JPH07231785A - 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 - Google Patents
新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法Info
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- JPH07231785A JPH07231785A JP6181308A JP18130894A JPH07231785A JP H07231785 A JPH07231785 A JP H07231785A JP 6181308 A JP6181308 A JP 6181308A JP 18130894 A JP18130894 A JP 18130894A JP H07231785 A JPH07231785 A JP H07231785A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 光学活性アルコール等の合成に有用な新規な
２級アルコール脱水素酵素及び該酵素をコードするＤＮ
Ａを提供する。 【構成】 キャンディダ属に属する微生物が立体選択性
の高い、新規な２級アルコール脱水素酵素を生産するこ
とを見いだした。また、該酵素を利用して、光学活性ア
ルコール等を製造した。また、該酵素をコードするＤＮ
Ａをクローニングし、その塩基配列を明らかにした。 【効果】 新規な立体選択性の高い２級アルコール脱水
素酵素、該酵素をコードする遺伝子を提供したことによ
って、光学活性アルコール等の効率的な製造が可能にな
った。
２級アルコール脱水素酵素及び該酵素をコードするＤＮ
Ａを提供する。 【構成】 キャンディダ属に属する微生物が立体選択性
の高い、新規な２級アルコール脱水素酵素を生産するこ
とを見いだした。また、該酵素を利用して、光学活性ア
ルコール等を製造した。また、該酵素をコードするＤＮ
Ａをクローニングし、その塩基配列を明らかにした。 【効果】 新規な立体選択性の高い２級アルコール脱水
素酵素、該酵素をコードする遺伝子を提供したことによ
って、光学活性アルコール等の効率的な製造が可能にな
った。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルコール、アルデヒ
ド、ケトンの製造、特に光学活性アルコールの製造に有
用な新規な２級アルコール脱水素酵素、該酵素の製造方
法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡにより形質転
換された微生物、及び該酵素を用いてアルコール、アル
デヒド、ケトン、特に光学活性アルコールを製造する方
法に関する。
ド、ケトンの製造、特に光学活性アルコールの製造に有
用な新規な２級アルコール脱水素酵素、該酵素の製造方
法、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡにより形質転
換された微生物、及び該酵素を用いてアルコール、アル
デヒド、ケトン、特に光学活性アルコールを製造する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物が産生する２級アルコール脱水素
酵素としては、補酵素としてニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ と略す）を要求
するサーモアナエロビウム・ブロッキー (Thermoanaero
bium brockii) 由来のアルコール脱水素酵素（J.Am.Che
m.Soc. 108, 162-169 (1986)）が知られている。また、
補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤ+ と略す）を要求する２級アルコール脱
水素酵素としては、ピキア・エスピー NRRL-Y-11328
（Pichia sp. NRRL-Y-11328: Eur.J.Biochem. 101, 401
-406 (1979) ）、シュードモナス・エスピー SPD6 （Ps
eudomonas sp. SPD6: Bioorg.Chem. 19, 398-417 (199
1) ）、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-124
4（Pseudomonasfluorescens NRRL B-1244: 特開昭59-1
7982号）、シュードモナス・マルトフィラ MB11L（Pseu
domonas maltophilia MB11L: FEMS Microbiol.Lett. 9
3, 49-56(1992)）、シュードモナス・エスピー PED（Ps
eudomonas sp. PED: J.Org.Chem.57, 1526-1532 (1992)
）、シュードモナス・エスピー ATCC 21439 （Pseudom
onas sp. ATCC 21439: Eur.J.Biochem. 119, 359-364
(1981)）、キャンディダ・ボイディニー SAHM （Candid
a boidinii SAHM: Biochim.Biophys.Acta 716, 298-307
(1992) ）、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5（Mycoba
cterium vaccae JOB-5: J.Gen.Microbiol. 131, 2901-2
907 (1985)）、ロドコッカス・ロドクロウスPNKb1（Rho
dococcus rhodochrous PNKb1: Arch.Microbiol. 153, 1
63-168 (1990)）、コマモナス・テリゲナ（Comamonas t
errigena: Biochim.Biophys.Acta 661, 74-86 (1981)
）、アースロバクター・エスピー SBA（Arthrobacter
sp. SBA: 特開昭51-57882号）由来の酵素が報告されて
いる。
酵素としては、補酵素としてニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+ と略す）を要求
するサーモアナエロビウム・ブロッキー (Thermoanaero
bium brockii) 由来のアルコール脱水素酵素（J.Am.Che
m.Soc. 108, 162-169 (1986)）が知られている。また、
補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤ+ と略す）を要求する２級アルコール脱
水素酵素としては、ピキア・エスピー NRRL-Y-11328
（Pichia sp. NRRL-Y-11328: Eur.J.Biochem. 101, 401
-406 (1979) ）、シュードモナス・エスピー SPD6 （Ps
eudomonas sp. SPD6: Bioorg.Chem. 19, 398-417 (199
1) ）、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-124
4（Pseudomonasfluorescens NRRL B-1244: 特開昭59-1
7982号）、シュードモナス・マルトフィラ MB11L（Pseu
domonas maltophilia MB11L: FEMS Microbiol.Lett. 9
3, 49-56(1992)）、シュードモナス・エスピー PED（Ps
eudomonas sp. PED: J.Org.Chem.57, 1526-1532 (1992)
）、シュードモナス・エスピー ATCC 21439 （Pseudom
onas sp. ATCC 21439: Eur.J.Biochem. 119, 359-364
(1981)）、キャンディダ・ボイディニー SAHM （Candid
a boidinii SAHM: Biochim.Biophys.Acta 716, 298-307
(1992) ）、ミコバクテリウム・バカエ JOB-5（Mycoba
cterium vaccae JOB-5: J.Gen.Microbiol. 131, 2901-2
907 (1985)）、ロドコッカス・ロドクロウスPNKb1（Rho
dococcus rhodochrous PNKb1: Arch.Microbiol. 153, 1
63-168 (1990)）、コマモナス・テリゲナ（Comamonas t
errigena: Biochim.Biophys.Acta 661, 74-86 (1981)
）、アースロバクター・エスピー SBA（Arthrobacter
sp. SBA: 特開昭51-57882号）由来の酵素が報告されて
いる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の２級アルコール脱水素酵素の立体選択性は満足できる
ものではない。例えば、２級アルコール脱水素酵素の基
質として最も報告の多い２−ブタノールに対して、
（Ｓ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化し、２−ブ
タノンを生成する活性を有する酵素は知られていない
（シュードモナス・エスピー ATCC 21439 、シュードモ
ナス・エスピー SPD6 、コマモナス・テリゲナ、キャン
ディダ・ボイディニー SAHM 又はピキア・エスピー NRR
L-Y-11328 が産生する酵素においてはＲ体が優先的に酸
化され、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-12
44が産生する酵素においては立体選択性を示さず、ミコ
バクテリウム・バカエ JOB-5、ロドコッカス・ロドクロ
ウス PNKb1、シュードモナス・エスピー PED又はシュー
ドモナス・マルトフィラ MB11Lが産生する酵素において
はその立体選択性は記載されていない）。なお、パン酵
母（Saccharomyces cerevisiae）由来の１級アルコール
脱水素酵素（SADH I）は、２−ブタノールに関してはＳ
体を優先的に酸化するという報告があるが（Arch.Bioch
em.Biophys.,126,933-944(1968) 、J.Biol.Chem.,268,7
792-7798(1993)）、その相対活性はエタノールの１％程
度と極めて低く、到底実用に耐えられるものではない。
の２級アルコール脱水素酵素の立体選択性は満足できる
ものではない。例えば、２級アルコール脱水素酵素の基
質として最も報告の多い２−ブタノールに対して、
（Ｓ）−２−ブタノールを立体選択的に酸化し、２−ブ
タノンを生成する活性を有する酵素は知られていない
（シュードモナス・エスピー ATCC 21439 、シュードモ
ナス・エスピー SPD6 、コマモナス・テリゲナ、キャン
ディダ・ボイディニー SAHM 又はピキア・エスピー NRR
L-Y-11328 が産生する酵素においてはＲ体が優先的に酸
化され、シュードモナス・フルオレッセンス NRRL B-12
44が産生する酵素においては立体選択性を示さず、ミコ
バクテリウム・バカエ JOB-5、ロドコッカス・ロドクロ
ウス PNKb1、シュードモナス・エスピー PED又はシュー
ドモナス・マルトフィラ MB11Lが産生する酵素において
はその立体選択性は記載されていない）。なお、パン酵
母（Saccharomyces cerevisiae）由来の１級アルコール
脱水素酵素（SADH I）は、２−ブタノールに関してはＳ
体を優先的に酸化するという報告があるが（Arch.Bioch
em.Biophys.,126,933-944(1968) 、J.Biol.Chem.,268,7
792-7798(1993)）、その相対活性はエタノールの１％程
度と極めて低く、到底実用に耐えられるものではない。
【０００４】即ち、（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に
酸化する２級アルコール脱水素酵素はこれまで知られて
おらず、立体選択性の高い２級アルコール脱水素酵素を
見い出すことが強く望まれていた。
酸化する２級アルコール脱水素酵素はこれまで知られて
おらず、立体選択性の高い２級アルコール脱水素酵素を
見い出すことが強く望まれていた。
【０００５】また、該酵素の遺伝子をクローニングでき
れば、遺伝子工学の手法を用いて該酵素を大量に製造す
ることが可能となるので、該酵素をコードする遺伝子を
クローニングすることが強く望まれていた。
れば、遺伝子工学の手法を用いて該酵素を大量に製造す
ることが可能となるので、該酵素をコードする遺伝子を
クローニングすることが強く望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、（Ｓ）−
２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有する微生物
を広くスクリーニングし、キャンディダ属に属する微生
物、特にキャンディダ・パラプシロシス (Candida para
psilosis）が（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化す
る能力を有することを見いだした。更に、この微生物を
培養し、その菌体より（Ｓ）−２−ブタノールを酸化す
る酵素を精製した。そして、その性質を検討した結果、
該酵素が（Ｓ）−２−ブタノールを高い立体選択性を持
って酸化すること、更に（Ｓ）−２−ブタノール以外の
多くの２級アルコールを立体選択的に酸化することを見
いだした。
２−ブタノールを優先的に酸化する能力を有する微生物
を広くスクリーニングし、キャンディダ属に属する微生
物、特にキャンディダ・パラプシロシス (Candida para
psilosis）が（Ｓ）−２−ブタノールを優先的に酸化す
る能力を有することを見いだした。更に、この微生物を
培養し、その菌体より（Ｓ）−２−ブタノールを酸化す
る酵素を精製した。そして、その性質を検討した結果、
該酵素が（Ｓ）−２−ブタノールを高い立体選択性を持
って酸化すること、更に（Ｓ）−２−ブタノール以外の
多くの２級アルコールを立体選択的に酸化することを見
いだした。
【０００７】即ち、本発明は、次のからに示す理化
学的性質を有する酵素を提供する。 作用 ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン
又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素と
して、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生
成する。
学的性質を有する酵素を提供する。 作用 ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン
又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素と
して、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生
成する。
【０００８】基質特異性 芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質と
する。１級アルコールに比較して２級アルコールに対し
て活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化す
る。
する。１級アルコールに比較して２級アルコールに対し
て活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化す
る。
【０００９】アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケ
トンを還元反応の基質とする。
トンを還元反応の基質とする。
【００１０】分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万。なお、本発
明の酵素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質
は以下の通りである。
明の酵素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質
は以下の通りである。
【００１１】至適pH及び安定pH範囲 （Ｓ）−２−ブタノール酸化反応の至適ｐＨは８．５〜
９．５である。２−ブタノン還元反応の至適ｐＨは５．
５〜６．５である。
９．５である。２−ブタノン還元反応の至適ｐＨは５．
５〜６．５である。
【００１２】ｐＨ８．０〜１０．０で比較的安定であ
る。
る。
【００１３】作用適温の範囲 ２５〜５５℃で活性が高く、５０℃が至適温度である。
【００１４】温度による失活の条件 ４０℃１０分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を
有する。
有する。
【００１５】阻害及び安定化 パラヒドロキシ安息香酸、塩化水銀、塩化銅、塩化亜
鉛、Ｎ−エチルマレイミドなどのＳＨ試薬で阻害され
る。還元剤の２ーメルカプトエタノール、ジチオスレイ
トールで阻害され、ｏ−フェナントロリンで阻害される
が、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない。
鉛、Ｎ−エチルマレイミドなどのＳＨ試薬で阻害され
る。還元剤の２ーメルカプトエタノール、ジチオスレイ
トールで阻害され、ｏ−フェナントロリンで阻害される
が、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない。
【００１６】精製方法 通常のタンパク質の精製方法を適当に組み合わせること
により精製することができる。例えば、菌体を破砕後、
プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸ア
ンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過を組
み合わせることにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
と略す）で単一バンドになるまで精製することができ
る。
により精製することができる。例えば、菌体を破砕後、
プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸ア
ンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過を組
み合わせることにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
と略す）で単一バンドになるまで精製することができ
る。
【００１７】等電点 等電点電気泳動に於いていくつかのバンドを生成する
が、主要なバンドの等電点は、６．７であった。
が、主要なバンドの等電点は、６．７であった。
【００１８】なお、本明細書中の実施例を含む全ての２
級アルコール脱水素酵素活性の測定は、以下に示す方法
により行った。即ち、トリス−塩酸緩衝液（pH9.0 ）50
μmol, ＮＡＤ+ 2.5 μmol, （Ｓ）−２−ブタノール
50μmol 及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、Ｎ
ＡＤＨの生成に由来する340nm の吸光度の増大を測定し
た。１Ｕは、１分間に 1μmol のＮＡＤＨの生成を触媒
する酵素量とした。
級アルコール脱水素酵素活性の測定は、以下に示す方法
により行った。即ち、トリス−塩酸緩衝液（pH9.0 ）50
μmol, ＮＡＤ+ 2.5 μmol, （Ｓ）−２−ブタノール
50μmol 及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、Ｎ
ＡＤＨの生成に由来する340nm の吸光度の増大を測定し
た。１Ｕは、１分間に 1μmol のＮＡＤＨの生成を触媒
する酵素量とした。
【００１９】また、本発明は、２級アルコール脱水素酵
素をコードするＤＮＡを提供する。即ち、本発明者ら
は、精製した２級アルコール脱水素酵素をリジルエンド
ペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断さ
れた断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミ
ノ酸配列の一部を決定した。得られたアミノ酸配列をも
とにして、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 用プラ
イマーを合成し、キャンディダ・パラプシロシス (Cand
ida parapsilosis）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
を行い、２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子
の一部を増幅し、その塩基配列（コア配列）を明らかに
した。更に、得られたＤＮＡ配列（コア配列）の周辺領
域の塩基配列を明らかにするために、キャンディダ・パ
ラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡ
をコア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素 Hae
II により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ
により自己環化し、逆ＰＣＲ（Nucleic Acids Res. 16,
8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製した。次に、コア
配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開
始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配
列の周辺領域を増幅した。得られたＤＮＡの塩基配列を
明らかにした結果、自己環化したＤＮＡ中に、図６、
７、８に示す２級アルコール脱水素酵素の全コード領域
が含まれていることを確認した。更に、クローニングし
た遺伝子の大腸菌宿主中での発現産物が、キャンディダ
・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素と同
様の活性を有することを確認した。
素をコードするＤＮＡを提供する。即ち、本発明者ら
は、精製した２級アルコール脱水素酵素をリジルエンド
ペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断さ
れた断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミ
ノ酸配列の一部を決定した。得られたアミノ酸配列をも
とにして、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 用プラ
イマーを合成し、キャンディダ・パラプシロシス (Cand
ida parapsilosis）の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
を行い、２級アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子
の一部を増幅し、その塩基配列（コア配列）を明らかに
した。更に、得られたＤＮＡ配列（コア配列）の周辺領
域の塩基配列を明らかにするために、キャンディダ・パ
ラプシロシス (Candida parapsilosis）の染色体ＤＮＡ
をコア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素 Hae
II により消化し、生成したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ
により自己環化し、逆ＰＣＲ（Nucleic Acids Res. 16,
8186 (1988)）用の鋳型ＤＮＡを調製した。次に、コア
配列をもとに、コア配列の外側に向かうＤＮＡ合成の開
始点となるプライマーを合成し、逆ＰＣＲによりコア配
列の周辺領域を増幅した。得られたＤＮＡの塩基配列を
明らかにした結果、自己環化したＤＮＡ中に、図６、
７、８に示す２級アルコール脱水素酵素の全コード領域
が含まれていることを確認した。更に、クローニングし
た遺伝子の大腸菌宿主中での発現産物が、キャンディダ
・パラプシロシス由来の２級アルコール脱水素酵素と同
様の活性を有することを確認した。
【００２０】本願発明の、２級アルコール脱水素酵素を
コードするＤＮＡは、２級アルコール脱水素酵素の活性
を有していて、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に
示されている蛋白質をコードする塩基配列を含むことを
特徴とする。ここで「実質的」とは、２級アルコール脱
水素酵素の活性を有する限り、図６、７、８に示したア
ミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、
置換等があってもよいことを示すものである。本発明の
ＤＮＡには、図６、７、８に示した１００８塩基からな
るＤＮＡが含まれることはいうまでもないが、本願発明
はこれに限られるものではない。なお、ＤＮＡがコード
するアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、
挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、
合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法
など、周知の方法で適宜行うことができる。また、図
６、７、８に示した１００８塩基を含むＤＮＡまたは該
ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法を
Ｍｎ2+イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）
または特定のヌクレオチドの濃度を低くして行うことに
よって、ランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ること
ができる。このようにして得られたＤＮＡのうち、２級
アルコール脱水素酵素の活性を有するタンパク質をコー
ドするものが、本願発明に含まれることはいうまでもな
い。
コードするＤＮＡは、２級アルコール脱水素酵素の活性
を有していて、アミノ酸配列が実質的に図６、７、８に
示されている蛋白質をコードする塩基配列を含むことを
特徴とする。ここで「実質的」とは、２級アルコール脱
水素酵素の活性を有する限り、図６、７、８に示したア
ミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、
置換等があってもよいことを示すものである。本発明の
ＤＮＡには、図６、７、８に示した１００８塩基からな
るＤＮＡが含まれることはいうまでもないが、本願発明
はこれに限られるものではない。なお、ＤＮＡがコード
するアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、
挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、
合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法
など、周知の方法で適宜行うことができる。また、図
６、７、８に示した１００８塩基を含むＤＮＡまたは該
ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ法を
Ｍｎ2+イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）
または特定のヌクレオチドの濃度を低くして行うことに
よって、ランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ること
ができる。このようにして得られたＤＮＡのうち、２級
アルコール脱水素酵素の活性を有するタンパク質をコー
ドするものが、本願発明に含まれることはいうまでもな
い。
【００２１】更に本発明は、アミノ酸配列が実質的に図
６、７、８に示されている蛋白質をコードするＤＮＡに
より形質転換された、２級アルコール脱水素酵素生産能
を有する微生物を提供する。
６、７、８に示されている蛋白質をコードするＤＮＡに
より形質転換された、２級アルコール脱水素酵素生産能
を有する微生物を提供する。
【００２２】本発明において形質転換の対象となる微生
物は、２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡにより形質転換され、２級アル
コール脱水素酵素活性を発現することができる微生物で
あればいかなるものでもよく、具体的には、イシェリヒ
ア(Escherichia) 属，バチルス(Bacillus)属，シュード
モナス(Pseudomonas) 属，セラチア(Serratia)属，ブレ
ビバクテリウム(Brevibacterium)属，コリネバクテリイ
ウム(Corynebacterium) 属、ストレプトコッカス(Strep
tococcu)属、ラクトバチルス(Lactobacillus) 属など宿
主，ベクター系の開発されている細菌、サッカロマイセ
ス(Saccharomyces) 属，クライベロマイセス(Kluyverom
yces) 属，シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyce
s) 属，チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)
、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosp
oron)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハン
ゼヌラ(Hansenula) 属、ピキア(Pichia)属、キャンディ
ダ(Candida) 属などの酵母、ノイロスポラ(Neurospora)
属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、セファロスポリ
ウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)
属などに属するカビなどが含まれる。
物は、２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡにより形質転換され、２級アル
コール脱水素酵素活性を発現することができる微生物で
あればいかなるものでもよく、具体的には、イシェリヒ
ア(Escherichia) 属，バチルス(Bacillus)属，シュード
モナス(Pseudomonas) 属，セラチア(Serratia)属，ブレ
ビバクテリウム(Brevibacterium)属，コリネバクテリイ
ウム(Corynebacterium) 属、ストレプトコッカス(Strep
tococcu)属、ラクトバチルス(Lactobacillus) 属など宿
主，ベクター系の開発されている細菌、サッカロマイセ
ス(Saccharomyces) 属，クライベロマイセス(Kluyverom
yces) 属，シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyce
s) 属，チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)
、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosp
oron)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ハン
ゼヌラ(Hansenula) 属、ピキア(Pichia)属、キャンディ
ダ(Candida) 属などの酵母、ノイロスポラ(Neurospora)
属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、セファロスポリ
ウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)
属などに属するカビなどが含まれる。
【００２３】形質転換体の作製のための手順ないし、方
法そのものは、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分
野において慣用されている技術に準じて行うことができ
る。
法そのものは、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分
野において慣用されている技術に準じて行うことができ
る。
【００２４】微生物中において、本発明の遺伝子を発現
させるためには、まず微生物中において安定に存在する
プラスミドベクターやファージベクター中にこの遺伝子
を挿入する必要がある。また、本発明のＤＮＡを微生物
中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写
・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を
制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮ
Ａの5'- 側上流に、ターミネーターを3'- 側下流に、そ
れぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネー
ターとしては、宿主として利用する微生物中において機
能することが知られているプロモーター、ターミネータ
ーを用いる必要がある。これら各種微生物において利用
可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに
関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、
特に酵母に関しては「Adv.Biochem.Eng. 43, 75-102 (1
990)」又は「Yeast 8, 423-488 (1992) 」 などに詳細
に記述されている。
させるためには、まず微生物中において安定に存在する
プラスミドベクターやファージベクター中にこの遺伝子
を挿入する必要がある。また、本発明のＤＮＡを微生物
中で発現させるためには、それが有する遺伝情報を転写
・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を
制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮ
Ａの5'- 側上流に、ターミネーターを3'- 側下流に、そ
れぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネー
ターとしては、宿主として利用する微生物中において機
能することが知られているプロモーター、ターミネータ
ーを用いる必要がある。これら各種微生物において利用
可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに
関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、
特に酵母に関しては「Adv.Biochem.Eng. 43, 75-102 (1
990)」又は「Yeast 8, 423-488 (1992) 」 などに詳細
に記述されている。
【００２５】例えば、イシェリヒア属特に大腸菌イシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR, pUC 系プラスミドを利用する
ことが可能であり、lac(β−ガラクトシダーゼ), trp(
トリプトファンオペロン), tac(lac, trp の融合), λ
ファージ PL, PR などに由来するプロモーターなどが利
用できる。また、ターミネーターとしては、trpA 由
来、ファージ由来 rrnBリボソーマルターミネーターな
どを用いることができる。
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR, pUC 系プラスミドを利用する
ことが可能であり、lac(β−ガラクトシダーゼ), trp(
トリプトファンオペロン), tac(lac, trp の融合), λ
ファージ PL, PR などに由来するプロモーターなどが利
用できる。また、ターミネーターとしては、trpA 由
来、ファージ由来 rrnBリボソーマルターミネーターな
どを用いることができる。
【００２６】バチルス属においては、ベクターとしてpU
B110系プラスミド、pC194 系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体に直接挿入させることもできる。また、
プロモーター、ターミネーターとして apr( アルカリプ
ロテアーゼ), npr( 中性プロテアーゼ), amy( α−アミ
ラーゼ) などが利用できる。
B110系プラスミド、pC194 系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体に直接挿入させることもできる。また、
プロモーター、ターミネーターとして apr( アルカリプ
ロテアーゼ), npr( 中性プロテアーゼ), amy( α−アミ
ラーゼ) などが利用できる。
【００２７】シュードモナス属においては、シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia) などで宿主ベクター系
が開発されており、トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミド TOL プラスミドを基本にした広宿主域ベクタ
ー(RSF1010 などに由来する自律的複製に必要な遺伝子
を含む） pKT240 などが利用可能であり、プロモータ
ー、ターミネーターとして、リパーゼ遺伝子（特開平5-
284973号）などが利用できる。
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia) などで宿主ベクター系
が開発されており、トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミド TOL プラスミドを基本にした広宿主域ベクタ
ー(RSF1010 などに由来する自律的複製に必要な遺伝子
を含む） pKT240 などが利用可能であり、プロモータ
ー、ターミネーターとして、リパーゼ遺伝子（特開平5-
284973号）などが利用できる。
【００２８】ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum) においては、pAJ43 (Gene 39, 281 (1985))
などのプラスミドベクターが利用可能であり、プロモー
ター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されてい
るプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能で
ある。
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum) においては、pAJ43 (Gene 39, 281 (1985))
などのプラスミドベクターが利用可能であり、プロモー
ター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されてい
るプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能で
ある。
【００２９】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11 ( 特開昭57-183799 号), pCB101 （Mo
l.Gen.Genet. 196, 175 (1984)）などのプラスミドベク
ターが利用可能である。
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11 ( 特開昭57-183799 号), pCB101 （Mo
l.Gen.Genet. 196, 175 (1984)）などのプラスミドベク
ターが利用可能である。
【００３０】ストレプトコッカス(Streptococcu)属にお
いては、pHV1301 (FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (198
5)），pGK1（Appl.Environ.MIcrobiol. 50, 94 (1985)
）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
いては、pHV1301 (FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (198
5)），pGK1（Appl.Environ.MIcrobiol. 50, 94 (1985)
）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００３１】ラクトバチルス(Lactobacillus) 属におい
ては、ストレプトコッカス属用に開発された pAMβ1
（J.Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されるているもの
が利用可能である。
ては、ストレプトコッカス属用に開発された pAMβ1
（J.Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されるているもの
が利用可能である。
【００３２】サッカロマイセス(Saccharomyces) 属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp 系，YEp 系，YCp 系，YIp
系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存
在するリボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したイン
テグレーションベクター（EP 537456 など）は、多コピ
ーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できる
ため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素), GAPDH( グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素), PHO( 酸性フォスファターゼ), GAL( β−ガラクト
シダーゼ), PGK( ホスホグリセレートキナーゼ), ENO(
エノラーゼ) などのプロモーター、ターミネーターが利
用可能でる。
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp 系，YEp 系，YCp 系，YIp
系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存
在するリボソームＤＮＡとの相同組換えを利用したイン
テグレーションベクター（EP 537456 など）は、多コピ
ーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できる
ため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素), GAPDH( グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素), PHO( 酸性フォスファターゼ), GAL( β−ガラクト
シダーゼ), PGK( ホスホグリセレートキナーゼ), ENO(
エノラーゼ) などのプロモーター、ターミネーターが利
用可能でる。
【００３３】クライベロマイセス属、特にクライベロマ
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 2μm 系プラ
スミド, pKD1 系プラスミド（J.Bacteriol. 145, 382-
390 (1981)），キラー活性に関与する pGKl1 由来プラ
スミド, クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子
KARS 系プラスミド，リボソームＤＮＡなどとの相同組
換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープ
ラスミド（EP 537456 など）などが利用可能である。ま
た、ADH, PGK などに由来するプロモーター、ターミネ
ーターが利用可能である。
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 2μm 系プラ
スミド, pKD1 系プラスミド（J.Bacteriol. 145, 382-
390 (1981)），キラー活性に関与する pGKl1 由来プラ
スミド, クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子
KARS 系プラスミド，リボソームＤＮＡなどとの相同組
換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープ
ラスミド（EP 537456 など）などが利用可能である。ま
た、ADH, PGK などに由来するプロモーター、ターミネ
ーターが利用可能である。
【００３４】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es) 属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
の ARS (自律複製に関与する遺伝子) 及びサッカロマイ
セス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マ
ーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mo
l.Cell.Biol. 6, 80 (1986) ）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来の ADH プロモーターなどが利用で
きる（EMBO J. 6, 729(1987) ）。
es) 属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
の ARS (自律複製に関与する遺伝子) 及びサッカロマイ
セス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マ
ーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mo
l.Cell.Biol. 6, 80 (1986) ）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来の ADH プロモーターなどが利用で
きる（EMBO J. 6, 729(1987) ）。
【００３５】チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyc
es) においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zy
gosaccharomyces rouxii) 由来の pSB3 （Nucleic Acid
s Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベ
クターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビシ
エ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・
ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素) のプロモーター（Agri.Biol.Chem. 54, 25
21 (1990) ）などが利用可能である。
es) においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zy
gosaccharomyces rouxii) 由来の pSB3 （Nucleic Acid
s Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベ
クターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビシ
エ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・
ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素) のプロモーター（Agri.Biol.Chem. 54, 25
21 (1990) ）などが利用可能である。
【００３６】ハンゼヌラ(Hansenula) 属においては、ハ
ンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenulapolymorpha)におい
て宿主ベクター系が開発されている。ベクターとして
は、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する
遺伝子（HARS1, HARS2）も利用可能であるが、比較的不
安定であるため、染色体への多コピーインテグレーショ
ンが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991) ）。また、
メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダ
ーゼ), FDH( ギ酸脱水素酵素) のプロモーターなどが利
用可能である。
ンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenulapolymorpha)におい
て宿主ベクター系が開発されている。ベクターとして
は、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する
遺伝子（HARS1, HARS2）も利用可能であるが、比較的不
安定であるため、染色体への多コピーインテグレーショ
ンが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991) ）。また、
メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダ
ーゼ), FDH( ギ酸脱水素酵素) のプロモーターなどが利
用可能である。
【００３７】ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パ
ストリス(Pichia pastoris) などにピキア由来自律複製
に関与する遺伝子 (PARS1, PARS2) などを利用した宿主
ベクター系が開発されており（Mol.Cell.Biol. 5, 3376
(1985) ）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX
など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids
Res. 15, 3859 (1987)）。
ストリス(Pichia pastoris) などにピキア由来自律複製
に関与する遺伝子 (PARS1, PARS2) などを利用した宿主
ベクター系が開発されており（Mol.Cell.Biol. 5, 3376
(1985) ）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX
など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids
Res. 15, 3859 (1987)）。
【００３８】キャンディダ(Candida) 属においては、キ
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa) 、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)などにおいて宿主
ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトー
サにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがク
ローニングされ（Agri.Biol.Chem. 51, 51, 1587 (198
7) ）、これを利用したベクターが開発されている。
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa) 、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)などにおいて宿主
ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトー
サにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがク
ローニングされ（Agri.Biol.Chem. 51, 51, 1587 (198
7) ）、これを利用したベクターが開発されている。
【００３９】アスペルギルス(Aspergillus) 属において
は、カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや
染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体
外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用
可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (19
89) ）。
は、カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや
染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体
外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用
可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (19
89) ）。
【００４０】トリコデルマ(Trichoderma) 属において
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989) ）。
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989) ）。
【００４１】本発明の酵素は、キャンディダ(Candida)
属に属する下記からに示す性質を有する酵素を産生
する微生物もしくはその変異株、又は該酵素をコードす
る遺伝子を異種の微生物宿主に導入し該酵素生産能を付
与された遺伝子組換え体を培養することなどにより製造
することができる。
属に属する下記からに示す性質を有する酵素を産生
する微生物もしくはその変異株、又は該酵素をコードす
る遺伝子を異種の微生物宿主に導入し該酵素生産能を付
与された遺伝子組換え体を培養することなどにより製造
することができる。
【００４２】作用 ＮＡＤ+ を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン
又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素と
して、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生
成する。
又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素と
して、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生
成する。
【００４３】基質特異性 芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質と
する。１級アルコールに比較して２級アルコールに対し
て活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化す
る。
する。１級アルコールに比較して２級アルコールに対し
て活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化す
る。
【００４４】アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケ
トンを還元反応の基質とする。
トンを還元反応の基質とする。
【００４５】分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万。
【００４６】更に、本発明の２級アルコール脱水素酵
素、又は該酵素を含む微生物（変異株や遺伝子組換え微
生物を含む）もしくはその処理物を、芳香族で置換され
てもよい脂肪族２級アルコール、例えば、２−ブタノー
ル、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−
ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエス
テルなどのラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体
の一方（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニル
エタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ
−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＳ体）のみを
酸化することにより、他方の光学活性アルコール（２−
ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、
１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エ
チルエステルにおいてはそのＲ体）を生産することがで
きる。この酸化反応により補酵素ＮＡＤ+ は還元され、
ＮＡＤＨが生成する。
素、又は該酵素を含む微生物（変異株や遺伝子組換え微
生物を含む）もしくはその処理物を、芳香族で置換され
てもよい脂肪族２級アルコール、例えば、２−ブタノー
ル、２−オクタノール、フェニルエタノール、１，３−
ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エチルエス
テルなどのラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体
の一方（２−ブタノール、２−オクタノール、フェニル
エタノール、１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ
−ｎ−酪酸エチルエステルにおいてはそのＳ体）のみを
酸化することにより、他方の光学活性アルコール（２−
ブタノール、２−オクタノール、フェニルエタノール、
１，３−ブタンジオール、β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸エ
チルエステルにおいてはそのＲ体）を生産することがで
きる。この酸化反応により補酵素ＮＡＤ+ は還元され、
ＮＡＤＨが生成する。
【００４７】生成したＮＡＤＨは、例えば、微生物の有
するＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する能力により、ＮＡＤ
+ に変換（再生）されることができる。また、グルタミ
ン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水
素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼなどのＮＡＤＨをＮＡＤ
+ に酸化する活性を有する酵素、又はこれら酵素を含有
する微生物もしくはその処理物を反応系に添加すること
により、ＮＡＤ+ を再生することもできる。また、本発
明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にアセトン、
２−ブタノンなどの安価な本酵素の還元反応の基質を共
存させることにより、１種類の酵素でＮＡＤ+ の再生も
同時に行うことができる。
するＮＡＤＨをＮＡＤ+ に変換する能力により、ＮＡＤ
+ に変換（再生）されることができる。また、グルタミ
ン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水
素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼなどのＮＡＤＨをＮＡＤ
+ に酸化する活性を有する酵素、又はこれら酵素を含有
する微生物もしくはその処理物を反応系に添加すること
により、ＮＡＤ+ を再生することもできる。また、本発
明の酵素の基質特異性を利用して、反応系にアセトン、
２−ブタノンなどの安価な本酵素の還元反応の基質を共
存させることにより、１種類の酵素でＮＡＤ+ の再生も
同時に行うことができる。
【００４８】また、ケトン体に本発明の２級アルコール
脱水素酵素、又は該酵素を産生する微生物（変異株や形
質転換微生物を含む）もしくはその処理物を作用させ、
光学活性なアルコールを生産することができる。例え
ば、２−ブタノンから（Ｓ）−２−ブタノール、２−オ
クタノンから（Ｓ）−２−オクタノール、アセトフェノ
ンから（Ｓ）−１−フェニルエタノール、４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンから（Ｓ）−１，３−ブタンジオー
ル、アセト酢酸エステルから（Ｓ）−β−ヒドロキシ−
ｎ−酪酸エステルなどを生産することができる。この還
元反応により補酵素ＮＡＤＨは酸化され、ＮＡＤ+ が生
成する。
脱水素酵素、又は該酵素を産生する微生物（変異株や形
質転換微生物を含む）もしくはその処理物を作用させ、
光学活性なアルコールを生産することができる。例え
ば、２−ブタノンから（Ｓ）−２−ブタノール、２−オ
クタノンから（Ｓ）−２−オクタノール、アセトフェノ
ンから（Ｓ）−１−フェニルエタノール、４−ヒドロキ
シ−２−ブタノンから（Ｓ）−１，３−ブタンジオー
ル、アセト酢酸エステルから（Ｓ）−β−ヒドロキシ−
ｎ−酪酸エステルなどを生産することができる。この還
元反応により補酵素ＮＡＤＨは酸化され、ＮＡＤ+ が生
成する。
【００４９】生成したＮＡＤ+ は、例えば、微生物の有
するＮＡＤ+ をＮＡＤＨに変換する能力により、ＮＡＤ
Ｈに変換（再生）されることができる。このＮＡＤ+ 還
元活性は、反応系にグルコース、エタノール、ギ酸など
を添加することにより促進することが可能である。ま
た、反応系に、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、
グルコース脱水素酵素などのＮＡＤ+ をＮＡＤＨへ還元
する能力を有する酵素、又はこれら酵素を含む微生物も
しくはその処理物を添加することにより、ＮＡＤ+ の還
元を行うこともできる。また、本発明の酵素の基質特異
性を利用して、反応系にイソプロパノールやエタノール
などの酸化反応の基質を添加することにより、１種類の
酵素でＮＡＤＨの再生反応を同時に行うこともできる。
するＮＡＤ+ をＮＡＤＨに変換する能力により、ＮＡＤ
Ｈに変換（再生）されることができる。このＮＡＤ+ 還
元活性は、反応系にグルコース、エタノール、ギ酸など
を添加することにより促進することが可能である。ま
た、反応系に、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、
グルコース脱水素酵素などのＮＡＤ+ をＮＡＤＨへ還元
する能力を有する酵素、又はこれら酵素を含む微生物も
しくはその処理物を添加することにより、ＮＡＤ+ の還
元を行うこともできる。また、本発明の酵素の基質特異
性を利用して、反応系にイソプロパノールやエタノール
などの酸化反応の基質を添加することにより、１種類の
酵素でＮＡＤＨの再生反応を同時に行うこともできる。
【００５０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】［実施例１］（２級アルコール脱水素酵素
の精製） キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 株をＹＭ培地
（グルコース１０ｇ，バクトペプトン５ｇ，酵母エキス
３ｇ，麦芽エキス３ｇ／Ｌ, pH6.0）で培養し、遠心分
離により菌体を調製した。
の精製） キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 株をＹＭ培地
（グルコース１０ｇ，バクトペプトン５ｇ，酵母エキス
３ｇ，麦芽エキス３ｇ／Ｌ, pH6.0）で培養し、遠心分
離により菌体を調製した。
【００５２】得られた湿菌体を超高圧細胞破砕装置によ
り菌体を破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無
細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸
を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。遠心分離
により得られた上清に、硫安を添加して７０％飽和にお
いて沈澱した画分を回収した。更に、Ｑ−セファロース
ＦＦを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、
塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行い、２級アルコール
脱水素酵素活性を有するピークを回収した。得られた画
分を１．６２Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化したフェニル
−セファロースに添加し、疎水クロマトグラフィーを行
った。硫安濃度を０Ｍまで減少させ、２級アルコール脱
水素酵素活性画分を回収した（酵素活性の測定法は前述
の方法で行った）。この活性画分をレッド−セファロー
スのアフィニティーカラムに添加し、素通り画分をスー
パーデックス２００のゲルろ過カラムに添加し、ゲルろ
過を行った。活性画分を回収し、モノＱカラムに添加
し、塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行い、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で純度検定を行い、単一バンドを示す画分のみを回収し
た。
り菌体を破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無
細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸
を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。遠心分離
により得られた上清に、硫安を添加して７０％飽和にお
いて沈澱した画分を回収した。更に、Ｑ−セファロース
ＦＦを用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、
塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行い、２級アルコール
脱水素酵素活性を有するピークを回収した。得られた画
分を１．６２Ｍ硫安を含む緩衝液で平衡化したフェニル
−セファロースに添加し、疎水クロマトグラフィーを行
った。硫安濃度を０Ｍまで減少させ、２級アルコール脱
水素酵素活性画分を回収した（酵素活性の測定法は前述
の方法で行った）。この活性画分をレッド−セファロー
スのアフィニティーカラムに添加し、素通り画分をスー
パーデックス２００のゲルろ過カラムに添加し、ゲルろ
過を行った。活性画分を回収し、モノＱカラムに添加
し、塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行い、活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で純度検定を行い、単一バンドを示す画分のみを回収し
た。
【００５３】得られた２級アルコール脱水素酵素標品
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE ）
において１本メジャーなバンドと近接する数本の薄いバ
ンドがみられた。活性染色の結果、全てのバンドが２級
アルコール脱水素酵素活性を有しており、この酵素標品
をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、単一バンドであっ
た。
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native-PAGE ）
において１本メジャーなバンドと近接する数本の薄いバ
ンドがみられた。活性染色の結果、全てのバンドが２級
アルコール脱水素酵素活性を有しており、この酵素標品
をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、単一バンドであっ
た。
【００５４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの分子量
は、約４００００であった（図１)。
は、約４００００であった（図１)。
【００５５】精製の要約を表１に示したが、精製酵素の
比活性は、１３７０Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
比活性は、１３７０Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
【００５６】
【表１】 ［実施例２］（２級アルコール脱水素酵素の至適ｐＨ） ２級アルコール脱水素酵素をカリウム−リン酸緩衝液
（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）、ブリッ
トン−ロビンソン緩衝液を用いてｐＨを変化させて
（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性、２−ブタノンの還
元活性（（Ｓ）−２−ブタノール 酸化活性測定時の条
件でＮＡＤ+ をＮＡＤＨ（0.4 μmol ）に代えて測定
し、ＮＡＤＨの減少に伴う340nm の吸光度の減少を測定
したもの）を測定した。最大活性を１００とした相対活
性で表し、図２、図３に示した。反応の至適ｐＨは、
（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応が８．５〜９．５、２
−ブタノンの還元反応が５．５〜６．５であった。
（ＫＰＢ）、トリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）、ブリッ
トン−ロビンソン緩衝液を用いてｐＨを変化させて
（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性、２−ブタノンの還
元活性（（Ｓ）−２−ブタノール 酸化活性測定時の条
件でＮＡＤ+ をＮＡＤＨ（0.4 μmol ）に代えて測定
し、ＮＡＤＨの減少に伴う340nm の吸光度の減少を測定
したもの）を測定した。最大活性を１００とした相対活
性で表し、図２、図３に示した。反応の至適ｐＨは、
（Ｓ）−２−ブタノール酸化反応が８．５〜９．５、２
−ブタノンの還元反応が５．５〜６．５であった。
【００５７】［実施例３］（２級アルコール脱水素酵素
の作用至適温度） ２級アルコール脱水素酵素活性を標準反応条件のうち温
度だけを変化させて測定した表２に示した。至適温度は
５０℃であった。
の作用至適温度） ２級アルコール脱水素酵素活性を標準反応条件のうち温
度だけを変化させて測定した表２に示した。至適温度は
５０℃であった。
【００５８】
【表２】 ［実施例４］（２級アルコール脱水素酵素のｐＨ安定
性） トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０−９．０、ブリットン−
ロビンソン緩衝液ｐＨ５．０−１２．０中で３０℃, ３
０分間処理後の残存活性を測定し図４に示した。ｐＨ
８．０〜１０．０において最も安定であった。
性） トリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０−９．０、ブリットン−
ロビンソン緩衝液ｐＨ５．０−１２．０中で３０℃, ３
０分間処理後の残存活性を測定し図４に示した。ｐＨ
８．０〜１０．０において最も安定であった。
【００５９】［実施例５］（２級アルコール脱水素酵素
の耐熱性） ２級アルコール脱水素酵素をｐＨ８．０で１０分間放置
した後、残存活性を測定し図５に示した。４０℃、１０
分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有してい
た。
の耐熱性） ２級アルコール脱水素酵素をｐＨ８．０で１０分間放置
した後、残存活性を測定し図５に示した。４０℃、１０
分間の熱処理後でも９０％以上の残存活性を有してい
た。
【００６０】［実施例６］（２級アルコール脱水素酵素
の基質特異性） ２級アルコール脱水素酵素を種々のアルコール、アルデ
ヒドと反応し、その酸化，還元反応の活性を （Ｓ）−
２−ブタノールの酸化，２−ブタノンの還元をそれぞれ
１００とした相対活性で表し、表３及び表４に示した。
の基質特異性） ２級アルコール脱水素酵素を種々のアルコール、アルデ
ヒドと反応し、その酸化，還元反応の活性を （Ｓ）−
２−ブタノールの酸化，２−ブタノンの還元をそれぞれ
１００とした相対活性で表し、表３及び表４に示した。
【００６１】
【表３】
【表４】 ［実施例７］（２級アルコール脱水素酵素の阻害剤に対
する挙動） ２級アルコール脱水素酵素を種々の試薬中で３０℃、３
０分間処理し、処理後の活性を、未処理の活性を１００
とした残存活性で表し、表５に示した。
する挙動） ２級アルコール脱水素酵素を種々の試薬中で３０℃、３
０分間処理し、処理後の活性を、未処理の活性を１００
とした残存活性で表し、表５に示した。
【００６２】
【表５】 酵素活性は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードア
セトアミド、パラクロロ水銀安息香酸、塩化水銀、塩化
亜鉛、高濃度の金属キレーター、２−メルカプトエタノ
ールによって顕著に阻害された。
セトアミド、パラクロロ水銀安息香酸、塩化水銀、塩化
亜鉛、高濃度の金属キレーター、２−メルカプトエタノ
ールによって顕著に阻害された。
【００６３】［実施例８］（２級アルコール脱水素酵素
の部分アミノ酸配列の解析） 精製した２級アルコール脱水素酵素 0.153mg を 50mM
トリス−塩酸 pH9.0,4M 尿素中において 0.53 μg の
リジルエンドペプチダーゼで30℃, ６時間消化した。切
断されたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ( 東ソー製 TSK O
DS-120T カラム) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸中に
おけるアセトニトリルの勾配溶出により分離し、分取し
た。
の部分アミノ酸配列の解析） 精製した２級アルコール脱水素酵素 0.153mg を 50mM
トリス−塩酸 pH9.0,4M 尿素中において 0.53 μg の
リジルエンドペプチダーゼで30℃, ６時間消化した。切
断されたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ( 東ソー製 TSK O
DS-120T カラム) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸中に
おけるアセトニトリルの勾配溶出により分離し、分取し
た。
【００６４】分取したペプチドをＡＢＩ製プロテインシ
ーケンサー４７７Ａによりアミノ酸配列を決定した。
ーケンサー４７７Ａによりアミノ酸配列を決定した。
【００６５】プロテインシーケンサーによって決定され
たアミノ酸配列は、図６、７、８のアミノ酸配列にアン
ダーラインで示した。
たアミノ酸配列は、図６、７、８のアミノ酸配列にアン
ダーラインで示した。
【００６６】［実施例９］（２級アルコール脱水素酵素
をコードする遺伝子のＰＣＲクローニング） ２級アルコール脱水素酵素のＮ末端に近い部分のアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を縮重を考慮して合成
し混合ＰＣＲプライマー(CpN) とした。また、Ｃ末端に
近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列の相
補配列をもう一方の混合ＰＣＲプライマー(CpT10) とし
て合成した。これら配列を図９に示した。なお、ＤＮＡ
の合成は、ＡＢＩ製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａによ
り行った。
をコードする遺伝子のＰＣＲクローニング） ２級アルコール脱水素酵素のＮ末端に近い部分のアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を縮重を考慮して合成
し混合ＰＣＲプライマー(CpN) とした。また、Ｃ末端に
近い部分のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列の相
補配列をもう一方の混合ＰＣＲプライマー(CpT10) とし
て合成した。これら配列を図９に示した。なお、ＤＮＡ
の合成は、ＡＢＩ製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａによ
り行った。
【００６７】［実施例１０］（キャンディダ・パラプシ
ロシスからの染色体ＤＮＡの調製） キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 をＹＥＰＤ培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
ス）100mL 中で培養し、遠心分離により菌体を回収し
た。菌体を 25mL の 1M ソルビトール, 0.1M エチレン
ジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）に澱懸し、再度遠心分離に
より菌体を回収した。回収した菌体を 10mL の 50mM リ
ン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 1M ソルビトール, 0.1M 2
- メルカプトエタノールで懸濁し、更に、2.5mg/mL チ
モリアーゼを0.4mL 添加し、30℃でインキュベートする
ことによりプロトプラストを形成した。検鏡によりプロ
トプラスト形成を確認後、遠心分離により菌体を回収し
た。回収した菌体を、12mLの 50mM トリス−塩酸 pH7.
4, 20mM EDTA に澱懸し、更に、1.2mL の 10% SDS（ド
デシル硫酸ナトリウム）を添加後よく混合した。この状
態で65℃, 30分間インキュベートした後、3.6mL の 5M
酢酸カリウム pH5.0 を添加し、氷上で60分間放置し、
タンパク質を変性沈殿させた。
ロシスからの染色体ＤＮＡの調製） キャンディダ・パラプシロシス IFO 1396 をＹＥＰＤ培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコー
ス）100mL 中で培養し、遠心分離により菌体を回収し
た。菌体を 25mL の 1M ソルビトール, 0.1M エチレン
ジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）に澱懸し、再度遠心分離に
より菌体を回収した。回収した菌体を 10mL の 50mM リ
ン酸カリウム緩衝液 pH7.5, 1M ソルビトール, 0.1M 2
- メルカプトエタノールで懸濁し、更に、2.5mg/mL チ
モリアーゼを0.4mL 添加し、30℃でインキュベートする
ことによりプロトプラストを形成した。検鏡によりプロ
トプラスト形成を確認後、遠心分離により菌体を回収し
た。回収した菌体を、12mLの 50mM トリス−塩酸 pH7.
4, 20mM EDTA に澱懸し、更に、1.2mL の 10% SDS（ド
デシル硫酸ナトリウム）を添加後よく混合した。この状
態で65℃, 30分間インキュベートした後、3.6mL の 5M
酢酸カリウム pH5.0 を添加し、氷上で60分間放置し、
タンパク質を変性沈殿させた。
【００６８】遠心分離により変性タンパク質を分離し、
上清を回収後、等量のイソプロパノールを室温で添加
し、ゆっくりと混合した。遠心分離により沈殿したＤＮ
Ａを回収し、乾燥後、15mL の 10mM トリス−塩酸緩衝
液 pH7.4, 1mM EDTA に溶解し、1mg/mL RNase( リボヌ
クレアーゼ) 0.75mL を添加し、37℃, 1 時間インキュ
ベートし、夾雑するＲＮＡを分解した。ＲＮＡ分解後、
フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロ
ロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を回収し、実施例１１におけるＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ
とした。
上清を回収後、等量のイソプロパノールを室温で添加
し、ゆっくりと混合した。遠心分離により沈殿したＤＮ
Ａを回収し、乾燥後、15mL の 10mM トリス−塩酸緩衝
液 pH7.4, 1mM EDTA に溶解し、1mg/mL RNase( リボヌ
クレアーゼ) 0.75mL を添加し、37℃, 1 時間インキュ
ベートし、夾雑するＲＮＡを分解した。ＲＮＡ分解後、
フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロ
ロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を回収し、実施例１１におけるＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ
とした。
【００６９】［実施例１１］（２級アルコール脱水素酵
素遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング） 実施例９において合成した２種類の混合ＰＣＲプライマ
ー(CpN 及び CpT10)100pmol, 実施例１０において調
製したキャンディダ・パラプシロシス染色体ＤＮＡ 50n
g を含むＰＣＲ用緩衝液（10mM トリス−塩酸緩衝液 p
H8.3, 50mM 塩化カリウム, 1.5mM 塩化マグネシウム,
各 0.2mM dNTP, 0.01% ゼラチン, 2U TaqＤＮＡポリメ
ラーゼ( ロシュ社製) ）を調製し、熱変性（94℃, 30
秒）、アニーリング（45℃, 30秒）、伸長反応（60℃,
2 分）を30サイクル行い、4 ℃まで冷却後、アガロース
ゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
素遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング） 実施例９において合成した２種類の混合ＰＣＲプライマ
ー(CpN 及び CpT10)100pmol, 実施例１０において調
製したキャンディダ・パラプシロシス染色体ＤＮＡ 50n
g を含むＰＣＲ用緩衝液（10mM トリス−塩酸緩衝液 p
H8.3, 50mM 塩化カリウム, 1.5mM 塩化マグネシウム,
各 0.2mM dNTP, 0.01% ゼラチン, 2U TaqＤＮＡポリメ
ラーゼ( ロシュ社製) ）を調製し、熱変性（94℃, 30
秒）、アニーリング（45℃, 30秒）、伸長反応（60℃,
2 分）を30サイクル行い、4 ℃まで冷却後、アガロース
ゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００７０】［実施例１２］（ＰＣＲ法によって増幅し
たＤＮＡのサブクローニング） 実施例１１においてＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを
SureClone LigationKit （ファルマシア社製）により
pUC18 にサブクローニングし、その塩基配列をＡＢＩ
製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより決定した結果、Ｐ
ＣＲプライマー配列を含めて 971塩基からなっていた。
その配列は図６、７、８に示したＤＮＡのうち、プライ
マー CpN 及びCpT10 間に当たる部分である。以後この
配列を「コア配列」と記す。
たＤＮＡのサブクローニング） 実施例１１においてＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを
SureClone LigationKit （ファルマシア社製）により
pUC18 にサブクローニングし、その塩基配列をＡＢＩ
製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａにより決定した結果、Ｐ
ＣＲプライマー配列を含めて 971塩基からなっていた。
その配列は図６、７、８に示したＤＮＡのうち、プライ
マー CpN 及びCpT10 間に当たる部分である。以後この
配列を「コア配列」と記す。
【００７１】［実施例１３］（逆ＰＣＲ法によるコア配
列周辺配列のクローニング） コア配列の5'- 側に近い部分の相補配列 CAATTGACCCGCT
TTGGGC (CPA-MUN)、及び、3'- 側に近い部分の配列 TTC
GAATCTTGGGATGTTTTTG (CPA-NSP) を化学合成した。２級
アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡにおける合成
した逆ＰＣＲプライマーの位置を図６、７、８に示し
た。
列周辺配列のクローニング） コア配列の5'- 側に近い部分の相補配列 CAATTGACCCGCT
TTGGGC (CPA-MUN)、及び、3'- 側に近い部分の配列 TTC
GAATCTTGGGATGTTTTTG (CPA-NSP) を化学合成した。２級
アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡにおける合成
した逆ＰＣＲプライマーの位置を図６、７、８に示し
た。
【００７２】逆ＰＣＲのＤＮＡ鋳型として、まず、キャ
ンディダ・パラプシロシスの染色体ＤＮＡを制限酵素 H
aeII により消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて自己環化した。この自己環化物 50ng 、化学合成し
たプライマー CPA-MUN 及びCPA-NSP をそれぞれ 20pm
ol 含むＰＣＲ用緩衝液（実施例１１に記載のもの）を
用い、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（50℃, 30
秒）、伸長反応（70℃, 2 分）のサイクルを３０回行っ
た。増幅されたＤＮＡ断片を実施例１２と同様に SureC
lone Ligation Kit （ファルマシア社製）を用いて pUC
18 にサブクローニングし、ＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサ
ー３７３Ａにより全塩基配列を決定した。
ンディダ・パラプシロシスの染色体ＤＮＡを制限酵素 H
aeII により消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて自己環化した。この自己環化物 50ng 、化学合成し
たプライマー CPA-MUN 及びCPA-NSP をそれぞれ 20pm
ol 含むＰＣＲ用緩衝液（実施例１１に記載のもの）を
用い、熱変性（94℃, 30秒）、アニーリング（50℃, 30
秒）、伸長反応（70℃, 2 分）のサイクルを３０回行っ
た。増幅されたＤＮＡ断片を実施例１２と同様に SureC
lone Ligation Kit （ファルマシア社製）を用いて pUC
18 にサブクローニングし、ＡＢＩ製ＤＮＡシーケンサ
ー３７３Ａにより全塩基配列を決定した。
【００７３】ＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより得られた２級ア
ルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの全塩基配列及
び該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を図６、７、８に
まとめた。
ルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡの全塩基配列及
び該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を図６、７、８に
まとめた。
【００７４】［実施例１４］（２級アルコール脱水素酵
素をコードする遺伝子のＰＣＲ法を用いた合成） まず、プライマーを用いてＰＣＲ法により制限酵素部位
の導入を行った。実施例１０において得たＤＮＡを鋳型
とし、プライマーとしては、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位
を含む５´−プライマー「CPA-ATG 」(5'-TCGCGAATTCAA
TGTCAATTCCATCAAGCCAG-3')とＢｇＩＩＩ部位を含む３´
−プライマー「CPA-TAG 」（5'-AGATCTTACTATGGATTAAAA
ACAACTCTA-3'）により約１０３０ｂｐのＤＮＡ断片をＰ
ＣＲ法により増幅し、遺伝子断片を得た。ＤＮＡの合成
は、ＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行
い、ＰＣＲ反応は実施例１１と同様に行った。
素をコードする遺伝子のＰＣＲ法を用いた合成） まず、プライマーを用いてＰＣＲ法により制限酵素部位
の導入を行った。実施例１０において得たＤＮＡを鋳型
とし、プライマーとしては、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位
を含む５´−プライマー「CPA-ATG 」(5'-TCGCGAATTCAA
TGTCAATTCCATCAAGCCAG-3')とＢｇＩＩＩ部位を含む３´
−プライマー「CPA-TAG 」（5'-AGATCTTACTATGGATTAAAA
ACAACTCTA-3'）により約１０３０ｂｐのＤＮＡ断片をＰ
ＣＲ法により増幅し、遺伝子断片を得た。ＤＮＡの合成
は、ＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａにより行
い、ＰＣＲ反応は実施例１１と同様に行った。
【００７５】［実施例１５］（ＰＣＲ法によって増幅し
たＤＮＡのサブクローニング） 実施例１４により増幅されたＰＣＲ断片を SureClone L
igation Kit （ファルマシア社製）にてプラスミドｐＵ
Ｃ１８マルチクローニングサイトのＳｍａｌ部位に連結
した（図１０）。構築されたプラスミド（ｐＣＰＡ６
Ｒ）は、ラクトースプロモーター（図中「ｌａｃＺ」で
示す部分に含まれる）とは逆向きに挿入されていた。
たＤＮＡのサブクローニング） 実施例１４により増幅されたＰＣＲ断片を SureClone L
igation Kit （ファルマシア社製）にてプラスミドｐＵ
Ｃ１８マルチクローニングサイトのＳｍａｌ部位に連結
した（図１０）。構築されたプラスミド（ｐＣＰＡ６
Ｒ）は、ラクトースプロモーター（図中「ｌａｃＺ」で
示す部分に含まれる）とは逆向きに挿入されていた。
【００７６】［実施例１６］（２級アルコール脱水素酵
素遺伝子発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築） さらに、２級アルコール脱水素酵素を発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３（ファルマシイ社製）にサブクローニング
し、ｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した。ｐＫＫ−ＣＰＡ１の
構築方法は以下の通りである。ｐＣＰＡ６ＲをＥｃｏｌ
ＣＲＩ（プロメガ社製）消化し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ
ー（タカラ社製）を連結した上でＥｃｏＲＩ（タカラ社
製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラ社製）で切断後、２
級アルコール脱水素酵素を有する断片を抽出し、発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断したものと連結することにより、２
級アルコール脱水素酵素遺伝子発現ベクターｐＫＫ−Ｃ
ＰＡ１を構築した（図１１）。
素遺伝子発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１の構築） さらに、２級アルコール脱水素酵素を発現ベクターｐＫ
Ｋ２２３−３（ファルマシイ社製）にサブクローニング
し、ｐＫＫ−ＣＰＡ１を構築した。ｐＫＫ−ＣＰＡ１の
構築方法は以下の通りである。ｐＣＰＡ６ＲをＥｃｏｌ
ＣＲＩ（プロメガ社製）消化し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ
ー（タカラ社製）を連結した上でＥｃｏＲＩ（タカラ社
製）およびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラ社製）で切断後、２
級アルコール脱水素酵素を有する断片を抽出し、発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断したものと連結することにより、２
級アルコール脱水素酵素遺伝子発現ベクターｐＫＫ−Ｃ
ＰＡ１を構築した（図１１）。
【００７７】［実施例１７］（２級アルコール脱水素酵
素の生産） イシェリヒア・コリ（Esherichia coli ）JM109 のコン
ピテントセルを調製し、発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１
で形質転換することにより、２級アルコール脱水素酵素
生産菌株を作成した。この菌株を、0.1mg/mlの濃度でア
ンピシリンを添加したＬＢ培地（1.0%ポリペプトン、0.
5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)中で30℃、
３時間培養した。最終濃度１mMとなるようにイソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに５時間
培養し、培養液を遠心分離し、集菌した。
素の生産） イシェリヒア・コリ（Esherichia coli ）JM109 のコン
ピテントセルを調製し、発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１
で形質転換することにより、２級アルコール脱水素酵素
生産菌株を作成した。この菌株を、0.1mg/mlの濃度でア
ンピシリンを添加したＬＢ培地（1.0%ポリペプトン、0.
5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)中で30℃、
３時間培養した。最終濃度１mMとなるようにイソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに５時間
培養し、培養液を遠心分離し、集菌した。
【００７８】［実施例１８］（酵素反応での活性評価） 実施例１７に従って調製した菌体を 50mM Tris-HCl pH
9.0、0.01%2- メルカプトエタノールに懸濁し、超音波
粉砕して粗酵素溶液を得た。該酵素液を 50mm トリス塩
酸緩衝液 pH9.0、50mM(S)-1,3-ブタンジオール、2.5mM
ＮＡＤ+ から成る30℃の反応液に加え、ＮＡＤ+ の増加
に伴う340nm の吸光度を測定することで（Ｓ）−１，３
−ブタンジオール酸化活性を測定した。結果を表６に示
す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ
１で形質転換していない宿主イシェリヒア・コリを用
い、実施例１８と同様に行った結果を表６に同時に示
す。
9.0、0.01%2- メルカプトエタノールに懸濁し、超音波
粉砕して粗酵素溶液を得た。該酵素液を 50mm トリス塩
酸緩衝液 pH9.0、50mM(S)-1,3-ブタンジオール、2.5mM
ＮＡＤ+ から成る30℃の反応液に加え、ＮＡＤ+ の増加
に伴う340nm の吸光度を測定することで（Ｓ）−１，３
−ブタンジオール酸化活性を測定した。結果を表６に示
す。なお、対照として、発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ
１で形質転換していない宿主イシェリヒア・コリを用
い、実施例１８と同様に行った結果を表６に同時に示
す。
【００７９】
【表６】 ［実施例１９］（遺伝子組換え菌体による（Ｒ）−１，
３−ブタンジオールの生産） 実施例１７に従って調製した菌体に最終濃度５％となる
ようラセミ１，３−ブタンジオールと0.8%炭酸カルシウ
ム水を加え、直径21mm試験管にて30℃、250rpmで１７時
間振とう反応させた。なお、反応開始時における菌体濃
度を660nm におけるＯＤが２０となるようにした。反応
終了後、遠心分離にて除菌し、得られた上澄液５００μ
ｌを塩化ナトリウムで飽和させた後、酢酸エチル2ml を
用いて残存する１，３−ブタンジオールを抽出した。抽
出液を脱溶媒後、残渣に塩化アセチル100 μｌを加え
て、アセチル化した。これに1ml ｎ−ヘキサンを加えて
アセチル化した１，３−ブタンジオールを溶解し、光学
分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー［カラ
ム：キラルセルＯＢ（ダイセル化学工業株式会社製）、
溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝19:1、波長22
0nm 、流速1.0ml/分、温度40℃］にて光学純度を測定し
た（保持時間：（Ｓ）体15分、（Ｒ）体19.3分）。ま
た、先の上澄液を蒸溜水にて適宜希釈した後、ガスクロ
マトグラフィー［カラム：Thermon 3000 5% / chromoso
rb W 80 〜100 メッシュ（内径3mm ×長さ2.1m）（信和
化工株式会社製）、温度130 ℃］にて１，３−ブタンジ
オール濃度を定量した。得られた１，３−ブタンジオー
ルの光学純度、収率を表７に示す。なお、対照として、
発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない
宿主イシェリア・コリを用い、実施例１９と同様に行っ
た結果を表７に同時に示す。なお、表７中で、収率とは
「最初に添加したラセミ１，３−ブタンジオールに対す
る、反応終了後残存した１，３−ブタンジオールのモル
比」を表す。
３−ブタンジオールの生産） 実施例１７に従って調製した菌体に最終濃度５％となる
ようラセミ１，３−ブタンジオールと0.8%炭酸カルシウ
ム水を加え、直径21mm試験管にて30℃、250rpmで１７時
間振とう反応させた。なお、反応開始時における菌体濃
度を660nm におけるＯＤが２０となるようにした。反応
終了後、遠心分離にて除菌し、得られた上澄液５００μ
ｌを塩化ナトリウムで飽和させた後、酢酸エチル2ml を
用いて残存する１，３−ブタンジオールを抽出した。抽
出液を脱溶媒後、残渣に塩化アセチル100 μｌを加え
て、アセチル化した。これに1ml ｎ−ヘキサンを加えて
アセチル化した１，３−ブタンジオールを溶解し、光学
分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー［カラ
ム：キラルセルＯＢ（ダイセル化学工業株式会社製）、
溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝19:1、波長22
0nm 、流速1.0ml/分、温度40℃］にて光学純度を測定し
た（保持時間：（Ｓ）体15分、（Ｒ）体19.3分）。ま
た、先の上澄液を蒸溜水にて適宜希釈した後、ガスクロ
マトグラフィー［カラム：Thermon 3000 5% / chromoso
rb W 80 〜100 メッシュ（内径3mm ×長さ2.1m）（信和
化工株式会社製）、温度130 ℃］にて１，３−ブタンジ
オール濃度を定量した。得られた１，３−ブタンジオー
ルの光学純度、収率を表７に示す。なお、対照として、
発現プラスミドｐＫＫ−ＣＰＡ１で形質転換していない
宿主イシェリア・コリを用い、実施例１９と同様に行っ
た結果を表７に同時に示す。なお、表７中で、収率とは
「最初に添加したラセミ１，３−ブタンジオールに対す
る、反応終了後残存した１，３−ブタンジオールのモル
比」を表す。
【００８０】
【表７】
【００８１】
【発明の効果】本発明により、新規な、立体特異性を有
する２級アルコール脱水素酵素、該酵素をコードするＤ
ＮＡ、該酵素をコードするＤＮＡにより形質転換された
微生物を得ることが可能になった。
する２級アルコール脱水素酵素、該酵素をコードするＤ
ＮＡ、該酵素をコードするＤＮＡにより形質転換された
微生物を得ることが可能になった。
【００８２】本酵素又は本酵素を産生する微生物（変異
株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を用い
ることにより、ラセミ体アルコールからの光学活性アル
コールの製造、非対称ケトンからの光学活性アルコール
の製造などを効率的に行うことが可能となった。
株や形質転換微生物を含む）もしくはその処理物を用い
ることにより、ラセミ体アルコールからの光学活性アル
コールの製造、非対称ケトンからの光学活性アルコール
の製造などを効率的に行うことが可能となった。
【図１】 精製した２級アルコール脱水素酵素のドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おけるパターンを示す図である。
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おけるパターンを示す図である。
【図２】 ２級アルコール脱水素酵素の（Ｓ）−２−ブ
タノール酸化反応のｐＨ依存性を至適ｐＨを１００とし
た相対活性で示す図である。
タノール酸化反応のｐＨ依存性を至適ｐＨを１００とし
た相対活性で示す図である。
【図３】 ２級アルコール脱水素酵素の２−ブタノン還
元反応のｐＨ依存性を至適ｐＨにおける活性を１００と
した相対活性で示す図である。
元反応のｐＨ依存性を至適ｐＨにおける活性を１００と
した相対活性で示す図である。
【図４】 ２級アルコール脱水素酵素を各ｐＨにおいて
３０℃、３０分処理した後の残存活性を示す図である。
３０℃、３０分処理した後の残存活性を示す図である。
【図５】 ２級アルコール脱水素酵素を各温度で１０分
処理した後の残存活性を示す図である。
処理した後の残存活性を示す図である。
【図６】 ２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮ
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
【図７】 ２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮ
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
【図８】 ２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮ
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
Ａの塩基配列、該塩基配列から予想されるアミノ酸配
列、ＰＣＲプライマー及び逆ＰＣＲプライマーの部位を
示す図である。
【図９】 ＰＣＲ用混合プライマーＣｐＮ、ＣｐＴ１０
の構造を示す図である。なお、図中同一部位に複数の塩
基が記載してあるものは、混合プライマーがそれら複数
の塩基を有するプライマーの混合物になっていることを
示す。
の構造を示す図である。なお、図中同一部位に複数の塩
基が記載してあるものは、混合プライマーがそれら複数
の塩基を有するプライマーの混合物になっていることを
示す。
【図１０】 プラスミドｐＣＰＡ６Ｒの構成を示す図で
ある。
ある。
【図１１】 発現ベクターｐＫＫ−ＣＰＡ１の構成を示
す図である。
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ 9452−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (15)
- 【請求項１】 次のからに示す理化学的性質を有す
る酵素。 作用 ＮＡＤ+ （酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又は
アルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨ（還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、ケ
トン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。 基質特異性 芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質と
する。１級アルコールに比較して２級アルコールに対し
て活性が高い。２−ブタノールのＳ体を優先的に酸化す
る。アルデヒド又は芳香族置換を含む脂肪族ケトンを還
元反応の基質とする。 分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約４万。 - 【請求項２】 キャンディダ(Candida) 属に属し請求項
１の酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素
を取得することを特徴とする、請求項１記載の酵素の製
造方法。 - 【請求項３】 請求項２記載の方法において、キャンデ
ィダ属に属する微生物が、キャンディダ・パラプシロシ
ス (Candida parapsilosis) であることを特徴とする方
法。 - 【請求項４】 請求項１記載の酵素をコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 請求項４記載のＤＮＡにおいて、アミノ
酸配列が実質的に図６、７、８に示されている蛋白質を
コードする塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項５記載のＤＮＡにおいて、アミノ
酸配列が図６、７、８に示されている蛋白質をコードす
る塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項５記載のＤＮＡにおいて、アミノ
酸配列が図６、７、８に示されている配列を置換、挿入
又は欠失したものである蛋白質をコードする塩基配列を
含むことを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項４〜７のいずれかに記載のＤＮＡ
を含むことを特徴とするベクター。 - 【請求項９】 請求項４〜７のいずれかに記載のＤＮＡ
によって形質転換された微生物。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の微生物を培養し、培
養物から請求項１記載の酵素を取得することを特徴とす
る、請求項１記載の酵素の製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を
産生する微生物もしくはその処理物を、ケトン又はアル
デヒドに作用させ、該ケトン又はアルデヒドを還元して
アルコールを製造することを特徴とする、アルコールの
製造方法。 - 【請求項１２】 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を
産生する微生物もしくはその処理物を、非対称ケトンに
作用させ、該非対称ケトンを還元して光学活性アルコー
ルを製造することを特徴とする、光学活性アルコールの
製造方法。 - 【請求項１３】 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を
産生する微生物もしくはその処理物をアルコールに作用
させ、該アルコールを酸化してケトン又はアルデヒドを
製造することを特徴とする、ケトン又はアルデヒドの製
造方法。 - 【請求項１４】 請求項１に記載の酵素、又は該酵素を
産生する微生物もしくはその処理物をラセミ体アルコー
ルに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残
存する光学活性アルコールを取得することを特徴とす
る、光学活性アルコールの製造方法。 - 【請求項１５】 請求項９に記載の微生物由来の酵素、
又は請求項９に記載の微生物もしくはその処理物を作用
させることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに
記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18130894A JP3574682B2 (ja) | 1993-09-24 | 1994-08-02 | 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 |
| DE69434148T DE69434148T2 (de) | 1993-09-24 | 1994-09-26 | Alkoholdehydrogenase, dafür kodierende DNA, Herstellung und Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkoholen |
| EP94115138A EP0645453B1 (en) | 1993-09-24 | 1994-09-26 | Alcohol dehydrogenase, DNA encoding it, preparation and method of preparing optically active alcohols |
| US08/713,254 US5763236A (en) | 1993-09-24 | 1996-09-12 | Method for producing ketone or aldehyde using an alcohol dehydrogenase of Candida Parapsilosis |
| US08/855,767 US6255092B1 (en) | 1993-09-24 | 1997-06-11 | Stereospecific alcohol dehydrogenase isolated from Candida parapsilosis, amino acid and DNA sequences therefor, and method of preparation thereof |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26164993 | 1993-09-24 | ||
| JP5-261649 | 1993-12-28 | ||
| JP33719193 | 1993-12-28 | ||
| JP5-337191 | 1993-12-28 | ||
| JP18130894A JP3574682B2 (ja) | 1993-09-24 | 1994-08-02 | 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07231785A true JPH07231785A (ja) | 1995-09-05 |
| JP3574682B2 JP3574682B2 (ja) | 2004-10-06 |
Family
ID=27324995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18130894A Expired - Fee Related JP3574682B2 (ja) | 1993-09-24 | 1994-08-02 | 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5763236A (ja) |
| EP (1) | EP0645453B1 (ja) |
| JP (1) | JP3574682B2 (ja) |
| DE (1) | DE69434148T2 (ja) |
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| US9416350B2 (en) | 2011-06-28 | 2016-08-16 | Kaneka Corporation | Enzyme function modification method and enzyme variant thereof |
| JP2020517284A (ja) * | 2017-04-27 | 2020-06-18 | コデクシス， インコーポレイテッド | ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド |
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