JPH07238024A - 好中球機能改善剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 有効成分としてエンテロコッカス属に属する
微生物の菌体またはその処理物を含有する好中球機能改
善剤 【効果】 抗癌剤、免疫抑制剤等化療法剤投与による好
中球機能の低下の抑制及び、正常状態への早期回復に有
効であり、白血球減少に伴う日和見感染等の予防、軽
減、治療効果を得ることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業土の利用分野】本発明はエンテロコッカス（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物の菌体又はそ
の処理物を有効成分として含有する、白血球中の特に好
中球の機能を活性化する作用を有する製剤に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】現在癌治療における化学療法剤としての
抗癌剤の作用機序は、癌細胞に働きかけて細胞分裂ない
し代謝を阻害することにより、癌細胞の死滅あるいは増
殖抑制をおこなうことにある。しかし、好中球やマクロ
ファージ等への細胞分化が活発に行われている骨髄系幹
細胞に対しても癌細胞に対するのと同様に薬剤が作用
し、これを破壊する。そのため、抗癌剤の使用による副
作用の重篤なものとして白血球（特に好中球）減少に伴
う免疫力の著しい低下が見られる。

【０００３】ヒトの腸管内には１００種類、１００兆個
と言われる腸内菌が生息している。腸内菌の存在は一つ
のエコシステム（生態系）として把握することができ
る。すなわち、腸内菌叢（フローラ）の構成微生物の種
類と量は、微生物相互間及び宿主生体との間の相互依
存、拮抗などの相互作用等の複雑な関係を維持しながら
存在している。この腸内菌叢は、あたかも一つの臓器で
あるとみることができ、その宿主生体における役割の重
要性がますます広く認識されつつある。その役割の範囲
は、発生分化、免疫活性、栄養（消化吸収）、癌、心臓
病、脳疾患をはじめとする成人病や消化器疾患などの各
種疾患、ひいては老化、寿命にいたるまで、直接的又は
間接的に関連しているものと思われる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】現在使用されている抗
癌剤その他の化学療法剤の使用によって生ずる重篤な副
作用である白血球減少症は、生体内の免疫力の減衰やそ
れに起因する日和見感染症を多発させ、また薬剤耐性病
原微生物によるやっかいな感染症を招いている。そのた
め、癌その他の疾患の改善あるいは完治よりも前にこの
様な感染症状態への移行により、投薬を休止せざるを得
ない事例が多い。こうした状況のため、副作用がなく、
白血球減少防止、もしくは白血球機能促進作用を有し、
しかも抗癌剤及びその他の薬剤との併用可能な薬剤が求
められている。

【０００５】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、ヒトの腸
管由来の腸球菌であるエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に白血球減少を予防す
る働きがあることに着目し、各種白血球に対する作用を
詳しく調べた。そして、病原体の進入に際して働く生体
防御系において最初に作用する好中球の機能を高める作
用があることを見いだした。更に本菌はヒトの腸内常在
菌の一種であることから経口摂取による毒性は実質上全
く認められないことより本発明に至ったものである。

【０００６】本発明に用いられるエンテロコッカス属に
属する微生物としてはエンテロコッカス・フェカリス
（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）やエ
ンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃｉｕｍ）等があげられるが、特に有用な菌
株は本発明者らにより健常者の糞便から分離された新菌
株のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＮＦ−１０１１である。
該菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研寄託
第１２５６４号として寄託されている。

【０００７】以下にエンテロコッカス・フェカリスＮＦ
−１０１１の分離手段及び同菌株の菌学的及び生理学的
性質を示す。

【０００８】（１）分離手段 健常者の糞便の加熱滅菌水による１０倍希釈物を適切な
選択培地（ＫＭＮ寒天平板及びＳＦ寒天平板）に塗抹
し、好気条件下３７℃で、４８〜７２時間培養し、菌集
落を出現させた。この菌集落を別の同種平板培地に画線
塗布し、同様に培養して菌集落を再び出現させた。同様
の操作を数回繰り返し、単一の菌種だけからなる単一集
落を分離した。この新分離菌株について、菌学的（形態
的、生化学的及び血清学的）性状を調べ、エンテロコッ
カス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅ
ｃａｌｉｓ）に属すると分類同定した

【０００９】

【００１０】（３）菌体標品の調製 （培地）本発明に用いられる微生物培養用の代表的培地
としては、以下に示す組成のロゴサ液体培地を用いるこ
とができる。 トリプチケース １０ ｇ 酵母エキス ５ ｇ トリプトース ３ ｇ リン酸一カリウム ３ ｇ リン酸二カリウム ３ ｇ クエン酸三アンモニウム ２ ｇ ツイーン８０（界面活性剤） １ ｇ グルコース ２０ ｇ システイン塩酸塩 ０． ２ｇ 塩類溶液（１のとおり） ５ ｍｌ 蒸留水 １，０００ ｍｌ （ｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整、１２１
℃１５分間加熱滅菌） （１）塩類溶液；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １１． ５ ｇ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０． ６８ｇ ＭｎＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ２． ４ ｇ 蒸留水 １００ ｍｌ

【００１１】（培養法）エンテロコッカス属に属する微
生物をロゴサ液体培地１０ｍｌに接種し、３７℃にて１
０〜１６時間好気的に静置培養（前培養）し、約１０^９
個／ｍｌの培養液（シード）を得る。これを１０リット
ルの滅菌ロゴサ液体培地に加え、同様に静置培養する。

【００１２】（集菌、洗浄及び乾燥法）上述のように得
られた培養液を８，０００〜１２，０００ｒｐｍにて遠
心分離操作を行い、生菌体（沈殿物）を得る。生菌体を
生理的食塩水（０．８５％ＮａＣｌ水溶液）で２回洗浄
（同様に遠心分離操作）した後、蒸留水に懸濁して菌液
（約１０^１１個／ｍ１）１００ｍ１を得る。

【００１３】得られた生菌体懸濁液を１００℃で１０分
間加熱して死菌体懸濁液を得る。次に熱風乾燥法など適
査な方法で乾燥処理し、乾燥死菌体を得る。

【００１４】（４）製剤 本発明剤は、上記のようにして得られた生菌体または死
菌体の菌全体あるいはこれらの磨砕物、水抽出物などの
菌体の一部を用いることができる。これらを製剤するに
はでんぷん、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合
剤、崩壊剤、潤滑剤、安定剤、矯味矯具剤等の添加物を
用いて周知の方法で錠剤や顆粒剤に製剤される。

【００１５】（５）使用量 使用量は、症状、年齢等により異なるが、有効成分とし
て１日０．００２〜０．１ｇ／ｋｇ体重を通常成人に対
して１日１回または数回に分けて投与することができ
る。

【００１６】（６）好中球機能の測定法 １）貧食能 好中球の貧食能は、ラテックスビーズを使用し、ビーズ
を４個以上貧食したものを貧食細胞として算定する方法
を用いた。末梢血より分離した好中球分画０．１ｍｌに
ＰＢＳにて１×１０^９個／ｍｌに調整した直径２．２７
μｍのラテックスビーズを５〜１０μｌ添加し、３７℃
で２５分間振とうした。反応終了後、３ｍＭＥＤＴＡ添
加ＰＢＳ２ｍｌに浮遊させて、表面についたラテックス
ビーズを取り除いた。この好中球浮遊液をスライドグラ
スにとり、ギムザ液にて１０分間染色後、顕微鏡下で、
４個以上のビーズを貧食している好中球数を算出した。

【００１７】２）活性酸素産生能 活性酸素産生能の測定は、ケミルミネッセンス法によっ
た。ハイアル中に５ｍＭＨＥＰＥＳ添加−ＭＥＭ培地
（ＧＩＢＣＯ．ＢＲＬ）で４×１０^５ｍｌに調整した細
胞浮遊液５００μｌを注入し、ルミノール溶液２０ｍｌ
を添加して、３７℃、３０分保温した。化学発光測定器
での基底値が安定したところでジモサン２０μｌを添加
し、活性酸素産生能を測定した。

【００１８】

【実施例】

実施例１（菌体の調製） Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓＮＦ−１
０１１をロゴサ液体培地１０リットルに接種（菌数；１
０^６個／ｍｌ）し、３７℃１６時間静置培養を行い、生
菌数１０^９個／ｍｌの培養液を得た。得られた培養液を
１２，０００ｒｐｍで遠心分離して集菌し、これを生理
的食塩水（０．８５％ＮａＣｌ水溶液）で２回洗浄し
て、１００ｍｌ蒸留水に懸濁し、１１０℃１０分間加熱
した。その後凍結乾燥により死菌体菌末を得た。

【００１９】実施例２ 体重１０〜１５ｋｇの健常犬
（雑種、雄性又は雌性）にＡＧＦ社製ドッグフード（乾
燥及び缶詰）及び飲料水を与え、通常の飼育環境にて飼
育した。

【００２０】６匹ずつ２群に分けた犬に、１０ｍｌ／ｋ
ｇのシクロフォスファミド（エンドキサン、シオノギ製
薬）を連続３日間、静脈内投与して、実験的に白血球減
少症を起こさせた。１群はシクロフォスファミド投与と
同時に、実施例１で得た菌体標品を生理的食塩水（０．
８５％ＮａＣｌ水溶液）に溶解又は懸濁し、１００ｍｇ
／ｋｇ体重の割合になるように１４日間連日経口投与を
行った。他方の群には生理的食塩水のみを同量投与し
た。

【００２１】菌体標品投与の５、９、１２、１４日後に
採血を行い、末梢血好中球を常法に従って比重遠沈法に
て分離した。得られた好中球の貧食能及び活性酸素産生
能をもって、好中球の機能亢進の有無を観察した。

【００２２】（貧食能）好中球貧食能を図１に示した
（測定値は平均値±ＳＤを示す）。左の棒グラフは健常
犬の好中球貧食能である。各測定時において菌体標品投
与群の好中球貧食能は、対照群（菌体標品非投与群）の
それよりも高値であり、１２日及び１４日後になると健
常犬のそれと同程度になった。このように、菌体標品投
与によって、好中球貧食能の活性化と早期回復が図られ
た。

【００２３】（活性酸素産生能）好中球活性酸素産生能
を図２に示した（測定値は平均値±ＳＤを示す）。左の
棒グラフは健常犬の好中球活性酸素産生能である。各測
定時において菌体標品投与群の好中球の活性酸素産生能
は対照群のそれよりも高値であり、１２日及び１４日後
になると健常犬のそれと同程度になった。このように、
菌体標品投与によって、好中球活性酸素産生能の増強と
早期回復が図られた。

【００２４】（副作用及び死亡例）シクロフォスファミ
ド投与後の各犬の一般的健康状態（発熱、活動性、食
欲、嘔吐、咳、脱水症状、紫斑、血尿、膀胱炎等の有
無）を観察した。菌体標品投与群では、全実験期間を通
して、シクロフォスファミド処置による副作用（一般的
健康状態）が軽度であった。又、死亡例はなかった。

【００２５】実施例３（製剤例） （１）実施例１で得た死菌体菌末１５０ｍｇを精製でん
ぷん末１５０ｍｇ及び乳糖７００ｍｇと混合して錠剤又
は顆粒剤にする。

【００２６】（２）実施例１で得た死菌体菌末３００ｍ
ｇを大豆タンパク３００ｍｇ及び乳糖４００ｍｇと混合
して錠剤又は顆粒剤にする。

【００２７】

【発明の効果】本発明のエンテロコッカス属菌は、腸内
乳酸球菌であるので毒性がなく、副作用もなく、抗癌
剤、免疫抑制剤等の化学療法剤投与による白血球、特に
好中球機能低下の抑制及び早期の正常状態への回復を促
進するため、白血球減少に起因する日和見感染等の病原
微生物感染に対して予防、軽減、又は治療効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】好中球の貧食能の回復を示すグラフである。

【図２】好中球の活性酸素産生能の回復を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 猪俣 生輝 宮崎県宮崎市学園木花台西１番地の１ 宮 崎大学農学部家畜内科学教室内 (72)発明者 金杉 洋美 宮崎県宮崎市学園木花台西１番地の１ 宮 崎大学農学部家畜内科学教室内 (72)発明者 安部 茂 東京都板橋区板橋４丁目58番地15号棟207 号室 (72)発明者 山口 英世 神奈川県川崎市多摩区栗橋２丁目15番５号

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有効成分としてエンテロコッカス属に属
   する微生物の菌体又はその処理物を含有する好中球機能
   改善剤