JPH07246040A - ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物 - Google Patents
ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
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- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
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-
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- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ＮＴ−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物及びＮ
Ｔ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
を提供する。 【構成】ＮＴ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動
物胚幹細胞を創製し、これを用いてＮＴ−３遺伝子発現
不全非ヒト哺乳動物を作出した。 【効果】本発明のＮＴ−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動
物は、ＮＴ−３の生体内での機能を探求するうえで、あ
るいはＮＴ−３の機能異常に伴う各種の病変の動物モデ
ルとして用いる事ができる。また、本発明のＮＴ−３遺
伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞はＮＴ−
３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を効率よく作出する事
ができる。
Ｔ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
を提供する。 【構成】ＮＴ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動
物胚幹細胞を創製し、これを用いてＮＴ−３遺伝子発現
不全非ヒト哺乳動物を作出した。 【効果】本発明のＮＴ−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動
物は、ＮＴ−３の生体内での機能を探求するうえで、あ
るいはＮＴ−３の機能異常に伴う各種の病変の動物モデ
ルとして用いる事ができる。また、本発明のＮＴ−３遺
伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞はＮＴ−
３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を効率よく作出する事
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニューロトロフィン−
３（以下、ＮＴ−３と略称することがある）遺伝子が不
活性化された非ヒト哺乳動物の胚幹細胞およびＮＴ−３
遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に関する。
３（以下、ＮＴ−３と略称することがある）遺伝子が不
活性化された非ヒト哺乳動物の胚幹細胞およびＮＴ−３
遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】発生工学的技術の発展ならびに分子生物
学の知識の急激な蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作
し、さらに動物個体へ導入することが可能になり〔Gord
on, J.W.ら, プロシーディングス オブ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）
USA, 第７７巻：７３８０−７３８４頁，１９８０
年〕、元来その生物に備わっていない外来性の遺伝形質
を人為的に付加、あるいは生物が持っている内在性の遺
伝形質の発現を抑制する方法も開発されるに至り、様々
な形質転換動物が作り出され形質転換動物として報告さ
れている。このような形質転換動物は、遺伝子工学等技
術によって単離されたクローン化された様々な遺伝子の
機能を明らかにする上で、これまで株化細胞や初代培養
細胞など体外培養細胞を用いていたため、得られる知見
が限られていた遺伝子の機能解析について、個体レベル
での研究が可能となる点で重要である。特に、クローン
化された遺伝子の生物体内での生理学的機能の解析や遺
伝子疾患のモデル系としてこの形質転換動物を利用した
実験や研究が盛んになってきている。胚幹細胞（Embryo
nic stem cell：ＥＳ細胞）は受精後の初期胚である胚
盤胞の内部に存在する内部細胞塊から樹立され、未分化
状態を保ったまま増殖、培養可能な細胞株である。この
細胞は生体のあらゆる種類の細胞に分化することができ
る多分化能を有しており、正常初期胚に注入すると胚体
の形成に参加してキメラ動物を形成することができる
〔Evans M.J. およびKaufman M.H., ネイチャー（Natur
e），第２９２巻，１５４頁（１９８１）〕。この性質
を利用して、様々な遺伝子変異動物の作出が試みられて
きた。その歴史は１９８１年のEvans 及び Kaufman に
よるＥＳ細胞の樹立に始まり、BradleyらによるＥＳキ
メラマウスの作製〔ネイチャー，第３０９巻，２５５頁
（１９８４）〕により本格的な研究が開始された。Thom
as 及び CapecchiがＥＳ細胞の遺伝子相同組換え〔セル
（cell）第５１巻，５０３頁（１９８７）〕に、続いて
Koller らのグループなど３組の研究グループがＥＳ細
胞形質のGermline Transmission に次々に成功し〔プロ
シーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA, 第８６巻，
８９２７頁（１９８９）〕、遺伝子欠損マウスの作製と
これを用いた研究が急速に進展してきた。
学の知識の急激な蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作
し、さらに動物個体へ導入することが可能になり〔Gord
on, J.W.ら, プロシーディングス オブ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）
USA, 第７７巻：７３８０−７３８４頁，１９８０
年〕、元来その生物に備わっていない外来性の遺伝形質
を人為的に付加、あるいは生物が持っている内在性の遺
伝形質の発現を抑制する方法も開発されるに至り、様々
な形質転換動物が作り出され形質転換動物として報告さ
れている。このような形質転換動物は、遺伝子工学等技
術によって単離されたクローン化された様々な遺伝子の
機能を明らかにする上で、これまで株化細胞や初代培養
細胞など体外培養細胞を用いていたため、得られる知見
が限られていた遺伝子の機能解析について、個体レベル
での研究が可能となる点で重要である。特に、クローン
化された遺伝子の生物体内での生理学的機能の解析や遺
伝子疾患のモデル系としてこの形質転換動物を利用した
実験や研究が盛んになってきている。胚幹細胞（Embryo
nic stem cell：ＥＳ細胞）は受精後の初期胚である胚
盤胞の内部に存在する内部細胞塊から樹立され、未分化
状態を保ったまま増殖、培養可能な細胞株である。この
細胞は生体のあらゆる種類の細胞に分化することができ
る多分化能を有しており、正常初期胚に注入すると胚体
の形成に参加してキメラ動物を形成することができる
〔Evans M.J. およびKaufman M.H., ネイチャー（Natur
e），第２９２巻，１５４頁（１９８１）〕。この性質
を利用して、様々な遺伝子変異動物の作出が試みられて
きた。その歴史は１９８１年のEvans 及び Kaufman に
よるＥＳ細胞の樹立に始まり、BradleyらによるＥＳキ
メラマウスの作製〔ネイチャー，第３０９巻，２５５頁
（１９８４）〕により本格的な研究が開始された。Thom
as 及び CapecchiがＥＳ細胞の遺伝子相同組換え〔セル
（cell）第５１巻，５０３頁（１９８７）〕に、続いて
Koller らのグループなど３組の研究グループがＥＳ細
胞形質のGermline Transmission に次々に成功し〔プロ
シーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA, 第８６巻，
８９２７頁（１９８９）〕、遺伝子欠損マウスの作製と
これを用いた研究が急速に進展してきた。
【０００３】現在までに樹立が報告されているＥＳ細胞
には、Evans 及び Kaufman のＥＫ細胞〔前記文献〕の
他に、Doetschman のＥＳ−Ｄ３細胞〔ジャーナル オブ
エンブリオロジー アンド エクスペリメンタル モルフ
ォロジー（J. Embryol. Exp. Molph.）第８７巻，２７
頁（１９８１）〕、Robertson のＣＣＥ細胞〔ネイチャ
ー，第３２３巻，４４５頁（１９８６）〕、Ledermann
及び BurkiのＢＬ/６III細胞〔エクスペリメンタル セ
ル リサーチ（Exp. Cell Res.）第１９７巻，２５４
頁〕等があるが、これらの大部分が１２９系のマウスよ
り樹立されたものである。ＥＳ細胞は特定の遺伝子を修
飾する遺伝子ターゲティング等において利用価値が非常
に高いにもかかわらず、その樹立や未分化状態を保った
ままでの継代維持が困難であるため利用が制限されてい
るというのが現状である。ＥＳ細胞を用いた動物疾患モ
デルの作製を一般化するためには、絶えず良好なＥＳ細
胞を樹立、供給していく体制を確立することが望まれて
いる。このようなＥＳ細胞を用いて作出された遺伝子発
現不全動物としては、Hooper等 ネイチャー（Nature）,
第３２６巻，２９２頁（１９８７年）及びKnehn等ネイ
チャー（Nature），第３２６巻，２９５頁（１９８７
年）の自然突然変異ＥＳ細胞を用いたＨＰＲＴ遺伝子欠
損マウス、Donehower等 ネイチャー（Nature），第３５
６巻，２１５頁（１９９２年）の癌抑制遺伝子の一つで
あるｐ５３を欠失したｐ５３欠失マウス、Zijlstra等
ネイチャー（Nature），第３４４巻，７４２頁（１９９
０年）のβ２ミクログロブリン遺伝子変異マウス、免疫
疾患モデルマウスの一つであるSinkai等 セル（Cel
l），第６８巻，８５５頁（１９９２年）のＲＡＧ−２
（Ｖ(Ｄ)Ｊ recombination activation gene）変異マ
ウス、Glimcher等 サイエンス（Science），第２５３
巻，１４１７頁（１９９１年）及びCosgrove等 セル（C
ell），第６６巻，１０５１頁（１９９１年）のＭＨＣ
classII変異マウスを発生、発育関連疾患モデルマウ
スの一つとしてMacMahon等セル（Cell），第６２巻，１
０７３頁（１９９０年）のint−１遺伝子欠損マウス及
びSoriano等 セル（Cell），第６４巻，６９３頁（１９
９１年）大理石病様症状を呈するsrc遺伝子欠損マウス
がそれぞれ報告されている。
には、Evans 及び Kaufman のＥＫ細胞〔前記文献〕の
他に、Doetschman のＥＳ−Ｄ３細胞〔ジャーナル オブ
エンブリオロジー アンド エクスペリメンタル モルフ
ォロジー（J. Embryol. Exp. Molph.）第８７巻，２７
頁（１９８１）〕、Robertson のＣＣＥ細胞〔ネイチャ
ー，第３２３巻，４４５頁（１９８６）〕、Ledermann
及び BurkiのＢＬ/６III細胞〔エクスペリメンタル セ
ル リサーチ（Exp. Cell Res.）第１９７巻，２５４
頁〕等があるが、これらの大部分が１２９系のマウスよ
り樹立されたものである。ＥＳ細胞は特定の遺伝子を修
飾する遺伝子ターゲティング等において利用価値が非常
に高いにもかかわらず、その樹立や未分化状態を保った
ままでの継代維持が困難であるため利用が制限されてい
るというのが現状である。ＥＳ細胞を用いた動物疾患モ
デルの作製を一般化するためには、絶えず良好なＥＳ細
胞を樹立、供給していく体制を確立することが望まれて
いる。このようなＥＳ細胞を用いて作出された遺伝子発
現不全動物としては、Hooper等 ネイチャー（Nature）,
第３２６巻，２９２頁（１９８７年）及びKnehn等ネイ
チャー（Nature），第３２６巻，２９５頁（１９８７
年）の自然突然変異ＥＳ細胞を用いたＨＰＲＴ遺伝子欠
損マウス、Donehower等 ネイチャー（Nature），第３５
６巻，２１５頁（１９９２年）の癌抑制遺伝子の一つで
あるｐ５３を欠失したｐ５３欠失マウス、Zijlstra等
ネイチャー（Nature），第３４４巻，７４２頁（１９９
０年）のβ２ミクログロブリン遺伝子変異マウス、免疫
疾患モデルマウスの一つであるSinkai等 セル（Cel
l），第６８巻，８５５頁（１９９２年）のＲＡＧ−２
（Ｖ(Ｄ)Ｊ recombination activation gene）変異マ
ウス、Glimcher等 サイエンス（Science），第２５３
巻，１４１７頁（１９９１年）及びCosgrove等 セル（C
ell），第６６巻，１０５１頁（１９９１年）のＭＨＣ
classII変異マウスを発生、発育関連疾患モデルマウ
スの一つとしてMacMahon等セル（Cell），第６２巻，１
０７３頁（１９９０年）のint−１遺伝子欠損マウス及
びSoriano等 セル（Cell），第６４巻，６９３頁（１９
９１年）大理石病様症状を呈するsrc遺伝子欠損マウス
がそれぞれ報告されている。
【０００４】一方、ニューロトロフィンは構造的に類似
している一連の因子群（神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由
来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３
（ＮＴ−３），ＮＴ−４およびＮＴ−５）であり、ＮＧ
Ｆがレヴィーモンタルチーニ（Levi−Monntalchini）、
〔アニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイエ
ンス（Aun. N.Y. Acad. Sci.）第５５巻，３３０頁（１
９５２）〕およびコーエン（Cohen）ら，〔プロシーデ
ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA，第４０巻 １０１４
頁 １９５４年）〕によって見出されて以来、ＢＤＮＦ
〔Barde Ｙ−Ａ，ら，エンボ ジャーナル（EMBO J.）第
１巻，５４９−５５３頁 １９８２年〕、ＮＴ−３〔Hoh
n ら，ネイチャー（Nature），第３４４巻，３９９頁
１９９０年；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０３５６９号公
報〕、ＮＴ−４〔ニューロン（Neuron），第６巻，８４
５頁１９９１年〕、ＮＴ−５〔ニューロン（Neuron），
第７巻，８５７頁 １９９１年〕と順次報告され、脳神
経系疾患、特に痴呆症の予防、治療法をさぐるうえで注
目されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成
熟、生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担ってい
るものとして見い出され、構造上の類似性を有すること
から一つのファミリーに属する因子とされているが、発
育段階において異なる発現様式を示し、また、数種の初
代神経培養細胞の生存維持に関して重複しながらも互い
に異なった細胞に作用することが知られている。これら
の生体における作用としては、ＮＧＦが末梢の交感神経
細胞および中隔野のコリン作動性神経細胞に対して、Ｂ
ＤＮＦが運動神経細胞および中脳のドーパミン作動性神
経細胞に対して作用を有することが知られているが、他
の因子や神経細胞以外に対する作用については、ＮＧＦ
に末梢血リンパ球のコロニー形成促進作用があることが
知られているが、いまだ解明されていない点が多い。
している一連の因子群（神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由
来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３
（ＮＴ−３），ＮＴ−４およびＮＴ−５）であり、ＮＧ
Ｆがレヴィーモンタルチーニ（Levi−Monntalchini）、
〔アニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイエ
ンス（Aun. N.Y. Acad. Sci.）第５５巻，３３０頁（１
９５２）〕およびコーエン（Cohen）ら，〔プロシーデ
ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA，第４０巻 １０１４
頁 １９５４年）〕によって見出されて以来、ＢＤＮＦ
〔Barde Ｙ−Ａ，ら，エンボ ジャーナル（EMBO J.）第
１巻，５４９−５５３頁 １９８２年〕、ＮＴ−３〔Hoh
n ら，ネイチャー（Nature），第３４４巻，３９９頁
１９９０年；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０３５６９号公
報〕、ＮＴ−４〔ニューロン（Neuron），第６巻，８４
５頁１９９１年〕、ＮＴ−５〔ニューロン（Neuron），
第７巻，８５７頁 １９９１年〕と順次報告され、脳神
経系疾患、特に痴呆症の予防、治療法をさぐるうえで注
目されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成
熟、生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担ってい
るものとして見い出され、構造上の類似性を有すること
から一つのファミリーに属する因子とされているが、発
育段階において異なる発現様式を示し、また、数種の初
代神経培養細胞の生存維持に関して重複しながらも互い
に異なった細胞に作用することが知られている。これら
の生体における作用としては、ＮＧＦが末梢の交感神経
細胞および中隔野のコリン作動性神経細胞に対して、Ｂ
ＤＮＦが運動神経細胞および中脳のドーパミン作動性神
経細胞に対して作用を有することが知られているが、他
の因子や神経細胞以外に対する作用については、ＮＧＦ
に末梢血リンパ球のコロニー形成促進作用があることが
知られているが、いまだ解明されていない点が多い。
【０００５】ＮＴ−３については、同じ因子がヒト神経
成長因子２（ＮＧＦ−２）として、ヨーロッパ特許出願
公開第３８６，７５２号公報にポリペプチド（I）とし
て示され、また、フェブス レターズ（FEBS Letter
s），第２６６巻，１８７−１９１頁 １９９０年に発表
されており、（１）その遺伝子は腎臓および脳中の海
馬、小脳に強く発現している。（２）成熟動物よりも新
生仔の方が発現が強い。（３）ＮＧＦ，ＢＤＮＦが作用
を示さないか弱い作用を示すような神経細胞（例えば、
nodose ganglion 由来神経細胞）に作用を示すことが知
られている。これらのことから、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３
は神経系の発達時に重要な働きをしていると考えられ
る。また、最近この因子にヒト末梢血リンパ球のコロニ
ー形成の促進作用を有することが見い出され、白血球，
好中球等の増殖においても重要な働きをしていると考え
られてきている。しかし、これらの作用についても十分
に解明されておらず、ＮＴ−３の生体内における働きに
ついては解明すべき点が数多く残されている。ＮＴ−３
の生体における作用を解明していくうえで、ＮＴ−３を
全く産生しない、ないし少量しか産生しないようなＮＴ
−３遺伝子発現不全動物のモデルは必須のものとして渇
望されているが、現時点において、このような動物モデ
ルは作出されていない。
成長因子２（ＮＧＦ−２）として、ヨーロッパ特許出願
公開第３８６，７５２号公報にポリペプチド（I）とし
て示され、また、フェブス レターズ（FEBS Letter
s），第２６６巻，１８７−１９１頁 １９９０年に発表
されており、（１）その遺伝子は腎臓および脳中の海
馬、小脳に強く発現している。（２）成熟動物よりも新
生仔の方が発現が強い。（３）ＮＧＦ，ＢＤＮＦが作用
を示さないか弱い作用を示すような神経細胞（例えば、
nodose ganglion 由来神経細胞）に作用を示すことが知
られている。これらのことから、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３
は神経系の発達時に重要な働きをしていると考えられ
る。また、最近この因子にヒト末梢血リンパ球のコロニ
ー形成の促進作用を有することが見い出され、白血球，
好中球等の増殖においても重要な働きをしていると考え
られてきている。しかし、これらの作用についても十分
に解明されておらず、ＮＴ−３の生体内における働きに
ついては解明すべき点が数多く残されている。ＮＴ−３
の生体における作用を解明していくうえで、ＮＴ−３を
全く産生しない、ないし少量しか産生しないようなＮＴ
−３遺伝子発現不全動物のモデルは必須のものとして渇
望されているが、現時点において、このような動物モデ
ルは作出されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は遺伝子転移操作を用いて病態モデル動物の作出に応用
しうるＥＳ細胞を提供することであり、またこのような
ＥＳ細胞を用いてＮＴ−３遺伝子不全非ヒト哺乳動物を
作出することにある。
は遺伝子転移操作を用いて病態モデル動物の作出に応用
しうるＥＳ細胞を提供することであり、またこのような
ＥＳ細胞を用いてＮＴ−３遺伝子不全非ヒト哺乳動物を
作出することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねヒト白血病抑制因子（Le
ukemia Inhibitory Factor；ＬＩＦ）を産生するネオマ
イシン耐性、ハイグロマイシン耐性のマウス胎仔線維芽
細胞由来のＳＴＯ細胞〔ザ ニュー バイオロジスト（Th
e New Biologist）第３巻，８６１頁 １９９１年〕をフ
ィーダー細胞として用い、培地中にＬＩＦを通常使用量
の５倍量加える条件下で、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６
Ｘ ＤＢＡ／２）マウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの初
期胚からキメラ形成能を有するＥＳ細胞株をそれぞれ樹
立することに成功し、このＥＳ細胞が高率に生殖系列キ
メラ形成能を有することを確認した。さらに樹立したＥ
Ｓ細胞株を用いて、遺伝子相同組換え法によりＮＴ−３
遺伝子欠損マウスを作出し、この知見に基づいて検討を
重ね本発明を完成させた。
解決するために鋭意検討を重ねヒト白血病抑制因子（Le
ukemia Inhibitory Factor；ＬＩＦ）を産生するネオマ
イシン耐性、ハイグロマイシン耐性のマウス胎仔線維芽
細胞由来のＳＴＯ細胞〔ザ ニュー バイオロジスト（Th
e New Biologist）第３巻，８６１頁 １９９１年〕をフ
ィーダー細胞として用い、培地中にＬＩＦを通常使用量
の５倍量加える条件下で、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６
Ｘ ＤＢＡ／２）マウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの初
期胚からキメラ形成能を有するＥＳ細胞株をそれぞれ樹
立することに成功し、このＥＳ細胞が高率に生殖系列キ
メラ形成能を有することを確認した。さらに樹立したＥ
Ｓ細胞株を用いて、遺伝子相同組換え法によりＮＴ−３
遺伝子欠損マウスを作出し、この知見に基づいて検討を
重ね本発明を完成させた。
【０００８】すなわち本発明は、 １）ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された非
ヒト哺乳動物胚幹細胞、特に、 ２）大腸菌由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を有する細
胞である上記１）記載の胚幹細胞、 ３）ネオマイシン耐性である上記１）記載の胚幹細胞、 ４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記１）記載の
胚幹細胞、 ５）ゲッ歯動物がマウスである上記４）記載の胚幹細胞
であり、また ６）ニューロトロフィン−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳
動物、特に ７）レポーター遺伝子がニューロトロフィン−３プロモ
ーターの制御下で発現しうる上記６）記載の動物、 ８）レポーター遺伝子が大腸菌由来βガラクトシダーゼ
遺伝子である上記７）記載の動物、 ９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記６）記載の
動物、 １０）ゲッ歯動物がマウスである上記９）記載の動物、
および １１）上記７）記載の動物に、被検物質を投与し、レポ
ーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするニュー
ロトロフィン−３プロモーター活性促進物質のスクリー
ニング方法である。
ヒト哺乳動物胚幹細胞、特に、 ２）大腸菌由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を有する細
胞である上記１）記載の胚幹細胞、 ３）ネオマイシン耐性である上記１）記載の胚幹細胞、 ４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記１）記載の
胚幹細胞、 ５）ゲッ歯動物がマウスである上記４）記載の胚幹細胞
であり、また ６）ニューロトロフィン−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳
動物、特に ７）レポーター遺伝子がニューロトロフィン−３プロモ
ーターの制御下で発現しうる上記６）記載の動物、 ８）レポーター遺伝子が大腸菌由来βガラクトシダーゼ
遺伝子である上記７）記載の動物、 ９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記６）記載の
動物、 １０）ゲッ歯動物がマウスである上記９）記載の動物、
および １１）上記７）記載の動物に、被検物質を投与し、レポ
ーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするニュー
ロトロフィン−３プロモーター活性促進物質のスクリー
ニング方法である。
【０００９】本発明におけるＮＴ−３遺伝子が不活性化
された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物
のＮＴ−３ゲノム遺伝子に人為的に変異を加えることに
より遺伝子の発現能を抑制するもしくは該遺伝子がコー
ドしているＮＴ−３蛋白の活性を実質的に喪失させるこ
とにより、遺伝子が実質的にＮＴ−３の発現能を有さな
い（以下、ＮＴ−３ノックアウト遺伝子と称することが
ある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（ＥＳ細胞）をいう。
ここで、非ヒト哺乳動物としては、個体発生及び生涯の
サイクルが短くかつ繁殖が比較的容易なマウス、ラット
等のゲッ歯動物が動物モデルを作出するのに用いるうえ
で好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、ウ
サギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等もこれに含まれる。
上記でいうＮＴ−３ゲノム遺伝子に人為的に変異を加え
る方法としては、遺伝子工学的手法により該遺伝子配列
の一部又は全部の削除、他遺伝子を挿入または置換させ
ることによって行ない得る。これらの変異により、例え
ばコドンの読み取り枠をずらす、プロモーターあるいは
エキソンの機能を破壊することによりＮＴ−３ノックア
ウト遺伝子を作製すればよい。具体例としては、本発明
のＮＴ−３遺伝子不活性化ＥＳ細胞（ＮＴ−３ノックア
ウトＥＳ細胞）は、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物
のＮＴ−３ゲノム遺伝子を単離し、そのエキソン部分に
ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子
を代表とする薬剤耐性遺伝子あるいは lacＺ（β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポ
ーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を
破壊する、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝
子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加
シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡ
を合成できなくすることによって結果的に遺伝子を破壊
するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以
下、ターゲッティングベクターと略する）を例えば相同
組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ
細胞についてＮＴ−３遺伝子上あるいはその近傍のＤＮ
Ａ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション
解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列
とターゲッティングベクター作製に使用したＮＴ−３遺
伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰ
ＣＲ法による解析によりＮＴ−３ノックアウトＥＳ細胞
を選別することにより得ることができる。この操作にお
いて、ＮＴ−３ゲノム遺伝子は、例えば既報のヒトＮＴ
−３ｃＤＮＡ配列〔フェブス レターズ（FEBS Letter
s）第２６６巻，１８７頁 １９９０年〕など公知のｃＤ
ＮＡ配列を基にしたセンスプライマーとアンチセンスプ
ライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（ＰＣＲ）法などの公知方法を用いて単離することが
できる。
された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物
のＮＴ−３ゲノム遺伝子に人為的に変異を加えることに
より遺伝子の発現能を抑制するもしくは該遺伝子がコー
ドしているＮＴ−３蛋白の活性を実質的に喪失させるこ
とにより、遺伝子が実質的にＮＴ−３の発現能を有さな
い（以下、ＮＴ−３ノックアウト遺伝子と称することが
ある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（ＥＳ細胞）をいう。
ここで、非ヒト哺乳動物としては、個体発生及び生涯の
サイクルが短くかつ繁殖が比較的容易なマウス、ラット
等のゲッ歯動物が動物モデルを作出するのに用いるうえ
で好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、ウ
サギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等もこれに含まれる。
上記でいうＮＴ−３ゲノム遺伝子に人為的に変異を加え
る方法としては、遺伝子工学的手法により該遺伝子配列
の一部又は全部の削除、他遺伝子を挿入または置換させ
ることによって行ない得る。これらの変異により、例え
ばコドンの読み取り枠をずらす、プロモーターあるいは
エキソンの機能を破壊することによりＮＴ−３ノックア
ウト遺伝子を作製すればよい。具体例としては、本発明
のＮＴ−３遺伝子不活性化ＥＳ細胞（ＮＴ−３ノックア
ウトＥＳ細胞）は、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物
のＮＴ−３ゲノム遺伝子を単離し、そのエキソン部分に
ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子
を代表とする薬剤耐性遺伝子あるいは lacＺ（β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポ
ーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を
破壊する、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝
子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加
シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡ
を合成できなくすることによって結果的に遺伝子を破壊
するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以
下、ターゲッティングベクターと略する）を例えば相同
組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ
細胞についてＮＴ−３遺伝子上あるいはその近傍のＤＮ
Ａ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション
解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列
とターゲッティングベクター作製に使用したＮＴ−３遺
伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰ
ＣＲ法による解析によりＮＴ−３ノックアウトＥＳ細胞
を選別することにより得ることができる。この操作にお
いて、ＮＴ−３ゲノム遺伝子は、例えば既報のヒトＮＴ
−３ｃＤＮＡ配列〔フェブス レターズ（FEBS Letter
s）第２６６巻，１８７頁 １９９０年〕など公知のｃＤ
ＮＡ配列を基にしたセンスプライマーとアンチセンスプ
ライマーを用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（ＰＣＲ）法などの公知方法を用いて単離することが
できる。
【００１０】また、相同組換え法等によりＮＴ−３遺伝
子を不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば前述の
ような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知の
Evans と Kaufman の方法に準じて新しく樹立したもの
でもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに変わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するな
どの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ
／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善
したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ１マウスは採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えてＣ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つの
で、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウス
を作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロス
する事でその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに変え
る事が可能である点で有利に用いうる。
子を不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば前述の
ような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知の
Evans と Kaufman の方法に準じて新しく樹立したもの
でもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに変わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するな
どの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ
／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善
したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ１マウスは採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えてＣ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つの
で、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウス
を作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロス
する事でその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに変え
る事が可能である点で有利に用いうる。
【００１１】また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には
受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、本発明におい
てはこれ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して
用いることにより効率よく多数の初期胚を取得すること
を見い出している。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用い
てもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを
作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削
減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが
望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば
ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増
幅、検出する方法がその１例として挙げることができ
る。この方法を使用すれば、従来核型分析をするのに約
１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー
程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期に
おけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行
うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にした
ことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。また、
第二次セレクションとしては、例えばＧ−バンディング
法による染色体数の確認等により行うことができる。得
られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望まし
いが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、
ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例
えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に
再びクローニングすることが望ましい。
受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、本発明におい
てはこれ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して
用いることにより効率よく多数の初期胚を取得すること
を見い出している。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用い
てもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを
作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削
減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが
望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば
ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増
幅、検出する方法がその１例として挙げることができ
る。この方法を使用すれば、従来核型分析をするのに約
１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー
程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期に
おけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行
うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にした
ことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。また、
第二次セレクションとしては、例えばＧ−バンディング
法による染色体数の確認等により行うことができる。得
られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望まし
いが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、
ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例
えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に
再びクローニングすることが望ましい。
【００１２】このようにして得られた胚幹細胞株は通常
その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いや
すいので、注意深く継代培養することが必要である。例
えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞
上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培
養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気あるい
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には例えばトリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５mＭＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリ
プシン／１mＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新た
に用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとら
れる。このような継代は通常１−３日毎に行うが、この
際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けら
れた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。本
発明ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞の両方のＮＴ−３遺伝子座を
異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を保持する２種のターゲ
ティングベクターによりそれぞれ不活化することも可能
であり、このようにして得られたＮＴ−３遺伝子不活化
ＥＳ細胞株はＮＴ−３遺伝子の作用、機能をイン ビト
ロ(in vitro)において検討するうえで有用である。ＥＳ
細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養
するあるいは細胞集塊を形成するまで浮遊培養すること
により、頭頂筋、内蔵筋、心筋などの種々のタイプの細
胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans 及び
M. H. Kaufman, ネイチャー(Nature) 第292巻 154頁 19
81年；G. R. Martin プロシーディングス オブ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー (Pro
c. Natl.Acad. Sci. U.S.A) 第78巻 7634頁 1981年；T.
C. Doetschman ら ジャーナルオブ エンブリオロジー
アンド エクスペリメンタル モルフォロジー 第87巻 27
頁1985年]、本発明ＥＳ細胞を分化させて得られるＮＴ
−３発現不全細胞は、イン ビトロにおけるＮＴ−３の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＮＴ−
３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、ＮＴ−３遺伝子の
不活性化により正常なＮＴ−３遺伝子を有する同種の動
物に対して、その遺伝子発現量が５０％以下に減退させ
られた非ヒト哺乳動物であり、例えば、後述の参考例に
示すように該動物のmＲＮＡ量を公知方法を用いて測定
して間接的にその発現量を比較することにより、正常動
物と区別することが可能である。該非ヒト哺乳動物とし
ては、病態動物モデル系の作製の面から固体発生及び生
物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なマウス、ラ
ット等のゲッ歯動物が好ましいが、特にこれらに限らず
例えば、ウサギ，ブタ，ウシ，ヤギ，ヒツジ，イヌ，ネ
コ等もこれに含まれる。
その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いや
すいので、注意深く継代培養することが必要である。例
えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞
上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培
養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気あるい
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には例えばトリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５mＭＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリ
プシン／１mＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新た
に用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとら
れる。このような継代は通常１−３日毎に行うが、この
際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けら
れた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。本
発明ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞の両方のＮＴ−３遺伝子座を
異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を保持する２種のターゲ
ティングベクターによりそれぞれ不活化することも可能
であり、このようにして得られたＮＴ−３遺伝子不活化
ＥＳ細胞株はＮＴ−３遺伝子の作用、機能をイン ビト
ロ(in vitro)において検討するうえで有用である。ＥＳ
細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養
するあるいは細胞集塊を形成するまで浮遊培養すること
により、頭頂筋、内蔵筋、心筋などの種々のタイプの細
胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans 及び
M. H. Kaufman, ネイチャー(Nature) 第292巻 154頁 19
81年；G. R. Martin プロシーディングス オブ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー (Pro
c. Natl.Acad. Sci. U.S.A) 第78巻 7634頁 1981年；T.
C. Doetschman ら ジャーナルオブ エンブリオロジー
アンド エクスペリメンタル モルフォロジー 第87巻 27
頁1985年]、本発明ＥＳ細胞を分化させて得られるＮＴ
−３発現不全細胞は、イン ビトロにおけるＮＴ−３の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＮＴ−
３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、ＮＴ−３遺伝子の
不活性化により正常なＮＴ−３遺伝子を有する同種の動
物に対して、その遺伝子発現量が５０％以下に減退させ
られた非ヒト哺乳動物であり、例えば、後述の参考例に
示すように該動物のmＲＮＡ量を公知方法を用いて測定
して間接的にその発現量を比較することにより、正常動
物と区別することが可能である。該非ヒト哺乳動物とし
ては、病態動物モデル系の作製の面から固体発生及び生
物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なマウス、ラ
ット等のゲッ歯動物が好ましいが、特にこれらに限らず
例えば、ウサギ，ブタ，ウシ，ヤギ，ヒツジ，イヌ，ネ
コ等もこれに含まれる。
【００１３】本発明のＮＴ−３遺伝子発現不全（ＮＴ−
３ノックアウト）非ヒト哺乳動物は、例えば前述のよう
にして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹
細胞あるいはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲ
ッティングベクターのＮＴ−３遺伝子が不活性化された
ＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えによりマウス胚幹細胞あ
るいはマウス卵細胞の染色体上のＮＴ−３遺伝子と入れ
換わる相同組換えをさせることによりＮＴ−３遺伝子を
ノックアウトさせることができる。ＮＴ−３遺伝子がノ
ックアウトされた細胞は、ＮＴ−３遺伝子上あるいはそ
の近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダ
イゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上
のＤＮＡ配列とターゲッティングベクターに使用したマ
ウスＮＴ−３遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプラ
イマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相
同組換えによりＮＴ−３遺伝子の不活性化された細胞株
をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば８細
胞期の非ヒト哺乳動物胚あるいは胚盤胞に注入し、作製
したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に
移植する。作出された動物は正常なＮＴ−３遺伝子座を
もつ細胞と人為的に変異したＮＴ−３遺伝子座をもつ細
胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ
動物の生殖細胞の一部が変異したＮＴ−３遺伝子座をも
つ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配するこ
とにより得られた個体群より全ての組織が人為的に変異
を加えたＮＴ−３遺伝子座をもつ細胞で構成された個体
を例えばコートカラーの判定等により選別することによ
り得られる。このようにして得られた個体は通常ＮＴ−
３ヘテロ発現不全個体であり、ＮＴ−３ヘテロ発現不全
個体同志を交配し、それらの産仔からＮＴ−３ホモ発現
不全個体を得ることができる。
３ノックアウト）非ヒト哺乳動物は、例えば前述のよう
にして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹
細胞あるいはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲ
ッティングベクターのＮＴ−３遺伝子が不活性化された
ＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えによりマウス胚幹細胞あ
るいはマウス卵細胞の染色体上のＮＴ−３遺伝子と入れ
換わる相同組換えをさせることによりＮＴ−３遺伝子を
ノックアウトさせることができる。ＮＴ−３遺伝子がノ
ックアウトされた細胞は、ＮＴ−３遺伝子上あるいはそ
の近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダ
イゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上
のＤＮＡ配列とターゲッティングベクターに使用したマ
ウスＮＴ−３遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプラ
イマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができ
る。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相
同組換えによりＮＴ−３遺伝子の不活性化された細胞株
をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば８細
胞期の非ヒト哺乳動物胚あるいは胚盤胞に注入し、作製
したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に
移植する。作出された動物は正常なＮＴ−３遺伝子座を
もつ細胞と人為的に変異したＮＴ−３遺伝子座をもつ細
胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ
動物の生殖細胞の一部が変異したＮＴ−３遺伝子座をも
つ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配するこ
とにより得られた個体群より全ての組織が人為的に変異
を加えたＮＴ−３遺伝子座をもつ細胞で構成された個体
を例えばコートカラーの判定等により選別することによ
り得られる。このようにして得られた個体は通常ＮＴ−
３ヘテロ発現不全個体であり、ＮＴ−３ヘテロ発現不全
個体同志を交配し、それらの産仔からＮＴ−３ホモ発現
不全個体を得ることができる。
【００１４】卵細胞を使用する場合は、例えば卵細胞核
内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入す
ることによりターゲッティングベクターを染色体内に導
入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることが
でき、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物より
は遺伝子相同組換えによりＮＴ−３遺伝子座に変異のあ
るものを選択することにより得られる。このようにして
ＮＴ−３遺伝子がノックアウトされている個体は、交配
により得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされ
ていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行う
ことができる。さらに、生殖系列の取得および保持につ
いても常法に従えばよい。すなわち該不活化遺伝子の保
有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝
子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
しうる。得られた、ホモザイゴート動物は、後述の実施
例５に示すように、母親動物に対して正常固体１，ホモ
ザイゴート複数になるような状態で飼育することにより
効率的に得られる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配
することにより、該不活化遺伝子を有するホモザイゴー
トおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明
のＮＴ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹
細胞は、ＮＴ−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を作出
する上で、非常に有用であり、また、本発明のＮＴ−３
発現不全マウスは種々の神経細胞に対する分化機能、す
なわち、ＮＴ−３の神経突起の伸長促進及びその生存を
維持する機能を欠失するため、感覚神経，運動神経を始
めとする末梢神経障害あるいは学習障害，小脳の失調を
始めとする中枢神経障害を呈し、これらを原因とする疾
病のモデルとなり得る。従って、これらの疾病の原因究
明及び治療法の検討に有用であり、例えば向知能薬の効
果の試験に用いることが可能である。またヒト末梢血リ
ンパ球のコロニー形成の促進および fibroblast の増殖
促進機能等の機能を欠失するため、白血球成熟不全症あ
るいは白血球減少症を呈する疾患モデルマウスあるいは
臓器硬化症を呈する疾患モデルにもなり得る。
内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入す
ることによりターゲッティングベクターを染色体内に導
入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることが
でき、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物より
は遺伝子相同組換えによりＮＴ−３遺伝子座に変異のあ
るものを選択することにより得られる。このようにして
ＮＴ−３遺伝子がノックアウトされている個体は、交配
により得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされ
ていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行う
ことができる。さらに、生殖系列の取得および保持につ
いても常法に従えばよい。すなわち該不活化遺伝子の保
有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝
子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
しうる。得られた、ホモザイゴート動物は、後述の実施
例５に示すように、母親動物に対して正常固体１，ホモ
ザイゴート複数になるような状態で飼育することにより
効率的に得られる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配
することにより、該不活化遺伝子を有するホモザイゴー
トおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。本発明
のＮＴ−３遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹
細胞は、ＮＴ−３遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を作出
する上で、非常に有用であり、また、本発明のＮＴ−３
発現不全マウスは種々の神経細胞に対する分化機能、す
なわち、ＮＴ−３の神経突起の伸長促進及びその生存を
維持する機能を欠失するため、感覚神経，運動神経を始
めとする末梢神経障害あるいは学習障害，小脳の失調を
始めとする中枢神経障害を呈し、これらを原因とする疾
病のモデルとなり得る。従って、これらの疾病の原因究
明及び治療法の検討に有用であり、例えば向知能薬の効
果の試験に用いることが可能である。またヒト末梢血リ
ンパ球のコロニー形成の促進および fibroblast の増殖
促進機能等の機能を欠失するため、白血球成熟不全症あ
るいは白血球減少症を呈する疾患モデルマウスあるいは
臓器硬化症を呈する疾患モデルにもなり得る。
【００１５】また、ＮＴ−３の構造遺伝子をレポーター
遺伝子で置換された本発明のＮＴ−３発現動物では、レ
ポーター遺伝子がＮＴ−３のプロモーターの支配下に存
在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現
をトレースすることにより、ＮＴ−３プロモーターの活
性を検出することができる。例えばＮＴ−３タンパク質
をコードする遺伝子領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、
本来ＮＴ−３の発現する組織でＮＴ−３の代わりにβ−
ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノ
シド（X-gal）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質と
なる試薬を用いて染色することにより、簡便にＮＴ−３
の動物生体内における発現状態を観察することが出来
る。具体的には、ＮＴ−３欠損マウスあるいはその組織
切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコ燐
酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ-ｇａｌを含
む染色液で、室温あるいは３７℃付近で、約３０分ない
し１時間反応させた後、組織標本を１mM EDTA/PBS溶液
で洗浄することによってβ−ガラクトシダーゼ反応を停
止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従いｌａ
ｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。このよう
な本発明のＮＴ−３が発現不全動物は、ＮＴ−３プロモ
ーターを活性化あるいは不活化する物質をスクリーニン
グするうえで極めて有用であり、ＮＴ−３発現不全に起
因する各種疾患の原因究明あるいは治療薬の開発に大き
く貢献しうる。
遺伝子で置換された本発明のＮＴ−３発現動物では、レ
ポーター遺伝子がＮＴ−３のプロモーターの支配下に存
在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現
をトレースすることにより、ＮＴ−３プロモーターの活
性を検出することができる。例えばＮＴ−３タンパク質
をコードする遺伝子領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、
本来ＮＴ−３の発現する組織でＮＴ−３の代わりにβ−
ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノ
シド（X-gal）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質と
なる試薬を用いて染色することにより、簡便にＮＴ−３
の動物生体内における発現状態を観察することが出来
る。具体的には、ＮＴ−３欠損マウスあるいはその組織
切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコ燐
酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ-ｇａｌを含
む染色液で、室温あるいは３７℃付近で、約３０分ない
し１時間反応させた後、組織標本を１mM EDTA/PBS溶液
で洗浄することによってβ−ガラクトシダーゼ反応を停
止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従いｌａ
ｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。このよう
な本発明のＮＴ−３が発現不全動物は、ＮＴ−３プロモ
ーターを活性化あるいは不活化する物質をスクリーニン
グするうえで極めて有用であり、ＮＴ−３発現不全に起
因する各種疾患の原因究明あるいは治療薬の開発に大き
く貢献しうる。
【００１６】本明細書および図面において、塩基，アミ
ノ酸，溶媒等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。なお、上記略号は、それに相当する化合物のペ
プチド結合を形成しうる残基を示す場合もある。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：シイテイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
ノ酸，溶媒等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。なお、上記略号は、それに相当する化合物のペ
プチド結合を形成しうる残基を示す場合もある。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：シイテイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまで
もない。 参考例１ 遺伝子発現量の測定 非ヒト哺乳動物より摘出した組織を５．０mlの冷生理食
塩水液で洗浄し、そして全ＲＮＡをクリグウィン（Chir
gwin）等〔バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４
頁（１９７９年）〕の方法によりＣsＣl濃度勾配変法を
用いて単離する。調製したＲＮＡペレットをエタノール
中で再沈殿させて１回洗浄する。次にポリ（Ａ）ＲＮＡ
をアビブ（Aviv）等〔プロシーディングス オブ ナシ
ョナルアカデミー オブ サイエンス（P. N. A. S.）
U. S. A. 第６９巻、第１４０８頁（１９７２年）〕の
方法により、オリゴ−ｄＴ−セルロースを用いてポリ
（Ａ）ＲＮＡを濃縮し、最後にエタノール沈殿により回
収する。各組織より取得した等量のポリ（Ａ）ＲＮＡを
１％ホルムアルデヒド１.５％アガロースゲルにて電気
泳動にかけ、ナイロンフィルターに吸い取らせ、トーマ
ス（Thomas）〔プロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（P. N. A.S.） U. S.
A. 第７７巻、第７５２０１頁（１９８０年）〕により
記載された方法に従って行う。先のフィルターをマウス
ＮＴ−３遺伝子配列を含む32Ｐ−ＤＮＡプローブへ一晩
ハイブリッド化させ、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにて
室温で２回洗浄し、かつ０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ
にて６５℃で１回洗浄する。洗浄したフィルターをＦＵ
ＪＩ ＢＡＳ２０００などの適当な解析装置により各ハ
イブリッドのバンドを視覚化および定量化することによ
り遺伝子発現量を定量する。
するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまで
もない。 参考例１ 遺伝子発現量の測定 非ヒト哺乳動物より摘出した組織を５．０mlの冷生理食
塩水液で洗浄し、そして全ＲＮＡをクリグウィン（Chir
gwin）等〔バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４
頁（１９７９年）〕の方法によりＣsＣl濃度勾配変法を
用いて単離する。調製したＲＮＡペレットをエタノール
中で再沈殿させて１回洗浄する。次にポリ（Ａ）ＲＮＡ
をアビブ（Aviv）等〔プロシーディングス オブ ナシ
ョナルアカデミー オブ サイエンス（P. N. A. S.）
U. S. A. 第６９巻、第１４０８頁（１９７２年）〕の
方法により、オリゴ−ｄＴ−セルロースを用いてポリ
（Ａ）ＲＮＡを濃縮し、最後にエタノール沈殿により回
収する。各組織より取得した等量のポリ（Ａ）ＲＮＡを
１％ホルムアルデヒド１.５％アガロースゲルにて電気
泳動にかけ、ナイロンフィルターに吸い取らせ、トーマ
ス（Thomas）〔プロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（P. N. A.S.） U. S.
A. 第７７巻、第７５２０１頁（１９８０年）〕により
記載された方法に従って行う。先のフィルターをマウス
ＮＴ−３遺伝子配列を含む32Ｐ−ＤＮＡプローブへ一晩
ハイブリッド化させ、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにて
室温で２回洗浄し、かつ０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ
にて６５℃で１回洗浄する。洗浄したフィルターをＦＵ
ＪＩ ＢＡＳ２０００などの適当な解析装置により各ハ
イブリッドのバンドを視覚化および定量化することによ
り遺伝子発現量を定量する。
【００１８】 参考例２ ＥＳ細胞用フィーダー細胞の調製 フィーダーとして用いるＳＴＯ細胞は１０％牛胎仔血清
（ＦＢＳ：Flow）、０.１mＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡ
Ａ：ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ：日水製薬）（以下、ＳＴＯ細胞用培地と称
する）で培養し、コンフルエントになる直前の約７０〜
８０％コンフルエントまで培養した時点で培地に終濃度
１０μg／mlになるようマイトマイシンＣ（協和発酵工
業）を加え３７℃で２．５時間培養した後、１mＭ ＥＤ
ＴＡ含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ
(−)）で２回洗浄し、０．０２５％トリプシンを含む１
mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)処理によりシングルセルサス
ペンジョンとした後培地を加え２００×ｇ ５分間遠心
して細胞を集めた。ＳＴＯ細胞用培地で細胞を２×１０
5個／mlの濃度に懸濁し、予め０.１％ゼラチン溶液（シ
グマ社）でコーティングしておいた２４穴リンブロカル
チャープレートあるいは３５mm、６０mm、１００mmのペ
トリディシュ（ファルコン社）にそれぞれ１ml、２ml、
３ml、１０mlの細胞懸濁液を加えて単層のフィーダー細
胞を調製した。
（ＦＢＳ：Flow）、０.１mＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡ
Ａ：ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地
（ＤＭＥＭ：日水製薬）（以下、ＳＴＯ細胞用培地と称
する）で培養し、コンフルエントになる直前の約７０〜
８０％コンフルエントまで培養した時点で培地に終濃度
１０μg／mlになるようマイトマイシンＣ（協和発酵工
業）を加え３７℃で２．５時間培養した後、１mＭ ＥＤ
ＴＡ含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ
(−)）で２回洗浄し、０．０２５％トリプシンを含む１
mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)処理によりシングルセルサス
ペンジョンとした後培地を加え２００×ｇ ５分間遠心
して細胞を集めた。ＳＴＯ細胞用培地で細胞を２×１０
5個／mlの濃度に懸濁し、予め０.１％ゼラチン溶液（シ
グマ社）でコーティングしておいた２４穴リンブロカル
チャープレートあるいは３５mm、６０mm、１００mmのペ
トリディシュ（ファルコン社）にそれぞれ１ml、２ml、
３ml、１０mlの細胞懸濁液を加えて単層のフィーダー細
胞を調製した。
【００１９】参考例３ ＥＳ細胞の雌雄判定 ＥＳ細胞１コロニー（細胞数約５０個）をエッペンドル
フチューブにとり、６００μｇ／mlのプロテインキナー
ゼ K（シグマ社）を含む細胞溶解用バッファー１００μ
l中で３７℃で一晩または５５℃で９０分インキュベー
トすることにより溶解した後、９５℃で１０分間加温し
プロテインキナーゼ Kを不活化後、１４００×ｇ、５分
間遠心した。上清を新しいチューブに移しエタノール沈
殿後、再蒸留水に溶かしその１／４量をＰＣＲのテンプ
レートとし、既報〔Hogan B.ら，Manipulating the Mou
se Embryo：実験マニュアル（コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー発行）〕のＳｒｙ遺伝子（４３
１bp）の塩基配列を基にして合成した５’＞ＣＡＧＣＣ
ＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＴ＜３’（Ｓ
ｒｙ−３）〔配列番号１〕および５’＞ＡＣＴＣＣＡＧ
ＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧ＜３’（Ｓｒｙ
−４）〔配列番号２〕をＰＣＲ用プライマーとして９４
℃５分でプレヒート後、９４℃３０秒、６０℃１分３０
秒のサイクルを４０回行い、さらに最後に７２℃５分の
エクステンションを行い、４３１ｂｐのＤＮＡフラグメ
ントの増幅の有無を確認した。
フチューブにとり、６００μｇ／mlのプロテインキナー
ゼ K（シグマ社）を含む細胞溶解用バッファー１００μ
l中で３７℃で一晩または５５℃で９０分インキュベー
トすることにより溶解した後、９５℃で１０分間加温し
プロテインキナーゼ Kを不活化後、１４００×ｇ、５分
間遠心した。上清を新しいチューブに移しエタノール沈
殿後、再蒸留水に溶かしその１／４量をＰＣＲのテンプ
レートとし、既報〔Hogan B.ら，Manipulating the Mou
se Embryo：実験マニュアル（コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー発行）〕のＳｒｙ遺伝子（４３
１bp）の塩基配列を基にして合成した５’＞ＣＡＧＣＣ
ＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＴ＜３’（Ｓ
ｒｙ−３）〔配列番号１〕および５’＞ＡＣＴＣＣＡＧ
ＴＣＴＴＧＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧ＜３’（Ｓｒｙ
−４）〔配列番号２〕をＰＣＲ用プライマーとして９４
℃５分でプレヒート後、９４℃３０秒、６０℃１分３０
秒のサイクルを４０回行い、さらに最後に７２℃５分の
エクステンションを行い、４３１ｂｐのＤＮＡフラグメ
ントの増幅の有無を確認した。
【００２０】実施例１ ＥＳ細胞株の樹立 ＢＤＦ１及びＣ５７ＢＬ／６の雄マウスに５ＩＵの妊馬
血清セロトロピン（ＰＭＳ：帝国臓器製薬）を腹腔内に
投与後、４６〜４８時間後にさらに５ＩＵのヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ：帝国臓器製薬）を腹腔内投与
することにより過排卵を誘起した。同系の雄マウスと交
配後２．５日目に開腹し、子宮潅流により８細胞期の胚
を採取し、ＬＩＦを含まないＥＳ細胞用培地（ＥＳＭ：
２０％非働化ＦＢＳ（牛胎仔血清：Flow），０.１mＭ
ＮＥＡＡ，１.０mＭ ピルビン酸ナトリウム(Flow)，０.
１mＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ：シグマ
社），０.１mＭ ヌクレオシド（シグマ社）およびリコ
ンビナントマウスＬＩＦ（rmＬＩＦ）（１×１０3Ｕ/m
l：ＡＭＲＡＤ）を含むＤＭＥＭ（日水製薬））中でゼ
ラチン処理した２４穴リンブロカルチャープレートで一
晩培養した。胚盤胞まで卵割した胚をガラスキャピラリ
ーで吸引採取し、予め培地を通常用いる量の５倍量(５
×１０3Ｕ／ml)のＬＩＦを含むＥＳＭに置き換えた参考
例２記載のフィーダー細胞上に播種した。栄養外胚葉が
破れて内部細胞塊が大きく成長してきた時に、ガラスキ
ャピラリーで内部細胞塊を吸引採取し、０.０２５％ト
リプシン含有１mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)のマイクロド
ロップ内でシングルセルサスペンジョンとした後フィー
ダー細胞上に再び播種した。細胞塊の細胞数が１００個
程度まで増えた時点でＰＣＲ法を用いて、マウスのＹ染
色体上の性決定領域（sex-determining region of the
Y-chromosome：Sry）遺伝子を増幅し、これを検出する
ことにより雄の核型を持つ細胞を選別した。選別した細
胞を２〜３日毎にトリプシン−ＥＤＴＡ処理によりフィ
ーダー細胞上への播種を行い、順次培養スケールを大き
くして継代し、細胞数が約１０6個／mlまで増えた時点
で、Ｇ−バンディング法により染色体数をカウントし
て、雄型で染色体数４０（正常値）のものを選択し、細
胞の劣化を防ぐため１０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ（シ
グマ社）を含むＤＭＥＭを凍結用培地として早期に凍結
保存した。このようにしてＥＳ細胞株ＢＤＭ−３および
ＢＤＭ−５を取得した。
血清セロトロピン（ＰＭＳ：帝国臓器製薬）を腹腔内に
投与後、４６〜４８時間後にさらに５ＩＵのヒト絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧ：帝国臓器製薬）を腹腔内投与
することにより過排卵を誘起した。同系の雄マウスと交
配後２．５日目に開腹し、子宮潅流により８細胞期の胚
を採取し、ＬＩＦを含まないＥＳ細胞用培地（ＥＳＭ：
２０％非働化ＦＢＳ（牛胎仔血清：Flow），０.１mＭ
ＮＥＡＡ，１.０mＭ ピルビン酸ナトリウム(Flow)，０.
１mＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ：シグマ
社），０.１mＭ ヌクレオシド（シグマ社）およびリコ
ンビナントマウスＬＩＦ（rmＬＩＦ）（１×１０3Ｕ/m
l：ＡＭＲＡＤ）を含むＤＭＥＭ（日水製薬））中でゼ
ラチン処理した２４穴リンブロカルチャープレートで一
晩培養した。胚盤胞まで卵割した胚をガラスキャピラリ
ーで吸引採取し、予め培地を通常用いる量の５倍量(５
×１０3Ｕ／ml)のＬＩＦを含むＥＳＭに置き換えた参考
例２記載のフィーダー細胞上に播種した。栄養外胚葉が
破れて内部細胞塊が大きく成長してきた時に、ガラスキ
ャピラリーで内部細胞塊を吸引採取し、０.０２５％ト
リプシン含有１mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)のマイクロド
ロップ内でシングルセルサスペンジョンとした後フィー
ダー細胞上に再び播種した。細胞塊の細胞数が１００個
程度まで増えた時点でＰＣＲ法を用いて、マウスのＹ染
色体上の性決定領域（sex-determining region of the
Y-chromosome：Sry）遺伝子を増幅し、これを検出する
ことにより雄の核型を持つ細胞を選別した。選別した細
胞を２〜３日毎にトリプシン−ＥＤＴＡ処理によりフィ
ーダー細胞上への播種を行い、順次培養スケールを大き
くして継代し、細胞数が約１０6個／mlまで増えた時点
で、Ｇ−バンディング法により染色体数をカウントし
て、雄型で染色体数４０（正常値）のものを選択し、細
胞の劣化を防ぐため１０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ（シ
グマ社）を含むＤＭＥＭを凍結用培地として早期に凍結
保存した。このようにしてＥＳ細胞株ＢＤＭ−３および
ＢＤＭ−５を取得した。
【００２１】実施例２ ターゲティングベクターｐＮＴ
３ＬＮＴの構築 既報のヒトＮＴ−３ｃＤＮＡ〔フェブス レターズ（Ｆ
ＥＢＳ Letters）第２６６巻，１８７頁（１９９
０）〕をプローブとしてマウスゲノム遺伝子ライブラリ
ー（ＢＡＬＢ／ｃ）をスクリーニングした。スクリーニ
ングはプラークハイブリダイゼーション法にて行い、１
５ｋｂ ＳalＩ断片のマウスＮＴ−３ゲノム遺伝子を得
た。得られたマウスＮＴ−３ゲノム遺伝子のコード領域
中に１ケ所存在するＥcoＲＶ部位とその５.５ｋｂ上流
域のＥcoＲＶ部位までのＤＮＡ断片を単離し、これをプ
ラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社 ２７−４９
４５−０１）をＳmaＩで切断したものにＴ４リガーゼで
連結し、プラスミドｐＥＶlacＺを得た。尚、挿入断片
の方向は、ｐＥＶlacＺを制限酵素ＥcoＲＶで切断した
パターンで確認した。得られたプラスミドｐＥＶlacＺ
をＳalＩで切断した後、その９.５ｋｂ断片を単離し、
この断片をpBlnescript II ＳＫ＋（東洋紡，ＳＣ２１
２２０５）をＳalＩで断片したものに連結し、プラスミ
ドpＳＫlacＺを得た。プラスミドpＳＫlacＺをＮotＩと
ＳalＩで切断し、その９.５ｋｂ断片を単離し、ＮotＩ
−ＳalＩ ９.５ｋｂ断片（フラグメント１）を得た〔図
１〕。マウスＮＴ−３ゲノムＤＮＡのコード領域内に１
ケ所存在するＳmaＩ部位からクローン化されたマウスＮ
Ｔ−３ゲノムＤＮＡの３’側末端ＳalＩまでの３ｋｂＤ
ＮＡ断片を単離し、これをＳmaＩとＳalＩで処理したプ
ラスミドベクターｐＵＣ１８に連結し、プラスミドｐＵ
ＣＳＭＳを得た。このｐＵＣＳＭＳをＨindIIIとＰstＩ
で切断することによって得られる１.０ｋｂのＨindIII
−ＰstＩ断片を単離した。次にｐＵＣ１８のＳmaＩ部位
にＮotＩリンカーを挿入することにより制限酵素ＡvaＩ
で切断不可能にしたプラスミドｐＵＣ１８Ｓ-を作製
し、これをＨindIIIとＰstＩで処理し、先に切り出した
マウスＮＴ−３ゲノムＤＮＡのＨindIII−ＰstＩ１.０
ｋｂ断片を連結し、プラスミドｐＵＣＨＰを得た。ｐＵ
ＣＨＰをＡvaＩで切断した後、Ｔ４ポリメラーゼで制限
酵素切断箇所を平滑化し、これにネオマイシン耐性遺伝
子を含むプラスミドｐＫＪ２よりネオマイシン耐性遺伝
子発現ユニットを含むＸhoＩ−ＥcoＲＩ断片を単離し、
制限酵素切断末端をＴ４ポリメラーゼで平滑化したＤＮ
Ａ断片を連結し、プラスミドｐＨＰＮeoを作製した
（尚、ネオマイシン耐性遺伝子の方向は任意である）。
３ＬＮＴの構築 既報のヒトＮＴ−３ｃＤＮＡ〔フェブス レターズ（Ｆ
ＥＢＳ Letters）第２６６巻，１８７頁（１９９
０）〕をプローブとしてマウスゲノム遺伝子ライブラリ
ー（ＢＡＬＢ／ｃ）をスクリーニングした。スクリーニ
ングはプラークハイブリダイゼーション法にて行い、１
５ｋｂ ＳalＩ断片のマウスＮＴ−３ゲノム遺伝子を得
た。得られたマウスＮＴ−３ゲノム遺伝子のコード領域
中に１ケ所存在するＥcoＲＶ部位とその５.５ｋｂ上流
域のＥcoＲＶ部位までのＤＮＡ断片を単離し、これをプ
ラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社 ２７−４９
４５−０１）をＳmaＩで切断したものにＴ４リガーゼで
連結し、プラスミドｐＥＶlacＺを得た。尚、挿入断片
の方向は、ｐＥＶlacＺを制限酵素ＥcoＲＶで切断した
パターンで確認した。得られたプラスミドｐＥＶlacＺ
をＳalＩで切断した後、その９.５ｋｂ断片を単離し、
この断片をpBlnescript II ＳＫ＋（東洋紡，ＳＣ２１
２２０５）をＳalＩで断片したものに連結し、プラスミ
ドpＳＫlacＺを得た。プラスミドpＳＫlacＺをＮotＩと
ＳalＩで切断し、その９.５ｋｂ断片を単離し、ＮotＩ
−ＳalＩ ９.５ｋｂ断片（フラグメント１）を得た〔図
１〕。マウスＮＴ−３ゲノムＤＮＡのコード領域内に１
ケ所存在するＳmaＩ部位からクローン化されたマウスＮ
Ｔ−３ゲノムＤＮＡの３’側末端ＳalＩまでの３ｋｂＤ
ＮＡ断片を単離し、これをＳmaＩとＳalＩで処理したプ
ラスミドベクターｐＵＣ１８に連結し、プラスミドｐＵ
ＣＳＭＳを得た。このｐＵＣＳＭＳをＨindIIIとＰstＩ
で切断することによって得られる１.０ｋｂのＨindIII
−ＰstＩ断片を単離した。次にｐＵＣ１８のＳmaＩ部位
にＮotＩリンカーを挿入することにより制限酵素ＡvaＩ
で切断不可能にしたプラスミドｐＵＣ１８Ｓ-を作製
し、これをＨindIIIとＰstＩで処理し、先に切り出した
マウスＮＴ−３ゲノムＤＮＡのＨindIII−ＰstＩ１.０
ｋｂ断片を連結し、プラスミドｐＵＣＨＰを得た。ｐＵ
ＣＨＰをＡvaＩで切断した後、Ｔ４ポリメラーゼで制限
酵素切断箇所を平滑化し、これにネオマイシン耐性遺伝
子を含むプラスミドｐＫＪ２よりネオマイシン耐性遺伝
子発現ユニットを含むＸhoＩ−ＥcoＲＩ断片を単離し、
制限酵素切断末端をＴ４ポリメラーゼで平滑化したＤＮ
Ａ断片を連結し、プラスミドｐＨＰＮeoを作製した
（尚、ネオマイシン耐性遺伝子の方向は任意である）。
【００２２】ｐＨＰＮeoをＨindIIIとＳalＩで切断して
得られる２.７ｋｂＤＮＡ断片、単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ発現ユニットを含むプラスミドｐＭＣ
１ＴＫ polyＡをＸhoＩとＢamＨＩで切断して得られた
３.０ｋｂＤＮＡ断片およびpBlnescriptII ＳＫ＋Ｂam
ＨＩとＨindIIIで切断した断片を連結し、プラスミドｐ
ＨＰＮeoＴＫを得た。ｐＨＰＮeoＴＫをＸhoＩとＮotＩ
で切断して得られる５.５ｋｂのＸhoＩ−ＮotＩ断片を
単離した（フラグメント２)（〔図２〕及び〔図
３〕）。プラスミドベクターpＢＲ３２２を制限酵素Ｅc
oＲＶで切断し、ＮotＩリンカーをＴ４リガーゼで連結
し、ＮotＩ部位でＤＮＡ断片をクローン化することが可
能なプラスミドベクターpＢＲ３２２（ＮotＩ）を作製
した。このプラスミドベクターpＢＲ３２２（ＮotＩ）
をＮotＩで切断し、先に調製したフラグメント１及び２
を連結し、プラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを得た〔図４〕
（尚、プラスミドベクターとしてpBlnescript あるいは
ｐＵＣ系プラスミドベクターにＮotＩ部位を挿入したプ
ラスミドベクターを用いることも可能である）。
得られる２.７ｋｂＤＮＡ断片、単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ発現ユニットを含むプラスミドｐＭＣ
１ＴＫ polyＡをＸhoＩとＢamＨＩで切断して得られた
３.０ｋｂＤＮＡ断片およびpBlnescriptII ＳＫ＋Ｂam
ＨＩとＨindIIIで切断した断片を連結し、プラスミドｐ
ＨＰＮeoＴＫを得た。ｐＨＰＮeoＴＫをＸhoＩとＮotＩ
で切断して得られる５.５ｋｂのＸhoＩ−ＮotＩ断片を
単離した（フラグメント２)（〔図２〕及び〔図
３〕）。プラスミドベクターpＢＲ３２２を制限酵素Ｅc
oＲＶで切断し、ＮotＩリンカーをＴ４リガーゼで連結
し、ＮotＩ部位でＤＮＡ断片をクローン化することが可
能なプラスミドベクターpＢＲ３２２（ＮotＩ）を作製
した。このプラスミドベクターpＢＲ３２２（ＮotＩ）
をＮotＩで切断し、先に調製したフラグメント１及び２
を連結し、プラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを得た〔図４〕
（尚、プラスミドベクターとしてpBlnescript あるいは
ｐＵＣ系プラスミドベクターにＮotＩ部位を挿入したプ
ラスミドベクターを用いることも可能である）。
【００２３】実施例３ 遺伝子導入とＮＴ−３遺伝子欠
損ＥＳ細胞の選別 ほぼコンフルエントまで増殖した実施例１記載のＥＳ細
胞ＢＤＭ−３をトリプシン処理により解離し、ＥＳ細胞
用培地（ＥＳＭ：ＤＭＥＭ、２０％ 非働化ＦＢＳ、
０.１mＭ 非必須アミノ酸、１.０mＭ ピルビン酸ナト
リウム、０.１mＭ２−ＭＥ、０.１mＭ ヌクレオシド、
１×１０3Ｕ／ml rmＬＩＦ）を加えて反応を止め遠心
後、上清を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液（２１m
Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、１３７mＭ ＮaＣl、５mＭ
ＫＣl、０.７mＭ Ｎa2ＰＯ4、１ｇ／リットル グルコ
ース）で再懸濁し、ＥＳ細胞懸濁液を調製した。実施例
２で得られたプラスミドpＮＴ３ＬＮＴから制限酵素Ｎo
tＩで切り出したターゲティングベクターをフェノール
−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行って精製
後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液に溶かした。５×１０7
個になるよう調製したＥＳ細胞懸濁液（０.５ml）に終
濃度１０μｇ／mlのターゲティングベクターを加え(こ
こで、より効率的な遺伝子導入細胞取得のためには終濃
度１００μｇ／mlとなるように加える）、バイオラッド
（Ｂio−Ｒad ）社のジーンパルサーを用い、２５０Ｖ
９６０μＦでＥＳ細胞にベクターをエレクトロポレー
ションした。エレクトロポレーション後の細胞は１０cm
のペトリディッシュには３×１０6個ずつ播種し、播種
後４８時間はＥＳＭで培養し、その後培地にＧ４１８
（２００μｇ／ml：ＧＩＢＣＯ）と１−（２−デオキシ
−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−
ヨードウラシル（ＦＩＡＵ；０.２μＭ ネイチャー
第３４４巻、１７２頁（１９９０年）に準じて調製）を
加えてＮＴ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞の選択培養を開始し
た。２日ごとに培地を交換し９日から１１日目に増殖し
たコロニーを採取し、順次スケールアップして培養し
た。得られたＧ４１８耐性株のＮＴ−３遺伝子欠損の判
定は採取した各細胞の一部よりＤＮＡを抽出し、制限酵
素ＢglIIで消化した後、マウスゲノムＤＮＡより調製し
た１.０ｋｂのＥcoＲＶ−ＢglII〔図５〕断片をプロー
ブＡとして用いてサザンハイブリダイゼーション法によ
り行った。ＮＴ−３遺伝子のノックアウト細胞株では
４.０kbp及び７.５kbpの位置にバンドが検出できた〔図
６〕。これに対して対照である野生株（ＢＤＭ−３）で
は４kbpのバンドのみが検出できた。１.２×１０8個の
ＥＳ細胞にエレクトロポレーションしたところＧ４１８
耐性を示す株が５×１０4コロニー得られ、Ｇ４１８と
ＦＩＡＵ両方に耐性を示すものが９.４×１０3コロニー
得られた。ＦＩＡＵによるターゲットクローンの濃縮率
は５.３倍であった。これらのコロニーについてサザン
ハイブリダイゼーションによる解析を行った結果、２３
クローンに変異が導入されている事が確認できた。ＮＴ
−３ゲノムＤＮＡおよびプラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを用
いたターゲッティングコンストラクトを〔図５〕に示
す。得られたＮＴ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞ＮＢ４−７１
は、平成５年７月６日より財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ ５０４０４として、また通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
平成５年７月１４日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３
６２としてそれぞれ寄託されている。
損ＥＳ細胞の選別 ほぼコンフルエントまで増殖した実施例１記載のＥＳ細
胞ＢＤＭ−３をトリプシン処理により解離し、ＥＳ細胞
用培地（ＥＳＭ：ＤＭＥＭ、２０％ 非働化ＦＢＳ、
０.１mＭ 非必須アミノ酸、１.０mＭ ピルビン酸ナト
リウム、０.１mＭ２−ＭＥ、０.１mＭ ヌクレオシド、
１×１０3Ｕ／ml rmＬＩＦ）を加えて反応を止め遠心
後、上清を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液（２１m
Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、１３７mＭ ＮaＣl、５mＭ
ＫＣl、０.７mＭ Ｎa2ＰＯ4、１ｇ／リットル グルコ
ース）で再懸濁し、ＥＳ細胞懸濁液を調製した。実施例
２で得られたプラスミドpＮＴ３ＬＮＴから制限酵素Ｎo
tＩで切り出したターゲティングベクターをフェノール
−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行って精製
後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液に溶かした。５×１０7
個になるよう調製したＥＳ細胞懸濁液（０.５ml）に終
濃度１０μｇ／mlのターゲティングベクターを加え(こ
こで、より効率的な遺伝子導入細胞取得のためには終濃
度１００μｇ／mlとなるように加える）、バイオラッド
（Ｂio−Ｒad ）社のジーンパルサーを用い、２５０Ｖ
９６０μＦでＥＳ細胞にベクターをエレクトロポレー
ションした。エレクトロポレーション後の細胞は１０cm
のペトリディッシュには３×１０6個ずつ播種し、播種
後４８時間はＥＳＭで培養し、その後培地にＧ４１８
（２００μｇ／ml：ＧＩＢＣＯ）と１−（２−デオキシ
−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−
ヨードウラシル（ＦＩＡＵ；０.２μＭ ネイチャー
第３４４巻、１７２頁（１９９０年）に準じて調製）を
加えてＮＴ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞の選択培養を開始し
た。２日ごとに培地を交換し９日から１１日目に増殖し
たコロニーを採取し、順次スケールアップして培養し
た。得られたＧ４１８耐性株のＮＴ−３遺伝子欠損の判
定は採取した各細胞の一部よりＤＮＡを抽出し、制限酵
素ＢglIIで消化した後、マウスゲノムＤＮＡより調製し
た１.０ｋｂのＥcoＲＶ−ＢglII〔図５〕断片をプロー
ブＡとして用いてサザンハイブリダイゼーション法によ
り行った。ＮＴ−３遺伝子のノックアウト細胞株では
４.０kbp及び７.５kbpの位置にバンドが検出できた〔図
６〕。これに対して対照である野生株（ＢＤＭ−３）で
は４kbpのバンドのみが検出できた。１.２×１０8個の
ＥＳ細胞にエレクトロポレーションしたところＧ４１８
耐性を示す株が５×１０4コロニー得られ、Ｇ４１８と
ＦＩＡＵ両方に耐性を示すものが９.４×１０3コロニー
得られた。ＦＩＡＵによるターゲットクローンの濃縮率
は５.３倍であった。これらのコロニーについてサザン
ハイブリダイゼーションによる解析を行った結果、２３
クローンに変異が導入されている事が確認できた。ＮＴ
−３ゲノムＤＮＡおよびプラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを用
いたターゲッティングコンストラクトを〔図５〕に示
す。得られたＮＴ−３遺伝子欠損ＥＳ細胞ＮＢ４−７１
は、平成５年７月６日より財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ ５０４０４として、また通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
平成５年７月１４日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３
６２としてそれぞれ寄託されている。
【００２４】実施例４ ＮＴ−３欠損マウスの作出 実施例３で得られたＮＴ−３遺伝子がノックアウトされ
た２３クローンのＥＳ細胞株のうち６クローンについて
それぞれ徳永らの方法〔細胞工学 第１０巻，第４０３
頁（１９９１年）〕に準じてＩＣＲマウスの８細胞期胚
にインジェクションした。すなわち、実施例１記載の方
法でホルモン剤を投与して過排卵を誘起し、ＩＣＲ雄マ
ウスと交配後２.５日目に子宮潅流により採卵したＩＣ
Ｒマウス８細胞期胚を予め６cmペトリディッシュに作っ
た流動パラフィンでおおったＬＩＦを含まないＥＳＭ小
ドロップ中に細胞と共に入れた。マイクロインジェクシ
ョン法により、ホスト８細胞期胚にＥＳ細胞を１０〜１
５個注入し、精管結紮した雄との交配により作製した偽
妊娠２．５日目のＩＣＲマウスを仮親として左右の子宮
角へそれぞれ約１０個の胚を移植した。得られたキメラ
マウスはＩＣＲマウスにバッククロスし、その産仔のコ
ートカラーの判定によりＥＳ細胞の生殖系列への分化能
を調べた。雄２３匹、雌８匹のキメラマウスが得られ、
このうち２株のＥＳ細胞から得られた雄７匹のキメラマ
ウスはＥＳ細胞の形質を子孫に伝える生殖系列キメラマ
ウスであった。この７匹のキメラマウスより８１匹の子
マウスが得られ、そのうち５１匹を実施例３と同様のサ
ザンハイブリダイゼーション法にて解析した〔図７〕と
ころ、２匹がヘテロザイゴートマウスであることが確認
された。得られた生殖系列中ＢＤＭ−３細胞の寄与率が
ほぼ１００％のキメラマウス（黒、雄）と正常ＩＣＲマ
ウス（白、雌）とを交配した結果を〔図８〕に示す。
〔図８〕に示すとおり産仔は全てＥＳ細胞由来のものが
得られた。なお、白色の産仔（下段）は参照として示し
た正常ＩＣＲの産仔である。
た２３クローンのＥＳ細胞株のうち６クローンについて
それぞれ徳永らの方法〔細胞工学 第１０巻，第４０３
頁（１９９１年）〕に準じてＩＣＲマウスの８細胞期胚
にインジェクションした。すなわち、実施例１記載の方
法でホルモン剤を投与して過排卵を誘起し、ＩＣＲ雄マ
ウスと交配後２.５日目に子宮潅流により採卵したＩＣ
Ｒマウス８細胞期胚を予め６cmペトリディッシュに作っ
た流動パラフィンでおおったＬＩＦを含まないＥＳＭ小
ドロップ中に細胞と共に入れた。マイクロインジェクシ
ョン法により、ホスト８細胞期胚にＥＳ細胞を１０〜１
５個注入し、精管結紮した雄との交配により作製した偽
妊娠２．５日目のＩＣＲマウスを仮親として左右の子宮
角へそれぞれ約１０個の胚を移植した。得られたキメラ
マウスはＩＣＲマウスにバッククロスし、その産仔のコ
ートカラーの判定によりＥＳ細胞の生殖系列への分化能
を調べた。雄２３匹、雌８匹のキメラマウスが得られ、
このうち２株のＥＳ細胞から得られた雄７匹のキメラマ
ウスはＥＳ細胞の形質を子孫に伝える生殖系列キメラマ
ウスであった。この７匹のキメラマウスより８１匹の子
マウスが得られ、そのうち５１匹を実施例３と同様のサ
ザンハイブリダイゼーション法にて解析した〔図７〕と
ころ、２匹がヘテロザイゴートマウスであることが確認
された。得られた生殖系列中ＢＤＭ−３細胞の寄与率が
ほぼ１００％のキメラマウス（黒、雄）と正常ＩＣＲマ
ウス（白、雌）とを交配した結果を〔図８〕に示す。
〔図８〕に示すとおり産仔は全てＥＳ細胞由来のものが
得られた。なお、白色の産仔（下段）は参照として示し
た正常ＩＣＲの産仔である。
【００２５】実施例 ５． ＮＴ−３欠損マウスの性質 ＮＴ−３ヘテロ欠損マウスの雌雄を交配することによ
り、ほぼ１／４の確率でＮＴ−３ホモ欠損マウスが得ら
れた。ＮＴ−３ホモ欠損マウスは、出生時までほぼ正常
に発生するものの、出生後は哺乳不良の傾向が強くみら
れた。そこで、同腹の野生型マウスあるいはヘテロ欠損
マウスを母親に対し１匹となるように間引いて、複数の
ホモ欠損マウスに授乳させることにより、哺乳不良を呈
するＮＴ−３ホモ欠損マウスを１０−２０％の割合で生
存させることができた。本マウスは、生後一週間目頃か
ら歩行困難を呈した。病理検索の結果、ＮＴ−３ホモ欠
損マウスの三叉神経節は、正常マウスのそれと比較して
およそ１／３程度の体積に減少しており、著しい感覚神
経細胞の減少が認められた。この感覚神経障害が新生マ
ウスの哺乳不良の主たる原因であると考えられ、さらに
は、歩行障害の原因の一つと考えられる。マウス脳から
抽出したｍＲＮＡを用いて、生後一日齢のＮＴ−３欠損
マウスの脳におけるＮＴ−３の発現不全を常法に従いノ
ーザンブロットで解析した結果を図９に示す。図９に示
したようにＮＴ−３ホモ欠損マウス（レーン３）はＮＴ
−３の発現がまったく見られない。また、ＮＴ−３ヘテ
ロ欠損マウス（レーン２）は、野生型マウス（レーン
１）と比較してＮＴ−３の発現量が約半分に減少してい
た。
り、ほぼ１／４の確率でＮＴ−３ホモ欠損マウスが得ら
れた。ＮＴ−３ホモ欠損マウスは、出生時までほぼ正常
に発生するものの、出生後は哺乳不良の傾向が強くみら
れた。そこで、同腹の野生型マウスあるいはヘテロ欠損
マウスを母親に対し１匹となるように間引いて、複数の
ホモ欠損マウスに授乳させることにより、哺乳不良を呈
するＮＴ−３ホモ欠損マウスを１０−２０％の割合で生
存させることができた。本マウスは、生後一週間目頃か
ら歩行困難を呈した。病理検索の結果、ＮＴ−３ホモ欠
損マウスの三叉神経節は、正常マウスのそれと比較して
およそ１／３程度の体積に減少しており、著しい感覚神
経細胞の減少が認められた。この感覚神経障害が新生マ
ウスの哺乳不良の主たる原因であると考えられ、さらに
は、歩行障害の原因の一つと考えられる。マウス脳から
抽出したｍＲＮＡを用いて、生後一日齢のＮＴ−３欠損
マウスの脳におけるＮＴ−３の発現不全を常法に従いノ
ーザンブロットで解析した結果を図９に示す。図９に示
したようにＮＴ−３ホモ欠損マウス（レーン３）はＮＴ
−３の発現がまったく見られない。また、ＮＴ−３ヘテ
ロ欠損マウス（レーン２）は、野生型マウス（レーン
１）と比較してＮＴ−３の発現量が約半分に減少してい
た。
【００２６】実施例 ６． ＮＴ−３欠損マウスの利用 実施例４で作製されたＮＴ−３欠損マウスは、ＮＴ−３
タンパク質をコードする遺伝子領域の一部を大腸菌由来
のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(ｌａｃＺ)で置換してい
るので、本来ＮＴ−３の発現する組織でＮＴ−３の代わ
りにβ-ガラクトシダーゼが発現する。従って、β-ガラ
クトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することに
より、簡便にＮＴ−３のマウスにおける発現部位を観察
することが出来る。すなわち、ＮＴ−３欠損マウスある
いはその組織切片をグルタルアルデヒドで固定し、ダル
ベッコ燐酸緩衝液(ＰＢＳ)で洗浄後、５-ブロモ-４-ク
ロロ-３-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)
を含む染色液（1mＭ Ｘ-ｇａｌ, ３mＭ フェリシアン化
カリウム, ３mＭ フェロシアン化カリウム, １mＭ 塩化
マグネシウム, ０.１％ トリトン Ｘ-100, １xＰＢ
Ｓ）で、室温あるいは３７℃で、３０分から１時間反応
させる。 組織標本を１mＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳ溶液で洗浄
することによってβ-ガラクトシダーゼ反応を停止す
る。この方法でＮＴ−３欠損マウス胎児をwhole-mount
で染色したところ、１０日胚からＮＴ−３の発現が中
脳、下顎、体節で見られその後、発生が進むにつれてこ
れらの領域の発現が増大し、さらに目、手足、外性器、
髭の生える領域等の末梢組織にも強い発現が観察され
た。ＮＴ−３ヘテロ欠損マウスとＮＴ−３ホモ欠損マウ
スとの間でｌａｃＺの発現パターンに差は見られなかっ
た。１７日胚の組織標本を作製し染色したところ、髭の
毛穴の周辺、目の虹彩、骨格筋、外性器、胃壁、腸壁、
膀胱壁等の末梢神経の終末組織、三叉神経節、後根神経
節等の末梢神経節、小脳、中脳、脊髄前角運動ニューロ
ン等の中枢神経系に比較的強くＮＴ−３プロモーターの
活性が観察された。
タンパク質をコードする遺伝子領域の一部を大腸菌由来
のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(ｌａｃＺ)で置換してい
るので、本来ＮＴ−３の発現する組織でＮＴ−３の代わ
りにβ-ガラクトシダーゼが発現する。従って、β-ガラ
クトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することに
より、簡便にＮＴ−３のマウスにおける発現部位を観察
することが出来る。すなわち、ＮＴ−３欠損マウスある
いはその組織切片をグルタルアルデヒドで固定し、ダル
ベッコ燐酸緩衝液(ＰＢＳ)で洗浄後、５-ブロモ-４-ク
ロロ-３-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)
を含む染色液（1mＭ Ｘ-ｇａｌ, ３mＭ フェリシアン化
カリウム, ３mＭ フェロシアン化カリウム, １mＭ 塩化
マグネシウム, ０.１％ トリトン Ｘ-100, １xＰＢ
Ｓ）で、室温あるいは３７℃で、３０分から１時間反応
させる。 組織標本を１mＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳ溶液で洗浄
することによってβ-ガラクトシダーゼ反応を停止す
る。この方法でＮＴ−３欠損マウス胎児をwhole-mount
で染色したところ、１０日胚からＮＴ−３の発現が中
脳、下顎、体節で見られその後、発生が進むにつれてこ
れらの領域の発現が増大し、さらに目、手足、外性器、
髭の生える領域等の末梢組織にも強い発現が観察され
た。ＮＴ−３ヘテロ欠損マウスとＮＴ−３ホモ欠損マウ
スとの間でｌａｃＺの発現パターンに差は見られなかっ
た。１７日胚の組織標本を作製し染色したところ、髭の
毛穴の周辺、目の虹彩、骨格筋、外性器、胃壁、腸壁、
膀胱壁等の末梢神経の終末組織、三叉神経節、後根神経
節等の末梢神経節、小脳、中脳、脊髄前角運動ニューロ
ン等の中枢神経系に比較的強くＮＴ−３プロモーターの
活性が観察された。
【００２７】実施例 ７．ＮＴ-３欠損マウスにおける
ＮＴ-３受容体遺伝子発現への影響 ＮＴ−３ホモ欠損マウス胎児（１７日胚）の三叉神経
節、後根神経節の組織標本を作製し、NT-3特異的な受容
体遺伝子、trkCの発現をイン シトゥ ハイブリッド形成
（in situ hybridization）法で検討した。プローブは
公知の配列であるラットtrkCのｃＤＮＡ〔Merlio, J.
P. ら, ニューロサイエンス（Neuroscience), 第51巻 5
13-532頁 1992年〕配列に基づき、5'-AGCGTCTGGCTGGACT
ATGTGGGGCT-3'〔配列番号６〕をセンスプライマー、5'-
GGTGACTATCCAGTCCACATCA-3'〔配列番号７〕をアンチセ
ンスプライマーとして、マウス脳より抽出した鋳型ｍＲ
ＮＡを用いてＰＴ−ＰＣＲにより調製した３種の４５-m
erのオリゴヌクレオチド鎖の混合物を用いた。その結
果、ＮＴ−３ホモ欠損マウスでは野生型マウスと比較し
て、これらの組織でtrkCの発現が著しく低下していた。
trkC のイン シトウ ハイブリッド形成法に用いたプ
ローブの配列を以下に示す。 5'-GATCTCAGTCTTGCTGCAGACACAATTTGCAGGGCAAGCCAGCAC-3' 〔配列番号３〕 5'-TGTGGTGAGCCGGTTACTTGACAAGTTTATATAACGCAAGTGGGG-3' 〔配列番号４〕 5'-CAAAGGAGAGCCAGAGCCATTGCAAGTGATCACGGCATTGTCTCC-3' 〔配列番号５〕
ＮＴ-３受容体遺伝子発現への影響 ＮＴ−３ホモ欠損マウス胎児（１７日胚）の三叉神経
節、後根神経節の組織標本を作製し、NT-3特異的な受容
体遺伝子、trkCの発現をイン シトゥ ハイブリッド形成
（in situ hybridization）法で検討した。プローブは
公知の配列であるラットtrkCのｃＤＮＡ〔Merlio, J.
P. ら, ニューロサイエンス（Neuroscience), 第51巻 5
13-532頁 1992年〕配列に基づき、5'-AGCGTCTGGCTGGACT
ATGTGGGGCT-3'〔配列番号６〕をセンスプライマー、5'-
GGTGACTATCCAGTCCACATCA-3'〔配列番号７〕をアンチセ
ンスプライマーとして、マウス脳より抽出した鋳型ｍＲ
ＮＡを用いてＰＴ−ＰＣＲにより調製した３種の４５-m
erのオリゴヌクレオチド鎖の混合物を用いた。その結
果、ＮＴ−３ホモ欠損マウスでは野生型マウスと比較し
て、これらの組織でtrkCの発現が著しく低下していた。
trkC のイン シトウ ハイブリッド形成法に用いたプ
ローブの配列を以下に示す。 5'-GATCTCAGTCTTGCTGCAGACACAATTTGCAGGGCAAGCCAGCAC-3' 〔配列番号３〕 5'-TGTGGTGAGCCGGTTACTTGACAAGTTTATATAACGCAAGTGGGG-3' 〔配列番号４〕 5'-CAAAGGAGAGCCAGAGCCATTGCAAGTGATCACGGCATTGTCTCC-3' 〔配列番号５〕
【００２８】
配列番号（SEQ ID NO)：１ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：２５ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRANDEDNESS)：１本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLEＣＵLE TYPE)：他の核酸（other nucl
eic acid） アンチセンス：Ｎｏ 配列: CAGCCCTACA GCCACATGAT ATCTT 25
eic acid） アンチセンス：Ｎｏ 配列: CAGCCCTACA GCCACATGAT ATCTT 25
【００２９】配列番号（SEQ ID NO)：２ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：２５ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STRANDEDNESS)：１本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス：Ｙｅｓ 配列: ACTCCAGTCT TGCCTGTATG TGATG 25
c acid） アンチセンス：Ｙｅｓ 配列: ACTCCAGTCT TGCCTGTATG TGATG 25
【００３０】配列番号(SEQ ID NO)：３ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：４５ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 配列の特徴(FEATURE)： 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列： GATCTCAGTC TTGCTGCAGA CACAATTTGC AGGGCAAGCC AGCAC 45
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 配列の特徴(FEATURE)： 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列： GATCTCAGTC TTGCTGCAGA CACAATTTGC AGGGCAAGCC AGCAC 45
【００３１】配列番号（SEQ ID NO)：４ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：４５ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列: TGTGGTGAGC CGGTTACTTG ACAAGTTTAT ATAACGCAAG TGGGG 45
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列: TGTGGTGAGC CGGTTACTTG ACAAGTTTAT ATAACGCAAG TGGGG 45
【００３２】配列番号（SEQ ID NO)：５ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：４５ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列： CAAAGGAGAG CCAGAGCCAT TGCAAGTGAT CACGGCATTG TCTCC 45
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：マウス 他の特徴(OTHER INFORMATION)：マウスtrkCのcDNA 配列： CAAAGGAGAG CCAGAGCCAT TGCAAGTGAT CACGGCATTG TCTCC 45
【００３３】配列番号（SEQ ID NO)：６ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：２６ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ラット 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ラットtrkCのcDNA 配列: AGCGTCTGGC TGGACTATGT GGGGCT 26
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｎｏ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ラット 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ラットtrkCのcDNA 配列: AGCGTCTGGC TGGACTATGT GGGGCT 26
【００３４】配列番号（SEQ ID NO)：７ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：２２ 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ラット 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ラットtrkCのcDNA 配列: GGTGACTATC CAGTCCACAT CA 22
c acid） アンチセンス(ANTI-SENCE)：Ｙｅｓ フラグメント型(FRAGMENT TYPE)：中間部フラグメント
（internal fragment） 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ラット 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ラットtrkCのcDNA 配列: GGTGACTATC CAGTCCACAT CA 22
【図１】実施例２で得られたターゲティングベクターｐ
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
【図２】実施例２で得られたターゲティングベクターｐ
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
【図３】実施例２で得られたターゲティングベクターｐ
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
【図４】実施例２で得られたターゲティングベクターｐ
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
ＮＴ３ＬＮＴの構築図を示す。
【図５】マウスゲノムＤＮＡ及び実施例２で得られたプ
ラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを用いたターゲッティングコン
ストラクトを示す。図中、イントロン部分は細実線で、
エクソン部分は太実線で示した。
ラスミドｐＮＴ３ＬＮＴを用いたターゲッティングコン
ストラクトを示す。図中、イントロン部分は細実線で、
エクソン部分は太実線で示した。
【図６】実施例３で得られたＮＴ−３ノックアウトＥＳ
細胞株のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
細胞株のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図７】実施例４で作出したＮＴ−３遺伝子発現不全マ
ウスのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。図
中、レーンＴはＮＴ−３ノックアウト細胞株、レーンＷ
は正常（野生）ＩＣＲマウスのＤＮＡ、レーン３２−１
〜３６−２は作出したＮＴ−３遺伝子発現不全マウスの
子孫の各固体ナンバーを示している。
ウスのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。図
中、レーンＴはＮＴ−３ノックアウト細胞株、レーンＷ
は正常（野生）ＩＣＲマウスのＤＮＡ、レーン３２−１
〜３６−２は作出したＮＴ−３遺伝子発現不全マウスの
子孫の各固体ナンバーを示している。
【図８】実施例４で作出した生殖系列のＮＴ−３遺伝子
発現不全マウスを示す。
発現不全マウスを示す。
【図９】ＮＴ−３欠損マウスの脳におけるＮＴ−３の発
現をノーザンブロット解析した結果を示す。
現をノーザンブロット解析した結果を示す。
図中の符号は以下のとおりである。 Ｖ：ＥｃｏＲＶ Ｂｇ：ＢｇlII Ｐ：ＰｓｔＩ Ｎ：ＮｏｔＩ ＡＴＧ：転写開始コドン ｐＡ：polyA付加シグナル
Claims (11)
- 【請求項１】ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化
された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。 - 【請求項２】大腸菌由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を
有する細胞である請求項１記載の胚幹細胞。 - 【請求項３】ネオマイシン耐性である請求項１記載の胚
幹細胞。 - 【請求項４】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項
１記載の胚幹細胞。 - 【請求項５】ゲッ歯動物がマウスである請求項４記載の
胚幹細胞。 - 【請求項６】ニューロトロフィン−３遺伝子発現不全非
ヒト哺乳動物。 - 【請求項７】レポーター遺伝子がニューロトロフィン−
３プロモーターの制御下で発現しうる請求項６記載の動
物。 - 【請求項８】レポーター遺伝子が大腸菌由来βガラクト
シダーゼ遺伝子である請求項７記載の動物。 - 【請求項９】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項
６記載の動物。 - 【請求項１０】ゲッ歯動物がマウスである請求項９記載
の動物。 - 【請求項１１】請求項７記載の動物に、被検物質を投与
し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とす
るニューロトロフィン−３プロモーター活性促進物質の
スクリーニング方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6141858A JPH07246040A (ja) | 1993-07-06 | 1994-06-23 | ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物 |
| US08/268,020 US5625123A (en) | 1993-07-06 | 1994-06-29 | Neurotrophin-3-deficient embryonic stem cells and mice and their use |
| EP94110304A EP0633314A1 (en) | 1993-07-06 | 1994-07-02 | Neurotrophin-3-deficient embryonic stem cell and its use |
| CA002127412A CA2127412A1 (en) | 1993-07-06 | 1994-07-05 | Neurotrophin-3-deficient embryonic stem cell and its use |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16693693 | 1993-07-06 | ||
| JP382494 | 1994-01-19 | ||
| JP5-166936 | 1994-01-19 | ||
| JP6-3824 | 1994-01-19 | ||
| JP6141858A JPH07246040A (ja) | 1993-07-06 | 1994-06-23 | ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07246040A true JPH07246040A (ja) | 1995-09-26 |
Family
ID=27275980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6141858A Pending JPH07246040A (ja) | 1993-07-06 | 1994-06-23 | ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5625123A (ja) |
| EP (1) | EP0633314A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07246040A (ja) |
| CA (1) | CA2127412A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9703550D0 (en) * | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
| WO1998040468A1 (en) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Vanderbilt University | Methods of constructing a gene mutation library and compounds and compositions thereof |
| US7531715B1 (en) | 1999-01-13 | 2009-05-12 | Ppl Therapeutics (Scotland) | Double nuclear transfer method and results thereof |
| CN101851637B (zh) * | 2010-01-15 | 2011-12-14 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GR1000980B (el) * | 1989-08-30 | 1993-03-31 | Max Planck Gesellschaft | Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο. |
| IL101661A (en) * | 1991-04-23 | 1998-02-08 | Regeneron Pharma | Method for detecting, identifying or measuring agents having neurotrophin activity |
| EP0582796A1 (en) * | 1992-06-01 | 1994-02-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Promotor for expression and use thereof |
-
1994
- 1994-06-23 JP JP6141858A patent/JPH07246040A/ja active Pending
- 1994-06-29 US US08/268,020 patent/US5625123A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-02 EP EP94110304A patent/EP0633314A1/en not_active Withdrawn
- 1994-07-05 CA CA002127412A patent/CA2127412A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0633314A1 (en) | 1995-01-11 |
| US5625123A (en) | 1997-04-29 |
| CA2127412A1 (en) | 1995-01-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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