JPH07261097A - 顕微鏡及び画像取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】画像処理装置を備え、生物などの移動する観察
対象を観察する顕微鏡の改善に関する。 【構成】観察対象２０を載置する載置台２４と、観察対
象２０の状態を示す光学的情報ＯＤを取得する光学系２
１と、光学的情報ＯＤに基づいて複数の画像情報ＩＤを
生成する画像情報生成手段２２と、複数の画像情報ＩＤ
を比較処理するもとになる補助情報ＨＤを画像追跡手段
２５に入力する入力手段２５Ａと、補助情報ＨＤに基づ
いて複数の画像情報ＩＤを比較処理して観察対象２０の
移動量を検出し、該観察対象２０の移動量に応じて移動
手段２３を駆動制御し、観察対象２０の状態を示す表示
情報ＤＤを生成して表示手段２５Ｂに出力する画像追跡
手段２５と、観察対象２０の移動分だけ載置台２４を移
動させる移動手段２３と、表示情報ＤＤを外部に表示す
る表示手段２５Ｂとを有すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は顕微鏡及び画像取得方法
に関し、更に詳しく言えば、画像処理装置を備え、生物
などのように、移動する観察対象を観察する顕微鏡及び
画像取得方法の改善に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、医学、生物学の分野では、生きた
細胞や組織の経時的変化をとらえるため、観察者が顕微
鏡をのぞいてその顕微鏡像をスケッチする古典的な方法
に代えて、種々の顕微鏡像をＣＣＤカメラなどのビデオ
カメラで記録し、コンピュータなどを用いて画像処理し
て解析する方法が広く用いられつつある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
従来例によれば、細胞や微生物など、移動する観察対象
の動的な変化を記録する場合、薬物投与などの刺激にと
もなって、観察対象がプレパラート上を移動してしま
い、その結果、観察可能な領域（以下これを視野と称す
る）内にとらえていた観察対象が視野から外れてしま
い、のちの画像処理はおろか、観察対象の観察さえでき
なくなってしまうという問題が生じていた。

【０００４】本発明はかかる従来例の問題点に鑑みて創
作されたものであり、観察対象の移動に対応して、移動
する観察対象の観察を確実にすることが可能になる顕微
鏡の提供を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題は、図１に示す
ように、観察対象２０を載置する載置台２４と、前記観
察対象２０の状態を示す光学的情報ＯＤを取得する光学
系２１と、前記光学的情報ＯＤに基づいて複数の画像情
報ＩＤを生成する画像情報生成手段２２と、前記複数の
画像情報ＩＤを比較処理するもとになる補助情報ＨＤを
画像追跡手段２５に入力する入力手段２５Ａと、前記補
助情報ＨＤに基づいて前記複数の画像情報ＩＤを比較処
理して前記観察対象２０の移動量を検出し、該観察対象
２０の移動量に応じて移動手段２３を駆動制御し、かつ
前記観察対象２０の状態を示す表示情報ＤＤを生成して
表示手段２５Ｂに出力する画像追跡手段２５と、前記観
察対象２０の移動分だけ前記載置台２４を移動させる移
動手段２３と、前記表示情報ＤＤを外部に表示する表示
手段２５Ｂとを有することを特徴とする本発明に係る第
１の顕微鏡によって達成され、図２に示すように、観察
対象２０を載置する載置台３４と、前記観察対象２０の
状態を示す光学的情報ＯＤを取得する光学系３１と、前
記光学的情報ＯＤに基づいて画像情報ＩＤを生成する画
像情報生成手段３２と、前記画像情報ＩＤを比較処理す
るもとになる補助情報ＨＤを画像追跡手段３５に入力す
る入力手段３５Ａと、観察期間中の複数の前記画像情報
ＩＤを全て保持したのちに、前記補助情報ＨＤに基づい
て複数の前記画像情報ＩＤの比較処理をして、前記観察
対象２０の移動量を検出し、該移動量だけ前記画像情報
ＩＤ内の前記観察対象２０の位置を補正して表示情報Ｄ
Ｄを生成し、表示手段３５Ｂに出力する画像追跡手段３
５と、前記表示情報ＤＤを外部に表示する表示手段３５
Ｂとを有することを特徴とする本発明に係る第２の顕微
鏡によって達成され、図３に示すように、蛍光発光する
観察対象７０を載置する載置台４８と、前記観察対象７
０の発光する蛍光強度を検出し、制御手段６０に出力す
る共焦点光学系４０と、前記載置台４８を前記共焦点光
学系４０の光軸方向に走査する移動手段５０と、前記蛍
光強度が最大の時に停止するように前記移動手段５０を
駆動制御し、かつ前記観察対象７０の状態を示す画像情
報ＩＤを生成する制御手段６０と、前記画像情報ＩＤに
基づいて、前記観察対象７０の状態を表示する表示手段
６１とを有することを特徴とする本発明に係る第３の顕
微鏡によって達成され、蛍光発光する観察対象７０の焦
点深度の浅い箇所と深い箇所を選択し、前記焦点深度の
浅い箇所と深い箇所との間で、前記観察対象７０の光軸
方向の断層画像を複数取得することを特徴とする本発明
に係る画像取得方法により達成される。

【０００６】

【作 用】本発明に係る第１の顕微鏡によれば、図１に
示すように、移動手段２３と、画像追跡手段２５と、入
力手段２５Ａと、表示手段２５Ｂとを有する。例えば、
表示手段２５Ｂによって表示情報ＤＤが外部に表示さ
れ、その表示情報ＤＤに基づいて入力手段２５Ａから補
助情報ＨＤが画像追跡手段２５に入力され、画像追跡手
段２５によって補助情報ＨＤに基づいて観察対象２０の
移動量が検出され、その移動量に応じて移動手段２３が
駆動制御されてその分だけ載置台２０が移動され、同時
に観察対象２０の状態を示す表示情報ＤＤが生成されて
表示手段２５Ｂに出力される。

【０００７】このため、観察対象２０が移動しても、表
示手段２５Ｂによって表示された表示情報ＤＤを見なが
ら操作者が補助情報ＨＤを入力すると、それに基づいて
画像追跡手段２５が観察対象２０の移動量を算出し、そ
の移動量分だけ移動手段２３によって載置台２４を移動
させて観察対象２０を一定の視野内に納め、例えば視野
内の中央領域など、視野内の一定の位置におくことがで
きるので、従来のように観察対象が視野から外れること
で観察ができなくなることを極力抑止することが可能に
なる。

【０００８】また、本発明に係る第２の顕微鏡によれ
ば、図２に示すように、表示手段３５Ｂと入力手段３５
Ａと、画像追跡手段３５とを有する。例えば、画像追跡
手段３５に観察期間中の画像情報ＩＤが全て取り込まれ
たのちに、入力手段３５Ａから補助情報ＨＤが画像追跡
手段３５に入力され、次いで画像追跡手段３５で補助情
報ＨＤに基づく複数の画像情報ＩＤの比較処理がなされ
ることで観察対象２０の移動量が検出され、該移動量だ
け画像情報ＩＤ内の観察対象２０の位置が補正されるこ
とによって表示情報ＤＤが生成され、表示手段３５Ｂに
よって出力される。

【０００９】このため、本発明に係る第１の顕微鏡のよ
うに観察対象の移動に対して載置台の移動を以て追従す
るのではなく、観察期間中の画像情報ＩＤを全て取り込
んで、実験・観察が全て終了した後に、補助情報ＨＤに
基づいて複数の画像情報ＩＤを比較処理して観察対象２
０の移動量を検出し、その移動量だけ画像情報ＩＤ内の
観察対象２０の位置を補正することにより、観察対象の
移動に対応して観察対象２０が常に視野内の同一位置に
くるような表示情報ＤＤを生成することができる。

【００１０】このため、特に載置台がその動きに追従で
きないほど速い動きをする観察対象を観察するような場
合などには、例えば視野の中央のように、視野内のほぼ
同じ位置に観察対象が納まるように画像処理することが
できるので、観察対象２０の状態変化を確実にとらえる
ことができるので、とりわけ有効である。さらに、本発
明に係る第３の顕微鏡によれば、図３に示すように、蛍
光発光する観察対象７０を載置する載置台４８と、共焦
点光学系４０と、移動手段５０と、制御手段６０と、表
示手段６１とを有する。

【００１１】すなわち、共焦点光学系４０によって載置
台４８に載置された蛍光発光する観察対象７０の発光す
る蛍光強度が検出され、移動手段５０によって載置台４
８が共焦点光学系４０の光軸方向に走査され、制御手段
６０によって蛍光強度が最大の時に停止するように移動
手段５０が駆動制御されて観察対象７０の状態を示す画
像情報ＩＤが生成され、画像情報ＩＤに基づいて、観察
対象７０の状態が表示手段６１によって表示される。

【００１２】このため、例えば生物などのように光学系
の光軸方向で不均一な構造を有する観察対象７０を観察
する際にも、蛍光を発光する観察対象７０または観察対
象７０に蛍光物質を注入することにより、蛍光強度が最
大のときに載置台４８が停止して焦点合わせを自動的に
することができるので、観察者による当該顕微鏡の取扱
いが非常に容易になる。

【００１３】さらに、本発明に係る画像取得方法によれ
ば、蛍光発光する観察対象７０の焦点深度の浅い箇所と
深い箇所を選択し、焦点深度の浅い箇所と深い箇所との
間で、観察対象７０の光軸方向の断層画像を複数取得し
ている。このため、観察対象７０の中で焦点深度の浅い
箇所と深い箇所との計２カ所を指定して、そのそれぞれ
に焦点合わせをすることにより、その深度の差から観察
対象７０の光軸方向の距離を算出することができ、ま
た、その２点間で観察対象７０の画像情報を複数取得す
ることにより、観察対象７０の縦断面構造を得ることが
でき、のちに画像処理して観察対象７０の３次元的画像
を生成することも可能になる。

【００１４】

【実施例】

（１）第１の実施例 以下で、本発明の第１の実施例に係る顕微鏡について、
図面を参照しながら説明する。本発明の第１の実施例に
係る顕微鏡は、図４に示すように、光学系２１，画像デ
ータ生成部２２，移動装置２３，可動ステージ２４，画
像追跡部２５，マウス２５Ａ及びディスプレイ２５Ｂか
らなり、細胞や、微生物のように、移動する観察対象２
０を観察するものである。

【００１５】光学系２１は、光源１２、対物レンズ２Ａ
及び反射鏡２Ｂからなり、可動ステージ２４上に載置さ
れた観察対象２０を光源１２で照らし、対物レンズ２Ａ
で拡大して、反射鏡２Ｂを介して観察対象２０の状態を
示す光学的情報ＯＤを画像データ生成部２２に出力する
ものである。画像データ生成部２２は、画像情報生成手
段の一例であり、ＣＣＤカメラ３と画像解析装置４とか
らなり、光学系２１からの光学的情報ＯＤに基づいて電
気的に処理するための画像データＩＤを生成するもので
ある。

【００１６】ＣＣＤカメラ３は、反射鏡２Ｂからの光学
的情報ＯＤを撮像し、画像解析装置４に出力するもので
ある。画像解析装置４は、ＣＣＤカメラ３からのデータ
に基づいて画像データＩＤを生成してフィルタリング、
疑似カラー処理、シューティング補正、差分演算などの
処理を行って画像追跡部２５に出力するものである。本
実施例ではアピオニクス製のSPICCAを用いている。

【００１７】移動装置２３は、移動手段の一例であり、
ステッピングモータ９，１０，１１及び微動ダイヤル
６，７，８からなり、後述する制御回路２５Ｅの制御に
基づいて、可動ステージ２４を移動させるものである。
ステッピングモータ９は制御回路２５Ｅの制御に基づい
て微動ダイヤル６を回転させるものであり、微動ダイヤ
ル６は、自身が回転することで可動ステージ２４をＸ軸
方向に移動させるものである。

【００１８】ステッピングモータ１０は制御回路２５Ｅ
の制御に基づいて微動ダイヤル７を回転させるものであ
り、微動ダイヤル７は、自身が回転することで可動ステ
ージ２４をＹ軸方向に移動させるものである。ステッピ
ングモータ１１は制御回路２５Ｅの制御に基づいて微動
ダイヤル８を回転させるものであり、微動ダイヤル８
は、自身が回転することで可動ステージをＺ軸方向を中
心として回転させるものである。

【００１９】可動ステージ２４は、載置台の一例であ
り、不図示のプレパラート上にある観察対象２０をその
上に載置する台である。画像追跡部２５は、画像追跡手
段２５の一例であり、第１のメモリ２５Ｃ，第２のメモ
リ２５Ｄ，第３のメモリ２５Ｅ及び制御回路２５Ｆから
なり、画像データＩＤや後述のクリックデータＨＤに基
づいて画像情報処理をし、移動装置２３の駆動制御や、
ディスプレイ２５Ｂの表示状態を制御するものである。

【００２０】第１のメモリ２５Ｃは、画像データＩＤを
一時記憶しておくメモリであって、第２のメモリ２５Ｄ
は画像データＩＤを取得するメモリである。また、第３
のメモリ２５Ｅは画像データＩＤに基づいて生成された
表示データＤＤを保持するメモリである。また、制御回
路２５ＦはマウスからのクリックデータＨＤに基づいて
画像データＩＤの情報処理をして、移動装置２３の駆動
制御や、ディスプレイ２５Ｂの表示状態を制御するもの
である。なお、クリックデータＨＤは補助情報の一例で
あり、表示データＤＤは表示情報の一例であり、画像デ
ータＩＤは画像情報の一例である。

【００２１】マウス２５Ａは、入力手段の一例であっ
て、ディスプレイ２５Ｂの表示状態に基づいて画像情報
処理の基になるクリックデータＨＤを入力するものであ
る。ディスプレイ２５Ｂは表示手段の一例であって、制
御回路２５Ｆの制御により、観察対象２０の状態を表示
するものである。なお、本実施例では上記の画像追跡部
２５，マウス２５Ａ及びディスプレイ２５Ｂは、表示部
一体型コンピュータであるApple 社製のMacintosh IIfx
を用いている。

【００２２】以下で、当該顕微鏡の操作方法について説
明する。本実施例では観察対象２０として、アカミミズ
（Eisenia foetida）の腹髄神経節内の巨大介在ニュー
ロンの一つであるＭＧＦ（Median Giant Fiber）を用
いた。まず神経節を１％プロテアーゼ（SIGMA ，TypeXI
V ）で３分間処理し、表面の斜紋筋を除去した。その
後、４．３５％Calcium green １を充填したガラス微
小電極をＭＧＦに刺入し、−２nAで１０分間通電を行っ
て色素を注入した。神経節を摘出、整形後、特製の電極
付ホールマウント・スライドガラスにワセリンで封入し
た。

【００２３】上記のスライドガラスを可動ステージ２４
に載せ、不図示のクランパで固定した後、光源１２から
光を照射する。これを対物レンズ２Ａで拡大した顕微鏡
像である光学的情報ＯＤが反射鏡２Ｂによって反射さ
れ、その光軸上に設置されているＣＣＤカメラ３によっ
て撮像される。撮像された顕微鏡像は、画像解析装置４
によってアナログ／ディジタル変換されるなどして、画
像データＩＤが生成されて、画像追跡部２５に出力され
る。

【００２４】次いで、画像追跡部２５によって、第１の
メモリ２５Ｃに画像データＩＤが取り込まれ、それに基
づいて制御回路２５Ｅによる表示データＤＤの生成がな
され、ディスプレイ２５Ｂに出力されることにより、観
察対象２０の状態がディスプレイ２５Ｂに表示される。
すると、直径約２０μｍの細胞体から尾側方向に伸びる
約５００μｍの神経軸索である刺激前のＭＧＦである移
動前の観察対象２０Ｃがディスプレイ２５Ｂに表示され
る（図５（ａ））。

【００２５】その後、操作者が、こうして表示された７
８６×５１２の画素から構成される表示画像を見なが
ら、背景と識別できるＭＧＦに特徴的な細胞体であるＡ
点、Initial SegmentであるＢ点、軸索末端のＣ点の３
点を指標点として選び、その３点をマウス２５Ａでクリ
ックし、クリックデータＨＤとして制御回路２５Ｆに入
力する。

【００２６】その後、この観察対象２０に薬物を加えて
刺激する。その刺激に応じて観察対象２０は移動する。
次いで、刺激開始後２０秒後、上記と同様の処理を経て
移動後の観察対象２０Ｄが撮像されている画像データＩ
Ｄを取り込んでディスプレイ２５Ｂに表示させる。取り
込んだ後に、ディスプレイ２５Ｂに表示されている移動
後の観察対象２０Ｄの、ＭＧＦに特徴的な細胞体である
Ａ′点、Initial SegmentであるＢ′点、軸索末端の
Ｃ′点の３点を再びマウス２５Ａでクリックし、クリッ
クデータＨＤを制御回路２５Ｆに入力させる。

【００２７】すると、移動後の観察対象２０Ｄが移動前
の観察対象２０Ｃに比してどれだけ動いたかが、制御回
路２５Ｆによって指標点Ａ′，Ｂ′，Ｃ′の３点の移動
量から求められる。すなわち、移動前に入力したクリッ
クデータＨＤと、移動後に入力したクリックデータＨＤ
の差分をとるなどの演算処理が制御回路２５Ｆによって
なされることにより、指標点Ａ，Ｂ，Ｃの３点の移動量
が求められる（図５（ａ））。

【００２８】このようにして求められた３点の移動量に
基づいて、制御回路２５Ｆによってステッピングモータ
９，１０，１１の駆動制御がなされ、それに応じて微動
ダイヤル６，７，８が回転されて、移動後の観察対象２
０が移動前の観察対象２０の位置にくるように可動テー
ブル２４が移動する。こうして、移動後の観察対象２０
が移動前の観察対象２０とほぼ同一の位置にきたのち
に、そのときの図５（ｂ）に示すような画像を保持用の
表示データＤＤとして第３のメモリ２５Ｅに保持する。

【００２９】以上のようにして、観察対象の移動分だけ
可動テーブル２４が移動することにより、常に観察対象
２０を視野内におき、例えば最初に視野の中央に観察対
象を配置しておけば、観察対象が常に視野の中央にくる
ように補正しながら画像表示することができるので、従
来のように、観察対象が視野から外れることで観察がで
きなくなることを極力抑止することが可能になる。

【００３０】なお、本実施例では指標点を３点選び、ク
リックデータＨＤとして入力したが、本発明の指標点の
個数、選択方法はこれに限らない。以下でそれらについ
て説明する。すなわち、マウス２５Ａでクリックする指
標点の個数は画像がどのように動いたかによって決定す
る。例えば観察対象２０が可動ステージ２４のＸＹ平面
上で単に平行移動しただけの場合、指標となる点は１点
だけ選べば移動後の補正が可能である。しかしこれに回
転が加わった場合は２点以上を選ばなくてはならない。

【００３１】また観察対象２０が刺激によって拡大・収
縮してしまった場合は３点以上の指標点が必要となる。
例えば観察対象２０の全体が均一に拡大・収縮した場合
には３点を選べば補正が可能である。すなわち、図５に
示すように、刺激前の画像上の３点の作る三角形と刺激
後の３点の三角形は相似しているから、予め拡大・収縮
したときには「そのうちの１点とそれを夾む２辺を重ね
る」とか「３点のつくる三角形の重心を重ね、各辺が平
行になるように補正する」というように設定しておけ
ば、画像上の一定の位置に観察対象２０を維持しておく
ことができる。

【００３２】また、観察対象２０の部分によって拡大・
収縮率が異なる場合には、その状況に応じて指標点を４
点、５点…というように増せば良い。この指標点の入力
は、実験・観察の状態に応じて、ディスプレイ２５Ｂの
表示画面を見ながら臨機応変に操作者が調整することが
できるので、データ入力、ひいては画像データの処理に
ついての自由度が高く、有効である。

【００３３】（２）第２の実施例 以下で、本発明の第２の実施例に係る顕微鏡について説
明する。なお、第１の実施例と共通する点については、
重複するので、説明を省略する。本実施例において、第
１の実施例と異なる点は、第１の実施例のように観察対
象２０の移動に応じて可動ステージ２４を移動させて視
野の中央に観察対象２０がくるようにするのではなく、
可動ステージ３４は全く移動させずに、画像処理のみで
対応して、観察対象２０が視野すなわち表示画像の中央
にくるように処理している点である。

【００３４】本発明の第２の実施例に係る顕微鏡は、図
６に示すように、光学系３１，画像データ生成部３２，
移動装置３３，可動ステージ３４，画像追跡部３５，マ
ウス３５Ａ及びディスプレイ３５Ｂからなり、細胞、微
生物のように、移動する観察対象２０を観察するもので
ある。光学系３１は、光源１２、対物レンズ２Ａ及び反
射鏡２Ｂからなり、可動ステージ３４上に載置された観
察対象２０を光源１２で照らし、対物レンズ２Ａで拡大
して、反射鏡２Ｂを介して観察対象２０の状態を示す光
学的情報ＯＤを画像データ生成部３２に出力するもので
ある。

【００３５】画像データ生成部３２は、ＣＣＤカメラ３
と画像解析装置４とからなり、光学系３１からの光学的
情報ＯＤに基づいて電気的に処理するための画像データ
ＩＤを生成するものである。個々の構成部については、
第１の実施例と同様なので説明を省略する。画像追跡部
３５は、第１のメモリ３５Ｃ，第２のメモリ３５Ｄ，第
３のメモリ３５Ｅ及び制御回路３５Ｆからなり、画像デ
ータＩＤや後述のクリックデータＨＤに基づいて画像情
報処理をし、ディスプレイ３５Ｂの表示状態を制御する
ものである。

【００３６】第１のメモリ３５Ｃ、第２のメモリ３５Ｄ
は、画像データＩＤを記憶しておくメモリであって、第
３のメモリ３５Ｅは表示データＤＤを保持するメモリで
ある。また、制御回路３５Ｆはマウスからのクリックデ
ータＨＤに基づいて画像データＩＤの情報処理結果の表
示データＤＤを生成して、ディスプレイ２５Ｂの表示状
態を制御するものである。なお、クリックデータＨＤは
補助情報の一例である。

【００３７】マウス３５Ａは、入力手段の一例であっ
て、ディスプレイ３５Ｂの表示状態に基づいて画像情報
処理の基になるクリックデータＨＤを入力するものであ
る。ディスプレイ３５Ｂは表示手段の一例であって、制
御回路３５Ｅの制御により、観察対象２０の状態を表示
するものである。以下で、当該顕微鏡の操作方法につい
て説明する。まず、図６に示すような観察対象２０が載
置されたスライドガラスを可動ステージ３４に載せ、不
図示のクランパで固定した後、これを対物レンズ２Ａで
拡大した顕微鏡像は反射鏡２Ｂによって反射され、その
光軸上に設置されているＣＣＤカメラ３によって撮像さ
れる。

【００３８】撮像された顕微鏡像は、画像解析装置４に
よってアナログ／ディジタル変換されるなどして、画像
データＩＤが生成されて、画像追跡部３５に出力され
る。画像追跡部３５によって、第１のメモリ３５Ｃに画
像データＩＤが取り込まれ、それに基づいて制御回路３
５Ｆによって表示データＤＤが生成され、ディスプレイ
３５Ｂに出力されることにより、観察対象２０の状態が
ディスプレイ３５Ｂに表示される。

【００３９】こうしたのちに観察対象２０に薬物などで
刺激を加えるなどして、実験・観察を続ける。なお、こ
の間の画像データＩＤは全て第１のメモリ３５Ｃに取り
込まれ、実験・観察をしている間の全ての画像データＩ
Ｄが第１のメモリ３５Ｃに取り込まれる。こうして実験
・観察が終了した後に、観察対象２０が刺激による移動
によらず、常に視野内の同一位置にあるように画像処理
をする。

【００４０】すなわち、例えば図７（ａ）に示すよう
に、刺激を加える前の画像であって、移動前の観察対象
２０Ｅが撮像されている刺激前の画像データを１枚、第
１のメモリ３５Ｃから取り出し、これを１枚目の画像デ
ータＩＤ１１としてディスプレイ３５Ｂに表示する。そ
して、操作者がその表示画面を見ながら、移動前の観察
対象２０Ｅの、背景と識別できる特徴点である、図７
（ａ）中のＡ，Ｂ，Ｃ点の３点を指標点として選び、そ
の３点をマウス３５Ａでクリックし、クリックデータＨ
Ｄとして制御回路３５Ｆに入力して第２のメモリ３５Ｂ
に保持させる。

【００４１】次いで、刺激を加えた後の画像であって、
移動後の観察対象２０Ｆが撮像されている刺激後の画像
データを１枚、第１のメモリ３５Ｃから取り出して、こ
れを２枚目の画像データＩＤ１２としてディスプレイ３
５Ｂに表示させる（図７（ｂ））。その後、移動後の観
察対象２０Ｆの、背景と識別できる特徴点である、図７
（ｂ）中のＡ′，Ｂ′，Ｃ′点の３点を指標点として選
び、その３点をマウス３５Ａでクリックし、クリックデ
ータＨＤとして制御回路３５Ｆに入力させる。

【００４２】次いで、図７（ｃ）に示すように、移動後
の観察対象２０Ｆが移動前の観察対象２０Ｅとほぼ重な
るように、２枚目の画像データＩＤ１２から１枚目の画
像データＩＤ１１に移動させ、重なった部分のみのデー
タを、図７（ｄ）に示すような処理後の表示データＤＤ
１１として保持用メモリである第３のメモリ３５Ｅに保
存する。

【００４３】よって、当初、移動前の観察対象２０Ｅを
画面の中央にくるようにしておけば、移動後の観察対象
２０Ｆも画面の中央にくるようになるので、観察対象が
視野から外れることがなくなる。このような動作を実験
の状況に応じて繰り返すことにより、刺激を受けて移動
する観察対象が常に画面内の同一の位置にくるように表
示しつつ実験期間中の観察対象の動的変化をとらえるこ
とが可能になる。

【００４４】以上のようにして、本発明の第２の実施例
に係る顕微鏡によれば、図６に示すように、ディスプレ
イ３５Ｂとマウス３５Ａと、画像追跡部３５とを有する
ので、本発明の第１の実施例に係る顕微鏡のように、観
察対象の移動に対して可動テーブル２４を移動すること
で追従するのではなく、実験・観察期間中の画像データ
ＩＤを全て第１のメモリ３５Ｃに取り込んで、実験が全
て終了した後に、例えば刺激前の画像データと刺激後の
画像データのように、２枚の画像データを画像処理によ
って比較して、観察対象２０の移動量を検出し、その移
動量に応じて観察対象２０が常に視野内の同一位置にく
るような表示データＤＤを生成している。

【００４５】このため、特に可動テーブル３４がその動
きに追従できないほど速い動きをする観察対象を観察す
るような場合などには、画像処理のみで、例えば画面中
央のように、視野内のほぼ同じ位置に観察対象が納まる
ように画像処理することができるので、観察対象２０の
状態変化を確実にとらえることができ、また高速で画像
処理して保持することができるので、とりわけ有効であ
る。

【００４６】なお、本実施例では指標点を３点選び、ク
リックデータＨＤとして入力したが、本発明の指標点の
個数、選択方法はこれに限らないが、そのことについて
は第１の実施例で説明した通りなので、その説明は省略
する。 （３）第３の実施例 本発明に係る第３の実施例を説明する前に、近年開発さ
れた共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡を図８に示す。これ
は、レーザ光などの点光源101 で観察対象上の一点を対
物レンズ104 の共焦点上に絞って照射し、そこから出る
蛍光を同じ対物レンズ104 を通してダイクロイックミラ
102 により、異なる光軸上に結像し、この点像の強度
を、観察対象上の焦点外からの光を遮断する瞳絞り103
を介してフォトマルチプライヤ106 などにより測光し、
この点と点の対応をすべての物体面に対してＴＶ画像の
ように走査を行い、得られた点像の集まりを不図示のＴ
Ｖモニタ上など画像として再現するものである。

【００４７】このような共焦点レーザ顕微鏡では瞳絞り
103 が設けられていることにより、焦点面以外からの蛍
光はほとんど遮断されるため、観察対象の厚さとは無関
係に優れた空間解像度を得ることができ、医学，生物学
などの分野で盛んに普及しつつある。だがその操作性に
ついてはＸＹ軸方向（焦点面方向）に比べてＺ軸方向は
自由度が少なく、焦点合わせ（以下合焦と称する）も操
作者がモニタを見ながら、ステージまたは対物レンズを
上下に動かして調節していたので、特に焦点合わせな
ど、操作者の取扱いが困難であった。

【００４８】しかしながら、上述した共焦点効果を用い
ることによってその取扱いを改善することができる。す
なわち、共焦点レーザ顕微鏡では光軸方向への画像情報
の加算がなされないため、フォトマルチプライヤ106 で
測定される蛍光強度はその点が合焦した場合に図９に示
すように最大となる。なお、図９は一定速度で観察対象
を載置するステージを光軸方向に移動させたときの、移
動時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。

【００４９】したがってあらかじめ指定した範囲の蛍光
強度を、光軸方向（Ｚ軸方向）に試料を動かしながら連
続して測定し、その強度が最大になる点でステージを固
定すれば容易に焦点を合わせることができる。そこで、
本実施例及び以下の実施例では、この特性を利用するこ
とにより、取扱いの改善がなされた顕微鏡について説明
する。本実施例に係る顕微鏡は、合焦を自動化すること
で、操作者の取扱いを容易にするものである。図１０
に、本実施例に係る共焦点レーザ顕微鏡の構成図を示
す。

【００５０】当該顕微鏡は、共焦点光学システム４０と
それを制御するコンピュータ６０と顕微鏡５５とからな
る。共焦点光学システム４０は共焦点光学系の一例であ
り、レーザ光源４１とダイクロイックミラ４２とフォト
マルチプライヤ４６，励起波長用フィルタ４３，蛍光波
長用フィルタ４４，瞳絞り４５などから構成されてお
り、蛍光発光する観察対象７０の蛍光強度を検出してコ
ンピュータ６０に出力するものである。

【００５１】また光源４１，フィルタ４３，４４は使用
する波長によって交換することが可能である。これらの
光学システムは全てBio-rad 製MRC-600 を用いた。顕微
鏡５５は対物レンズ４７、ステージ４８、オートフォー
カスコントローラ４９からなり、載置台の一例であるス
テージ４８はその上に観察対象７０を載置するものであ
り、移動手段の一例であって、ステッピング・モータで
駆動されるオートフォーカスコントローラ４９はＺ軸方
向にステージ４８を移動させるものである。この顕微鏡
５０にはNikon 製Diaphot 倒立顕微鏡を用いた。

【００５２】共焦点光学システム４０とオートフォーカ
スコントローラ４９はコンピュータ６０（IBM 製 PC/AT
コンパチブル）で制御され、観察対象７０の蛍光強度が
最大になったところで合焦して、ステージ４８のＺ軸方
向の移動が停止し、捕らえられた顕微鏡画像と制御用画
面はモニタ６１Ａ，６１Ｂ上に映しだされる。以下で本
実施例に係る共焦点レーザ顕微鏡の操作手順を示す。作
業手順は図１１のフローチャートに示す。

【００５３】すなわち、観察対象７０がステージ４８上
に載置された後に、図１１のステップＰ１でレーザ光源
４１より励起光が発せられ、ダイクロックミラ４２によ
って対物レンズ４７から観察対象７０に照射される。次
に、ステップＰ２で観察対象７０の発光する蛍光の観察
を行い、ステップＰ３で、観察対象７０が蛍光発光する
部位を、蛍光発光の基準として指定する。

【００５４】次いで、ステップＰ４で、コンピュータ６
０の制御命令により、オートフォーカスコントローラ４
９がステージ４８をＺ軸方向に移動させ、同時にフォト
マルチプライヤ４６によって蛍光強度をリアルタイムに
測定する。次にステップＰ５で、蛍光強度の測定値よ
り、そのピーク値を検出し、ステップＰ６でＺ軸の固
定、すなわち蛍光強度がピークになったところで、コン
ピュータ６０からの指令により、自動的にオートフォー
カスコントローラ４９がステージ４８のＺ軸方向への移
動を停止する。

【００５５】その後、レーザ光源４１や、フィルタ４
３，４４を交換する必要があるときはステップＰ７で交
換し、そうでないときにはそのまま、ステップＰ８で合
焦がなされた観察対象７０の状態を示す画像をモニタ６
１Ａで表示し、必要がある場合はその画像データを取り
込んで保持する。このようにして、本実施例に係る顕微
鏡によれば、リアルタイムで観察対象７０の蛍光強度を
検出し、その強度が最大になったところでＺ軸方向への
ステージ４８の移動を自動的に中止することにより、自
動的に合焦をすることが可能になり、操作者の取扱いが
非常に容易になる。

【００５６】以下で、本実施例に係る顕微鏡を用いて蛍
光色素を注入した無脊椎動物神経細胞を観察した場合の
実施例を示す。観察する試料にはアカミミズ(Eisenia f
oetida) の腹髄神経節内の巨大介在ニューロンの一つで
あるＭＧＦを用いた。まず、神経節を１％プロテアーゼ
（SIGMA,Type XIV）で３分間処理し、表面の斜紋筋を除
去した。１％ Lucifer Yellowを充填したガラス微小電
極をＭＧＦに刺入し、−２ｎＡで１０分間通電を行って
色素を注入した。神経節を摘出、脱水、透徹処理後、ホ
ールマウント・スライドガラスに移して観察した。

【００５７】スライドガラスを顕微鏡のステージ４８に
載せて観察したところ、ＭＧＦと思わせる Lucifer Yel
low の蛍光が観察された。軸索部と思われる部位を指定
し、自動焦点を行った。軸は５μｍ毎にステップさせ、
約１００μｍ（２０ステップ）の深さに渡って測光し
た。その結果最も蛍光強度が強い位置でステージが停止
し、そこで全画面で画像を取り込んだところ、焦点の合
った明瞭なＭＧＦの軸索が観察された。さらに軸索部位
よりやや背側に位置する細胞体部位を指定したところ、
速やかに細胞体に合焦した画像が得られた。 （４）第４の実施例 次に、第３の実施例の顕微鏡を用いて、細胞内の特定の
器官からの自家蛍光、またはそれを特異的に染色する蛍
光色素を使用して合焦を行い、その後光源やフィルタを
交換して別の観察像を得る場合の実験例を示す。なお、
当該顕微鏡の操作手順は、図１１のフローチャートに示
すように、第３の実施例と同様なので説明を省略する。

【００５８】第３の実施例と同様にアカミミズ腹髄神経
節内のＭＧＦに4.35％ Calcium green 1（細胞内Ｃａ²⁺
感受性蛍光色素）を充填したガラス微小電極を刺入し、
−２ｎＡで１０分間通電を行って色素を注入した。その
後神経節を摘出し１００μｇ／ｍｌのＪＣ−１に３０分
間浸した。ＪＣ−１は細胞内のミトコンドリアを選択的
に染色する蛍光色素である。染色後、特製の電極付ホー
ルマウント・スライドガラスにワセリンで封入した。

【００５９】まず、５７５ｎｍの波長で励起し、ＪＣ−
１からの５９０ｎｍの波長の蛍光を測光する。細胞体部
を指定して自動焦点を行ったところ、Ｚ軸方向に２０μ
ｍ以上の厚さがある細胞体のミトコンドリアが多く存在
する細胞質層に合焦させることができた。その後、励
起、蛍光フィルタをそれぞれ４８８ｎｍ，５３０ｎｍの
ものに変更し、Calcium green 1 の蛍光を用いてミトコ
ンドリア近傍でのＣａ²⁺濃度変化の測定を行った。

【００６０】（５）第５の実施例 次いで、第３の実施例の顕微鏡を用いて、観察対象の合
焦する部位を２ヵ所指定し、その間で一定幅で光学的断
層像を得る場合の実施例を示す。なお、当該顕微鏡の操
作手順は、図１１のフローチャートに示すように、第３
の実施例と同様なので説明を省略する。

【００６１】第３、第４の実施例と同様に、切り出した
アカミミズ腹髄神経節を４０μＭ RH-414 に９０分間浸
し、ＭＧＦを染色した。 RH-414 は細胞膜に結合して膜
を特異的に染色する蛍光色素である。観察画像から最も
焦点深度が浅いと思われる軸索末端部と最も深い細胞体
頭頂部の２ヵ所を指定し、その間で５μｍ毎の光学的断
層像を取り込んだ。その結果、２点のＺ軸方向の距離は
約３５μｍで８枚の断層像を得ることができた。これら
の断層像から、のちに当該観察対象の３次元像を形成す
ることが可能になる。

【００６２】従って、本実施例に示すように、本実施例
に係る顕微鏡を用いて、例えば焦点深度の浅い箇所と深
い箇所の２点を選択してそれぞれについて合焦すること
により、Ｚ軸方向の断層画像を得ることができ、さらに
はのちに観察対象の３次元立体像を構成することもでき
るので、非常に有効である。 （６）第６の実施例 次に、第３の実施例の顕微鏡を用いて、カルシウム・イ
メージングの連続画像取込みに用いた場合の実施例を示
す。なお、当該顕微鏡の操作手順は、図１１のフローチ
ャートに示すように、第３の実施例と同様なので説明を
省略する。

【００６３】第３〜第５の実施例と同様にして、アカミ
ミズ腹髄神経節内のＭＧＦに4.35％Calcium green 1を
充填したガラス微小電極を刺入し、−２ｎＡで１０分間
通電を行って色素を注入した。その後神経節を摘出、整
形後、特製の電極付ホールマウント・スライドガラスに
ワセリンで封入した。スライドガラスを顕微鏡ステージ
に載せ、軸索部を指定して合焦させたところ、直径約２
０μｍの細胞体から尾側方向に延びる約５００μｍの神
経軸索が認められた。刺激には細胞外電気刺激を用い、
刺激前後での軸索各部での蛍光強度変化を捉えるため、
３０秒毎に画像を取り込む。取込み直前５秒前に自動焦
点補正を行う。カルシウム濃度変化に対応する Calcium
green 1の蛍光強度変化が補正のための走査中には大き
く変化せず、また５秒間では標本がそれほど大きくずれ
ないと考えられるからである。刺激に伴って変化すると
思われるＺ軸の量は多くとも１０μｍ前後と考えられる
ので、Ｚ軸走査幅は前回合焦位置から上下５μｍとし
た。また補正のための走査速度を上げるため、指定する
画像上の範囲は軸束部の９ピクセルに止めた。

【００６４】電気刺激の開始直後のＭＧＦ深度は若干浅
くなったが、自動焦点補正後の画像で常に合焦した像を
捉えることができた。

【００６５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る第１
の顕微鏡によれば、表示手段と入力手段と、画像追跡手
段と、移動手段とを有するので、たとえ観察対象が移動
しても、表示手段によって表示された表示情報を見なが
ら操作者が補助情報を入力すると、それに基づいて画像
追跡手段が観察対象の移動量を算出し、移動量分だけ載
置台を移動させて観察対象を一定の視野内におくことが
でき、従来のように観察対象が視野から外れて観察がで
きないという事態を極力回避することが可能となる。

【００６６】また、本発明に係る第２の顕微鏡によれ
ば、観察期間中の画像情報を全て取り込み、観察が終了
したのちに、所望の表示情報を得ることができるので、
特に載置台を追従できないほど速い動きをする観察対象
を観察するような場合などには、画像処理のみで、視野
内のほぼ同じ位置に納まるように画像処理することがで
き、とりわけ有効である。

【００６７】さらに、本発明に係る第３の顕微鏡によれ
ば、蛍光を発光する観察対象を載置する載置台と、共焦
点光学系と、移動手段と、制御手段と、表示手段とを有
する。このため、例えば生物などのように光学系の光軸
方向で不均一な構造を有する観察対象を観察する際に
も、蛍光強度が最大のときに載置台が停止して焦点合わ
せを自動的にすることができるので、観察者による当該
顕微鏡の取扱いが非常に容易になる。

【００６８】さらに、本発明に係る画像取得方法によれ
ば、蛍光発光する観察対象の焦点深度の浅い箇所と深い
箇所を選択し、焦点深度の浅い箇所と深い箇所との間
で、観察対象の光軸方向の断層画像を複数取得してい
る。このため、観察対象の光軸方向の距離を算出するこ
とができ、また、観察対象の縦断面構造を得ることがで
き、のちに画像処理して観察対象の３次元的画像を生成
することも可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る第１の顕微鏡を説明する図であ
る。

【図２】本発明に係る第２の顕微鏡を説明する図であ
る。

【図３】本発明に係る第３の顕微鏡を説明する図であ
る。

【図４】本発明の第１の実施例に係る顕微鏡を説明する
図である。

【図５】本発明の第１の実施例に係る顕微鏡の操作方法
を説明する図である。

【図６】本発明の第２の実施例に係る顕微鏡を説明する
図である。

【図７】本発明の第２の実施例に係る顕微鏡の操作方法
を説明する図である。

【図８】共焦点レーザ顕微鏡の構成を示す図である。

【図９】共焦点レーザ顕微鏡の特徴を説明するグラフで
ある。

【図１０】本発明の第３の実施例に係る顕微鏡を説明す
る図である。

【図１１】本発明の第３の実施例に係る顕微鏡の操作方
法を説明するフローチャートである。

【符号の説明】

２０ 観察対象、 ２１，３１ 光学系、 ２２，３２ 画像情報生成手段、 ２３ 移動手段、 ２４，３４ 載置台、 ２５，３５ 画像追跡手段、 ２５Ａ，３５Ａ マウス（入力手段）、 ２５Ｂ，３５Ｂ ディスプレイ（表示手段）、 ２５Ｃ，３５Ｃ 第１のメモリ（第１の記憶手段）、 ２５Ｄ，３５Ｄ 第２のメモリ（第２の記憶手段）、 ２５Ｅ，３５Ｅ 第３のメモリ（第３の記憶手段）、 ２５Ｆ，３５Ｆ 制御回路（制御手段）、 ４０ 共焦点光学系 ４１ レーザ光源 ４２ ダイクロックミラ ４３ 励起波長用フィルタ ４４ 蛍光波長用フィルタ ４５ 瞳絞り ４６ フォトマルチプライヤ ４７ 対物レンズ ４８ 載置台 ４９ オートフォーカスコントローラ ５０ 移動手段 ５５ 顕微鏡 ６０ コンピュータ（制御手段） ６１ 表示手段 ６１Ａ，６１Ｂ モニタ ７０ 観察対象 ＤＤ 表示データ（表示情報）、 ＨＤ クリックデータ（補助情報）、 ＩＤ 画像データ（画像情報）、 ＯＤ 光学的情報。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 観察対象（２０）を載置する載置台（２
   ４）と、 前記観察対象（２０）の状態を示す光学的情報（ＯＤ）
   を取得する光学系（２１）と、 前記光学的情報（ＯＤ）に基づいて複数の画像情報（Ｉ
   Ｄ）を生成する画像情報生成手段（２２）と、 前記複数の画像情報（ＩＤ）を比較処理するもとになる
   補助情報（ＨＤ）を画像追跡手段（２５）に入力する入
   力手段（２５Ａ）と、 前記補助情報（ＨＤ）に基づいて前記複数の画像情報
   （ＩＤ）を比較処理して前記観察対象（２０）の移動量
   を検出し、該観察対象（２０）の移動量に応じて移動手
   段（２３）を駆動制御し、前記観察対象（２０）の状態
   を示す表示情報（ＤＤ）を生成して表示手段（２５Ｂ）
   に出力する画像追跡手段（２５）と、 前記観察対象（２０）の移動分だけ前記載置台（２４）
   を移動させる移動手段（２３）と、 前記表示情報（Ｄ
   Ｄ）を外部に表示する表示手段（２５Ｂ）とを有するこ
   とを特徴とする顕微鏡。
2. 【請求項２】 観察対象（２０）を載置する載置台（３
   ４）と、 前記観察対象（２０）の状態を示す光学的情報（ＯＤ）
   を取得する光学系（３１）と、 前記光学的情報（ＯＤ）に基づいて画像情報（ＩＤ）を
   生成する画像情報生成手段（３２）と、 前記画像情報（ＩＤ）を比較処理するもとになる補助情
   報（ＨＤ）を画像追跡手段（３５）に入力する入力手段
   （３５Ａ）と、 観察期間中の複数の前記画像情報（ＩＤ）を全て保持し
   たのちに、前記補助情報（ＨＤ）に基づいて複数の前記
   画像情報（ＩＤ）の比較処理をして、前記観察対象（２
   ０）の移動量を検出し、該移動量だけ前記画像情報（Ｉ
   Ｄ）内の前記観察対象（２０）の位置を補正して表示情
   報（ＤＤ）を生成し、表示手段（３５Ｂ）に出力する画
   像追跡手段（３５）と、 前記表示情報（ＤＤ）を外部に表示する表示手段（３５
   Ｂ）とを有することを特徴とする顕微鏡。
3. 【請求項３】 蛍光発光する観察対象（７０）を載置す
   る載置台（４８）と、 前記観察対象（７０）の発光する蛍光強度を検出し、制
   御手段（６０）に出力する共焦点光学系（４０）と、 前記載置台（４８）を前記共焦点光学系（４０）の光軸
   方向に走査する移動手段（５０）と、 前記蛍光強度が最大の時に停止するように前記移動手段
   （５０）を駆動制御し、かつ前記観察対象（７０）の状
   態を示す画像情報（ＩＤ）を生成する制御手段（６０）
   と、 前記画像情報（ＩＤ）に基づいて、前記観察対象（７
   ０）の状態を表示する表示手段（６１）とを有すること
   を特徴とする顕微鏡。
4. 【請求項４】 蛍光発光する観察対象（７０）の焦点深
   度の浅い箇所と深い箇所を選択し、前記焦点深度の浅い
   箇所と深い箇所との間で、前記観察対象（７０）の光軸
   方向の断層画像を複数取得することを特徴とする画像取
   得方法。