JPH07258110A - 骨疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、骨折等の骨疾患の治療に有用であ
り、安定性に優れた治療剤を提供するものであり、特に
軟骨細胞の増殖促進に有用である。 【構成】 細胞成長因子とヒスタチンからなる。細胞成
長因子としては上皮細胞成長因子が好ましく、ヒスタチ
ンとしてはヒスタチン−５が好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨疾患例えば骨折、骨
移植、顎関節症等の骨修復を必要とする整形外科的治療
に用いられる薬剤に関するものであり、特に軟骨細胞の
増殖を促進させ軟骨細胞を成熟化し石灰化、骨形成を誘
導することにより、骨の修復作用を有する骨疾患治療剤
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術および課題】骨格を形成する骨組織は、成
長にしたがって大きくなり、また骨折しても修復され
る。この中でも、大腿骨、下腿骨に代表される四肢にお
ける長管骨の修復過程においては、まず軟骨組織が形成
されこれが骨芽細胞に分化して骨組織で置換され、骨修
復が完了する。このような軟骨形成を介する骨形成は、
軟骨性骨化と呼ばれ、軟骨の由来となる軟骨細胞の増
殖、成熟化が正常な骨化修復をもたらすものと考えられ
ている。軟骨細胞の増殖を促進する因子として、これま
でに、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、
トランスフォーミング細胞成長因子、インシュリン様細
胞成長因子等が知られている（加藤幸夫ら、実験医学、
７、１２７９−１２８５、１９８９）。しかし、骨折部
位への投与では、顕著な有効性が認められた例はなく、
また用いる細胞成長因子の安全性も解決されていないた
め、臨床的に応用された例は知られていない。

【０００３】臨床においてこれまでに行われている骨折
の治療法としては、観血的、非観血的骨の固定、自家骨
の移植、電磁波療法等が試みられている。しかしなが
ら、複雑骨折や開放性骨折などの予後の悪い例では、骨
髄炎の併発、仮骨形成不良による偽関節が生じ、骨折部
の治癒が不可能であった。そのため長期入院もしくは骨
切断などにより、患者は多大な肉体的、精神的苦痛に耐
えざるを得なかった。また、顎関節症の治療において
も、長期にわたる固定が必要となり多大な精神的苦痛を
伴う。そこで、骨折の治療において薬物を用いた積極的
な骨形成の誘導等による治療法が必要とされるが、いま
だ臨床応用に至った療法は確立されていない。このよう
な事情に鑑み、本発明者は、安全性、安定性および有効
性に優れた骨疾患治療剤につき鋭意研究を重ねた。その
結果、既にポルフィロモナス・ジンジバリス等の歯周病
原菌の歯牙および歯周組織への付着を抑制する効果が知
られている（特開平３−２６１７１７号公報）一連のペ
プチド群であるヒスタチンと細胞成長因子を組み合わせ
ることによって、意外にも細胞成長因子の軟骨細胞増殖
促進作用をさらに増強することを見いだし、本発明を完
成するに至った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒスタチンと
細胞成長因子を配合してなる骨疾患治療剤を提供するも
のである。ヒスタチンは、細胞成長因子と組み合わせて
配合することで、細胞成長因子の活性を促進し、軟骨細
胞を増殖を促進し、軟骨細胞から肥大軟骨細胞へと最終
分化後石灰化し、積極的な骨形成を誘導する。ヒスタチ
ンは、ヒト唾液腺から分泌される分子量１,０００−５,
０００のヒスチジンを多く含むペプチド群であり、これ
までのところ１２種類のヒスタチンの一次配列が決定さ
れている（Ｒ．Ｆ．Ｔｒｏｘｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，
Ｊ．Ｄｅｎｔ．れｓ．，６９，２−６，１９９０）。こ
れらヒスタチンの合成法は、後記の参考例に示すよう
に、公知の固相合成法や液相合成法によって、容易に合
成ことができる。これらヒスタチンのアミノ酸配列を表
１に示す。

【０００５】

【表１】

【０００６】ヒスタチンの構成アミノ酸およびその保護
基等についての略号はペプチドの分野で通常用いられる
ものである。例えば、アミノ酸残基は３文字で表し（Ｐ
ｒｏはプロリン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｖａｌはバリ
ン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｃｙｓはシステイン、Ｍ
ｅｔはメチオニン、Ａｌａはアラニン、Ａｓｎはアスパ
ラギン、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｌｙ
ｓはリジン、Ａｒｇはアルギニン、Ｇｌｕはグルタミン
酸、Ｓｅｒはセリン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｌｅｕ
はロイシン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｔｙｒはチロシ
ン、Ｐｈｅはフェニルアラニン）、アミノ酸残基間の−
記号はペプチド結合を表す。ＢＯＣは t−ブトキシルカ
ルボニル基を表す。ペプチドの左端のＨ−はアミノ末端
が、また右端の−ＯＨは、カルボキシ末端が保護されて
いない状態を表す。

【０００７】本発明に用いるヒスタチンは、唾液腺から
の抽出物でも良いし、合成品でも良い。合成品は化学合
成でも良いし、遺伝子誘導により生物的に合成されたも
のでも良い。ヒスタチンは表１に示すように多数の塩基
性ペプチドの総称であり、本発明ではどのペプチドも有
効に使用でき、単体でも良いし、２種以上を混合して用
いても良いが、特にヒスタチン−５が好ましい。本ヒス
タチンは塩基性を示すため、中和して使用することもで
きる。中和に使用する酸は、通常医薬品に使用される酸
であればどのようなものでも良い。例えば、塩酸、硫酸
等の鉱酸、酢酸、クエン酸、酸性アミノ酸等の有機酸な
どが適当である。本発明においてヒスタチンの組成中に
おける配合量は、０.０１〜１０ｍｇ／ｍｌ特に０.１〜
１ｍｇ／ｍｌが好ましい。ヒスタチンは、医薬上許容さ
れる酸または塩基性物質により中和された塩の形のもの
を用いてもよい。またヒスタチンと共に配合される細胞
成長因子には、ヒト上皮細胞成長因子、ヒト塩基性線維
芽細胞成長因子、ヒトトランスフォーミング細胞成長因
子、ヒトインシュリン様細胞成長因子等の細胞成長因子
が適当である。これら細胞成長因子は市販されており、
例えば、米国シグマ社より入手できる。またこれら細胞
成長因子は、組み替え遺伝子導入法により大腸菌により
産生されるものでも良い。これらの配合量は、上皮細胞
成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフォー
ミング細胞成長因子で ０.１〜１００ｎｇ／ｍｌが好ま
しく、特に１〜１０ｎｇ／ｍｌが良い。インシュリン様
細胞成長因子では１〜１０００ｎｇ／ｍｌが好ましく、
特に１０〜１００ｎｇ／ｍｌが良い。

【０００８】本発明の骨疾患治療剤は、有効量のヒスタ
チンと細胞成長因子類を配合した軟膏剤、注射剤や経口
製剤として投与することができる。これらのヒスタチン
の安全性は、通常有効性の認められる濃度範囲では細胞
に対する毒性は見られないことが、ニュートラルレッド
染色法によって確認されている。

【０００９】かくして本発明の骨疾患治療剤は、疾患部
位への塗布、注射、内服等種々の投与形態を採ることが
できるが、注射剤としての局所投与が好ましい。投与量
は、治療すべき症状、部位によって適宜増減できるが、
ヒスタチン量として１〜数１０ｍｇ、細胞成長因子量と
して１〜数１０μｇを疾患部位に局所投与することによ
って、所望の骨疾患治療効果が得られる。以下に注射
剤、軟膏剤の処方例を示す。

【００１０】

【実施例】以下に実施例、参考例、試験例を示して説明
する。本願発明はこれらの実施例等に限定されるもので
はない。 （１）参考例 本実験に用いたヒスタチン−５の合成例
を示す。用いたヒスタチン−５は、ＢＯＣ−アミノ酸無
水物法を採用しているＡＢＩペプチドシンセサイザー４
３０Ａを用いて固相法によって合成した。側鎖を保護し
たＢＯＣ−アミノ酸誘導体はＨ−Ａｓｐ（ＯＣＨｅｘ）
−ＯＨ、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ（Ｂ
ｏｍ）−ＯＨ、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ、Ｈ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｈ−Ｔｙｒ（Ｚ）−ＯＨ、Ｈ−Ｇｌ
ｕ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨであり、合成の出発物質として
ＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｚ）−ＰＡＭ樹脂を用いたペプチド鎖
の組み立てが終了した後、ペプチド結合した樹脂を１０
％アニソールを含む無水ＨＦを用いて０℃にて７５分間
処理した。ＨＦを蒸発させた後、遊離したペプチドを５
％酢酸で抽出し、凍結乾燥した。粗ペプチドは、ＨＰＬ
Ｃを用いてＯＤＳカラムによって精製し、凍結乾燥する
ことによって目的のペプチドを精製した。 ついで、得
られたヒスタチン−５を６Ｎ塩酸を用いて１１０℃にて
２４時間加水分解し、各アミノ酸含量を測定した。その
結果を、以下の表に示す。

【００１１】

【表２】

【００１２】（２）実施例 実施例１：注射薬 下記の成分を注射用水に溶解し注射薬とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １ｍｇ ヒスタチン−５ ２００ｍｇ 塩化ナトリウム ９００ｍｇ 注射用水 適量 全 量 １００ｍｌ

【００１３】実施例２：注射薬 下記の成分を注射用水に溶解し注射薬とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １０ｍｇ ヒスタチン−５ ２００ｍｇ 塩化ナトリウム ９００ｍｇ 注射用水 適量 全 量 １００ｍｌ

【００１４】実施例３：注射薬 下記の成分を注射用水に溶解し注射薬とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １ｍｇ ヒスタチン−５ ２ｇ 塩化ナトリウム ９００ｍｇ 注射用水 適量 全 量 １００ｍｌ

【００１５】実施例４：注射薬 下記の成分を注射用水に溶解し注射薬とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １０ｍｇ ヒスタチン−５ ２ ｇ 塩化ナトリウム ９００ｍｇ 注射用水 適量 全 量 １００ｍｌ

【００１６】実施例５：注射薬 下記の成分を注射用水に溶解し注射薬とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １０ｍｇ ヒスタチン−５ ２ｇ ヒスタチン−８ １００ｍｇ 塩化ナトリウム ９００ｍｇ 注射用水 適量 全 量 １００ｍｌ

【００１７】実施例６：軟膏薬 下記の成分を滅菌精製水に溶解し軟膏剤とする。 成分 配合量 上皮細胞成長因子 １０ｍｇ ヒスタチン−５ ２ｇ キサンタンガム １ｇ 滅菌精製水 適量 全 量 １００ｇ

【００１８】（３）試験例１： ヒスタチン−５と細胞
成長因子の併用による、骨疾患の治療効果を試験した。
以下にその結果を示す。 （１）軟骨細胞のＤＮＡ合成に対する作用 各種ペプチドと細胞成長因子類との相互作用による軟骨
細胞のＤＮＡ合成に対する作用について検討した。直径
１８ｍｍの組織培養用シャーレに軟骨細胞を５×１０４
個播種し、３７℃で２日インキュベートし、血清成分を
除いた培地に交換して、さらに１日インキュベート後、
各種濃度の上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因
子、トランスフォーミング細胞成長因子、インシュリン
様細胞成長因子（いずれもギブコ社製）とともに、ある
いは各種濃度のヒスタチン−５を加え、３７℃で１日イ
ンキュベートした。次に培地 ０.５ｍｌ中に［３Ｈ］−
チミジンを１μＣｉ／ｍｌになるように添加し、２時間
インキュベートした。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で
２回洗浄した後、氷冷した５％トリクロロ酢酸で洗浄し
細胞を固定した。これに ０.２５Ｍの水酸化ナトリウム
０.５ｍｌを加え細胞を溶解し、溶解液をシンチレーシ
ョンカクテルが入ったバイアルに移し、液体シンチレー
ションカウンターを用いて放射活性を測定した。一方、
対照としてヒスタチン−５および各種細胞成長因子を加
えずに同様の実験を行った。各検体のＤＮＡ合成能は、
ヒスタチン−５および各種細胞成長因子を加えないもの
を１とした、相対活性で示した。各検体におけるＤＮＡ
合成能を以下の表に示す。

【００１９】

【表３】

【００２０】第３表に示すごとく、ヒスタチン−５と細
胞成長因子は相乗的に軟骨細胞のＤＮＡ合成を促進し
た。その中でも、ヒスタチン−５と上皮細胞成長因子の
組み合わせが、最もＤＮＡ合成を促進した。

【００２１】（２）ラット骨折部における仮骨形成に対
する作用 ヒスタチン−５と上皮細胞成長因子との相互作用によ
る、ラット骨折部における仮骨形成に対する作用を検討
した。Ｓｐｒａｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（２００〜
２２５ｇ実験開始時）の大腿骨に、徒手的に骨折を生じ
させた。つぎに処方例１、２、３、４で示すヒスタチン
−５と上皮細胞成長因子を骨折部位に、１日１回毎日、
筋肉内投与した。対照として骨折部位にヒスタチン−５
を投与した群、上皮細胞成長因子を投与した群、生理食
塩水を投与した群、骨折のみを生じさせた群を設定し
た。投与５、１０、１５日後に大腿骨の骨折部位をＸ線
撮影装置を用いて軟Ｘ線撮影し（コダックペリアピカル
超高感度歯科用Ｘ線フィルムＤＦ５８）、軟Ｘ線像を観
察し画像解析装置（オリンパス Ｉｍａｇｅ Ｃｏｍｍ
ａｎｄ５０９８）により仮骨形成面積（軟Ｘ線を遮蔽す
る仮骨の面積）測定し平方ミリメートルで示した（表
４）。また、２０日後における骨折治癒の割合を調べた
（表５）。骨折治癒の割合は、全骨折部位数を分母と
し、骨折治癒部位数を分子として示した。

【００２２】

【表４】 第４表に示すごとく、ヒスタチン−５と上皮細胞成長因
子を組み合わせることによって、仮骨形成の促進が認め
られた。

【００２３】

【表５】 第５表に示すごとく、ヒスタチン−５と上皮細胞成長因
子を組み合わせることによって、骨折治癒の促進効果が
認められた。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、骨折等の骨疾患に有用
な、安定性および有効性に優れた骨疾患治療剤が得られ
る。本発明は軟骨細胞の増殖促進に有用である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞成長因子とヒスタチンからなる骨疾
   患治療剤。
2. 【請求項２】 ヒスタチンがヒスタチン−５である特許
   請求の範囲１記載の骨疾患治療剤。
3. 【請求項３】 細胞成長因子が、上皮細胞成長因子であ
   る特許請求の範囲１記載の骨疾患治療剤。
4. 【請求項４】 細胞成長因子とヒスタチンからなる軟骨
   細胞増殖促進剤。