むか、あるいはプロモー
ター／オペレーターを挿入したプラスミドと不和合性の
ないプラスミド上に組み込み、同一のBacillus属宿主に
共存させれば、培養温度の変更によって温度感受性リプ
レッサー蛋白質の活性を変化させ、プロモーターの機能
調節を行なうことが可能な形質発現用の系を造成するこ
とができる。
ほどこし、温度感受性リプレッサーをコードするように
なったpen I（pen Its）を誘導した。温度感受性リプレ
ッサーは温度の変化によってその高次構造が変化し、そ
の機能を失なう蛋白質である。この蛋白質の遺伝情報を
担う遺伝子pen ItsをpenPプロモーター／オペレーター
を挿入したプラスミドに組み込むか、あるいはプロモー
ター／オペレーターを挿入したプラスミドと不和合性の
ないプラスミド上に組み込み、同一のBacillus属宿主に
共存させれば、培養温度の変更によって温度感受性リプ
レッサー蛋白質の活性を変化させ、プロモーターの機能
調節を行なうことが可能な形質発現用の系を造成するこ
とができる。
以下pen Itsの誘導方法について詳しく述べる。B. lich
eniformisのpenP及びPen I遺伝子はともに、4.2kbのEco
R Iフラグメント上にコードされている（Imanaka,T.,et
al.,J.Bacteriol.,147,776,1981）。両遺伝子を含む領
域は制限酵素で切り出してプラスミドベクターに挿入す
ることができる。使用する制限酵素は両遺伝子の内部を
切断しないものならどのような酵素でもよく、またプラ
スミドベクターは、Bacillus属内で増殖できるものなら
ばどのようなプラスミドでもよい。この領域を組み込ん
だプラスミドのBacillus属への形質転換は、プロトプラ
スト法やコンピテント法（Imanaka T.,et al.,J.Bacter
iol.,146,1091,1981）など様々な方法で実施できる。
eniformisのpenP及びPen I遺伝子はともに、4.2kbのEco
R Iフラグメント上にコードされている（Imanaka,T.,et
al.,J.Bacteriol.,147,776,1981）。両遺伝子を含む領
域は制限酵素で切り出してプラスミドベクターに挿入す
ることができる。使用する制限酵素は両遺伝子の内部を
切断しないものならどのような酵素でもよく、またプラ
スミドベクターは、Bacillus属内で増殖できるものなら
ばどのようなプラスミドでもよい。この領域を組み込ん
だプラスミドのBacillus属への形質転換は、プロトプラ
スト法やコンピテント法（Imanaka T.,et al.,J.Bacter
iol.,146,1091,1981）など様々な方法で実施できる。
クローン化されたPen I遺伝子に突然変異をおこすため
の方法は、DNA自体をin vitroで変異させる、例えばヒ
ドロキシアミンなどを使用する方法でもプラスミドを担
わせた形質転換体に例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）など変異剤処理をほど
こした後、プラスミドを取り出して変異プラスミドをス
クリーニングする方法でも、どちらでもかまわない。
の方法は、DNA自体をin vitroで変異させる、例えばヒ
ドロキシアミンなどを使用する方法でもプラスミドを担
わせた形質転換体に例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）など変異剤処理をほど
こした後、プラスミドを取り出して変異プラスミドをス
クリーニングする方法でも、どちらでもかまわない。
変異処理をほどこしたプラスミドで例えばB.subtilisを
形質転換し、ペニシリナーゼのプレートテストをする
と、目的のPen Its遺伝子を含むプラスミドを担った形
質転換株は、高温域では大量のペニシリナーゼを分泌し
て大きなハローを形成するが、低温域では小さなハロー
しか形成できない。低温は30℃以下、高温は35℃以上で
あればよい。
形質転換し、ペニシリナーゼのプレートテストをする
と、目的のPen Its遺伝子を含むプラスミドを担った形
質転換株は、高温域では大量のペニシリナーゼを分泌し
て大きなハローを形成するが、低温域では小さなハロー
しか形成できない。低温は30℃以下、高温は35℃以上で
あればよい。
Pen Its遺伝子を含むプラスミドは、一例としてLovett
らの方法（Levett,P.S.et al.,Methods in Enzymology,
68,342,1979）で大量に調整することができる。組換え
プラスミドから挿入されたDNAフラグメントを得るため
には、制限酵素で切断し、調製用アガロースゲル電気泳
動や調製用アクリルアミドゲル電気泳動を利用すればよ
い。
らの方法（Levett,P.S.et al.,Methods in Enzymology,
68,342,1979）で大量に調整することができる。組換え
プラスミドから挿入されたDNAフラグメントを得るため
には、制限酵素で切断し、調製用アガロースゲル電気泳
動や調製用アクリルアミドゲル電気泳動を利用すればよ
い。
このようにして得られたDNAフラグメントは、一例とし
てマキサムとギルバートの方法（A.W.Maxam et al.,Met
hod in Enzymology,65,499,（1980））によって塩基配
列を決定できる。
てマキサムとギルバートの方法（A.W.Maxam et al.,Met
hod in Enzymology,65,499,（1980））によって塩基配
列を決定できる。
温度感受性リプレッサー蛋白質によってpenPプロモータ
ーの機能を調節する場合、前述のPen Itsのスクリーニ
ングの場合のごとく、Pen ItsとpenPプロモーターを同
一のプラスミドに存在させる方法の他、すでに述べたよ
うに、不和合性のない異種プラスミドに分割して存在さ
せる方法がある。いずれの場合も、penPプロモーターの
下流に有用な遺伝情報を担う遺伝子を挿入すれば、Baci
llus属細菌内で、温度の変化によって発現を調節しなが
ら、有用ペプチドの生産を行うことができるので応用上
有用である。
ーの機能を調節する場合、前述のPen Itsのスクリーニ
ングの場合のごとく、Pen ItsとpenPプロモーターを同
一のプラスミドに存在させる方法の他、すでに述べたよ
うに、不和合性のない異種プラスミドに分割して存在さ
せる方法がある。いずれの場合も、penPプロモーターの
下流に有用な遺伝情報を担う遺伝子を挿入すれば、Baci
llus属細菌内で、温度の変化によって発現を調節しなが
ら、有用ペプチドの生産を行うことができるので応用上
有用である。
実施例１ PenItsの変異誘導と塩基配列 野生型のpenP,Pen I両遺伝子をコードする4.2kbのEcoR
Iフラグメントが組み込まれたプラスミドpTTE 21（T.Im
anaka et al.,J.Bacterial,147,776,1981）から4.2kbの
上記EcoR Iフラグメントを切り出し、EcoR Iで切断した
低コピー数プラスミドpTB522（Imanaka,T.et al.,J.Ge
n.Microbiol.,131,1753,1985）と、T4 DNAリガーゼで結
合される。この反応混合液でB.subtilis MI 113（arg−
15,trp C2,r- M,m- M）を形質転換し、25μg/mlのテトラ
サイクリンを含むＬ寒天培地（１％バクトトリプトン、
0.5％酵母エキス、0.5％NaCl、1.5％寒天、pH7.0）で形
質転換株を選択し、その中からさらに、4.2kbのEcoR I
フラグメントが組み込まれたものを選択した。得られた
プラスミドをpPTB 60と命名する（第１図）。pPTB 60を
担ったB.subtilisMI113を100μg/mlのNTGで30分間処理
した後、25μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ寒天培地
にプレーティングする。出現したコロニーをレプリカ
で、48℃におけるペニシリナーゼのプレートテスト（T.
Imanaka,etal.,J.Bacteriol.,147,776,1981）に供す
る。約150,000コロニーのうち、200コロニーが48℃でpP
TB60を担ったB.subtilisよりも大きなハローを形成し
た。これらのコロニーをさらに30℃におけるプレートテ
ストに使用したところ、２コロニーが不活性のリプレッ
サー遺伝子をもったpPTB50を担ったB.subtilisよりも小
さなハローを形成した。これら２株の候補株をそれぞれ
D13,E24と命名し、プラスミドを抽出し、これでB.subti
lis MI 113を形質転換した。25μg/mlのテトラサイクリ
ンを含むＬ寒天培地で形質転換株を選択した後、同様の
プレートテストをくりかえし、Pen Itsの表現型を確認
した。これらのプラスミドをそれぞれpPTB 60 D13,pPTB
60 E24と命名した（第１図）。
Iフラグメントが組み込まれたプラスミドpTTE 21（T.Im
anaka et al.,J.Bacterial,147,776,1981）から4.2kbの
上記EcoR Iフラグメントを切り出し、EcoR Iで切断した
低コピー数プラスミドpTB522（Imanaka,T.et al.,J.Ge
n.Microbiol.,131,1753,1985）と、T4 DNAリガーゼで結
合される。この反応混合液でB.subtilis MI 113（arg−
15,trp C2,r- M,m- M）を形質転換し、25μg/mlのテトラ
サイクリンを含むＬ寒天培地（１％バクトトリプトン、
0.5％酵母エキス、0.5％NaCl、1.5％寒天、pH7.0）で形
質転換株を選択し、その中からさらに、4.2kbのEcoR I
フラグメントが組み込まれたものを選択した。得られた
プラスミドをpPTB 60と命名する（第１図）。pPTB 60を
担ったB.subtilisMI113を100μg/mlのNTGで30分間処理
した後、25μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ寒天培地
にプレーティングする。出現したコロニーをレプリカ
で、48℃におけるペニシリナーゼのプレートテスト（T.
Imanaka,etal.,J.Bacteriol.,147,776,1981）に供す
る。約150,000コロニーのうち、200コロニーが48℃でpP
TB60を担ったB.subtilisよりも大きなハローを形成し
た。これらのコロニーをさらに30℃におけるプレートテ
ストに使用したところ、２コロニーが不活性のリプレッ
サー遺伝子をもったpPTB50を担ったB.subtilisよりも小
さなハローを形成した。これら２株の候補株をそれぞれ
D13,E24と命名し、プラスミドを抽出し、これでB.subti
lis MI 113を形質転換した。25μg/mlのテトラサイクリ
ンを含むＬ寒天培地で形質転換株を選択した後、同様の
プレートテストをくりかえし、Pen Itsの表現型を確認
した。これらのプラスミドをそれぞれpPTB 60 D13,pPTB
60 E24と命名した（第１図）。
B.subtilis MI 113/pPTB 60 D13とB.subtilis MI 113/p
PTB 60 E24は、それぞれFERM P−8963（AJ12304）,FERM
P−8964（AJ12305）として微工研に寄託されている。
PTB 60 E24は、それぞれFERM P−8963（AJ12304）,FERM
P−8964（AJ12305）として微工研に寄託されている。
実施例２ Pen ItsプラスミドをもったB.subtilisにおけるペニシ
リナーゼ遺伝子の発現 実施例１で誘導したPen Itsが予想通りに機能するかど
うか検討を加えるために、以下のようにして液体培地中
でのペニシリナーゼの生産を調べた。
リナーゼ遺伝子の発現 実施例１で誘導したPen Itsが予想通りに機能するかど
うか検討を加えるために、以下のようにして液体培地中
でのペニシリナーゼの生産を調べた。
プラスミドpPTB 60 D13,pPTB 60 E24,pPTB 50もしくはp
PTB 60を担ったB.subtilis MI 113をＬ培地で37℃一晩
培養し、おのおのを25μg/mlのテトラサイクリンを含む
Ｌ培地に１％接種した。それぞれを30,37,42,そして48
℃で0.D660１まで培養し、ペニシリナーゼ活性を測定
した（T.Imanaka et al.,J.Bacteriol.,147,776,198
1）。この結果を表１に示した。
PTB 60を担ったB.subtilis MI 113をＬ培地で37℃一晩
培養し、おのおのを25μg/mlのテトラサイクリンを含む
Ｌ培地に１％接種した。それぞれを30,37,42,そして48
℃で0.D660１まで培養し、ペニシリナーゼ活性を測定
した（T.Imanaka et al.,J.Bacteriol.,147,776,198
1）。この結果を表１に示した。
プラスミドpPTB 60とpPTB 50は、完全なリプレッション
と完全なデリプレッションのコントロールとして用い
た。
と完全なデリプレッションのコントロールとして用い
た。
表１の結果は、Pen Itsのコードするリプレッサーを使
えば、ペニシリナーゼの生産、さらに言えばpenPプロモ
ーターの活性を温度によってコントロールできることを
示している。
えば、ペニシリナーゼの生産、さらに言えばpenPプロモ
ーターの活性を温度によってコントロールできることを
示している。
第１図はプラスミドpPTB 50,pPTB 60,pPTB 60 D13とpPT
B 60 E24の制限酵素切断地図を示す。図中の記号はE;Ec
oR I,H;Hind III,P;Pst Iの切断部位をそれぞれ示す。 第２図は野生型のPen I遺伝子とその温度感受性変異遺
伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。蛋白質のコード
されている領域の最初の塩基を＋１とした。コードされ
ている領域のアミノ酸配列は下に記した。pPTB 60 D13
（D13）とpPTB 60 E24（E24）における塩基置換は野生
型遺伝子の塩基配列上段に印した。またこれに相当する
アミノ酸置換を野性型遺伝子産物のアミノ酸配列下段に
印した。
B 60 E24の制限酵素切断地図を示す。図中の記号はE;Ec
oR I,H;Hind III,P;Pst Iの切断部位をそれぞれ示す。 第２図は野生型のPen I遺伝子とその温度感受性変異遺
伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。蛋白質のコード
されている領域の最初の塩基を＋１とした。コードされ
ている領域のアミノ酸配列は下に記した。pPTB 60 D13
（D13）とpPTB 60 E24（E24）における塩基置換は野生
型遺伝子の塩基配列上段に印した。またこれに相当する
アミノ酸置換を野性型遺伝子産物のアミノ酸配列下段に
印した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】下記の式で示されるアミノ酸配列を有する
リプレッサーをコードするDNA。 但し、ＸはAla以外のアミノ酸、ＹはPro以外のアミノ酸
を示す。 - 【請求項２】下記の式で示されるアミノ酸配列を有する
リプレッサーをコードするDNAを含有するベクター。 但し、ＸはAla以外のアミノ酸、ＹはPro以外のアミノ酸
を示す。 - 【請求項３】下記の式で示されるアミノ酸配列を有する
リプレッサーをコードするDNAを含有するベクターを保
持するバチルス属細菌。 但し、ＸはAla以外のアミノ酸、ＹはPro以外のアミノ酸
を示す。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215094A JPH0722509B2 (ja) | 1986-09-12 | 1986-09-12 | 温度感受性リプレツサ−とこれを利用した遺伝子の発現方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61215094A JPH0722509B2 (ja) | 1986-09-12 | 1986-09-12 | 温度感受性リプレツサ−とこれを利用した遺伝子の発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6371178A JPS6371178A (ja) | 1988-03-31 |
| JPH0722509B2 true JPH0722509B2 (ja) | 1995-03-15 |
Family
ID=16666653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61215094A Expired - Fee Related JPH0722509B2 (ja) | 1986-09-12 | 1986-09-12 | 温度感受性リプレツサ−とこれを利用した遺伝子の発現方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0722509B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888775A (en) * | 1994-04-29 | 1999-03-30 | Dade International Inc | Peptide synthesis and purification by fusion to penI protein or precipitation effective portion thereof |
-
1986
- 1986-09-12 JP JP61215094A patent/JPH0722509B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6371178A (ja) | 1988-03-31 |
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