JPH0723788A - 神経栄養因子の生産方法及びそのためのべクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を効率良く
生産する。 【構成】 ＢＤＮＦの生産に適した発現ベクター、具体
的には調節遺伝子とシグナル配列及びＢＤＮＦをコード
する遺伝子を有するベクター、該ベクターで大腸菌を形
質転換して得られた形質転換体、及び、該形質転換体を
培養してＢＤＮＦを生産する方法からなる。 【効果】 本発明によれば、生物活性を有するＢＤＮＦ
を効率良く、且つ、大量に生産する技術を提供すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、脳由来神経栄養因子の
遺伝子と大腸菌の調節遺伝子及び大腸菌のシグナル配列
をコードするＤＮＡを有するベクター、該ベクターで形
質転換された形質転換体、及び該形質転換体を用いて脳
由来神経栄養因子を生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊椎動物の神経細胞は、その生存に、神
経栄養因子と呼ばれる一群のポリペプチドを必要とす
る。これらのポリペプチドは、神経系の機能や発生、老
化等の機構の解明に役立ち、医薬としても期待されてい
る。

【０００３】脳由来神経栄養因子（以下、ＢＤＮＦと略
記する）はその一種であるが、中枢神経系において重要
な役割を果たしていると考えられており、特に注目され
ている。天然からのＢＤＮＦの単離は、Barde，Y．-A．
らによって初めて報告され、３ｋｇのブタ脳から２μｇ
のＢＤＮＦが得られている（ジ エンボ ジャーナル(EMB
O J.) 1，549（1982））。ＢＤＮＦの生体内における存
在量はこのように極微量であるため、神経系の研究や医
療への利用は非常に困難であると考えられた。

【０００４】その後、Leibrock，J．らによってブタＢ
ＤＮＦ遺伝子がクローニングされ（ネイチャー(Nature)
341，149（1989））、アミノ酸配列が完全に解明され
てからは、動物細胞を宿主とするＢＤＮＦの遺伝子工学
的生産が盛んに試みられている。例えば、Knusel，B．
らは、組換え動物細胞の培養液３ｌから精製を行ない、
１μｇのＢＤＮＦを主成分として含む分画を得ている
（プロシーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)USA 88，961（19
91））。一方、Negro，A．らは、大腸菌を宿主に用い、
Ｎ末端にメチオニンが付加したＢＤＮＦの生産を報告し
ている（バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commu
n.)186，1553（1992））。全菌体蛋白質の２５％に相当
する大量のＢＤＮＦが細胞質内に蓄積したが、生物活性
が認められなかったため、これを変性剤と酸化還元剤に
よって処理することにより生物活性を回復させ、培養液
１ｌ当たり約１００μｇのＢＤＮＦを得ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ＢＤＮＦの遺伝子工学
的生産はこれまで盛んに試みられてきたが、動物細胞を
宿主とする方法では生産量が少なく、培養に要する時間
やコストを考えた場合、生産性に問題がある。一方、培
養が容易な大腸菌を宿主とする方法では、生産されたＢ
ＤＮＦが生物活性を示さず、これを回復させるために煩
雑な操作が必要になる。また、Ｎ末端に余分なアミノ酸
が付加することも大腸菌の問題点であり、ＢＤＮＦの医
療への利用を考える上で障害となりうる。天然からの単
離も含めて、これら従来技術でＢＤＮＦの大量生産を考
えた場合、問題が多い。

【０００６】本発明の課題は、ＢＤＮＦの生産性を向上
させるべく、大腸菌を宿主とする発現効率の高いベクタ
ー及び該ベクターで形質転換された形質転換体を提供す
ることにあり、更に、該形質転換体を培養して、生物活
性を有するＢＤＮＦ成熟蛋白質を効率良く生産する方法
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、大腸菌の
細胞質内に生産されたＢＤＮＦは細胞質内の還元雰囲気
下では正しい立体構造をとることができず、その結果、
生物活性を示さないものと考え、ペリプラズムへのＢＤ
ＮＦの分泌生産を試みた。ＢＤＮＦは分泌性の蛋白質で
あり、大腸菌の細胞質膜の透過に支障は無いものと予想
されたが、天然のプレプロ配列をそのまま膜透過に利用
することは問題があると考えた。そこで、プレプロ配列
を含まない成熟蛋白質としてのＢＤＮＦをコードする遺
伝子と大腸菌のシグナル配列を有する発現ベクターを作
製し、該ベクターで形質転換された大腸菌を培養した結
果、著量のＢＤＮＦが成熟蛋白質として生産されること
を見出した。更に、大腸菌の分泌機構を利用して生産さ
れたＢＤＮＦは生物活性を有していることを見出し、こ
れに基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成した。

【０００８】

【作用】本発明では、大腸菌のシグナル配列を利用し
て、ＢＤＮＦを大腸菌のペリプラズムに生産させている
ため、ＢＤＮＦのポリペプチド鎖が適切に折りたたま
れ、また、Ｓ-Ｓ結合による架橋が適切に行なわれ、そ
の結果、本来の立体構造を保持し生物活性を有するＢＤ
ＮＦが生産できる。また、Ｎ末端に余分なアミノ酸が付
加することなく、完全な成熟蛋白質としてＢＤＮＦを生
産することができる。

【０００９】本発明では、大腸菌の調節遺伝子を利用し
て、大腸菌の増殖とＢＤＮＦの生産が制御できるため、
ＢＤＮＦの生産性が向上する。

【００１０】本発明では、増殖が速く、取扱いが簡便で
ある大腸菌を宿主としているため、動物細胞を宿主とす
る方法よりも高い生産性が実現できる。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を詳述する。

【００１２】ＢＤＮＦのポリペプチド鎖のアミノ酸配列
は、ＢＤＮＦ遺伝子の塩基配列を翻訳することにより決
定されている。前述のLeibrock，J．らによるブタＢＤ
ＮＦ遺伝子のクローニングに続いて、Jones，K．らがヒ
トＢＤＮＦ遺伝子を（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8
7，8060（1990））、Hofer，M．らがマウスＢＤＮＦ遺
伝子を（EMBO J．9，2459（1990））、Maisonpierre，
P．C．らがラットＢＤＮＦ遺伝子を（ジェノミクス(Gen
omics) 10，558（1991））それぞれクローニングし、そ
の塩基配列を翻訳してＢＤＮＦのアミノ酸配列を報告し
ている。ブタＢＤＮＦも含めて、これら哺乳動物のＢＤ
ＮＦのアミノ酸配列は、生物種を超えて完全に一致して
いる。その他の動物のＢＤＮＦについては、例えば、Ha
llbook，F．らがニワトリやサケなどのＢＤＮＦのアミ
ノ酸配列を報告しているが（ニューロン(Neuron) 6，84
5（1991））、ヒトＢＤＮＦとは幾つかのアミノ酸の置
換が認められているだけで、全体として良く類似してい
る。生物種を超えたアミノ酸配列の高い相同性はＢＤＮ
Ｆの特徴の一つであり、従って、本発明は特定のＢＤＮ
Ｆに限定されず、様々な生物のＢＤＮＦに適用できる。

【００１３】本発明のベクターは、ＢＤＮＦのポリペプ
チド鎖をコードするＤＮＡを有しており、該ＤＮＡとし
ては、上記のように天然からクローニングされたＢＤＮ
Ｆ遺伝子及びこれと同一の塩基配列からなるＤＮＡが挙
げられる。天然からクローニングされた遺伝子は、成熟
蛋白質としてのＢＤＮＦをコードするＤＮＡの他に、Ｂ
ＤＮＦのプレプロ配列をコードするＤＮＡやポリペプチ
ドをコードしていないＤＮＡを含んでいる場合が多い。
本発明では、ＢＤＮＦのポリペプチド鎖をコードするＤ
ＮＡとして、成熟蛋白質としてのＢＤＮＦをコードする
ＤＮＡを用いており、このようなＤＮＡは、例えば、次
のような方法で取得することができる。制限酵素を用
いて、天然からクローニングされた遺伝子から目的のＤ
ＮＡを分離する方法。天然からクローニングされた遺
伝子を鋳型として、ＰＣＲ法（Saiki，R．K．ら，サイ
エンス(Science) 239，487（1988））により目的のＤＮ
Ａを増幅する方法。目的のＤＮＡを化学合成する方
法。

【００１４】本発明のベクターが有する、ＢＤＮＦのポ
リペプチド鎖をコードするＤＮＡとしては、更に、ＢＤ
ＮＦのアミノ酸配列を逆翻訳して塩基配列を設計したＤ
ＮＡが挙げられる。ＢＤＮＦのアミノ酸配列を逆翻訳す
ると、遺伝子コドンの縮重によって、複数の塩基配列が
得られるが、この中から適切な塩基配列を選択し設計す
る。設計した塩基配列を有するＤＮＡは化学合成するこ
とにより取得できる。設計の基準としては、使用する
遺伝子コドンが、ＢＤＮＦの生産に用いる大腸菌の中で
出現頻度の高いものであるかどうか、合成した一本鎖
ＤＮＡからＤＮＡ全体を構築する際、ＤＮＡ断片の間違
った連結が生じにくいかどうか、ＤＮＡから転写され
たｍＲＮＡがヘアピン構造等の二次構造を取り、リボソ
ームにおける翻訳の効率低下が生じないかどうか、など
の点が挙げられる。

【００１５】本発明のベクターは、上記ＢＤＮＦのポリ
ペプチド鎖をコードするＤＮＡを有し、該ＤＮＡの5'末
端上流側には大腸菌のシグナル配列をコードするＤＮＡ
が結合している。この二種類のＤＮＡは、その間に余分
な塩基を介することなく、且つ、シグナル配列部分とＢ
ＤＮＦ部分の間でフレームシフトが起こることがないよ
うに結合する。このような結合は、二種類のＤＮＡ
の、該結合に関与する側の末端を、結合後に目的の配列
が生じるように制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓ１ヌ
クレアーゼなどを用いて加工した後、ＤＮＡリガーゼを
用いて両ＤＮＡを結合する方法、正しく結合した状態
の結合部分を含み、二種類のＤＮＡの一部または全部の
配列を化学合成する方法、などを用いることにより実現
される。

【００１６】シグナル配列としては、大腸菌β−ラクタ
マーゼのシグナル配列が好適に用いられる他、大腸菌の
細胞内で機能するものであれば使用することができ、例
えば、大腸菌アルカリホスファターゼのシグナル配列、
大腸菌の各種外膜蛋白質のシグナル配列などが挙げられ
る。

【００１７】シグナル配列を結合することにより、本発
明のベクターを有する大腸菌を培養してＢＤＮＦ遺伝子
を発現させると、ＢＤＮＦはＮ末端にシグナル配列が付
加した融合蛋白質として合成される。シグナル配列の作
用によって該融合蛋白質は大腸菌のペリプラズムに輸送
され、シグナル配列が解離して、ＢＤＮＦは正しいＮ末
端を有する成熟蛋白質へと変化する。ペリプラズムの環
境はＢＤＮＦのポリペプチド鎖の折りたたみ、特に、Ｓ
-Ｓ結合による架橋反応に適しており、その結果、ＢＤ
ＮＦは本来の立体構造を保持し、生物活性を示すことが
できる。

【００１８】本発明のベクターは、また、大腸菌のシグ
ナル配列をコードするＤＮＡの上流側に調節遺伝子を有
する。調節遺伝子としては、大腸菌の細胞内で機能する
ものであれば特に制限はないが、プロモータとしての作
用が強く、遺伝子発現の誘導及び抑制が容易な調節遺伝
子であるトリプトファン調節遺伝子が好適に用いられ
る。トリプトファン調節遺伝子は、ＲＮＡ合成酵素の結
合部位であるプロモータ領域とリプレッサ蛋白質の結合
部位であるオペレータ領域からなる。ＤＮＡを鋳型とす
るメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成はＲＮＡ合
成酵素がプロモータ領域に結合することによって開始さ
れ、合成されたｍＲＮＡはリボソームと結合して、ポリ
ペプチド鎖が合成される。大腸菌の細胞内の L-トリプ
トファン（Ｔｒｐ）濃度が増大すると、リプレッサ蛋白
質はＴｒｐと結合して活性化され、オペレータ領域に結
合する。この結果、ＲＮＡ合成酵素がプロモータ領域に
結合できなくなり、ｍＲＮＡの合成と、これに続くポリ
ペプチド鎖の合成が停止することになる。一方、Ｔｒｐ
濃度が低下してリプレッサ蛋白質がＴｒｐと結合できな
くなるか、あるいは、リプレッサ蛋白質がＴｒｐの類似
物質である３-インドールアクリル酸と結合して不活性
化されると、ｍＲＮＡが合成され、ポリペプチド鎖の合
成が始まる。従って、トリプトファン調節遺伝子を用い
た本発明のベクターを有する大腸菌を培養する場合、培
地中にＴｒｐを添加することにより発現を抑制すること
ができ、逆に、培地中のＴｒｐを除去するか、または、
培地中に３-インドールアクリル酸を添加することによ
り、発現を誘導することができる。

【００１９】トリプトファン調節遺伝子以外で、本発明
のベクターで用いることができる調節遺伝子としては、
例えば、ラクトース調節遺伝子、タック（tac）調節遺
伝子、アルカリホスファターゼ調節遺伝子などが挙げら
れる。また、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子
を組み込んだ大腸菌を宿主とした場合、Ｔ７プロモータ
を用いることができる。

【００２０】本発明のベクターを作製するには、公知の
方法、例えば、Maniatis，T．らのモレキュラー クロー
ニング，ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Clon
ing，A Laboratory Manual)，コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー（ColdSpring Harbor Laborator
y）（1982）に記載された方法を用いることができる。

【００２１】本発明の形質転換体は、以上のようにして
作製したベクターを用いて大腸菌を形質転換することに
より取得できる。

【００２２】大腸菌としては、例えば、ＨＢ１０１株、
ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株などが挙げられる。

【００２３】大腸菌を形質転換する方法としては、例え
ば、Maniatis，T．らのモレキュラー クローニング，ア
ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning，A Lab
o-ratory Manual)，コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold SpringHarbor Laboratory）（1982）
に記載された方法が挙げられる。プラスミドベクターを
用いる場合は塩化カルシウム法または塩化カルシウム/
塩化ルビジウム法が、ファージベクターを用いる場合は
インビトロパッケージング法が適用できる。

【００２４】本発明の神経栄養因子の生産方法は、以上
のようにして得られた形質転換体を培養し、培養物中に
ＢＤＮＦを生産せしめるものである。

【００２５】培養に用いる培地としては、大腸菌の種類
及びベクターの種類により異なるが、例えば、Ｍ９培
地、ＮＺＣＹＭ培地、ＬＢ培地などが挙げられる。ｐＨ
は約６〜８であるのが望ましい。また、前述のように、
培地条件によって遺伝子発現を抑制、誘導すると、形質
転換体の増殖とＢＤＮＦの生産を制御することができ、
その結果、効率良くＢＤＮＦを生産することができる。

【００２６】培養は、通常約３７℃で約４〜２４時間行
ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２７】以下、具体的な実施例を挙げて本発明を更
に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

【００２８】実施例１ ＢＤＮＦ発現ベクターの作製 (1) プライマーＤＮＡの合成（図１） ラットＢＤＮＦ遺伝子の、ＢＤＮＦ成熟蛋白質のＮ末端
であるヒスチジン（His）から６番目のアルギニン（Ar
g）まで及び７番目のArgの一部をコードする部分のセン
ス配列に一致する一本鎖ＤＮＡ（5'-ＣＡＣＴＣＣＧＡ
ＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧ）と、１１４番目のトレオニ
ン（Thr）の一部及び１１５番目のイソロイシン（Ile）
から１１９番目の Arg までをコードする部分のアンチ
センス配列に一致し、更に、翻訳の終止コドンをコード
する配列を付加した一本鎖ＤＮＡ（5'-ＧＡＴＣＣＴＡ
ＴＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧ）を自動Ｄ
ＮＡ合成機380B（アプライド・バイオシステムズ社）を
用いて固相合成した。

【００２９】合成した一本鎖ＤＮＡを樹脂から切り離し
た後、ＯＰＣカートリッジ（アプライド・バイオシステ
ムズ社）を用いて精製し、８５〜１５０μｇの一本鎖Ｄ
ＮＡ（プライマーＤＮＡ）を得た。

【００３０】(2) ＢＤＮＦ遺伝子の合成（図１、図２） ラットＢＤＮＦｃＤＮＡを有するプラスミドｐｃＢＤＮ
Ｆ/ＣＤＭ８ ０.１μｇに各１μＭのプライマーＤＮ
Ａ、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、２.５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝
液を加えて１００μｌとし、ＰＣＲを行った。９４℃で
１.５分間、５５℃で２.５分間、７２℃で３.４分間の
反応サイクルを２５回繰返し、最後に７２℃で７分間反
応させた。反応混合物をエタノール沈殿で濃縮した後、
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、目的の
３６７塩基対のＤＮＡを含むゲル片を切取り、電気溶出
法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをフェノー
ル処理とエタノール沈殿によって精製し、４ＵのＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼと共に３７℃で５分間反応させて、末
端を平滑化した。再度、フェノール処理とエタノール沈
殿によって精製した後、１０ＵのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼと３７℃で１時間反応させて末端をリン酸化
し、１０μｌのＢＤＮＦ遺伝子を得た。

【００３１】得られたＢＤＮＦ遺伝子０.５μｌを用い
てＤＮＡシーケンシングを行なった結果、図１に示す塩
基配列が得られ、蛋白質をコードする部分の塩基配列
は、ＢＤＮＦｃＤＮＡの塩基配列と完全に一致した。

【００３２】(3) ＢＤＮＦ発現ベクターの作製（図２） プラスミドベクターｐＴＲＳＮＧＦ ０.６μｇを制限酵
素ＳａｃＩ ２０Ｕ、次いで、ＢａｍＨＩ １８Ｕとそれ
ぞれ３７℃で１時間反応させて切断した。仔ウシ腸アル
カリホスファターゼ１３Ｕと共に３７℃で１５分間、続
いて５５℃で１５分間反応させて末端を脱リン酸した
後、０.８％アガロースゲル電気泳動を行ない、トリプ
トファン調節遺伝子及び大腸菌β-ラクタマーゼのシグ
ナル配列をコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片を回収
した。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ４Ｕと３７℃で
５分間反応させ、末端を平滑化した。

【００３３】得られたＤＮＡ断片の１/１０量とＢＤＮ
Ｆ遺伝子０.５μｌを混合し、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造）を用いて、４℃で一晩、結合反応を行っ
た。反応混合物を用いて大腸菌Ｃ６００株を形質転換
し、生成したコロニー５２個からプラスミドＤＮＡを調
製した。各種制限酵素による切断及び塩基配列の解析を
行った結果、目的のベクターを保持するクローンが１０
個得られた。この中の１クローンを培養し、培養物中か
ら単離したＢＤＮＦ発現ベクターをｐＴＲＳＢＤＮＦと
命名した。

【００３４】実施例２ ＢＤＮＦ遺伝子の発現 (1) 形質転換体の作製 発現ベクターｐＴＲＳＢＤＮＦ ０.１μｇを用いて大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、１０３個のコロニーを得
た。この中の１クローンをＬＢ培地中で、３７℃、１６
時間培養し、保存菌株とした。

【００３５】この菌株を大腸菌ＨＢ１０１［ｐＴＲＳＢ
ＤＮＦ］と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所
に微工研菌寄第１３７０３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３７０
３）の受託番号で寄託した。

【００３６】(2) 形質転換体の培養 保存菌株１０μｌを１０ｍｌの培地（ＮＨ₄Ｃl １ｇ、
Ｎa₂ＨＰＯ₄ ６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ、ＮaＣl ０.５
ｇ、ＣaＣl₂・2Ｈ₂Ｏ １５ｍｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.
５ｇ、カザミノ酸 ２.５ｇ、グルコース ５ｇ、酵母エ
キス １.５ｇ、L-トリプトファン ４０ｍｇ、L-プロリ
ン ０.１ｇ、塩酸チアミン ０.１ｇ、アンピシリン ５
０ｍｇ、水 １ｌ、ｐＨ７）に接種し、３７℃で一晩培
養した。培養液全量を９０ｍｌの培地（ＮＨ₄Ｃl １
ｇ、Ｎa₂ＨＰＯ₄ ６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ、ＮaＣl ０.
５ｇ、ＣaＣl₂・２Ｈ₂Ｏ １５ｍｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.５ｇ、カザミノ酸 ２.５ｇ、グルコース ５ｇ、L-プ
ロリン ０.１ｇ、塩酸チアミン０.１ｇ、アンピシリン
５０ｍｇ、水 ０.９ｌ、ｐＨ７）に加え、３７℃で２４
時間培養した。

【００３７】(3) 培養物中のＢＤＮＦの検出（図３） 培養２４時間目の菌体を遠心分離で回収し、０.１５Ｍ
食塩水、次いで、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８、
４℃）で洗浄後、５５０ｎｍの吸光度が約２８になるよ
うに１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８、４℃）に懸濁
した。懸濁液４ｍｌに０.５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）４０
μｌを加え、氷冷下で２０kＨz、７０Ｗ、計５.４分
間、超音波を照射し、菌体を破砕した。4,000×ｇ、４
℃、１０分間の遠心分離で未破砕の菌体を除去して得ら
れた菌体抽出液中のＢＤＮＦを、以下の手順で検出し
た。

【００３８】菌体抽出液１０μｌに緩衝液（４０％グリ
セロール、２％ＳＤＳ、０.０４％クマシーブリリアン
トブルーＲ-２５０、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ
６.８）１０μｌを加え、１００℃、５分間加熱した。
この溶液を試料として０.１％ＳＤＳ-１５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行なった後、ゲル中の蛋白質を
ニトロセルロース膜に転写し、マウスＮＧＦ（２.５
Ｓ）に対するポリクローナル抗体（コラボレイティブ
社）と反応させたところ、分子量１４,０００付近に抗
体の結合が認められた。

【００３９】これに対して、培地に L-トリプトファン
を添加し、ＢＤＮＦ遺伝子の発現を抑制した状態で培養
した菌体を同様に処理したところ、分子量１４,０００
付近に抗体の結合は全く認められなかった。

【００４０】ＢＤＮＦとの構造の類似性が高いＮＧＦに
対する抗体と結合し、その分子量がラットＢＤＮＦの分
子量約１３,５００と一致したことから、大腸菌による
ＢＤＮＦの生産が確認できた。抗体の結合量から、ＢＤ
ＮＦの生産量は培養液１ｌあたり１ｍｇ以上と算出され
た。尚、高分子量側に認められる抗体の結合は、ＢＤＮ
Ｆ遺伝子の発現に無関係であり、宿主である大腸菌の蛋
白質が抗体と反応したものである。

【００４１】更に、生産されたＢＤＮＦを精製し、プロ
テインシーケンサ477A（アプライド・バイオシステムズ
社）を用いてＮ末端アミノ酸配列を分析したところ、Ｎ
末端から１０個目までのアミノ酸配列が、ＢＤＮＦ遺伝
子を翻訳して得られるＢＤＮＦのアミノ酸配列と完全に
一致した。この結果、ＢＤＮＦが成熟蛋白質として生産
されたことが確認できた。

【００４２】 実施例３ ＢＤＮＦの生物活性評価（図４） コラーゲンコーティングした２４穴プレートに無血清Ｐ
ＩＴ培地２００μｌとニワトリ８日胚の脊髄後根神経節
（dorsal root ganglia；ＤＲＧ）を入れ、ＣＯ₂インキ
ュベータ内で３７℃で保温し、ＤＲＧをプレート底面に
付着させた。実施例２で調製した菌体抽出液を無菌ろ過
した溶液１０μｌとＰＩＴ培地３００μｌをプレート内
に添加し、ＣＯ₂インキュベータ内で３７℃で３９時間
培養したところ、神経線維の伸長が促進された。これに
対して、ＢＤＮＦ遺伝子の発現を抑制した状態で培養し
た菌体から得られた抽出液では、神経線維の伸長はほと
んど認められなかった。

【００４３】

【発明の効果】本発明で得られたＢＤＮＦは生物活性を
有しており、神経系の研究用試薬として有効に利用でき
る。また、Ｎ末端に余分なアミノ酸が付加されていない
ため、これを高度に精製することにより、神経症に対す
る医薬品としての利用も可能になると考えられる。

【００４４】本発明のベクターは、生物活性を有するＢ
ＤＮＦの発現ベクターとして優れており、ＢＤＮＦの蛋
白質工学的な研究に有効に利用できる。

【００４５】本発明の形質転換体はクローン化されてお
り、ＢＤＮＦ遺伝子を安定して発現させることができ、
生物活性を有するＢＤＮＦの生産系として有効に利用で
きる。

【００４６】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..18 特徴を決定した方法：S 配列 CAC TCC GAC CCC GCC CGC CG 20 His Ser Asp Pro Ala Arg 1 5 配列番号：2 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：3 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA アンチセンス：yes 配列 GATCCTATTATCTTCCCCTTTTAATGG 27 配列番号：4 配列の長さ：476 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：2..7 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：CDS 存在位置：41..466 特徴を決定した方法：S 配列 GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCGACA ATG AGT ATT CAA CAT 55 Met Ser Ile Gln His -20 TTC CGT GTC GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA TTT TGC CTT CCT GTT 103 Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val -15 -10 -5 TTT GCG CAC TCC GAC CCC GCC CGC CGT GGG GAG CTG AGC GTG TGT GAC 151 Phe Ala His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp 1 5 10 AGT ATT AGC GAG TGG GTC ACA GCG GCA GAT AAA AAG ACT GCA GTG GAC 199 Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp 15 20 25 30 ATG TCC GGT GGG ACG GTC ACA GTC CTG GAG AAA GTC CCG GTA TCA AAA 247 Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys 35 40 45 GGC CAA CTG AAG CAA TAT TTC TAC GAG ACC AAG TGT AAT CCC ATG GGT 295 Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly 50 55 60 TAC ACG AAG GAA GGC TGC AGG GGC ATA GAC AAA AGG CAC TGG AAC TCG 343 Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser 65 70 75 CAA TGC CGA ACT ACC CAA TCG TAT GTT CGG GCC CTT ACT ATG GAT AGC 391 Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser 80 85 90 AAA AAG AGA ATT GGC TGG CGG TTC ATA AGG ATA GAC ACT TCC TGT GTA 439 Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val 95 100 105 110 TGT ACA CTG ACC ATT AAA AGG GGA AGA TAATAGGATC 476 Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115 配列番号：5 配列の長さ：142 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-23..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..119 特徴を決定した方法：S 配列 Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala -20 -15 -10 Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu -5 1 5 Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys 10 15 20 25 Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys 30 35 40 Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys 45 50 55 Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys 60 65 70 Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala 75 80 85 Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile 90 95 100 105 Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 110 115

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で作製したＢＤＮＦ発現ベクターｐＴ
ＲＳＢＤＮＦの部分塩基配列、及びこれを翻訳して得ら
れるシグナルペプチドとＢＤＮＦのアミノ酸配列を示
す。

【図２】実施例１で作製したＢＤＮＦ発現ベクターｐＴ
ＲＳＢＤＮＦの作製方法を示す。

【図３】実施例２で得られた菌体抽出液中の蛋白質をＳ
ＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニト
ロセルロース膜に転写後、抗体との結合反応を行なった
結果を示す。（ａ）はＢＤＮＦ遺伝子の発現を抑制した
場合の菌体抽出液、（ｂ）はＢＤＮＦ遺伝子を発現させ
た場合の菌体抽出液を示す。

【図４】実施例３で述べた菌体抽出液中のＢＤＮＦの、
ニワトリ８日胚ＤＲＧに対する神経線維伸長促進活性を
示す。（Ａ）はＢＤＮＦ遺伝子の発現を抑制した場合の
菌体抽出液、（Ｂ）はＢＤＮＦ遺伝子を発現させた場合
の菌体抽出液を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高橋 健一 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式会 社日立製作所基礎研究所内 (72)発明者 清水 範夫 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式会 社日立製作所基礎研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】脳由来神経栄養因子のポリペプチド鎖をコ
   ードするＤＮＡを有し、該ＤＮＡの5'末端上流側に大腸
   菌のシグナル配列をコードするＤＮＡが結合し、更に、
   該シグナル配列をコードするＤＮＡの上流に大腸菌の調
   節遺伝子を有するベクター。
2. 【請求項２】大腸菌のシグナル配列がβ−ラクタマーゼ
   のシグナル配列である請求項１記載のベクター。
3. 【請求項３】大腸菌の調節遺伝子がトリプトファン調節
   遺伝子である請求項１記載のベクター。
4. 【請求項４】大腸菌の調節遺伝子がトリプトファン調節
   遺伝子である請求項２記載のベクター。
5. 【請求項５】請求項１、２又は３記載のベクターで大腸
   菌を形質転換して得られた形質転換体。
6. 【請求項６】請求項５記載の形質転換体を培養し、培養
   物中に脳由来神経栄養因子を生産せしめることを特徴と
   する神経栄養因子の生産方法。
7. 【請求項７】下式の配列を有するベクター。 GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCGACA ATG AGT ATT CAA CAT 55 Met Ser Ile Gln His -20 TTC CGT GTC GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA TTT TGC CTT CCT GTT 103 Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val -15 -10 -5 TTT GCG CAC TCC GAC CCC GCC CGC CGT GGG GAG CTG AGC GTG TGT GAC 151 Phe Ala His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp 1 5 10 AGT ATT AGC GAG TGG GTC ACA GCG GCA GAT AAA AAG ACT GCA GTG GAC 199 Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp 15 20 25 30 ATG TCC GGT GGG ACG GTC ACA GTC CTG GAG AAA GTC CCG GTA TCA AAA 247 Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys 35 40 45 GGC CAA CTG AAG CAA TAT TTC TAC GAG ACC AAG TGT AAT CCC ATG GGT 295 Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly 50 55 60 TAC ACG AAG GAA GGC TGC AGG GGC ATA GAC AAA AGG CAC TGG AAC TCG 343 Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser 65 70 75 CAA TGC CGA ACT ACC CAA TCG TAT GTT CGG GCC CTT ACT ATG GAT AGC 391 Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser 80 85 90 AAA AAG AGA ATT GGC TGG CGG TTC ATA AGG ATA GAC ACT TCC TGT GTA 439 Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val 95 100 105 110 TGT ACA CTG ACC ATT AAA AGG GGA AGA TAATAGGATC 476 Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115