JPH07250680A - 突然変異の誘発方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安全性が高くかつ効率良く動植物細胞に突然
変異体を誘発する。 【構成】 一般式［Ｉ］で定義する複素環化合物を光照
射下に被験細胞に接触させる。 【化１】 （Ｘ，Ｙ，Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³は明細書の定義に同じ）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細菌、酵母、かび、藻
類、原生動物などの微生物や、動植物細胞などに突然変
異を誘発する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】微生物の有用性が明らかになるに従い、
微生物をより積極的に活用する目的でより有用な性質を
持った新しい菌株が育種されるようになった。その成果
は近年の発酵工業における、品質の向上、多様化、生産
性の向上、工程の簡素化などから明らかである。ここ
で、微生物の育種に欠かせない手段として、有用菌株の
突然変異処理が汎く用いられている。また応用面のみな
らず、あらゆる生物の遺伝学、あるいは分子遺伝学的な
基礎研究を進めていくうえでも、突然変異を人為的に誘
発し、突然変異株を分離することは、研究の出発点にな
る重要な項目となっている。

【０００３】このように、基礎、応用の両面にわたり重
要な技術である突然変異の誘発には、Ｘ線あるいは紫外
線を照射することによる物理的な手法、あるいは変異原
となる化学物質などを用いる手法がその生物種、用途な
どにより適宜利用されている。

【０００４】この物理的方法としてはＸ線、紫外線など
の使用があげられる。Ｘ線はポリヌクレオチド鎖を切断
したり、塩基や糖にいろいろな反応を引き起こすこと
で、効率良く突然変異体を取得することが可能である。
しかしながら、Ｘ線の利用には人体への危険性から、放
射性同位元素などの取り扱いに準じた登録や教育訓練が
必要であること、更に特別の設備が必要であると云う問
題、コスト、簡便さなどに難点が多い。

【０００５】なお、紫外線照射ではＤＮＡ分子中で隣接
するピリミジン塩基の間で２量体がつくられる、特にチ
ミン２量体が最も効率良く生成されるという特質を利用
して、突然変異体の取得に利用される。これは、先のＸ
線に比較すれば、線種が紫外線であるために、設備面、
簡便さ、危険性などの観点から突然変異を誘起する手段
としては優れている。しかしながら実際は、光回復現象
により、誘起されたＤＮＡ障害が白色光と細胞内酵素と
の協同作用で修復されてしまい、結果的に突然変異体の
取得効率ははなはだ低いものでしかないことが問題であ
る。この問題を避けるためには、実験操作をナトリウム
光源下で行うなどの配慮が必要となり、設備面、簡便さ
などの点での有効性は活かし難いといった不都合が生じ
る。

【０００６】さらに、紫外線の場合それがシャーレ、培
養液などで吸収されることが大きな課題である。特に哺
乳類培養細胞の培養液には通常フェノールレッドが着色
の目的で好んで使用されており、それは著しい紫外線の
吸収を起す。また血清を含んでいることでも吸収が生じ
てしまう。このために余計な洗いの操作を必要とするな
ど実験操作が煩雑になる。さらに、底面に生育する細胞
をシャーレを用いて照射する場合は、紫外線を透過する
材料で作ったシャーレを用いる必要があり、コストの点
からも不利になる。また、Ｘ線などの放射線よりは危険
性が少ないものの、やはり作業者にとって紫外線は危険
性があり、人体に体するその影響を最小限に押さえ、安
全性を確保するための装備を必要とするなどの不都合も
ある。

【０００７】化学物質を用いた突然変異体の取得には、
亜硝酸、ヒドロキシルアミン、硫酸ジメチル、エチルメ
タンスルホン酸、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、５−ブロ
モウラシル、エチジウムブロマイド、アクリジン色素、
などが利用されている。

【０００８】亜硝酸は塩基を脱アミノしてケト基に置き
換え、塩基転位を引き起こす。ヒドロキシルアミンは、
シトシンに特異的に働きＮ⁴−ヒドロキシシトシンを生
成する。これはアデニンと塩基対をつくるので塩基転位
が引き起こされることになる。

【０００９】また、アルキル化剤である硫酸ジメチル、
エチルメタンスルホン酸、ナイトロジェンマスタード、
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎニトロソグアニジンはグ
アニン、アデニンなどをアルキル化し、特に、前２者は
グアニンに特異的に働き、４級アンモニウム窒素を生成
し、デオキシリボシド結合を切断する。その結果４種の
塩基のどれかが挿入されたり、ＤＮＡが切れたりする。
５−ブロモウラシルの様な塩基類似体は、通常の塩基に
比べ互変位性を起こしやすく塩基転位型の突然変異を誘
発する。

【００１０】エチジウムブロマイド、アクリジン色素は
ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡ複製の際に塩基対
の１〜数個の挿入もしくは欠失を誘発してフレームシフ
ト型の突然変異を起こす。

【００１１】このように、化学物質はそれぞれにさまざ
まな作用機序を持つが、これらの中でもＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎニトロソグアニジンは、その強力な突
然変異誘起性、致死効果が小さくても多くの変異体が取
得できること、緩衝液の方が最小倍地に比べ高い生存率
で高率の変異体が得られること、などの理由によい幅広
く利用されている。

【００１２】

【発明が解決しようとしている課題】このように、放射
線、紫外線、ならびに化合物が突然変異誘発に用いられ
るがこれらは他方で強い発癌性を有することが知られて
いる。たとえば、汎用される突然変異誘発剤であるエチ
ルメタンスルホン酸、ナイトロジェンマスタード、Ｎ−
メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどに
はきわめて強い癌原性があることが明らかになってお
り、その処理操作はきわめて細心の注意を必要とする。
効率良く突然変異を誘発できる手段は、その反面一般的
により危険性が高くなることが知られており、突然変異
体の取得には安全性の確保がきわめて重要な課題であ
る。また逆に、弱い変異原性しか持たない化合物による
突然変異の誘発では、効率が良くない点が大きな課題と
なっている。

【００１３】このように、基礎、応用の両面において重
要な技術である突然変異の誘発には、効率の良い変異の
誘発と安全性の確保という互いに矛盾する課題があり、
効率の良い突然変異体の取得を可能としながらも、さら
に安全な、あるいはより危険性の少ない突然変異体の取
得を可能とする方法に対する要望が高まっている。

【００１４】本発明の目的は、突然変異体の取得を高い
効率を維持しながら、従来の方法に比べより安全性の高
い方法を提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の突然変異体の取
得方法は、処理対象に下記一般式［Ｉ］で表される化合
物を突然変異原として適用することと、その際に光を照
射することを特徴とする。

【００１６】

【化１０】 上記一般式［Ｉ］において、

【００１７】

【化１１】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
る。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウ
ム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げること
ができる。

【００１８】Ｒ¹及びＲ²は、それぞれ独立して水素原
子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
くは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルア
ルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を
示す。

【００１９】Ｒ³は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌ
は、−Ｌ¹−、−Ｌ²−Ｌ³−または−Ｌ ⁴−Ｌ⁵−Ｌ⁶−で
あり、Ｌ¹〜Ｌ⁶はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価
の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−Ｃ
Ｈ＝Ｒ⁴−（Ｒ⁴はオキソ基を有する環構造を示す）を表
わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２
価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることが
でき、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するも
のでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜
４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げること
ができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示され
る基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造と
しては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキ
ソ基を有するものを挙げることができる。

【００２０】−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、
［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わさ
れる基を好ましいものとして挙げることができる。

【００２１】

【化１２】 （上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もし
くは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２
である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換
基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙
げることができる。

【００２２】

【化１３】 （上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であ
り、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェ
ニレン基を表わす。）

【００２３】

【化１４】 （上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ
−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）

【００２４】

【化１５】

【００２５】

【化１６】 上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示
したものを挙げることができる。

【００２６】一般式［Ｉ］のＲ³におけるＡは、置換も
しくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ⁵（Ｒ⁵は、置換も
しくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアル
キル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わ
す。Ｒ⁵の複素環としては、

【００２７】

【化１７】 （Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子
または窒素原子を、Ｙ^-はアニオンを表わす）等から誘
導された基を挙げることができ、その置換基としては、
例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げるこ
とができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル
基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例え
ば

【００２８】

【化１８】 等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げる
ことができる。また、置換もしくは未置換芳香環として
はアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換
基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリー
ル基等を挙げることができる。

【００２９】Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環
のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³が結合していない炭素原子に結合して
いる水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボ
キシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル
基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは
未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。

【００３０】Ｙ^-はアニオンを示し、該アニオンとして
は、例えばＢＦ₄ ^-、過塩素酸イオン、ＨＯ₃ＳＣＨ₂ＣＯ
Ｏ^-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオ
ン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭
化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を
有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃ
ｏ、Ｐｄ、等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げること
ができる。

【００３１】以上挙げた各種の置換基に更に置換される
基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子として
は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低
級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、そ
の炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。アリー
ル基としては、例えば、フェニル基等を挙げることがで
きる。アリール基やフェニレン基の置換基としては、例
えば低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキ
ルアミノ基）等を挙げることができる。なお、この低級
アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチ
ルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。
低級アルアルキル基としては、上記の置換もしくは未置
換アリール基で置換された低級アルキル基を挙げること
ができる。

【００３２】一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む
複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置
換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員
環の場合のそのような化合物としては、（１）Ｘを含む
６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で
置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ³で置換
されているもの、（２）該６員環の３位と５位が置換も
しくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位
のいずれかがＲ³で置換されているもの、（３）該６員
環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換
され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ³で置換され
ているもの、などを挙げることができる。このような位
置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、
核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を
得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もし
くは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が
隣合わないように置換されたものがより好ましい。

【００３３】一般式［Ｉ］の化合物の具体例としては、
例えば後述の表１に示すものを挙げることができる。更
に、特に好ましい化合物としては、下記一般式［ＶＩ
Ｉ］

【００３４】

【化１９】 （上記一般式［ＶＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わし、
Ｙ⁻はアニオンを表わす）で表わされる化合物や、下記
一般式［ＶＩＩＩ］

【００３５】

【化２０】 （上記一般式［ＶＩＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わ
し、Ｙ^-はアニオンを表わす）で表わされる化合物を挙
げることができる。

【００３６】さらに、一般式［Ｉ］の化合物の水溶性を
高めるために、例えば、アミノ基、ジメチルアミノ基、
スルホネート基等の親水性基を適当な部分に導入しても
よい。

【００３７】一般式［Ｉ］で表わされる化合物はそのま
ま用いて、あるいは適当な溶媒や分散剤に溶解または分
散させることで、本発明に供する突然変異原として利用
することができる。この溶媒や分散剤としては、水、ア
セトニトリル、ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、
酢酸緩衝液等の各種緩衝液など特に水性媒体が好ましく
用いることができる。その際の一般式［Ｉ］で表わされ
る化合物の含有量はその生物種に応じて適宜選択すれば
よい。

【００３８】一般式［Ｉ］で表される化合物そのもの
は、エチルメタンスルホン酸、ナイトロジェンマスター
ド、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、エチジウムブロマイドなどと比較すると、きわめて
弱い変異原性しか持たない。

【００３９】ここで、一般式［Ｉ］で表される化合物は
それだけを生物種に応じて適宜、望ましい含有量に調製
した緩衝液、培地などを用いて適当な生物種を変異原処
理しても、対照区に比較して突然変異体の出現頻度の上
昇は観察されないか、観察されてもごくわずかなもので
ある。

【００４０】ここで、発明者らは、一般式［Ｉ］で表さ
れる化合物がインターカレーターとしての機能を有する
ことを明らかとした。すなわち、この化合物が二本鎖核
酸の二重らせんにインターカレートすると、その蛍光強
度が、遊離した状態に比べ大きくなることがわかってい
る。

【００４１】一般的に、インターカレーターとして機能
する化合物の多くは、変異原性を持つことが知られてお
り、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジなどは
実際に変異原として多用されている。エチジウムブロマ
イドは、突然変異体を取得するために同様に多用され
る、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、ナイトロジェンマスタード、エチルメタンスルホン
酸などのアルキル化剤に比較すれば弱い癌原性しか持た
ないものの、人体に対してやはり重大な危険性を持ち、
実験操作、処理液の廃棄、実験室の汚染などにきわめて
慎重な配慮が必要とされる。

【００４２】我々は、一般式［Ｉ］で表される化合物
が、それ自体はごく弱い変異原性しか持たない、あるい
は変異原性をまったく持たないものの適用の條件次第で
は、生物種に応じて望ましい含有量に調製した緩衝液、
培地などを用いて、望む生物種を該緩衝液、あるいは培
地に分散し、光を照射することにより、安全に効率良く
変異を誘発できることを見いだし、本発明に至った。

【００４３】すなわち、一般式［Ｉ］で表される化合物
が強力な変異原性を発揮するのは、強い光の照射下で一
定時間処理を行う、あるいは、低光量でより長時間の照
射を行うといった高い線量投与時のみであり、変異原処
理の前後の処理などの通常の実験操作を行う程度の光の
強さ、操作に要する時間においては注目する程の変異原
性を示すことはない。さらに、突然変異を誘発させる前
や後の処理においてサンプルの廻りをアルミホイルなど
でおおい遮光することで、実験の再現性、信頼性、さら
には安全性をより高めることも可能である。つまり、一
般式［Ｉ］の化合物の溶解、適当な濃度への希釈、調
製、生物種の懸濁などの操作においては、該化合物が変
異原であることを意識する必要はない。強力な光照射、
あるいは十分に長時間の光の照射時などの高い線量の投
与を伴ってのみ変異原性化合物として利用可能である。
さらに、実験終了後の廃液の処理、実験室の汚染などに
関しても、従来の変異原に比べて安全性は高いが、従来
の変異原化合物の場合と同様の慎重な操作、処理を行え
ば、さらに高い安全性を確保できる。さらに、処理光は
可視光で十分な効果が得られるので、わざわざ紫外線を
用いる必要がないために、培養液、あるいは細胞懸濁液
などの吸収、シャーレの透過性などの実験上の不都合
や、目や皮膚を紫外線から保護するための装備、さらに
は、処理液からのオゾンの発生などの不都合も併せて排
除できる。

【００４４】光照射による突然変異誘発は、一般式
［Ｉ］で表される化合物の濃度と、光源の強さ、照射時
間、つまり投与線量により制御可能である。安全性を重
視するならば、低濃度の該化合物存在下で、より強力、
あるいはより長時間の光の照射を選択すればよい。しか
しながら、一般式［Ｉ］で表わした化合物は従来公知の
他の変異原化合物において通常利用される程度の濃度で
あれば、なんら問題なく安全に実験操作が可能である。

【００４５】一般式［Ｉ］の化合物を用いる実際の突然
変異誘発の具体的な実験操作としては、適当な溶媒、緩
衝液に溶解した一般式［Ｉ］で表される化合物を、突然
変異を誘発したい細菌、酵母、糸状菌、動植物細胞など
の分散、懸濁液に適当量加え、十分混合の後、可視光を
照射することで行なう。その後、細胞から一般式［Ｉ］
で表される化合物を洗い去り、従来の突然変異誘発方法
における処理と同様に突然変異株の濃縮、分離などの操
作を行い、所望の突然変異体を取得することができる。

【００４６】ここで、一般式［Ｉ］で表される化合物の
処理液における濃度、光源の種類、強さ、照射時間など
はその生物種に応じて適宜選択すればよいが、一般的に
は実際の処理液の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの
間で最良の結果が得られる。光源としてはタングステン
ランプ、キセノンランプなどの汎用されている光源が利
用可能であり、また、これらの光源に限定されることな
く、可視領域に波長域を持つような光源ならば連続光、
単色光の区別によって使用が制限されることはない。つ
まり光源の性質に基くその光の性質により本発明の効果
は影響されないから、光源のこの性質についてはそのど
ちらについても好ましく本発明に用いることができる。
しかしここで、連続光が紫外領域あるいは、赤外領域に
そのスペクトルを持つならば、望む波長のみを透過させ
るようなバンドパスフィルターなどを適宜利用すること
は好ましいことである。何故なら紫外線はそれ自体で突
然変異を誘発する作用があり、赤外線は温度を上昇させ
る作用があるので、どちらも意図せざる効果をもたらし
かねないからである。また紫外線は人体に有害であるか
ら取扱いが厄介である。光の照射時間はタングステンラ
ンプ、キセノンランプなど輝度の高い光源を１０ｃｍ内
外の距離より用いた場合で、数十秒から数分程度の照射
で最良の結果が得られる場合が多い。しかしながら、突
然変異の誘発は生物種、生育フェイズ、処理条件（処理
剤濃度、処理時間など）に大きく左右されるものであ
り、通常の突然変異誘発方法と同様、生存率、突然変異
率などを事前に予備検討し、あらかじめ最も効果的な実
験条件を決めておくことは極めて好ましい。

【００４７】なお、本発明の方法が適用されて有効に突
然変異が誘起される動植物細胞の範囲は、格別後記の実
施例に示される種類のものに限られるものでなく、実施
例に示したものは単に例示したものであり世上入手しう
るいずれの種類にも本発明は適用しうるものである。ま
た後記の各種の実験に用いた菌株や動物細胞もいずれも
世上容易に入手しうる有名なものばかりである。

【００４８】

【実施例】以下合成例、予備テスト、実施例、比較例に
より本発明をさらに詳しく説明する。

【００４９】

【合成例１】無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを
冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバス
で８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸
２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌ
を室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４
時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノール
を加え、冷却し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると
粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エ
タノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）で再結
晶させて一般式［Ｉ］の化合物である、２−メチル−
４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニ
ル）ピリリウム アイオダイド（表１の化合物１（ただ
しＹはＩである））の緑色の結晶を得た。 得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２５４〜２５７℃ ＵＶ／可視（ＣＨ₃ＣＮ ε×１０^-4）λｍａｘ：４４
４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４） ＮＭＲ（¹Ｈ、ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：８．３７３７（１
Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈ
ｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、
Ｊ_AB＝Ｊ_BC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、
３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ^-1：１６４５、１６１０（ｓ
ｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１
２００、１１６０ 更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液
を用いる以外は上記と同様にして同じく一般式［Ｉ］の
化合物である２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムの過塩素酸塩
（化合物１（Ｙ：ＣｌＯ₄））を得た。

【００５０】

【合成例２】硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交
換水に溶解させ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸
水素ナトリウム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０
ｍｌのエタノールを更に加えてから、室温で３０分間攪
拌した。析出した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌの
エタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍ
ｌの水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液を得た。

【００５１】次に、合成例１で得た２−メチル−４，６
−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリ
リウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳ
Ｏに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナト
リウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で
５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを
加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジク
ロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エ
タノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶
させて同じく一般式［Ｉ］の化合物である０．７ｇの２
−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノフェニル）チオピリリウム アイオダイドの結晶（表
１の化合物２（ただし、ＹはＩである））を得た。 得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２４６〜２４８℃ ＵＶ／可視（ＣＨ₃ＣＮ ε×１０^-4）λｍａｘ：４９
５ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５） ＮＭＲ（¹Ｈ、ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：８．５６７９（１
Ｈ、ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６
（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、Ｊ
_AB＝Ｊ_BC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、
３．１１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ^-１：１６００（ｓ）、１５６０
（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０
（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ） 更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる
以外は上記と同様にして同じく一般式［Ｉ］の化合物で
ある２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノフェニル）チオピリリウムの過塩素酸塩（化合
物２（Ｙ：ＣｌＯ₄））を得た。

【００５２】

【合成例３〜５５】表１に示す化合物３〜５５をそれぞ
れ用意した。表１においては上記化合物１と２もまとめ
て記し、Φはｐ−フェニレン基：

【００５３】

【化２１】 またはフェニル基を表わす。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】

【表３】

【００５７】

【表４】

【００５８】

【表５】

【００５９】

【表６】

【００６０】

【表７】

【００６１】

【表８】

【００６２】

【表９】

【００６３】

【表１０】

【００６４】

【表１１】

【００６５】

【表１２】

【００６６】

【表１３】

【００６７】

【表１４】

【００６８】

【表１５】

【００６９】

【表１６】

【００７０】

【表１７】

【００７１】

【表１８】

【００７２】

【表１９】 なお、これらの化合物は以下の方法により合成した。な
お、具体的な反応操作は常法に従った。

【００７３】化合物７は、Ｗ．Ｆｏｅｒｓｔらの「Ｎｅ
ｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 」、Ａｃａｄ．
Ｐｒｅｓｓ（１９６４）に記載の方法に従って、化合
物［ｉ］

【００７４】

【化２２】 を合成した後、これと

【００７５】

【化２３】 （ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。化合物１７は、化合物［ｉ］と

【００７６】

【化２４】 （ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。また、化合物［ｉ］を水硫化ナトリウムと
反応させることにより化合物［ｉｉ］

【００７７】

【化２５】 を得た後、この化合物［ｉｉ］を化合物７、１７と同様
にして化合物８、１８を合成した。

【００７８】Ｒ． ＷｉｚｉｎｇｅｒらのＨｅｌｖ．
ｃｈｉｎ． Ａｃｔａ、３９、２１７（１９５６）に記
載の方法に従い、アセトフェノンとアセトアルデヒドか
ら以下に示すルート

【００７９】

【化２６】 を経て、化合物［ｉｉｉ］

【００８０】

【化２７】 を合成した。この化合物［ｉｉｉ］を原料として、ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応から得られた
化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物５を、
ｐ−ジエチルアミノスチリルべンズアルデヒドとの反応
から同様にして化合物１５を、ｐ−ジメチルアミノ桂皮
アルデヒドとの反応から同様にして化合物９を、

【００８１】

【化２８】 との反応から同様にして化合物１１をそれぞれ得た。ま
た、化合物［ｉｉｉ］を水硫化ナトリウムと反応させる
ことにより化合物［ｉｖ］

【００８２】

【化２９】 を得た後、化合物［ｉｉｉ］に代えて化合物［ｉｖ］を
用いる以外は、化合物５、１５、９及び１１の合成の場
合と同様の方法で、化合物６、１６、１０及び１２をそ
れぞれ得た。

【００８３】更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物
［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチ
オン部分を得た後、これに硫化ナトリウムを反応させて
得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合
物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデ
ヒドとアセトフェノンから化合物［ｖ］

【００８４】

【化３０】 を得た後、それを水硫化ナトリウムと反応させて化合物
［ｖｉ］

【００８５】

【化３１】 を得た。更に、化合物［ｖ］及び［ｖｉ］をそれぞれｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応させ、得られ
た化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物１３
及び１４を得た。

【００８６】化合物１９、２０及び２１は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン
部分とを

【００８７】

【化３２】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２２、２３及び２４は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、

【００８８】

【化３３】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２５及び２６は、化合物［ｉ］ま
たは［ｉｉ］を

【００８９】

【化３４】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２７、２８及び２９は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、トリエトキシメタン［ＨＣ（ＯＣ₂Ｈ₅）₃］と
反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させることにより合成した。化合物３０、３１及び３２
は化合物［ｉｉｉ］または［ｉｖ］と、［ｉｉｉ］と
［ｉｖ］と同様の方法によりｐ−ジメチルアミノアセト
フェノンから合成した化合物［ｉｉｉ］と［ｉｖ］のジ
メチルアミノ誘導体と、トリエトキシメタンとを反応さ
せ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させる
ことにより合成した。

【００９０】化合物３３〜５５は以下の各反応によりそ
れぞれ合成した。 化合物３３の合成

【００９１】

【化３５】 化合物３４の合成

【００９２】

【化３６】 化合物３５の合成

【００９３】

【化３７】 化合物３６の合成

【００９４】

【化３８】 化合物３７の合成

【００９５】

【化３９】 化合物３８の合成

【００９６】

【化４０】 化合物３９の合成

【００９７】

【化４１】 化合物４０は、化合物３６の合成で原料を

【００９８】

【化４２】 から

【００９９】

【化４３】 に変更して合成した。

【０１００】化合物４１は、化合物３７の合成で原料を

【０１０１】

【化４４】 から

【０１０２】

【化４５】 に変更して合成した。

【０１０３】化合物４２は、化合物３８の合成で原料を

【０１０４】

【化４６】 から

【０１０５】

【化４７】 に変更して合成した。

【０１０６】化合物４３は、化合物３９の合成で原料を

【０１０７】

【化４８】 から

【０１０８】

【化４９】 に変更して合成した。 化合物４４の合成

【０１０９】

【化５０】 化合物４５の合成

【０１１０】

【化５１】 化合物４６の合成

【０１１１】

【化５２】 化合物４７の合成

【０１１２】

【化５３】 化合物４８は、化合物４４の合成で原料を

【０１１３】

【化５４】 から

【０１１４】

【化５５】 に変更して合成した。

【０１１５】化合物４９は、化合物４５の合成で原料を

【０１１６】

【化５６】 から

【０１１７】

【化５７】 に変更して合成した。

【０１１８】化合物５０は、化合物４６の合成で原料を

【０１１９】

【化５８】 から

【０１２０】

【化５９】 に変更して合成した。

【０１２１】化合物５１は、化合物４７の合成で原料を

【０１２２】

【化６０】 から

【０１２３】

【化６１】 に変更して合成した。 化合物５２の合成

【０１２４】

【化６２】 化合物５３の合成

【０１２５】

【化６３】 化合物５４の合成

【０１２６】

【化６４】 化合物５５の合成

【０１２７】

【化６５】

【０１２８】

【予備テスト】合成例で用意した化合物１、３、４と、
陽性対照としてのエチジウムブロマイド（ＥＢ）、２−
（２−ｆｕｒｙｌ）−３−（５−ｎｉｔｒｏ−２−ｆｕ
ｒｙｌ）−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＡＦ−２）、ｂｅｎ
ｚｏ（α）ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ）について、Ａｍｅｓ法
による突然変異の予備テストを行った。用いた菌株はＴ
Ａ１００、ＴＡ９８の２菌株で、それぞれ、塩基対置換
型の突然変異原物質の検出、フレームシフト型の突然変
異原物質の検出に利用されている有名な微生物であり市
場で容易に入手することができる。

【０１２９】寒天平板培地、Ｓ−９Ｍｉｘ培地などは常
法により調製した。エチジウムブロマイドは水に、化合
物Ｎｏ．１、３、４、ＡＦ２、ＢＰはＤＭＳＯにそれぞ
れ適当な濃度になるように溶解し試験に用いた。

【０１３０】結果を表２に示す。

【０１３１】この結果ＥＢ、ＮＴＧなどの化合物に比べ
化合物１、３、４それ自体はごく弱い変異原性しか持た
ないことがわかった。

【０１３２】

【表２０】表２ Ａｍｅｓ法による突然変異テスト 枠内の数字は比活性を陽性の強さで示し単位は（Ｒｅｖ
ｅｒｔａｎｔｓ／μｇ）である。−：活性なしＮ．Ｄ未
試験

【０１３３】

【実施例１】合成例１で用意した化合物１を１０％アセ
トニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、その濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにして
化合物１溶液を調製した。

【０１３４】細胞懸濁液の調製には、３７℃であらかじ
め１夜培養したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の培養液２５
ｍｌを遠沈集菌し、全体を２００ｍｌの１０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し５００ｍｌの三角フラス
コに集めた。ここで菌濃度は１．５ｘ１０⁸ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ程度であった。なおこの菌はタカラ酒造（株）か
ら入手可能である。

【０１３５】この細胞懸濁液を９９ｍｌ分取し、上のよ
うにして調製した化合物１溶液を１ｍｌ加えたから化合
物１の終濃度は０．５μｇ／ｍｌとなった。対照とし
て、化合物１を含まない１０％アセトニトリルを含む１
０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた細胞懸濁液
もあわせて調製した。

【０１３６】これらの細胞懸濁液をシャーレ（１０ｃｍ
径）に１０ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置き、タングス
テンランプ（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上の波長をカッ
トオフするフィルターを取付け、５ｃｍの距離で予め計
画した時間照射した。なお、この間細胞懸濁液はマグネ
チックスターラーでかくはんを続けた。このように照射
処理した細胞懸濁液は、その０．１ｍｌずつを９．９ｍ
ｌの１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、よく
懸濁し、さらに必要に応じて同様の希釈を行った。

【０１３７】希釈した細胞懸濁液の０．１ｍｌを２×Ｙ
Ｔ固形平板培地に加え、コンラージ棒で寒天面上に均一
に塗布し、３７℃で１夜培養した。コロニー同志が重な
り合わない程度に密に生育したプレートを用いて、レプ
リカ法により２×ＹＴ固形平板培地と最少培地への植え
継ぎを行い、栄養要求性の突然変異体の出現頻度の評価
を行った。

【０１３８】結果は表３に示したとうりの変異体の生存
が照射時間２４０秒までの間で認められた。なお化合物
１を用いなかった対照の細胞懸濁液では生存率の低下さ
らには突然変異体の出現は観察できなかった。

【０１３９】

【表２１】表３ 突然変異体の出現頻度（実施例１）

【０１４０】

【比較例１】突然変異原として公知の化合物を用いた例
を示す。

【０１４１】使用した細胞懸濁液は実施例１で用いたも
のと同じである。

【０１４２】この細胞懸濁液の９９ｍｌにＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）濃度
２０ｍｇ／ｍｌに調製した１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を１ｍｌ加え、ＮＴＧ終濃度を２００μｇ／ｍ
ｌとし、３７℃で３０分間保持した。対照として、ＮＴ
Ｇが入っていない１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を加えたサンプルもあわせて調製し、同様の條件で保持
した。

【０１４３】このようにして処理した細胞懸濁液は、実
施例１と同様に１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
希釈を行なった。

【０１４４】希釈した細胞懸濁液はその０．１ｍｌを用
いて実施例１と全く同様に処理を行なって栄養要求性の
突然変異体の出現頻度の評価を行った。

【０１４５】結果は表４に示すとうり実施例１とほぼ同
じか若干低い突然変異体出現率であり、また対照の細胞
懸濁液では、生存率の低下、さらには突然変異体の出現
は観察できなかった。

【０１４６】

【表２２】表４ 突然変異体の出現頻度（比較例１）

【０１４７】

【実施例２】マウスＦＭ３Ａ細胞を用いて、高濃度ｍｙ
ｏ−イノシトール要求性変異株の取得をおこなった。

【０１４８】供試細胞の調製については、その継代培養
は組織培養用プラスチックシャーレ（６０ｍｍ）を利用
し、５％ＣＯ₂、９５％湿度のインキュベーター、許容
温度（３３．５℃）の條件で行った。増殖培地には、Ｅ
Ｓ培地（日水製薬）に、非働化したウシ胎児血清を２％
加えた。コロニー形成とレプリカに用いた寒天培地は、
ＥＳ培地に血清５％と寒天（ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｇａ
ｒ、Ｄｉｆｃｏ）を０．５％、またはアガロース（電気
泳動用）を０．３５％加えた培地を１０ｍｌずつ細菌用
プラスチックシャーレ（１００ｍｍ）にて固化して用い
た。

【０１４９】細胞の突然変異処理には、対数増殖期（５
×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌに希釈し、これに合成例１で用意した化合物１
を１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に０．５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した
ものを加えて、細胞懸濁液における終濃度を０．５μｇ
／ｍｌとした。次に、これらの細胞懸濁液をシャーレ
（１０ｃｍ径）に１０ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置
き、タングステンランプ（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上
の波長をカットオフするフィルターを取付け、５ｃｍの
距離より所定時間照射した。なお、この間細胞懸濁液は
マグネチックスターラーでかくはんを続けた。照射処理
後、細胞懸濁液は、遠心と洗滌によって化合物１から分
離し１ｍＭのｍｙｏ−イノシトールを加えた培養液中で
変異の発現のために４日間、３７℃で培養した。さら
に、濃縮処理のために、ＰＢＳで２回、血清のみを含む
培地で１回洗浄した。２４時間培養の後、培養液の細胞
濃度を２×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈し５０μＭの
５−ブロモデオキシウリジンを加え２５時間暗所で培養
し、次に、無血清培地に交換、細胞をシャーレに接着の
後、下方５ｃｍより６０Ｗの白色蛍光灯を１．５時間照
射した。照射後、１ｍＭのｍｙｏ−イノシトールを加え
た培養液と交換し、３日間培養した。

【０１５０】これを、Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉらの方法
（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃ．，１１，７５
（１９８６））を用いてレプリカ操作ならびに変異株の
分離に供した。結果は表５に示したとうりの突然変異体
の出現頻度であった。

【０１５１】

【表２３】表５ 突然変異体の出現頻度（実施例２）

【０１５２】

【比較例２】実施例２で用いた化合物１を公知の突然変
異原に代えた例である。

【０１５３】供試細胞は実施例２に同じである。

【０１５４】細胞の突然変異処理には対数増殖期（５×
１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ
／ｍｌに希釈し、これにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンを終濃度を０．５μｇ／ｍｌとな
るように加え４時間放置した。この後、格別の光照射は
行なわなかった。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンを実施例２の手法と同じ方法で除き、こ
の後は変異の発現のための培養以降Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａ
ｋｉらの方法の適用まで実施例２と全く同様に処理し
た。結果を表６に示すが、実施例２での最適値に比べ若
干低めの突然変異体出現頻度であった。

【０１５５】

【表２４】表６ 突然変異体の出現頻度（比較例２）

【０１５６】

【実施例３】参考例１で用意した化合物Ｎｏ．１を１０
％アセトニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、その濃度が５０μｇ／ｍｌになるよ
うに調製した。

【０１５７】ＹＰＤ培地（酵母エキス２０ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ、グルコース２０ｇ／ｌ）を用いて３０℃で
あらかじめ１夜培養したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＩＦＯ ０２２４株の培養液２５
ｍｌを遠沈集菌し、全体を２００ｍｌの１０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し５００ｍｌの三角フラス
コに集めた。ここで菌濃度は３．０×１０⁷ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ程度であった。

【０１５８】この細胞懸濁液を９９ｍｌ分取し、上のよ
うにして調製した化合物Ｎｏ．１溶液を１ｍｌ加え、終
濃度を０．５μｇ／ｍｌとした。対照として、化合物Ｎ
ｏ．１が入っていない１０％アセトニトリルを含む１０
ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたサンプルもあ
わせて調製した。

【０１５９】これらのサンプルをシャーレ（１０ｃｍ
径）に１０ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置き、タングス
テンランプ（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上の波長をカッ
トオフするフィルターを取付け、５ｃｍの距離より所定
時間照射した。なお、この間マグネチックスターラーで
かくはんを続けた。このようにして処理したサンプル
は、０．１ｍｌずつを９．９ｍｌの１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に加え、よく懸濁し、さらに必要に応
じて同様の希釈を行った。

【０１６０】希釈したサンプル０．１ｍｌをＹＰＤ固形
平板培地に加え、コンラージ棒で寒天面上に均一に塗布
し、３０℃で１夜培養した。各コロニーが重なり合わな
い程度に密に生育したプレートを用いて、レプリカ法に
よりＹＰＤ固形平板培地と最少培地への植え継ぎを行
い、栄養要求性の突然変異体の出現頻度の評価を行っ
た。

【０１６１】結果を表７に示す。

【０１６２】

【表２５】

【０１６３】

【比較例３】ＹＰＤ培地を用いて、３０℃であらかじめ
１夜培養したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅＩＦＯ ０２２４株の培養液２５ｍｌを遠沈
集菌し、全体を２００ｍｌの１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に懸濁し５００ｍｌの三角フラスコに集め
る。

【０１６４】ここで菌濃度は３．０×１０⁷ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ程度であった。

【０１６５】この細胞懸濁液を９９ｍｌ分取し、Ｎ−メ
チル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴ
Ｇ）濃度２０ｍｇ／ｍｌに調製した１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を１ｍｌ加え、終濃度を２００μｇ／
ｍｌとし、３０℃で３０分間保持した。対照として、Ｎ
ＴＧが入っていない１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を加えたサンプルもあわせて調製し、同様に処理し
た。

【０１６６】このようにして処理したサンプルは、０．
１ｍｌずつを９．９ｍｌの１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に加え、よく懸濁し、さらに必要に応じて同様
の希釈を行った。

【０１６７】希釈したサンプル０．１ｍｌをＹＰＤ固形
平板培地に加え、コンラージ棒で寒天面上に均一に塗布
し、３０℃で１夜培養した。各コロニーが重なり合わな
い程度に密に生育したプレートを用いて、レプリカ法に
よりＹＰＤ固形平板培地と最少培地への植え継ぎを行
い、栄養要求性の突然変異体の出現頻度の評価を行っ
た。

【０１６８】結果を表８に示す。

【０１６９】

【表２６】

【０１７０】

【実施例４】参考例１で用意した化合物Ｎｏ．４を１０
％アセトニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、その濃度が５０μｇ／ｍｌになるよ
うに調製した。

【０１７１】２ｘＹＴ培地（酵母エキス１６ｇ、ポリペ
プトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ）を用いて３７
℃であらかじめ１夜培養したＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株の
培養液２５ｍｌを遠沈集菌し、全体を２００ｍｌの１０
ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し５００ｍｌの
三角フラスコに集めた。ここで菌濃度は１．５×１０ ⁸
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であった。

【０１７２】この細胞懸濁液を９９ｍｌ分取し、上のよ
うにして調製した化合物Ｎｏ．４溶液を１ｍｌ加え、終
濃度を０．５μｇ／ｍｌとした。対照として、化合物Ｎ
ｏ．４が入っていない１０％アセトニトリルを含む１０
ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたサンプルもあ
わせて調製した。

【０１７３】これらのサンプルをシャーレ（１０ｃｍ
径）に１０ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置き、タングス
テンランプ（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上の波長をカッ
トオフするフィルターを取付け、５ｃｍの距離より所定
時間照射した。なお、この間マグネチックスターラーで
かくはんを続けた。このようにして処理したサンプル
は、０．１ｍｌずつを９．９ｍｌの１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に加え、よく懸濁し、さらに必要に応
じて同様の希釈を行った。

【０１７４】希釈したサンプル０．１ｍｌを２ｘＹＴ固
形平板培地に加え、コンラージ棒で寒天面上に均一に塗
布し、３７℃で１夜培養した。各コロニーが重なり合わ
ない程度に密に生育したプレートを用いて、レプリカ法
により２ｘＹＴ固形平板培地と最少培地への植え継ぎを
行い、栄養要求性の突然変異体の出現頻度の評価を行っ
た。

【０１７５】結果を表９に示す。

【０１７６】

【表２７】

【０１７７】

【実施例５】マウスＦＭ３Ａ細胞を用いて、高濃度ｍｙ
ｏ−イノシト−ル要求性変異株の取得をおこなった。

【０１７８】継代は組織培養用プラスチックシャーレ
（６０ｍｍ）を利用し、５％ＣＯ２、９５％湿度のイン
キュベーター、許容温度（３３．５℃）で行った。増殖
培地は、ＥＳ培地（日水製薬）に、非働化したウシ胎仔
血清を２％加えた。コロニー形成とレプリカに用いた寒
天培地は、ＥＳ培地に血清５％と寒天（ｐｕｒｉｆｉｅ
ｄ ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ）を０．５％、またはアガロ
ース（電気泳動用）を０．３５％加えた培地を１０ｍｌ
ずつ細菌用プラスチックシャーレ（１００ｍｍ）にて固
化して用いた。

【０１７９】対数増殖期（５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ）の細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈し、こ
れに参考例１で用意した化合物Ｎｏ．４を１０％アセト
ニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
０．５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解したものを加えて、細
胞懸濁液における終濃度を０．５μｇ／ｍｌとした。次
に、これらのサンプルをシャーレ（１０ｃｍ径）に１０
ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置き、タングステンランプ
（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上の波長をカットオフする
フィルターを取付け、５ｃｍの距離より所定時間照射し
た。なお、この間マグネチックスターラーでかくはんを
続けた。処理後、化合物Ｎｏ．４を除き、１ｍＭのｍｙ
ｏ−イノシトールを加えた培養液中で変異の発現のため
に４日間、３７℃で培養した。さらに、濃縮処理のため
に、ＰＢＳで２回、血清のみを含む培地で１回洗浄し
た。２４時間培養の後、培養液の細胞濃度を２×１０⁴
ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈し５０μＭの５−ブロモデオキ
シウリジンを加え２５時間暗所で培養し、次に、無血清
培地に交換、細胞をシャーレに接着の後、下方５ｃｍよ
り６０Ｗの白色蛍光灯を１．５時間照射した。照射後、
１ｍＭのｍｙｏ−イノシトールを加えた培養液と交換
し、３日間培養した。これを、Ｈ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ
らの方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．，１
１，７５（１９８６））を用いてレプリカ操作ならびに
変異株の分離に供した。

【０１８０】結果を表１０に示す。

【０１８１】

【表２８】

【０１８２】

【実施例６】参考例１で用意した化合物Ｎｏ．４を１０
％アセトニトリルを含む１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、その濃度が５０μｇ／ｍｌになるよ
うに調製した。

【０１８３】ＹＰＤ培地（酵母エキス２０ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ、グリコース２０ｇ／ｌ）を用いて３０℃で
あらかじめ１夜培養したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＩＦＯ ０２２４株の培養液２５
ｍｌを遠沈集菌し、全体を２００ｍｌの１０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し５００ｍｌの三角フラス
コに集めた。ここで菌濃度は３．０×１０⁷ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ程度であった。

【０１８４】この細胞懸濁液を９９ｍｌ分取し、上のよ
うにして調製した化合物Ｎｏ．４溶液を１ｍｌ加え、終
濃度を０．５μｇ／ｍｌとした。対照として、化合物Ｎ
ｏ．４が入っていない１０％アセトニトリルを含む１０
ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えたサンプルもあ
わせて調製した。

【０１８５】これらのサンプルをシャーレ（１０ｃｍ
径）に１０ｍｌずつ流し込んだ後氷上に置き、タングス
テンランプ（２５０Ｗ）に８００ｎｍ以上の波長をカッ
トオフするフィルターを取付け、５ｃｍの距離より所定
時間照射した。なお、この間マグネチックスターラーで
かくはんを続けた。このようにして処理したサンプル
は、０．１ｍｌずつを９．９ｍｌの１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ７．０））に加え、よく懸濁し、さらに必要に
応じて同様の希釈を行った。

【０１８６】希釈したサンプル０．１ｍｌをＹＰＤ固形
平板培地に加え、コンラージ棒で寒天面上に均一に塗布
し、３０℃で１夜培養した。各コロニーが重なり合わな
い程度に密に生育したプレートを用いて、レプリカ法に
よりＹＰＤ固形平板培地と最少培地への植え継ぎを行
い、栄養要求性の突然変異体の出現頻度の評価を行っ
た。

【０１８７】結果１１を表に示す。

【０１８８】

【表２９】

【０１８９】

【発明の効果】一般式［Ｉ］で表わされる化合物を突然
変異原とし光照射下に微生物を含む動植物細胞に接触さ
せる本発明の突然変異の誘発方法は、人体に対する危険
性なく効率の良い突然変異体の取得が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物、動物または植物の細胞に、光照
   射下に下記一般式［Ｉ］ 【化１】 で表される化合物を有効成分として含む水性媒体を接触
   させて突然変異を誘発する方法。（ただし上記一般式
   ［Ｉ］において、 【化２】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
   り、 Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原
   子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
   基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
   もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換ア
   リール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基また
   は置換もしくは未置換シクロアルキル基を示し、 Ｒ³は、−Ａまたは−Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ¹−、−Ｌ²−Ｌ³−または−Ｌ⁴−Ｌ⁵−Ｌ⁶−
   であり、Ｌ¹〜Ｌ⁶はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
   Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
   ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
   −ＣＨ＝Ｒ⁴−（Ｒ⁴はオキソ基を有する環構造を示す）
   を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
   ⁵（Ｒ⁵は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
   置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
   を示す）を表わし、 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ¹、Ｒ²、
   Ｒ³が結合していない炭素原子に結合している水素原子
   は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
   ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
   アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
   くは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級ア
   ルアルキル基で置換されていても良く、Ｙ^-はアニオン
   を示す。）
2. 【請求項２】 Ｒ¹およびＲ²がともに置換もしくは未置
   換アリール基であることを特徴とする、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 Ｘを含む複素環が、６員環であることを
   特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 Ｘを含む複素環の２位と４位が置換もし
   くは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位
   のいずれかがＲ³で置換されていることを特徴とする請
   求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 Ｘを含む複素環の３位と５位が置換もし
   くは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位の
   いずれかがＲ³で置換されていることを特徴とする請求
   項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｘを含む複素環の２位と６位が置換もし
   くは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位
   のいずれかがＲ³で置換されていることを特徴とする請
   求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 少なくとも２以上の置換もしくは未置換
   アリール基がＸを含むピリリウム環もしくはその類似環
   に一つおきに置換されていることを特徴とする請求項１
   〜６のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 −Ｌ−が、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩ
   Ｉ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基
   であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載
   の方法。 【化３】 （上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もし
   くは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２
   である。） 【化４】 （上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であ
   り、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェ
   ニレン基を表わす。） 【化５】 （上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ
   −、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。） 【化６】 【化７】
9. 【請求項９】 一般式［Ｉ］で表わされる化合物が、下
   記一般式［ＶＩＩ］ 【化８】 （上記一般式［ＶＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わし、
   Ｙ^-はアニオンを表わす）で表わされる化合物であるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 一般式［Ｉ］で表わされる化合物が、
    下記一般式［ＶＩＩＩ］ 【化９】 （上記一般式［ＶＩＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わ
    し、Ｙ^-はアニオンを表わす）で表わされる化合物であ
    ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類
    似環の置換基に更に親水性基が導入されていることを特
    徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 照射する光の波長が、可視領域のもの
    であることを特徴とする請求項１−１１のいずれかに記
    載の方法。
13. 【請求項１３】 照射する光の波長が、４７０ｎｍから
    ８００ｎｍまでの波長域を少なくともその一部として含
    む連続光であることを特徴とする請求項１〜１２のいず
    れかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 照射する光の波長が、４７０ｎｍから
    ８００ｎｍまでの波長域に存在する単色光であることを
    特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。