JPH07227299A - Ｄｎａの特定塩基配列の検出方法及びその装置 - Google Patents
Ｄｎａの特定塩基配列の検出方法及びその装置Info
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- JPH07227299A JPH07227299A JP6040556A JP4055694A JPH07227299A JP H07227299 A JPH07227299 A JP H07227299A JP 6040556 A JP6040556 A JP 6040556A JP 4055694 A JP4055694 A JP 4055694A JP H07227299 A JPH07227299 A JP H07227299A
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-
- G—PHYSICS
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＤＮＡに化学物質をラベルする操作を不要に
して、簡便に特定塩基配列を検出できるようにする。 【構成】 検出しようとするＤＮＡの特定塩基配列を有
する単鎖ＤＮＡ７０を含む溶液に正電荷金コロイド７２
を混合してＤＮＡプローブ７４を作成する。温調セル７
８に検体ＤＮＡ７６とＤＮＡプローブ７４を入れ、９０
〜９５℃に昇温して検体ＤＮＡを解裂させ、その後、徐
々に温度を下げて３７〜７０℃で数分〜１時間インキュ
ベーションを行なう。このとき、検体ＤＮＡ７６にＤＮ
Ａプローブ７４の単鎖ＤＮＡに対応した塩基配列が含ま
れている場合は、検体ＤＮＡ７６の単鎖ＤＮＡ７６ａと
ＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡとがハイブリダイゼー
ションを起こしてＤＮＡプローブに二本鎖ＤＮＡが形成
される。
して、簡便に特定塩基配列を検出できるようにする。 【構成】 検出しようとするＤＮＡの特定塩基配列を有
する単鎖ＤＮＡ７０を含む溶液に正電荷金コロイド７２
を混合してＤＮＡプローブ７４を作成する。温調セル７
８に検体ＤＮＡ７６とＤＮＡプローブ７４を入れ、９０
〜９５℃に昇温して検体ＤＮＡを解裂させ、その後、徐
々に温度を下げて３７〜７０℃で数分〜１時間インキュ
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Ａプローブ７４の単鎖ＤＮＡに対応した塩基配列が含ま
れている場合は、検体ＤＮＡ７６の単鎖ＤＮＡ７６ａと
ＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡとがハイブリダイゼー
ションを起こしてＤＮＡプローブに二本鎖ＤＮＡが形成
される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの特定塩基配列を
検出する方法とその方法に使用する装置に関するもので
ある。ＤＮＡの特定塩基配列の検出は、臨床検査、遺伝
子診断、病理学の研究、医薬品の品質管理などの分野で
利用される。
検出する方法とその方法に使用する装置に関するもので
ある。ＤＮＡの特定塩基配列の検出は、臨床検査、遺伝
子診断、病理学の研究、医薬品の品質管理などの分野で
利用される。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの特定塩基配列を検出する方法と
しては、サザンプロット法や液相ハイブリダイゼーショ
ン法が主流である。これらの方法はＢ／Ｆ分離を必要と
し、処理が複雑になる問題がある。そこで、Ｂ／Ｆ分離
を必要としない特定塩基配列の検出方法として、螢光標
識された単鎖（一本鎖）ＤＮＡプローブと、そのＤＮＡ
プローブの単鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を含む単鎖Ｄ
ＮＡを分子量の大きい固定化担体に結合させた固定化試
薬とを用い、検体中のＤＮＡとＤＮＡプローブを固定化
試薬に競合反応させ、蛍光偏光度により検出する方法が
提案されている（特開平５−１２３１９６号公報参
照）。
しては、サザンプロット法や液相ハイブリダイゼーショ
ン法が主流である。これらの方法はＢ／Ｆ分離を必要と
し、処理が複雑になる問題がある。そこで、Ｂ／Ｆ分離
を必要としない特定塩基配列の検出方法として、螢光標
識された単鎖（一本鎖）ＤＮＡプローブと、そのＤＮＡ
プローブの単鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を含む単鎖Ｄ
ＮＡを分子量の大きい固定化担体に結合させた固定化試
薬とを用い、検体中のＤＮＡとＤＮＡプローブを固定化
試薬に競合反応させ、蛍光偏光度により検出する方法が
提案されている（特開平５−１２３１９６号公報参
照）。
【０００３】一方、分子の振動スペクトルを測定する方
法として表面増感ラマン分光法が行なわれている。この
方法では金、銀などの貴金属電極やコロイドの表面に物
質が吸着すると強いラマン散乱が起こる現象を利用して
いる（例えば、「ぶんせき」誌、５７７〜５８５頁（１
９９３年）参照）。表面増感ラマン分光法を用いてタン
パク質やビリルビンなどの研究が行なわれている。表面
増感ラマン散乱が起れば振動スペクトルが１０7〜１０8
倍に増強されることが知られており、高感度な測定を行
なうことができる。
法として表面増感ラマン分光法が行なわれている。この
方法では金、銀などの貴金属電極やコロイドの表面に物
質が吸着すると強いラマン散乱が起こる現象を利用して
いる（例えば、「ぶんせき」誌、５７７〜５８５頁（１
９９３年）参照）。表面増感ラマン分光法を用いてタン
パク質やビリルビンなどの研究が行なわれている。表面
増感ラマン散乱が起れば振動スペクトルが１０7〜１０8
倍に増強されることが知られており、高感度な測定を行
なうことができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】螢光標識されたＤＮＡ
プローブと固定化された相補ＤＮＡを用いる提案の方法
は、ＤＮＡに種々の化学物質をラベルする必要があり、
処理が複雑で簡便性に欠ける問題がある。本発明の第１
の目的は、ＤＮＡに化学物質をラベルする操作を不要に
して、簡便に特定塩基配列を検出できる方法を提供する
ことである。本発明の第２の目的は、そのような特定塩
基配列検出方法を実現する装置を提供することである。
プローブと固定化された相補ＤＮＡを用いる提案の方法
は、ＤＮＡに種々の化学物質をラベルする必要があり、
処理が複雑で簡便性に欠ける問題がある。本発明の第１
の目的は、ＤＮＡに化学物質をラベルする操作を不要に
して、簡便に特定塩基配列を検出できる方法を提供する
ことである。本発明の第２の目的は、そのような特定塩
基配列検出方法を実現する装置を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の塩基配列検出方
法は、検出しようとするＤＮＡの特徴的な塩基配列を有
する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子をラベルしたもの
をＤＮＡプローブとし、被測定ＤＮＡを昇温により単鎖
ＤＮＡに解裂させる工程、その解裂工程の前又は後で前
記ＤＮＡプローブを被測定ＤＮＡと混合する工程、解裂
した被測定ＤＮＡとＤＮＡプローブとの混合溶液の温度
を下げてＤＮＡプローブの単鎖ＤＮＡをそれと相補的な
塩基配列を含む被測定ＤＮＡの単鎖ＤＮＡと結合させる
ハイブリダイゼーション工程、及びその後前記コロイド
に励起光を照射して発生したラマン散乱光を測定する工
程を含んでいる。ＤＮＡプローブは単鎖ＤＮＡに金、
銀、銅などの貴金属コロイド粒子を結合させたものであ
る。そのコロイドの粒径は１〜５０ｎｍが適当である。
法は、検出しようとするＤＮＡの特徴的な塩基配列を有
する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子をラベルしたもの
をＤＮＡプローブとし、被測定ＤＮＡを昇温により単鎖
ＤＮＡに解裂させる工程、その解裂工程の前又は後で前
記ＤＮＡプローブを被測定ＤＮＡと混合する工程、解裂
した被測定ＤＮＡとＤＮＡプローブとの混合溶液の温度
を下げてＤＮＡプローブの単鎖ＤＮＡをそれと相補的な
塩基配列を含む被測定ＤＮＡの単鎖ＤＮＡと結合させる
ハイブリダイゼーション工程、及びその後前記コロイド
に励起光を照射して発生したラマン散乱光を測定する工
程を含んでいる。ＤＮＡプローブは単鎖ＤＮＡに金、
銀、銅などの貴金属コロイド粒子を結合させたものであ
る。そのコロイドの粒径は１〜５０ｎｍが適当である。
【０００６】ＤＮＡプローブに対応した塩基配列を検出
する好ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程の前
のＤＮＡプローブによるラマン散乱光とハイブリダイゼ
ーション工程の後のＤＮＡプローブによるラマン散乱光
とを分光し、両ラマン散乱光のスペクトルの特徴の差に
より行なう方法である。本発明はＢ／Ｆ分離を行なう不
均一系検出方法に適用されることを排除するものではな
いが、ハイブリダイゼーション工程の後、Ｂ／Ｆ分離を
行なわなくてもラマン散乱光を測定することができる。
する好ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程の前
のＤＮＡプローブによるラマン散乱光とハイブリダイゼ
ーション工程の後のＤＮＡプローブによるラマン散乱光
とを分光し、両ラマン散乱光のスペクトルの特徴の差に
より行なう方法である。本発明はＢ／Ｆ分離を行なう不
均一系検出方法に適用されることを排除するものではな
いが、ハイブリダイゼーション工程の後、Ｂ／Ｆ分離を
行なわなくてもラマン散乱光を測定することができる。
【０００７】本発明の塩基配列検出装置は、被測定ＤＮ
Ａと検出しようとするＤＮＡの特徴的な塩基配列を有す
る単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子をラベルしたＤＮＡ
プローブとを収容でき、温度センサ及び加熱・冷却手段
を備えたセルと、そのセル内の試料に励起光を照射する
光源部と、そのセル内の試料からのラマン散乱光を分光
して測定する分光測定部と、そのセルの温度センサと加
熱・冷却手段によりそのセルの温度を予定のプログラム
に従って変化させる温度コントローラとを備えている。
Ａと検出しようとするＤＮＡの特徴的な塩基配列を有す
る単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子をラベルしたＤＮＡ
プローブとを収容でき、温度センサ及び加熱・冷却手段
を備えたセルと、そのセル内の試料に励起光を照射する
光源部と、そのセル内の試料からのラマン散乱光を分光
して測定する分光測定部と、そのセルの温度センサと加
熱・冷却手段によりそのセルの温度を予定のプログラム
に従って変化させる温度コントローラとを備えている。
【０００８】
【作用】図１（Ａ）は検出しようとするＤＮＡの特定塩
基配列を有する単鎖ＤＮＡ７０を含む溶液に正電荷金コ
ロイド７２を混合してＤＮＡプローブ７４を作成するプ
ロセスを示している。
基配列を有する単鎖ＤＮＡ７０を含む溶液に正電荷金コ
ロイド７２を混合してＤＮＡプローブ７４を作成するプ
ロセスを示している。
【０００９】図１（Ｂ）はＤＮＡプローブ７４の単鎖Ｄ
ＮＡに対応した塩基配列を検出する方法を示したもので
あり、温調セル７８に測定しようとする検体ＤＮＡ７６
を入れ、トリス−塩酸緩衝液や燐酸緩衝液により溶液の
ｐＨを４〜８.５に調製し、それにＤＮＡプローブ７４
を混合する。その温調セル７８を９０〜９５℃に昇温し
検体ＤＮＡを解裂させて単鎖ＤＮＡ７６ａに変成させ
る。その後、徐々に温度を下げて３７〜７０℃で数分〜
１時間インキュベーションを行なう。このとき、検体Ｄ
ＮＡ７６にＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡに対応した
塩基配列が含まれている場合は、検体ＤＮＡ７６の単鎖
ＤＮＡ７６ａとＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡとがハ
イブリダイゼーションを起こしてＤＮＡプローブに二本
鎖ＤＮＡが形成される。８０はＤＮＡプローブに二本鎖
ＤＮＡが形成されたものを表わしている。
ＮＡに対応した塩基配列を検出する方法を示したもので
あり、温調セル７８に測定しようとする検体ＤＮＡ７６
を入れ、トリス−塩酸緩衝液や燐酸緩衝液により溶液の
ｐＨを４〜８.５に調製し、それにＤＮＡプローブ７４
を混合する。その温調セル７８を９０〜９５℃に昇温し
検体ＤＮＡを解裂させて単鎖ＤＮＡ７６ａに変成させ
る。その後、徐々に温度を下げて３７〜７０℃で数分〜
１時間インキュベーションを行なう。このとき、検体Ｄ
ＮＡ７６にＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡに対応した
塩基配列が含まれている場合は、検体ＤＮＡ７６の単鎖
ＤＮＡ７６ａとＤＮＡプローブ７４の単鎖ＤＮＡとがハ
イブリダイゼーションを起こしてＤＮＡプローブに二本
鎖ＤＮＡが形成される。８０はＤＮＡプローブに二本鎖
ＤＮＡが形成されたものを表わしている。
【００１０】ＤＮＡプローブを検体ＤＮＡと混合するタ
イミングは、まずセル７８に検体ＤＮＡを入れて９０〜
９５℃に昇温し、検体ＤＮＡを単鎖ＤＮＡに解裂させた
後であってもよい。
イミングは、まずセル７８に検体ＤＮＡを入れて９０〜
９５℃に昇温し、検体ＤＮＡを単鎖ＤＮＡに解裂させた
後であってもよい。
【００１１】検体ＤＮＡ中にＤＮＡプローブの単鎖ＤＮ
Ａに対応した特定塩基配列のＤＮＡが存在するか否かを
検出するには、ハイブリダイゼーション工程前のＤＮＡ
プローブを含む溶液と、ハイブリダイゼーション工程後
のＤＮＡプローブを含む溶液とに励起光を照射し、それ
ぞれの溶液からのラマン散乱光を分光する。被測定ＤＮ
Ａ物質によるラマン光は貴金属コロイド粒子の存在によ
って増強ラマン光となる。ハイブリダイゼーションによ
り二本鎖ＤＮＡが形成された場合には、ハイブリダイゼ
ーションの前後で異なるラマンスペクトルが得られる。
Ａに対応した特定塩基配列のＤＮＡが存在するか否かを
検出するには、ハイブリダイゼーション工程前のＤＮＡ
プローブを含む溶液と、ハイブリダイゼーション工程後
のＤＮＡプローブを含む溶液とに励起光を照射し、それ
ぞれの溶液からのラマン散乱光を分光する。被測定ＤＮ
Ａ物質によるラマン光は貴金属コロイド粒子の存在によ
って増強ラマン光となる。ハイブリダイゼーションによ
り二本鎖ＤＮＡが形成された場合には、ハイブリダイゼ
ーションの前後で異なるラマンスペクトルが得られる。
【００１２】ラマン光の与える情報は分子の振動スペク
トルであり、これは分子の立体構造や電子状態に敏感に
依存する。その特徴は、分子振動中のエネルギーの変化
によって決まるラマン振動数が物質を構成する電子振動
エネルギー準位差に対応することにある。ラマン散乱光
から得られる振動スペクトルは、分子の個性に敏感であ
り、分子の基準振動解析の理論及び分析処理などの手段
により、分子を同定する際の高精度で、かつ有力な手段
である。したがって、分子スペクトルから分子構造を推
定したり、濃度を測定することもできる。
トルであり、これは分子の立体構造や電子状態に敏感に
依存する。その特徴は、分子振動中のエネルギーの変化
によって決まるラマン振動数が物質を構成する電子振動
エネルギー準位差に対応することにある。ラマン散乱光
から得られる振動スペクトルは、分子の個性に敏感であ
り、分子の基準振動解析の理論及び分析処理などの手段
により、分子を同定する際の高精度で、かつ有力な手段
である。したがって、分子スペクトルから分子構造を推
定したり、濃度を測定することもできる。
【００１３】貴金属コロイドが結合したＤＮＡプローブ
が単鎖ＤＮＡの状態と、それに相補的な塩基配列をもつ
被測定ＤＮＡ中の単鎖ＤＮＡがハイブリダイゼーション
により二本鎖ＤＮＡとなった状態とでは、分子の構造が
異なるので、ラマンスペクトルが異なってくる。ハイブ
リダイゼーションによってＤＮＡプローブに二本鎖ＤＮ
Ａが形成されると、検出感度も異なることがある。
が単鎖ＤＮＡの状態と、それに相補的な塩基配列をもつ
被測定ＤＮＡ中の単鎖ＤＮＡがハイブリダイゼーション
により二本鎖ＤＮＡとなった状態とでは、分子の構造が
異なるので、ラマンスペクトルが異なってくる。ハイブ
リダイゼーションによってＤＮＡプローブに二本鎖ＤＮ
Ａが形成されると、検出感度も異なることがある。
【００１４】このように、ＤＮＡプローブに二本鎖ＤＮ
Ａが形成されると、ラマンスペクトルのピーク位置の変
化によって、又は検出感度の変化も加味することによ
り、被測定ＤＮＡ中に特定塩基配列をもつものが含まれ
ていたかを検出することができる。
Ａが形成されると、ラマンスペクトルのピーク位置の変
化によって、又は検出感度の変化も加味することによ
り、被測定ＤＮＡ中に特定塩基配列をもつものが含まれ
ていたかを検出することができる。
【００１５】
【実施例】単鎖ＤＮＡをコロイド粒子に結合させるに
は、コロイド粒子を正に帯電させ、それに負に帯電した
単鎖ＤＮＡを静電気と疎水的により結合させることがで
きる。正に帯電した金コロイドは、例えばBioCell社か
ら”GENOGOLD”（登録商標）という名称で市販されてい
る。単鎖ＤＮＡをそのような正電荷金コロイドと混和す
ると、単鎖ＤＮＡに金コロイドが結合したＤＮＡプロー
ブを容易に得ることができる。コロイド粒子と結合しな
かった未反応の単鎖ＤＮＡは、超遠心分離、ゲルろ過又
は高速液体クロマトグラフィにより除去する。ＤＮＡプ
ローブは、検体中に存在する測定対象以外のＤＮＡの金
コロイドへの非特異吸着を阻止するために、ＢＳＡ、カ
ゼインなどのタンパク質溶液や、反応溶液のｐＨより低
い等電点をもつタンパク質溶液でブロッキングしておく
のが好ましい。
は、コロイド粒子を正に帯電させ、それに負に帯電した
単鎖ＤＮＡを静電気と疎水的により結合させることがで
きる。正に帯電した金コロイドは、例えばBioCell社か
ら”GENOGOLD”（登録商標）という名称で市販されてい
る。単鎖ＤＮＡをそのような正電荷金コロイドと混和す
ると、単鎖ＤＮＡに金コロイドが結合したＤＮＡプロー
ブを容易に得ることができる。コロイド粒子と結合しな
かった未反応の単鎖ＤＮＡは、超遠心分離、ゲルろ過又
は高速液体クロマトグラフィにより除去する。ＤＮＡプ
ローブは、検体中に存在する測定対象以外のＤＮＡの金
コロイドへの非特異吸着を阻止するために、ＢＳＡ、カ
ゼインなどのタンパク質溶液や、反応溶液のｐＨより低
い等電点をもつタンパク質溶液でブロッキングしておく
のが好ましい。
【００１６】単鎖ＤＮＡをコロイド粒子に結合させる他
の方法として、マレイミド基を結合させたコロイド粒子
（ナノプローブ社）に、ＳＨ基を導入させた単鎖ＤＮＡ
をマレイミド反応させて、コロイド粒子に単鎖ＤＮＡを
共有結合させる方法もある。また、ストレプトアビジン
結合コロイド粒子（ナノプローブ社、ザイメット社、Ｅ
・Ｙラボラトリーズ社）に、ビオチンを導入させた単鎖
ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合させて、コロイド粒子
に単鎖ＤＮＡを結合させることもできる。
の方法として、マレイミド基を結合させたコロイド粒子
（ナノプローブ社）に、ＳＨ基を導入させた単鎖ＤＮＡ
をマレイミド反応させて、コロイド粒子に単鎖ＤＮＡを
共有結合させる方法もある。また、ストレプトアビジン
結合コロイド粒子（ナノプローブ社、ザイメット社、Ｅ
・Ｙラボラトリーズ社）に、ビオチンを導入させた単鎖
ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合させて、コロイド粒子
に単鎖ＤＮＡを結合させることもできる。
【００１７】図２に本発明の一実施例の免疫分析装置を
示す。加熱用のヒータと冷却用のペルチェ素子を備えた
温調セル８０には、検体ＤＮＡと検出しようとするＤＮ
Ａの特定塩基配列を有するＤＮＡプローブを含む試料１
５が収容されている。６７はセル８０の温度を検出する
温度センサ装置であり、その温度センサ装置６７の検出
信号が温度コントロール装置８４に入力され、温度コン
トロール装置８４によりセル８０の温度が検体ＤＮＡを
解裂させるのに必要な温度まで上昇され、その後ハイブ
リダイゼーションのための温度まで降温するように制御
される。
示す。加熱用のヒータと冷却用のペルチェ素子を備えた
温調セル８０には、検体ＤＮＡと検出しようとするＤＮ
Ａの特定塩基配列を有するＤＮＡプローブを含む試料１
５が収容されている。６７はセル８０の温度を検出する
温度センサ装置であり、その温度センサ装置６７の検出
信号が温度コントロール装置８４に入力され、温度コン
トロール装置８４によりセル８０の温度が検体ＤＮＡを
解裂させるのに必要な温度まで上昇され、その後ハイブ
リダイゼーションのための温度まで降温するように制御
される。
【００１８】１はラマン散乱光を測定するための励起光
源であり、レーザ装置が用いられる。レーザ装置として
は、連続発振をするＡｒイオンレーザ、Ｋｒイオンレー
ザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、又はＨｅ−Ｃｄレーザなどや、
Ｎｄ：ＹＡＧレーザなどのパルスレーザなどを用いるこ
とができ、近紫外域から近赤外域に渡る広い波長範囲の
レーザから選択して利用することができる。レーザ装置
の自然放出線を遮蔽して発振線のみを励起光として利用
するときは、レーザ装置と光学フィルタや分光器を組み
合わせて使用すればよい。しかし、自然放出線も同時に
照射してスペクトルの波長校正を行なうこともある。
源であり、レーザ装置が用いられる。レーザ装置として
は、連続発振をするＡｒイオンレーザ、Ｋｒイオンレー
ザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、又はＨｅ−Ｃｄレーザなどや、
Ｎｄ：ＹＡＧレーザなどのパルスレーザなどを用いるこ
とができ、近紫外域から近赤外域に渡る広い波長範囲の
レーザから選択して利用することができる。レーザ装置
の自然放出線を遮蔽して発振線のみを励起光として利用
するときは、レーザ装置と光学フィルタや分光器を組み
合わせて使用すればよい。しかし、自然放出線も同時に
照射してスペクトルの波長校正を行なうこともある。
【００１９】光源１から発生した励起光は光学系１０に
よって測定光と対照光に分離され、測定光は光学系１０
で調整されてセル８０中の試料１５に照射される。試料
１５から発生したラマン散乱光は、測定光の入射方向と
９０度をなす方向に取り出され、光束を調整するための
光学系２０を経て分光器を含む分光検出器３０により検
出される。
よって測定光と対照光に分離され、測定光は光学系１０
で調整されてセル８０中の試料１５に照射される。試料
１５から発生したラマン散乱光は、測定光の入射方向と
９０度をなす方向に取り出され、光束を調整するための
光学系２０を経て分光器を含む分光検出器３０により検
出される。
【００２０】一方、励起光強度の変動を補正するために
対照光は光束調整用の光学系４０を経て検出器２６で検
出される。信号処理演算装置５０は分光検出器３０によ
り検出されたラマン散乱光を光源強度を示す検出器２６
の出力で補正してラマンスペクトルを得、測定対象物質
の同定や定量を行なう。信号処理演算装置５０はまた、
予め設定された温度プログラムに従い、温度コントロー
ル装置８４を制御してセル８０の温度を変化させる。３
５はプリンタやＣＲＴなどの出力装置である。
対照光は光束調整用の光学系４０を経て検出器２６で検
出される。信号処理演算装置５０は分光検出器３０によ
り検出されたラマン散乱光を光源強度を示す検出器２６
の出力で補正してラマンスペクトルを得、測定対象物質
の同定や定量を行なう。信号処理演算装置５０はまた、
予め設定された温度プログラムに従い、温度コントロー
ル装置８４を制御してセル８０の温度を変化させる。３
５はプリンタやＣＲＴなどの出力装置である。
【００２１】図３は光学系を詳細に示した免疫分析装置
の例である。レーザ光源１からの光束を測定光として試
料１５に照射するための光学系１０として、その光束を
測定光と対照光に分離するためのビームスプリッタ２、
ビームスプリッタ２で分離された測定光を集光する凸レ
ンズ３、光束調製用の凸レンズ６，７、及び測定光を反
射してセル８０中の試料１５に導くビームスプリッタ８
が測定光の光路に沿って配列されている。また、測定光
の光路上で、凸レンズ３と６の間にはレーザ光源１から
の複数の発振線のうちの１つの波長のレーザ光を選択す
るためにフィルタ４が設けられている。
の例である。レーザ光源１からの光束を測定光として試
料１５に照射するための光学系１０として、その光束を
測定光と対照光に分離するためのビームスプリッタ２、
ビームスプリッタ２で分離された測定光を集光する凸レ
ンズ３、光束調製用の凸レンズ６，７、及び測定光を反
射してセル８０中の試料１５に導くビームスプリッタ８
が測定光の光路に沿って配列されている。また、測定光
の光路上で、凸レンズ３と６の間にはレーザ光源１から
の複数の発振線のうちの１つの波長のレーザ光を選択す
るためにフィルタ４が設けられている。
【００２２】セル８０中の試料１５から発生したラマン
散乱光は、測定光の入射方向と１８０度をなす方向に取
りだして分光検出器３０へ導く光学系２０として、ビー
ムスプリッタ８を透過したラマン散乱光と測定光を集光
する凸レンズ９、及び光束調整用の凸レンズ１２，１３
が光路に沿って配列されている。凸レンズ９と１２の間
の光路上には励起光成分を除去するためのフィルタ１１
が設けられている。
散乱光は、測定光の入射方向と１８０度をなす方向に取
りだして分光検出器３０へ導く光学系２０として、ビー
ムスプリッタ８を透過したラマン散乱光と測定光を集光
する凸レンズ９、及び光束調整用の凸レンズ１２，１３
が光路に沿って配列されている。凸レンズ９と１２の間
の光路上には励起光成分を除去するためのフィルタ１１
が設けられている。
【００２３】対照光側においては、対照光を検出器２６
に導くために、光路を曲げるための反射ミラー２１，２
２、及び光束調整用の凸レンズ２４，２５が光路に沿っ
て配列されている。反射ミラー２２と凸レンズ２４の間
の光路上には測定光側のフィルタ４と同じ波長特性のフ
ィルタ２３が設けられている。
に導くために、光路を曲げるための反射ミラー２１，２
２、及び光束調整用の凸レンズ２４，２５が光路に沿っ
て配列されている。反射ミラー２２と凸レンズ２４の間
の光路上には測定光側のフィルタ４と同じ波長特性のフ
ィルタ２３が設けられている。
【００２４】温調セル８０の一例を図４に示す。図４
で、６３はアルミニウム製セルであり、アルミニウム製
金属ブロックの上端から内部に向かって試料を収容する
穴があけられたものである。その穴の内面は鏡面研磨さ
れ、赤外反射率が大きくなるように金メッキが施されて
いる。穴の底部には励起光を試料６４に照射し、ラマン
散乱光を取り出すための窓６５があけられ、その窓６５
には石英ガラス製窓板６８が嵌め込まれている。セル６
３の金属ブロックにはセル用の穴の側部と底部にそれぞ
れヒータとペルチェ素子を含む加熱・冷却装置６２，６
２が接触して設けられており、加熱・冷却装置６２，６
２の他方の面にはアルミニウム製の拡散板６１，６１が
接触して設けられている。セル６３の金属ブロックには
温度センサ６７が埋め込まれている。図４のセルは励起
光の入射方向とラマン散乱光が取り出される方向が１８
０度をなしている。
で、６３はアルミニウム製セルであり、アルミニウム製
金属ブロックの上端から内部に向かって試料を収容する
穴があけられたものである。その穴の内面は鏡面研磨さ
れ、赤外反射率が大きくなるように金メッキが施されて
いる。穴の底部には励起光を試料６４に照射し、ラマン
散乱光を取り出すための窓６５があけられ、その窓６５
には石英ガラス製窓板６８が嵌め込まれている。セル６
３の金属ブロックにはセル用の穴の側部と底部にそれぞ
れヒータとペルチェ素子を含む加熱・冷却装置６２，６
２が接触して設けられており、加熱・冷却装置６２，６
２の他方の面にはアルミニウム製の拡散板６１，６１が
接触して設けられている。セル６３の金属ブロックには
温度センサ６７が埋め込まれている。図４のセルは励起
光の入射方向とラマン散乱光が取り出される方向が１８
０度をなしている。
【００２５】このセルで温度を上昇させたり下降させた
りして制御するために、図５に示されるように温度セン
サ６７の検出信号を取り込み、加熱・冷却装置６２，６
２へ流す電流量を制御する温度コントロール装置８４が
設けられている。
りして制御するために、図５に示されるように温度セン
サ６７の検出信号を取り込み、加熱・冷却装置６２，６
２へ流す電流量を制御する温度コントロール装置８４が
設けられている。
【００２６】図６は他のセルの例を示したものである。
図４のセルと比較すると、図４ではセル６３が金属ブロ
ックをくり抜いて一体的に形成されたものであるのに対
し、図６では石英ガラス製セル６６が用いられている。
アルミニウム製金属ブロックは２つの部分６３ａ，６３
ｂに分割され、両部分６３ａ，６３ｂの対向部にはセル
６６を収容する凹部が形成され、その凹部にセル６６を
包み込むように金属ブロックの両部分６３ａ，６３ｂが
組み合わされるようになっている。金属ブロック部分６
３ａを組み合わせることによってセル６６が金属ブロッ
ク部分６３ａと接触する。両部分６３ａ，６３ｂが組み
合わされた状態でセル６６がその金属ブロックと接触す
る。金属ブロック部分６３ａでセル６６の底部に該当す
る位置には、励起光を照射し、ラマン散乱光を取り出す
ための窓６５があけられている。温度を制御するための
加熱・冷却装置６２，６２それぞれの一方の面が金属ブ
ロック部分６３ｂに接触するように取りつけられ、加熱
・冷却装置６２，６２の放熱側には拡散板６１が設けら
れ、温度センサ６７が金属ブロック部分６３ａに埋め込
まれている。
図４のセルと比較すると、図４ではセル６３が金属ブロ
ックをくり抜いて一体的に形成されたものであるのに対
し、図６では石英ガラス製セル６６が用いられている。
アルミニウム製金属ブロックは２つの部分６３ａ，６３
ｂに分割され、両部分６３ａ，６３ｂの対向部にはセル
６６を収容する凹部が形成され、その凹部にセル６６を
包み込むように金属ブロックの両部分６３ａ，６３ｂが
組み合わされるようになっている。金属ブロック部分６
３ａを組み合わせることによってセル６６が金属ブロッ
ク部分６３ａと接触する。両部分６３ａ，６３ｂが組み
合わされた状態でセル６６がその金属ブロックと接触す
る。金属ブロック部分６３ａでセル６６の底部に該当す
る位置には、励起光を照射し、ラマン散乱光を取り出す
ための窓６５があけられている。温度を制御するための
加熱・冷却装置６２，６２それぞれの一方の面が金属ブ
ロック部分６３ｂに接触するように取りつけられ、加熱
・冷却装置６２，６２の放熱側には拡散板６１が設けら
れ、温度センサ６７が金属ブロック部分６３ａに埋め込
まれている。
【００２７】
【発明の効果】本発明では検出しようとするＤＮＡの特
定塩基配列を有する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子を
ラベルしたものをＤＮＡプローブとして、検体ＤＮＡを
昇温して解裂させ単鎖ＤＮＡとしたものに混合し温度を
下げてハイブリダイゼーションが起こる条件にする。ハ
イブリダイゼーション工程の前後でＤＮＡプローブに励
起光を照射しラマン散乱光を測定することによって、検
体ＤＮＡ中にプローブのＤＮＡと相補的な関係にある塩
基配列をもつＤＮＡが含まれているかどうかを検出する
ようにしたので、簡便で、かつ短時間でＤＮＡの特定塩
基配列を検出することができる。また、本発明の方法で
はＢ／Ｆ分離をしなくてもラマン散乱光を測定すること
ができるので、処理が簡単になる。
定塩基配列を有する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子を
ラベルしたものをＤＮＡプローブとして、検体ＤＮＡを
昇温して解裂させ単鎖ＤＮＡとしたものに混合し温度を
下げてハイブリダイゼーションが起こる条件にする。ハ
イブリダイゼーション工程の前後でＤＮＡプローブに励
起光を照射しラマン散乱光を測定することによって、検
体ＤＮＡ中にプローブのＤＮＡと相補的な関係にある塩
基配列をもつＤＮＡが含まれているかどうかを検出する
ようにしたので、簡便で、かつ短時間でＤＮＡの特定塩
基配列を検出することができる。また、本発明の方法で
はＢ／Ｆ分離をしなくてもラマン散乱光を測定すること
ができるので、処理が簡単になる。
【図１】本発明を示す図であり、（Ａ）はＤＮＡプロー
ブを作成する工程を示す図、（Ｂ）はハイブリダイゼー
ション工程を示す図である。
ブを作成する工程を示す図、（Ｂ）はハイブリダイゼー
ション工程を示す図である。
【図２】本発明を実施する光学系を概略的に示すブロッ
ク図である。
ク図である。
【図３】一実施例の光学系を詳細に示すブロック図であ
る。
る。
【図４】好適なセルの一例を示す垂直断面図である。
【図５】図４のセルの温度制御系を示すブロック図であ
る。
る。
【図６】好適なセルの他の例を示す垂直断面分解図であ
る。
る。
１ 光源 ３０ 分光検出器 ５０ 信号処理演算装置 ６２ 加熱・冷却装置 ６３，６６，７８，８０ セル ６７ 温度センサ ７０ 検出しようとする特定塩基配列を有する単鎖
ＤＮＡ ７２ 金コロイド ７４ ＤＮＡプローブ ７６ 検体ＤＮＡ ７６ａ 検体ＤＮＡが解裂してできた単鎖ＤＮＡ ８０ 検体ＤＮＡの単鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡプ
ローブ ８４ 温度コントロール装置
ＤＮＡ ７２ 金コロイド ７４ ＤＮＡプローブ ７６ 検体ＤＮＡ ７６ａ 検体ＤＮＡが解裂してできた単鎖ＤＮＡ ８０ 検体ＤＮＡの単鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡプ
ローブ ８４ 温度コントロール装置
Claims (4)
- 【請求項１】 検出しようとするＤＮＡの特徴的な塩基
配列を有する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイド粒子をラベル
したものをＤＮＡプローブとし、被測定ＤＮＡを昇温に
より単鎖ＤＮＡに解裂させる工程、その解裂工程の前又
は後で前記ＤＮＡプローブを被測定ＤＮＡと混合する工
程、解裂した被測定ＤＮＡとＤＮＡプローブとの混合溶
液の温度を下げてＤＮＡプローブの単鎖ＤＮＡをそれと
相補的な塩基配列を含む被測定ＤＮＡの単鎖ＤＮＡと結
合させるハイブリダイゼーション工程、及びその後前記
コロイドに励起光を照射して発生したラマン散乱光を測
定する工程を含み、被測定ＤＮＡに存在するプローブＤ
ＮＡに対応した塩基配列を検出する検出方法。 - 【請求項２】 ハイブリダイゼーション工程の後、Ｂ／
Ｆ分離を行なわないでコロイドに励起光を照射する均一
系検出方法である請求項１に記載の塩基配列検出方法。 - 【請求項３】 プローブＤＮＡに対応した塩基配列の検
出は、ハイブリダイゼーション工程の前のＤＮＡプロー
ブによるラマン散乱光とハイブリダイゼーション工程の
後のＤＮＡプローブによるラマン散乱光とを分光し、両
ラマン散乱光のスペクトルの特徴の差により行なう請求
項１又は２に記載の塩基配列検出方法。 - 【請求項４】 被測定ＤＮＡと検出しようとするＤＮＡ
の特徴的な塩基配列を有する単鎖ＤＮＡに貴金属コロイ
ド粒子をラベルしたＤＮＡプローブとを収容でき、温度
センサ及び加熱・冷却手段を備えたセルと、前記セル内
の試料に励起光を照射する光源部と、前記セル内の試料
からのラマン散乱光を分光して測定する分光測定部と、
前記温度センサと加熱・冷却手段により前記セルの温度
を予定のプログラムに従って変化させる温度コントロー
ラと、を備えていることを特徴とする塩基配列検出装
置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6040556A JPH07227299A (ja) | 1994-02-14 | 1994-02-14 | Ｄｎａの特定塩基配列の検出方法及びその装置 |
| EP95101441A EP0667398A3 (en) | 1994-02-14 | 1995-02-02 | Method and device for the detection of the specific base sequence of the DNA. |
| CN 95102935 CN1112960A (zh) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | 用于检测dna的特异碱基顺序的方法和装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6040556A JPH07227299A (ja) | 1994-02-14 | 1994-02-14 | Ｄｎａの特定塩基配列の検出方法及びその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227299A true JPH07227299A (ja) | 1995-08-29 |
Family
ID=12583730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6040556A Pending JPH07227299A (ja) | 1994-02-14 | 1994-02-14 | Ｄｎａの特定塩基配列の検出方法及びその装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0667398A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07227299A (ja) |
| CN (1) | CN1112960A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049508A1 (ja) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Intellectual Property Bank Corp. | 長鎖ｄｎａ塩基配列解析装置及び方法 |
| JP2007516426A (ja) * | 2003-05-16 | 2007-06-21 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | オリゴヌクレオチドの検出のための比色法および蛍光法 |
| JP2008029351A (ja) * | 1996-07-29 | 2008-02-14 | Nanosphere Inc | オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子および該粒子の利用法 |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274552B1 (en) | 1993-03-18 | 2001-08-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US6174677B1 (en) | 1995-10-13 | 2001-01-16 | Ut-Battelle, Llc | Advanced surface-enhanced Raman gene probe systems and methods thereof |
| US5814516A (en) * | 1995-10-13 | 1998-09-29 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof |
| US6750016B2 (en) | 1996-07-29 | 2004-06-15 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US6506564B1 (en) | 1996-07-29 | 2003-01-14 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
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