JPH07255495A - タキソールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 タキソールを含むタキサン類およびその誘導
体を工業的規模で大量生産することが可能な製造方法の
提供を目的としている。 【構成】 イチイ属植物の細胞又は細胞群を培養する際
に、液体培地を間欠的にあるいは連続的に新鮮な培地と
交換し、培養に使用した培地中に含有するタキソールを
含むタキサン類生産物を回収することを特徴とするタキ
ソールの製造方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イチイ属植物の培養細
胞を用いて、タキソールを含むタキサン類を製造する方
法に関する。更に詳細には、本発明は、イチイ属植物の
細胞又は細胞群を培養する際に、液体培地を間欠的にあ
るいは連続的に新鮮な培地と交換し、培養に使用した培
地に含有する生産物を回収することによって、タキソー
ルを含むタキサン類の増収を図る方法に関する。本発明
によって、抗腫瘍活性を有するタキソールをはじめとす
るタキサン類およびその誘導体を多量に生産できるよう
になるため、医薬品業界に益するところ大なるものがあ
る。

【０００２】

【従来の技術】タキソール（Taxol）は、イチイ属の植
物が生産するジテルペンアミドであり、抗腫瘍活性を有
している。その作用機序は、微小管を安定化させ、その
脱重合を阻害することによって細胞分裂を抑制するとい
うユニークなものである。このタキソールは、卵巣癌、
乳癌に顕著な効果があることが報告されており、肺癌や
悪性黒色腫などに対する効果も期待されている。このよ
うにタキソールを含むタキサン類は天然抗ガン剤あるい
は抗ガン剤の合成原料として極めて有用である。

【０００３】タキソールの原料としてはタイヘイヨウイ
チイ（Taxus breviforia: Pacificyew）などのイチイ属
植物の樹皮を利用することが考えられている。しかしな
がら、そのタキソール含有量は乾燥重量のおよそ０．０
１％であり、しかもイチイ属植物は極めて成長の遅い植
物であるため、一人の患者の治療に必要とされる１〜２
ｇのタキソールを生産するのに樹齢６０年以上の成木が
２〜３本必要とされている。従って、タキソールの原料
としてイチイ属植物の樹皮を利用することは、原料の安
定供給と植物資源の保護の観点から問題が多い。

【０００４】このため、タキソールの化学合成法による
製造が試みられているが、収率は極めて低く、大量生産
は困難である。一方、タキソールの前駆体（１０−デア
セチルバッカチンIIIなど）からのタキソールの半合
成、あるいはタキソテールのような類似物の合成研究が
進んでいる。半合成法を採用するにしても植物原料の供
給源が必要となるため、植物細胞培養法（組織培養法）
によるタキソールを含むタキサン類の大量生産が試みら
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、イチイ
属植物の細胞を用い、組織培養法によってその細胞を培
養しようとする場合、このイチイ属植物の細胞および細
胞群の培養液による培養における増殖速度は極めて遅
く、また、そのタキソールなどのタキサン類の蓄積量も
少ないために、工業的な規模で大量生産できるまでには
至っていない。

【０００６】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、液体培養方法の改良によってタキソールの生産性を
向上させることにより、タキソールを含むタキサン類お
よびその誘導体を工業的規模で大量生産することが可能
な製造方法の提供を目的としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、イチイ属
植物の細胞または細胞群を用いて、タキソールを含むタ
キサン類およびその誘導体を大量生産する方法を求めて
研究したところ、液体培地を間欠的にあるいは連続的に
新鮮な培地と交換し、培養に利用した培地に含有する生
産物を回収することによって、タキソールを含むタキサ
ン類の生産性を向上し得ることを見出し、本発明を完成
させた。

【０００８】すなわち、本発明はイチイ属植物の細胞又
は細胞群を培養する際に、液体培地を間欠的にあるいは
連続的に新鮮な培地と交換し、培養に使用した培地中に
含有するタキソールを含むタキサン類生産物を回収する
ことを特徴とするタキソールの製造方法である。

【０００９】また本発明において、培養液を抜き出す際
に培養系内の濃度より低い細胞濃度の培養液を抜き出せ
るように、膜または網による細胞の分離、あるいは、担
体への細胞の固定化、あるいは重力または遠心力を用い
た細胞沈降槽または装置を用いても良い。

【００１０】

【作用】イチイ属植物の細胞または細胞群の液体培養に
おいて、培養液を間欠的にあるいは連続的に抜き出し、
同時に新鮮培地を供給し、抜き出した培地中に放出され
たタキソール等のタキサン類生産物を回収することによ
り、細胞を破壊することなく長期間にわたってタキソー
ルなどのタキサン類生産物の生産を継続して行うことが
でき、その結果、高い生産性が得られる。

【００１１】

【実施例】本発明において培養に使用されるイチイ属植
物としては、タキソールなどのタキサン類の生産能を有
するものであれば使用可能であり、例えばタイヘイヨウ
イチイ（Taxus breviforia Nutt）、イチイ（Taxus cus
pidata）などから得ることができる。これらイチイ属植
物から、液体培養に適した培養細胞（カルス）を誘導す
る方法は、周知の組織培養法を適用して行うことができ
る。植物細胞から培養細胞を誘導する際に用いる培地や
植物ホルモンの種類と濃度は材料細胞に応じて適宜選択
して良く、例えばイチイ属植物の葉の細胞から培養細胞
を得る場合には、組織培養において通常使用される固体
培地に、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸やナフタレン酢
酸などのオーキシン、又はオーキシンとサイトカイニン
とを添加した培地を用いて細胞を培養して培養細胞（カ
ルス）を得る。

【００１２】得られたカルスは、次に液体培地中で培養
する。本発明では、このカルスを培養する際に、液体培
地を間欠的にあるいは連続的に新鮮な培地と交換し、培
養に使用した培地中に含有するタキソールを含むタキサ
ン類生産物を回収することを特徴としている。この液体
培地としては、組織培養において通常使用される液体培
地を基本とし、２,４-ジクロロフェノキシ酢酸やナフタ
レン酢酸などのオーキシンを０.１〜５ｐｐｍ程度添加
して調製した液体培地などを用いる。

【００１３】本発明においては、培養細胞または個々の
細胞が数個〜数百個程度の小塊状にまとまった培養細胞
群の液体培養において、培養液を間欠的にあるいは連続
的に抜き出し、同時に等量の新鮮培地を供給し、抜き出
した培地中に放出されたタキソールなどのタキサン類生
産物を回収することにより、培養細胞を破壊することな
く、長期間にわたってタキソールなどのタキサン類生産
物の生産を継続して行う。この培養における培養装置と
しては、フラスコ等の小容量の容器から大型のタンク式
培養器などを培養規模に応じて適宜選択して用いること
ができる。またその培養条件は、一般の植物の組織培養
における培養条件と同様にして行うことができ、特に好
ましくは培養温度２０〜２８℃程度、暗所条件下とす
る。また、この培養において、培養細胞に損傷を与える
ことがないように培養液を振盪、攪拌、混合することが
望ましい。

【００１４】そして、この培養中に培養液を抜き出す際
には、培養系内の濃度より低い細胞濃度の培養液を培養
系内から抜き出すことが望ましい。培養系から抜き出す
培養液中に培養細胞がある程度混在してもよく、抜き出
した培養液中の培養細胞は、、ろ過や遠心分離によって
集めて培養系内に返送しても良い。また、培養液中の細
胞を破砕して培養液と共に、或いは別々にタキソール等
のタキサン類を抽出しても良い。

【００１５】この培養中に培養系内の培地の交換に際
し、抜き出す使用済みの培地の細胞濃度を、培養装置内
より低くするためには、使用する細胞あるいは細胞塊の
平均径より小さい目開きを有する網、例えば、目開き２
００μｍ程度のナイロンメッシュや、細胞または細胞塊
の平均径より小さい平均細孔径を有する分離膜、例え
ば、０．２〜１μｍ程度の細孔径を有する精密分離膜な
どを通して培養系内から培養液を抜き出す。

【００１６】また、培地の交換に際して、抜き出す使用
済みの培地の細胞濃度を、培養装置内より下げるために
は、細胞をアルギン酸塩、カラギーナン、寒天、感光性
樹脂、アクリルアミドゲルなどのゲル状の担体に包括す
る、あるいは、ウレタンフォーム、セルロース、デキス
トラン、多孔質ガラス、ステンレススチールなどに吸着
することによって固定化する方法も有効である。

【００１７】さらに、培地の交換に際して、抜き出す使
用済みの培地の細胞濃度を、培養装置内より下げるため
には、重力あるいは遠心力を利用した沈降槽あるいは沈
降装置を設置し、分離の上清あるいは軽液（細胞濃度の
より低い液）のみを取り出すことも効果がある。

【００１８】また、この培地の交換は、培養系内に新し
い培地を連続的に一定流量で供給するとともに、この培
養系から等量の培養液（タキソールを含有した使用済み
の培養液）を連続的に抜き出す方法、培養系内に新しい
培地を間欠的に供給するとともに、等量の培養液を抜き
出す方法のいずれの方法でも良く、交換する培地の量は
特に限定されない。また、間欠的に培地を交換する場合
の交換頻度についても限定されず、例えば２〜３日間隔
で培地を交換したり、１日数回の交換を行っても良い。

【００１９】培養系から抜き出した培養液からのタキソ
ールの回収には、通常の方法が使用できる。すなわち、
エーテルやジクロロメタンなどの溶媒を用いて培養液中
から目的とするタキソール等のタキサン類生産物抽出す
ることが可能である。また、抽出の前に、吸着剤、例え
ば、非イオン性の高分子吸着剤ビーズであるアンバーラ
イトＸＡＤ−２を使ってタキソールを吸着分離すること
もできる。

【００２０】（実験例）培養には改変ガンボルグＢ５培
地にナフタレン酢酸を１〜５ｐｐｍ加えたものを用い
た。３００ｍｌの三角フラスコに培地１００ｍｌを入
れ、これに目開き１００〜２００μｍのナイロンメッシ
ュを装着した培地の抜き出しパイプと、供給パイプを装
着し、１２０℃で１５分間滅菌した。冷却後、イチイ
（Taxus cuspidata）の培養細胞（カルス）を湿重量で
約１ｇ入れて、２６℃で往復振盪培養を行なった。連続
培養における希釈率は、一日あたり０.０９、０.２７、
０.９０とした。培養１１日目間に取り出した培地中の
タキソールの総生産量を通常の１１日間の回分培養（培
地の抜き出し・供給せず）後の培地中の生産量と比較し
た結果を表１に示した。なお、培地中のタキソールの定
量分析は、ＨＰＬＣを用いて、標準物質と保持時間を比
較した。

【００２１】

【表１】

【００２２】表１の結果から明かなように、培養系内に
新鮮な培地を供給しつつ、使用済みの培地を抜き出しな
がら培養し、抜き出した培地からタキソールを抽出する
ことにより、回分培養によって培地からタキソールを得
る方法に比べ、タキソール生産量を格段に増加できるこ
とが判明した。

【００２３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
タキソールの生産性が大幅に向上し、タキソール等のタ
キサン類およびその誘導体を工業的規模で大量生産する
ことが可能なタキソールの製造方法を提供することがで
きる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イチイ属植物の細胞又は細胞群を培養す
   る際に、液体培地を間欠的にあるいは連続的に新鮮な培
   地と交換し、培養に使用した培地中に含有するタキソー
   ルを含むタキサン類生産物を回収することを特徴とする
   タキソールの製造方法。
2. 【請求項２】 液体培地を間欠的にあるいは連続的に新
   鮮な培地と交換する際に、膜あるいは網を用い、培養系
   内の細胞濃度を該培養系内から抜き出す培地中の細胞濃
   度より高く維持することを特徴とする請求項１記載のタ
   キソールの製造方法。
3. 【請求項３】 液体培地を間欠的にあるいは連続的に新
   鮮な培地と交換する際に、細胞を担体に包括、付着また
   は結合させることにより固定化し、培養系内の細胞濃度
   を該培養系内から抜き出す培地中の細胞濃度より高く維
   持することを特徴とする請求項１記載のタキソールの製
   造方法。
4. 【請求項４】 液体培地を間欠的にあるいは連続的に新
   鮮な培地と交換する際に、重力あるいは遠心力による沈
   降槽あるいは沈降装置を用いて、培養系内の細胞濃度を
   該培養系内から抜き出す培地中の細胞濃度より高く維持
   することを特徴とする請求項１記載のタキソールの製造
   方法。