JPH07258263A

JPH07258263A - 神経細胞分化促進剤およびその製造法

Info

Publication number: JPH07258263A
Application number: JP7635094A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Komagata; 大介駒形; Tatsumi Hayaoka; 辰巳早岡
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1994-03-24
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 1995-10-09

Abstract

(57)【要約】【構成】下記式〔１〕【化１】で表されるシューロチンＡ及びその薬理学上許容される
塩を有効成分とする神経細胞分化促進剤。【効果】本発明における神経細胞分化促進剤は抗痴呆剤
もしくは神経細胞保護剤や制癌剤による末梢神経障害治
療剤として応用されることが期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はシューロチンＡを有効成
分とする新規神経細胞分化促進剤に関するものであり、
例えば抗痴呆剤としてもしくは神経細胞保護剤や末梢神
経障害治療剤として使用することが期待されている。

【０００２】

【従来の技術】本発明で使用される式〔Ｉ〕

【０００３】

【化２】で表わされるPseurotin A はヘルベエティカ・キミカ・
アクタ(Helvetica Chimica Acta)59巻 133頁、1976年に
記載されている公知化合物である。本化合物は、モノア
ミン酸化酵素阻害剤（Maikotoxin 22 33 (1985) ）、キ
チン生合成阻害剤（Biosci. Biotech, Biochem57 961
(1993) ）、及びアポモルフィンアンタゴニスト（EP特
許第0546475 号）としての活性が報告されている。

【０００４】神経成長因子（以下ＮＧＦと称する。）に
は、神経突起を伸ばす作用、神経伝達物質の産生を調節
する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生作用を示
すことが試験管内で証明されており、〔エイジ８巻 19
頁(1985 年) 〕一方、ラット副腎髄質褐色細胞腫よりク
ローン化された株細胞であるＰＣ−１２細胞にＮＧＦを
添加することにより、増殖を停止し、神経突起をもつ交
感神経様の細胞へ分化することで知られている。このよ
うな作用があることから、近年、抗痴呆薬として注目さ
れているものの１つである。

【０００５】この細胞を用いてＮＧＦの他に、線維芽細
胞成長因子やインターロイキン６も突起の伸長を誘導す
ることが調べられたが、最近、微生物由来の低分子物質
スタウロスポリンも同様に神経突起の伸長をもたらすこ
とが示された。〔神経化学、26巻、200 〜220 頁(198
7)〕。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のスタウロスポリ
ンはＮＧＦとは違って低分子物質であるところから医療
上に極めて貴重であるが、残念ながら毒性が強いため、
実際の使用にあたっては、なお、検討の余地があると考
えられる。かかる実状において、より毒性が低く、低濃
度で神経突起伸長作用を示す低分子物質を提供すること
は、医療上に極めて重要なことである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで発明者らは土壌か
ら菌株を分離し、その生産物について研究を続けた結
果、式〔Ｉ〕

【化３】

【０００８】で表わされるシューロチンＡが神経細胞分
化促進活性を有することを見い出した。本発明は上記知
見に基づき完成されたものである。

【０００９】本発明をより詳しく説明すると、第１にシ
ューロチンＡ及びその薬理学上許容される塩を有効成分
とする神経細胞分化促進剤に関する。

【００１０】第２に、ジヘテロスポラ（Diheterospora)
属に属するシューロチンＡ（Pseurotin)A 生産菌を培地
に培養し、得られた培養物からシューロチンＡを採取す
ることを特徴とするシューロチンＡおよびその薬理学上
許容される塩の製造法を提供するものである。

【００１１】第１の発明について、次に詳しく述べる。
本発明において有効成分として使用されるシューロチン
Ａの、薬理学上許容される塩としては酸付加塩であって
もよく、酸付加塩を形成する酸としては、例えば塩酸、
臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸等
の無機酸及びマレイン酸、フマール酸、シュウ酸、ギ
酸、酢酸等の有機酸が挙げられる。

【００１２】本発明のシューロチンＡを有効成分とする
神経細胞分化促進剤は、例えば、抗痴呆剤として、もし
くは制癌剤等による末梢神経障害の治療剤や神経細胞保
護剤等として使用することが期待されている。

【００１３】本化合物が神経細胞分化促進剤として用い
られる場合は、単独または賦形剤あるいは担体と混合し
て注射剤、経口剤、または坐剤などとして投与される。
賦形剤及び担体としては薬剤学的に許容されるものが選
ばれ、その種類及び組成は投与径路や投与方法によって
決まる。例えば液状担体として水、アルコール類もしく
は大豆油、ピーナツ油、ゴマ油、ミネラル油等の動植物
油、または合成油が用いられる固体担体としてマルトー
ス、シュクロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシ
プロピルセルロースなどセルロース誘導体、ステアリン
酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。

【００１４】注射剤の場合一般には生理食塩水、各種緩
衝液、グルコース、イノシトール、マンニトール等の糖
類溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、
ポリエチレングリコール等のグリコール類が望ましい。
また、イノシトール、マンニトール、グルコース、マン
ノース、マルトース、シュークロース等の糖類、フェニ
ルアラニン等のアミノ酸等の賦形剤と共に、それを投与
時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、
ブドウ糖液、電解質溶液、アミノ酸液等静脈投与用液体
に溶解して投与することもできる。

【００１５】製剤中における本化合物の含量は製剤によ
り種々異なるが通常０．１〜１００重量％好ましくは１
〜９８重量％である。例えば注射液の場合には、通常
０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の有効
成分を含むようにすることがよい。経口投与する場合に
は、前記固体担体もしくは液状担体とともに錠剤、カプ
セル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形
態で、用いられる。カプセル、錠剤、顆粒、粉剤は一般
に５〜１００重量％、好ましくは２５〜９８重量％の有
効成分を含む。

【００１６】投与量は、患者の年令、体重、症状、治療
目的等により決定されるが、治療量は一般に、非経口投
与で１〜１００mg/kg ・日、経口投与で５〜５００mg/k
g ・日である。

【００１７】本化合物は低毒性であり、また、いずれの
化合物も連続投与による毒性の蓄積性が小さいことが特
徴的である。本化合物をマウス腹腔内に８００mg/kg の
投与量で１回投与しても何ら毒性の徴候はみられなかっ
た。

【００１８】次に、第２の発明について詳しく述べる。
本発明におけるシューロチンＡ生産菌はジヘテロスポラ
（Diheterospora)属に属するが、例えば本発明者らが分
離したＮＦ０１１５０（寄託番号FERM P-13984) 菌株
は、本発明に最も有効に使用される菌株の一例である。
本菌株の菌学的性質を示すと次のとおりである。

【００１９】ＮＦ０１１５０の菌学的性状

【００２０】１．ポテト・デキストロース寒天培地（２
５℃）の生育は極めて良く、１４日間で、集落の径は５
６〜５９ｍｍに達する。集落の表面は気生菌糸が発達し
て羊毛状となり、同心輪紋状に広がる。培養日数に従い
白色〜クリームを呈し、裏面は中心部が黄褐色で周辺部
は黄白色を呈する。２．麦芽エキス寒天培地（２５℃）の生育も良く、１４
日間で、集落の径は５３〜５４ｍｍに達する。集落の表
面は気生菌糸が発達して羊毛状となり、同心輪紋状に広
がる。培養日数に従い、白色〜クリーム色を呈し、裏面
は黄色〜黄褐色を呈する。また、培地中に黄色色素を産
生する。３．ツアペック寒天培地（２５℃）の生育も良く、１４
日間で、集落の径は５０〜５３ｍｍに達する。集落の表
面は羊毛状、同心輪紋状に広がる。培養日数に従い白色
〜淡黄色色を呈し、裏面は白色を呈する。

【００２１】４．コーンミール寒天培地（２５℃）の生
育はやや悪く、１４日間で、集落の径は４７〜５０ｍｍ
に達する。集落の表面は気生菌糸が薄く平坦に広がる。
培養日数に従い無色〜白色を呈する。５．オートミール寒天培地（２５℃）の生育は良く、１
４日間で、集落の径は５４〜５６ｍｍに達する。集落の
表面は羊毛状、培養日数に従い白色から後に中心部が黄
色を呈し、裏面は黄色〜黄橙色を呈する。

【００２２】６．本菌株は、ツアペック寒天培地上で速
やかに生育し、集落全面に分生子の豊富に形成する。菌
糸は直径１．６〜２．６μｍ、無色で細長く隔壁を有す
る。分生子の形成はアレウロ型分生子とフィアロ型分生
子の２型からなる。アレウロ型分生子形成構造：分生子
柄は、長さ２．５〜３０μｍ直径１．６〜２．６μｍで
分生子の着生部に向かってふくらみ分生子を頂生する。
分生子はアレウ型分生子で無色〜黄褐色、球形から卵形
さらに不規則な形となり、縦横に石垣状の隔壁を生じ隔
壁部はくびれる。細胞壁は成熟すると厚壁になる。直径
は１６〜２９μｍ。フィアロ型分生子形成構造：分生子
柄は細長く隔壁を有し、単生（１本）〜輪生状（５本）
にフィアライドを生じる。フィアライドは細長く基部は
ややふくらみ、１７〜３０μｍ×１．３〜２．０μｍ、
無色。分生子はフィアロ型分生子、大きさは変化に富み
卵形から短円筒形で先端は丸みを帯び、基部は突き出て
裁断状、滑面で無色、１．９〜４．５×１．３〜２．２
μｍ。フィアライドの先端に分生子が集まってドロップ
状（球状）となる。本菌株の至適生育温度は２５℃前後
で、３７℃では生育しない。生育ｐＨの範囲は３〜１０
と広く、至適ｐＨは５．５前後である。

【００２３】７．以上の菌学的性状により本菌株は、
“Ainsworth and Bisby's Dictionaryof the Fungi"
（by D.L Hawksworth B.C.Sutton and G.G.Ainsworth.
7th ed.,C.M.I., Kew, 1983)に従い、真菌門、不完全菌
亜門、不完全糸状菌網のDiheterospora 属菌と同定し
た。さらに種の検索を行ったところ、Diheterospora ch
lamydosporiaの記載とほぼ一致したので本菌株をDihete
rospora chlamydosporiaと同定し、Diheterospora chla
mydosporiaＮＦ０１１５０と命名した。

【００２４】本発明によりシューロチンＡを製造するに
は、ジヘテロスポラ属に属し、シューロチンＡを産生す
る能力を有する微生物を培地中で培養し培養物中にPseu
rotin A を生成蓄積せしめ、ついでこれを採取すればよ
い。

【００２５】培養方法は原則的に糸状菌の培養方法に準
ずるが、通常は液体培養による深部培養法が有利であ
る。培養に用いられる培地としては菌株ＮＦ−０１１５
０が利用する栄養源を含有する培地であればよい。栄養
源としては従来から糸状菌の培養に利用されている公知
のものが使用でき、例えば、炭素源として、グルコー
ス、ガラクトース、マンニトール、デキストリン、澱
粉、水飴（澱粉麦芽糖化物）、大豆油など単独または組
合わせて用いることができる。

【００２６】無機および有機窒素源としては、塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、硝酸ソーダ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾
燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆油カス、オー
トミル、カザミノ酸、バクトソイトン、ソリュブルベン
ジタブルプロティンなど単独または組合わせて用いるこ
とができる。

【００２７】その他必要に応じて食塩、硫酸マグネシウ
ム、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化マンガン、炭酸カルシウ
ム、燐酸塩などの無機塩を加えることができるほか、本
菌の生育や、シューロチンＡの生産を促進する有機物、
例えば核酸類、アミノ酸、ビタミン類や無機物を適当に
添加することができる。

【００２８】培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行うのが良い。実用的には、深部通
気攪拌培養が好ましい。培地のｐＨは例えば５．０〜
８．０であるが、中性付近が好ましい。培養温度は２５
〜２８℃が好ましい。培養時間は、液体培養の場合、通
常２〜４日培養を行ない培養物中のシューロチンＡ蓄積
量が最大に達したときに培養を終了する。

【００２９】これらの培地組成、培地の液生、培養温
度、攪拌速度、通気量等の培養条件は使用する菌株の種
類や外部の条件等に応じて好ましい結果が得られるよう
に適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培
養において発泡があるときは、シリコン油、植物油、界
面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。

【００３０】このようにして得られた培養物中に蓄積さ
れたシューロチンＡは、通常は培養ろ液中に生成され
る。

【００３１】培養ろ液からシューロチンＡを採取するに
は、通常微生物の培養液から代謝物を採取するのに用い
られる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、
または反復して用いられる。すなわち、例えば、ろ過、
遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種
溶媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば、沈
澱、結晶化、再結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグ
ラフィー等の手段が用いられる。

【００３２】シューロチンＡは、主として培養ろ液に生
成蓄積されるので、本化合物を分離採取するには、培養
液から菌体を除去した培養ろ液から採取すれば良い。例
えば、培養物から菌体その他を除去した培養ろ液から、
シューロチンＡを酢酸エチルで抽出し、濃縮後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−
２０クロマトグラフィー等によってシューロチンＡを単
離することができる。

【００３３】

【作用】次に、シューロチンＡのＰＣ１２細胞に対する
神経様突起伸長作用について述べる。グリーン（Green)
らの方法〔Ann, Rev. Neurosi., ３巻，353 頁(1980
年）〕に準じて形態変化により判定した。

【００３４】すなわち１０％牛胎児血清と１０％馬血清
を添加したダルコベッコ変法イーグル培地にＰＣ１２細
胞を１×１０⁴／ｍｌになるように植え、コラーゲンコ
ート９６穴マルチプレートで１晩、３７℃、５％ＣＯ₂
下に培養した。ここにサンプルを添加して、１日後の形
態変化を顕微鏡で観察する。

【００３５】その結果、シューロチンＡのＰＣ１２細胞
に対する神経様突起伸長を引き起こす有効濃度は、２５
μｇ／ｍｌから０．４μｇ／ｍｌと広範囲に渡った。

【００３６】対照として同様の作用を示すスタウロスポ
リンの活性を上記の方法と同様に測定したところ、０．
０２μｇ／ｍｌで突起伸長が認められた。

【００３７】また、シューロチンＡが、上記方法により
１日後にＰＣ１２細胞を細胞毒性により死滅させる濃度
は、３０μｍ／ｍｌであり、一方スタウロスポリンは濃
度０．０５μｍ／ｍｌであった。よって、シューロチン
Ａは低毒性であることがわかった。

【００３８】

【実施例】以下に本発明を実施例により説明するが、こ
れにより限定されるものではない。

【００３９】実施例１５００ｍｌ容三角フラスコに、グルコース１％、シュク
ロース２％、大豆粉（商品名；アジプロンＥ−３）２
％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．０５％を含む液体培地１００ｍｌを分注し、１２１
℃で２０分間蒸気滅菌し、これにポテトデキストロース
マガー斜面培地上で２６℃で培養したジヘテロスポラク
ラミドスポリア（Diheterospora chlemydosporia) ＮＦ
−０１１５０（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１３９８４）
の斜面培養から１白金耳ずつ接種し、２６℃で３日間回
転振とう培養し、種母を得た。

【００４０】３０リットル容ジャー・ファーメンター１
基に上記液体培地１５リットルを仕込み、１２１℃で３
０分間蒸気滅菌した。これに上記の種母３本分を移植
し、攪拌速度２５ｒｐｍ通気量１０リットル／分条件
下で２６℃で７２時間通気攪拌した。

【００４１】培養液をろ過した上清を酢酸エチル１５リ
ットルで抽出し、濃縮乾固物１０．２ｇを得た。これを
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ３×２０ｃ
ｍ）にかけ、ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝５０：１で溶出し
た。各フラクションをＰＣ１２細胞を用いた生物検定法
によって追跡し、活性画分を集め、減圧濃縮し、乾固物
３８０ｍｇを得た。これをＬＨ−２０カラムクロマトグ
ラフィー（φ３×１８０ｃｍ）にかけ、ＭｅＯＨで溶出
し、活性画分を集めて、シューロチンＡ１００ｍｇを単
離した。

【００４２】

【発明の効果】上記の通り、シューロチンＡはＰＣ１２
細胞の突起伸長促進活性を有し、かつ微生物由来のスタ
ウロスポリンなどに比べると低毒性であることから、神
経細胞分化促進剤として有用であり、例えば抗痴呆剤も
しくは、制癌剤治療における末梢神経障害治療剤や神経
細胞保護剤として応用されると考えられる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式〔１〕【化１】で表されるシューロチンＡ（Pseurotin A)及びその薬理
学上許容される塩を有効成分とする神経細胞分化促進剤
【請求項２】ジヘテロスポラ（Diheterospora)属に属す
るシューロチンＡ（Pse-urotin A) 生産菌を培養して、
得られた培養物からシューロチンＡを採取することを特
徴とするシューロチンＡの製造法。
【請求項３】ジヘテロスポラ属に属するシューロチンＡ
生産菌がジヘテロスポラ・クラミドスポリア（Dihetero
spora Chlamydosporia) である第２項記載の製造法。
【請求項４】ジヘテロスポラ属に属するシューロチンＡ
生産菌が、ジヘテロスポラ・クラミドスポリアＮＦ０１
１５０である特許請求の範囲第３項記載の製造法。