JPH072643B2 - 大食細胞活性化組成物およびその製造方法 - Google Patents
大食細胞活性化組成物およびその製造方法Info
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- JPH072643B2 JPH072643B2 JP60205498A JP20549885A JPH072643B2 JP H072643 B2 JPH072643 B2 JP H072643B2 JP 60205498 A JP60205498 A JP 60205498A JP 20549885 A JP20549885 A JP 20549885A JP H072643 B2 JPH072643 B2 JP H072643B2
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- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は水溶性であるがそれ自体は大食細胞刺激作用を
有しないβ−1,3−結合グルカンおよびそのグルカンが
固定されている非水溶性担体を含有する大食細胞刺激組
成物に関する。本発明によれば本発明方法で固定化され
る水溶性グルカンは単核の食細胞（fagocytes）、いわ
ゆる大食細胞（macrophages）を活性化しうる能力を有
することが見出された。
有しないβ−1,3−結合グルカンおよびそのグルカンが
固定されている非水溶性担体を含有する大食細胞刺激組
成物に関する。本発明によれば本発明方法で固定化され
る水溶性グルカンは単核の食細胞（fagocytes）、いわ
ゆる大食細胞（macrophages）を活性化しうる能力を有
することが見出された。
ある種の多糖類がたとえば補体系の活性化および大単核
細胞‐大食細胞の機能の刺激によつて身体の防御機構を
改善するということは知られている。これらの細胞は内
側からおよび外側からの両方、例えば癌細胞の生長に対
するまたは例えば細菌の攻撃に対する身体の防御にとつ
て非常に重要である。
細胞‐大食細胞の機能の刺激によつて身体の防御機構を
改善するということは知られている。これらの細胞は内
側からおよび外側からの両方、例えば癌細胞の生長に対
するまたは例えば細菌の攻撃に対する身体の防御にとつ
て非常に重要である。
以前に、必ずしも可溶性ではないが、ある種のグルカン
特に1,3-結合β‐D-グルコースその物を含有するものが
生体外において大食細胞を活性化しそしてそれを細胞毒
素性ならしめるということが指摘されたことがある
（「Experi-mental Cell Research」139（1981）121、
R.Seljelid氏、G.Bgwald氏およびÅ.Lundwall氏によ
る「GLYCAN STIMULATION OF MACROPHAGES IN VITRO」を
参照されたい）。
特に1,3-結合β‐D-グルコースその物を含有するものが
生体外において大食細胞を活性化しそしてそれを細胞毒
素性ならしめるということが指摘されたことがある
（「Experi-mental Cell Research」139（1981）121、
R.Seljelid氏、G.Bgwald氏およびÅ.Lundwall氏によ
る「GLYCAN STIMULATION OF MACROPHAGES IN VITRO」を
参照されたい）。
不溶性化合物は生体外および生体内で使用するのにしば
しば不適当であるので本発明の主目的は制御された条件
を得ることを可能にした、大食細胞の活性化を提供しう
る能力を有する組成物を提供することにある。
しば不適当であるので本発明の主目的は制御された条件
を得ることを可能にした、大食細胞の活性化を提供しう
る能力を有する組成物を提供することにある。
本発明の別の目的はかかる組成物の製造方法を提供する
ことである。
ことである。
本発明によれば驚くべきことに、通常非水溶性担体への
固定により大食細胞を活性化しない水溶性β‐1,3-結合
D-グルカン類が大食細胞刺激性質を獲得するということ
が見出された。すなわち可溶性だが、それ自体不活性な
β‐1,3-結合D-グルカン類が適当な表面への固定後に大
食細胞を活性化するのである。かかる表面は医学技術に
おいて広範な有用性をもたらす。例としては例えばβ‐
1,3-結合D-グルカン類で被覆された表面上を血液が通過
する体外循環の種々な形態を挙げることができる。他の
医学的適用は本発明開示の例示部分で以下に示す。
固定により大食細胞を活性化しない水溶性β‐1,3-結合
D-グルカン類が大食細胞刺激性質を獲得するということ
が見出された。すなわち可溶性だが、それ自体不活性な
β‐1,3-結合D-グルカン類が適当な表面への固定後に大
食細胞を活性化するのである。かかる表面は医学技術に
おいて広範な有用性をもたらす。例としては例えばβ‐
1,3-結合D-グルカン類で被覆された表面上を血液が通過
する体外循環の種々な形態を挙げることができる。他の
医学的適用は本発明開示の例示部分で以下に示す。
本発明において有用なβ‐1,3-結合D-グルカン類の例と
しては例えばラミナラン（laminaran）、クルドラン（c
urdlan）、パヒマン（pachyman）、酵母グルカン（yeas
t glucan）およびリケナン（lichenan）を挙げることが
できる。
しては例えばラミナラン（laminaran）、クルドラン（c
urdlan）、パヒマン（pachyman）、酵母グルカン（yeas
t glucan）およびリケナン（lichenan）を挙げることが
できる。
本発明開示で使用される「大食細胞」の表現は科学的観
点から考えてより適切な表現である単核の食細胞を意味
する。
点から考えてより適切な表現である単核の食細胞を意味
する。
すなわち本発明による技術は第一に動物、例えばヒトの
単核の食細胞を活性化させるのに使用されうる。このこ
とは本発明による組成物が特にヒトおよび商業的に有用
な動物をはじめとする動物の、例えば感染および癌に対
する身体防御を改善するのに使用できることを意味して
いる。このような考えられる利用面は本発明開示で以下
に提供する実験試験によつて証明される。
単核の食細胞を活性化させるのに使用されうる。このこ
とは本発明による組成物が特にヒトおよび商業的に有用
な動物をはじめとする動物の、例えば感染および癌に対
する身体防御を改善するのに使用できることを意味して
いる。このような考えられる利用面は本発明開示で以下
に提供する実験試験によつて証明される。
グルカンの固定化は適当な担体への共有結合によりもた
らされるのが好ましい。特に好ましいのはグルカンが結
合されるアミノ基を含有している担体を使用することで
ある。すなわちこの好ましい方法とは担体の表面が最初
にアミノ基の導入により活性化されることを意味する。
グルカンはかかる方法でアミノ化された表面へ共有結合
しうるものとして変性される。担体の性質は臨界的では
なく、種々の型のプラスチツクがアミノ化したゲルと同
様に使用されるものと考えられる。
らされるのが好ましい。特に好ましいのはグルカンが結
合されるアミノ基を含有している担体を使用することで
ある。すなわちこの好ましい方法とは担体の表面が最初
にアミノ基の導入により活性化されることを意味する。
グルカンはかかる方法でアミノ化された表面へ共有結合
しうるものとして変性される。担体の性質は臨界的では
なく、種々の型のプラスチツクがアミノ化したゲルと同
様に使用されるものと考えられる。
前述のようにアミノ基への結合を使用してグルカンを表
面に共有結合させるための技術は固定化にとつて好まし
い方法である。例えばβ‐1,3-結合D-グルカンを適当な
酸、好ましくは強酸（例えばぎ酸）中で減成させついで
それをO-（2,2′‐ジメトキシエチル）基と置換させる
ために2-クロルアセトアルデヒドジメチルアセタールで
処理する。ついでこのように置換されたグルカンを酸で
処理してアルデヒド基を得、そのアルデヒド置換された
グルカンをシアノボロヒドリドの存在下でアミノ基含有
担体と接触させて担体との共有結合がもたらされる。別
の例ではエピクロロヒドリンでの活性化によりグルカン
中にエポキシ作用基が導入される。このエポキシ活性化
グルカンはアミノ基含有担体と接触するとこれらのアミ
ノ基がエポキシ基と反応してグルカンは担体に共有結合
される。結合技術に関する詳細は後記の具体的な実施例
から明らかである。
面に共有結合させるための技術は固定化にとつて好まし
い方法である。例えばβ‐1,3-結合D-グルカンを適当な
酸、好ましくは強酸（例えばぎ酸）中で減成させついで
それをO-（2,2′‐ジメトキシエチル）基と置換させる
ために2-クロルアセトアルデヒドジメチルアセタールで
処理する。ついでこのように置換されたグルカンを酸で
処理してアルデヒド基を得、そのアルデヒド置換された
グルカンをシアノボロヒドリドの存在下でアミノ基含有
担体と接触させて担体との共有結合がもたらされる。別
の例ではエピクロロヒドリンでの活性化によりグルカン
中にエポキシ作用基が導入される。このエポキシ活性化
グルカンはアミノ基含有担体と接触するとこれらのアミ
ノ基がエポキシ基と反応してグルカンは担体に共有結合
される。結合技術に関する詳細は後記の具体的な実施例
から明らかである。
本発明の適用に話を戻せば、本発明にしたがつて固定さ
れたβ‐1,3-結合D-グルカン類は細胞静止作用および抗
菌作用を示すことが見出された。固定化されたβ‐1,3-
結合D-グルカン類が大食細胞を活性化し、そのために細
胞静止作用をもたらすという事実はβ‐1,3-結合D-グル
カン類で被覆された組織培養プレート上での培養中に腫
瘍の細胞および大食細胞を使用することによる本発明開
示において示される。結果は後記実施例に提供されてい
る。
れたβ‐1,3-結合D-グルカン類は細胞静止作用および抗
菌作用を示すことが見出された。固定化されたβ‐1,3-
結合D-グルカン類が大食細胞を活性化し、そのために細
胞静止作用をもたらすという事実はβ‐1,3-結合D-グル
カン類で被覆された組織培養プレート上での培養中に腫
瘍の細胞および大食細胞を使用することによる本発明開
示において示される。結果は後記実施例に提供されてい
る。
固定されたβ‐1,3-結合D-グルカン類が抗菌活性を有す
ることはポリスチレン球に結合されたβ‐1,3-結合D-グ
ルカンが肺炎球菌または連鎖球菌で感染されたマウスに
おいて腹膜炎を予防するという事実による本発明開示に
示される。これに関する結果は対照群のすべての試験動
物が死んでしまつたのに対しグルカン被覆ポリスチレン
球で処置されたすべての動物が生き残つたことで明白で
ある。
ることはポリスチレン球に結合されたβ‐1,3-結合D-グ
ルカンが肺炎球菌または連鎖球菌で感染されたマウスに
おいて腹膜炎を予防するという事実による本発明開示に
示される。これに関する結果は対照群のすべての試験動
物が死んでしまつたのに対しグルカン被覆ポリスチレン
球で処置されたすべての動物が生き残つたことで明白で
ある。
また、本発明は活性成分としての本発明による固定化グ
ルカンを製薬的に許容しうる担体と組み合わせて含有す
る大食細胞刺激性組成物をも提供する。
ルカンを製薬的に許容しうる担体と組み合わせて含有す
る大食細胞刺激性組成物をも提供する。
本発明による活性な固定化グルカン類は常套手段でヒト
または家畜のための医薬用に調製されうる。組成物また
は製剤は投与経路および他の実際上の条件によつて固
体、半固体または液体でありうる製薬的に許容しうる担
体と組み合わせて活性成分を含有することができる。ま
た時には生物分解性担体（bio-degradable car-rier）
を使用することも適当でありうる。また、活性成分は担
体物質を添加せずにそのままで使用してもよい。これら
組成物は全く従来の製薬の方法に従つて製造される。
または家畜のための医薬用に調製されうる。組成物また
は製剤は投与経路および他の実際上の条件によつて固
体、半固体または液体でありうる製薬的に許容しうる担
体と組み合わせて活性成分を含有することができる。ま
た時には生物分解性担体（bio-degradable car-rier）
を使用することも適当でありうる。また、活性成分は担
体物質を添加せずにそのままで使用してもよい。これら
組成物は全く従来の製薬の方法に従つて製造される。
前述のように単核食細胞の機能は内側および外側からの
両影響における身体の防御にとつて非常に重要である。
本発明によつて例えば癌細胞の生長、感染等に対する身
体の防御系を一般的に活性化しうる能力を有する組成物
が入手されうるようになる。かかる適用はヒトを包含す
る哺乳類および魚類からなる相異なる種類の脊椎動物用
について考慮されうるものである。例えば抑制された条
件下で養殖されるサカナの病気の発現傾向を減少させる
ために、本発明による組成物は養殖が行なわれている水
中に直接あるいは飼料への添加物としてのいずれかでサ
カナの環境に供給するのが有利である。本発明は例えば
サケ、マスまたは類似種のような貴重な魚の養殖に関し
て特に有用である。
両影響における身体の防御にとつて非常に重要である。
本発明によつて例えば癌細胞の生長、感染等に対する身
体の防御系を一般的に活性化しうる能力を有する組成物
が入手されうるようになる。かかる適用はヒトを包含す
る哺乳類および魚類からなる相異なる種類の脊椎動物用
について考慮されうるものである。例えば抑制された条
件下で養殖されるサカナの病気の発現傾向を減少させる
ために、本発明による組成物は養殖が行なわれている水
中に直接あるいは飼料への添加物としてのいずれかでサ
カナの環境に供給するのが有利である。本発明は例えば
サケ、マスまたは類似種のような貴重な魚の養殖に関し
て特に有用である。
以下に本発明を具体例によりさらによく記載する。この
記載は添付図面に関連してなされているが、そこで 第１図はいくつかのプラスチツク表面に関する刺激指数
を柱状の形で示しており、 第２図は種々のプラスチツク表面上で生長した大食細胞
との共培養（co-cultivation）中におけるL-929細胞の
導入を示している。
記載は添付図面に関連してなされているが、そこで 第１図はいくつかのプラスチツク表面に関する刺激指数
を柱状の形で示しており、 第２図は種々のプラスチツク表面上で生長した大食細胞
との共培養（co-cultivation）中におけるL-929細胞の
導入を示している。
生物学的方法 大食細胞培養 ハイブリドC3D2（C3H/Tifx×DBA/2）マウスからの腹膜
細胞（７×105細胞／ウエル）をコスター組織培養プレ
ート（米国マサチユーセツツ州ケンブリツジにあるコス
ター社製品）中にある円形状ウエルのカバーガラス（直
径14mm）上に移した。２時間の培養後ウエルの底に付着
しなかつた細胞を洗い落とした。これらの細胞を、血清
を添加するかまたは添加しないで37℃で空気中５％v/vC
O2においてアール（Earle′ｓ）塩（DME）（スコツトラ
ンドのGibco Biocult社製）を有するイーグル培地（Eag
le′s medium）中で培養した。すべての培地はペニシリ
ン（100I.U./ml）およびストレプトマイシン（100μg/m
l）を含有した。
細胞（７×105細胞／ウエル）をコスター組織培養プレ
ート（米国マサチユーセツツ州ケンブリツジにあるコス
ター社製品）中にある円形状ウエルのカバーガラス（直
径14mm）上に移した。２時間の培養後ウエルの底に付着
しなかつた細胞を洗い落とした。これらの細胞を、血清
を添加するかまたは添加しないで37℃で空気中５％v/vC
O2においてアール（Earle′ｓ）塩（DME）（スコツトラ
ンドのGibco Biocult社製）を有するイーグル培地（Eag
le′s medium）中で培養した。すべての培地はペニシリ
ン（100I.U./ml）およびストレプトマイシン（100μg/m
l）を含有した。
走査電子顕微鏡（SEM） 大食細胞培養を0.1Mカコジル酸塩バツフアーpH7.3およ
び0.1Mスクロース中の2.5％グルタルアルデヒド（メル
ク社製）中において固定した。これらの細胞を増加する
濃度のエタノール中臨界点で脱水し（日立製CPI）二酸
化炭素中で乾燥させた。これらの剤をマウントし金（Po
laron SEMコーテイングユニツトE5000）で被覆しついで
20KVおよび15゜の傾斜角度で日立SEM（HHS 12R）を用い
て分析した。写真はコダツクトリ‐Ｘパン（TX P-120）
フイルムに撮られた。
び0.1Mスクロース中の2.5％グルタルアルデヒド（メル
ク社製）中において固定した。これらの細胞を増加する
濃度のエタノール中臨界点で脱水し（日立製CPI）二酸
化炭素中で乾燥させた。これらの剤をマウントし金（Po
laron SEMコーテイングユニツトE5000）で被覆しついで
20KVおよび15゜の傾斜角度で日立SEM（HHS 12R）を用い
て分析した。写真はコダツクトリ‐Ｘパン（TX P-120）
フイルムに撮られた。
動物 B16黒色腫を使用する実験では同系繁殖のC57BLマウスが
使用された。残りの研究では大食細胞はハイブリドC3D2
（C3H Tif×CBA/2）マウスから得られた。すべての動物
はデンマークのGI.Bomholtgrd社から得られた。
使用された。残りの研究では大食細胞はハイブリドC3D2
（C3H Tif×CBA/2）マウスから得られた。すべての動物
はデンマークのGI.Bomholtgrd社から得られた。
化学的方法 クルドランは大阪の和光純薬会社から、アミロースタイ
プIIIは米国セントルイスのシグマ社から、ラミナラン
は米国クリーブランドの米国生化学会社から、重合アミ
ノ化合物であるポリミンSN（Polymin SN、登録商標）お
よびポリミンＰ（Polymin P、登録商標）は西独のルド
ウイツヒシヤフエン（Ludwigshafen）社から得られた。
アミノ化ポリスチレン球はノールウエーのウグルシユタ
ツト（Uglestad）社からそしてアミノ化プレートはフア
ルコン（Falcon）社から得られた。その他の化学薬品は
西独ダルムシユタツトのメルク社から得られた。
プIIIは米国セントルイスのシグマ社から、ラミナラン
は米国クリーブランドの米国生化学会社から、重合アミ
ノ化合物であるポリミンSN（Polymin SN、登録商標）お
よびポリミンＰ（Polymin P、登録商標）は西独のルド
ウイツヒシヤフエン（Ludwigshafen）社から得られた。
アミノ化ポリスチレン球はノールウエーのウグルシユタ
ツト（Uglestad）社からそしてアミノ化プレートはフア
ルコン（Falcon）社から得られた。その他の化学薬品は
西独ダルムシユタツトのメルク社から得られた。
糖分析 適切な炭水化物（10mg）含有物質を110℃で12時間内標
準（ミオ‐イノシトール、1mg）と一緒にしてトリフル
オロ酢酸（0.5M、2ml）で処理し、中和し（BaCO3で）、
過しついで還元した（NaBH4、10mgで）。２時間後そ
のpHを酸イオン交換体（ダウエツクス50）使用により約
５に調整しそして試料を過しついでメタノールと共に
蒸発乾固させた。この試料を100℃で15分間無水酢酸（1
ml）およびピリジン（1ml）を使用してアセチル化し
た。この試料を蒸発乾固させついでガスクロマトグラフ
イーにより分析した。
準（ミオ‐イノシトール、1mg）と一緒にしてトリフル
オロ酢酸（0.5M、2ml）で処理し、中和し（BaCO3で）、
過しついで還元した（NaBH4、10mgで）。２時間後そ
のpHを酸イオン交換体（ダウエツクス50）使用により約
５に調整しそして試料を過しついでメタノールと共に
蒸発乾固させた。この試料を100℃で15分間無水酢酸（1
ml）およびピリジン（1ml）を使用してアセチル化し
た。この試料を蒸発乾固させついでガスクロマトグラフ
イーにより分析した。
実施例 １ アルデヒド作用基の導入によるグルカン類の調製 非水溶性β‐1,3-結合D-グルカンであるクルドランを
「Carbohydr.Res.」29（1973）397に記載のケイ．オガ
ワ、アイ．ツルギおよびテイー．ナタナベによる「The
dependence of the conformation of a（１→３）‐β
‐D-glucan on chain length in alkaline solution」
の方法にしたがつてぎ酸（90％水溶液）中で90℃におい
て20分間減成させた。ついでこの部分的に減成されたク
ルドランを水溶性フラクシヨンおよび非水溶性フラクシ
ヨンに分離した。この水溶性フラクシヨンは水溶液中で
水素化硼素ナトリウム（10mg/g）を使用して還元し、透
析しついで凍結乾燥させた。
「Carbohydr.Res.」29（1973）397に記載のケイ．オガ
ワ、アイ．ツルギおよびテイー．ナタナベによる「The
dependence of the conformation of a（１→３）‐β
‐D-glucan on chain length in alkaline solution」
の方法にしたがつてぎ酸（90％水溶液）中で90℃におい
て20分間減成させた。ついでこの部分的に減成されたク
ルドランを水溶性フラクシヨンおよび非水溶性フラクシ
ヨンに分離した。この水溶性フラクシヨンは水溶液中で
水素化硼素ナトリウム（10mg/g）を使用して還元し、透
析しついで凍結乾燥させた。
上記水溶性クルドランフラクシヨン、ラミナラン（水溶
性β‐1,3-結合D-グルカン）、アミロース（水溶性α‐
1,4-結合D-グルカン）を「J.Bio.Chem.」（東京）55（1
964）205に記載のエス・ハコモリによる「A rapid perm
ethylation of glucolipid and polysac-charide catal
yzed by methylsulfinyl car-banion in dimethyl sulf
oxide」にしたがつてアルキル化した。その多糖（0.5
g）を窒素ガス下、血清瓶中の乾燥ジメチルスルホキシ
ド（20ml）中に溶解した。注射器を使用してこれに2Mの
ナトリウムメチルスルフイニルメタニド（8ml）を加え
た。50℃で30分間超音浴中で振盪後この反応混合物を一
夜室温に放置した。注射器を使用して2-クロルアセトア
ルデヒドジメチルアセタール（5ml）を徐々に加えた。
超音浴中において50℃で60分間乾振盪後その反応混合物
を水中に注ぎそして蒸留水に対して透析した。これを凍
結乾燥させてO-（2,21-ジメトキシエチル）基で置換さ
れた約0.45gのグルカンを得た。置換度は1H-n.m.r.によ
り測定された。この第１段階の反応は以下に説明される
通りである。
性β‐1,3-結合D-グルカン）、アミロース（水溶性α‐
1,4-結合D-グルカン）を「J.Bio.Chem.」（東京）55（1
964）205に記載のエス・ハコモリによる「A rapid perm
ethylation of glucolipid and polysac-charide catal
yzed by methylsulfinyl car-banion in dimethyl sulf
oxide」にしたがつてアルキル化した。その多糖（0.5
g）を窒素ガス下、血清瓶中の乾燥ジメチルスルホキシ
ド（20ml）中に溶解した。注射器を使用してこれに2Mの
ナトリウムメチルスルフイニルメタニド（8ml）を加え
た。50℃で30分間超音浴中で振盪後この反応混合物を一
夜室温に放置した。注射器を使用して2-クロルアセトア
ルデヒドジメチルアセタール（5ml）を徐々に加えた。
超音浴中において50℃で60分間乾振盪後その反応混合物
を水中に注ぎそして蒸留水に対して透析した。これを凍
結乾燥させてO-（2,21-ジメトキシエチル）基で置換さ
れた約0.45gのグルカンを得た。置換度は1H-n.m.r.によ
り測定された。この第１段階の反応は以下に説明される
通りである。
アミロース、部分的に減成されたクルドランおよびラミ
ナランは各単量体グルコース実体当たりそれぞれ平均し
て0.7、0.5および0.4のO-（2,21-ジメトキシエチル）基
を有した。H-n.m.r.スペクトルはJeol FX 90 Q n.m.r.
器を用いて85℃においてD2O中、90MHzで測定された。
ナランは各単量体グルコース実体当たりそれぞれ平均し
て0.7、0.5および0.4のO-（2,21-ジメトキシエチル）基
を有した。H-n.m.r.スペクトルはJeol FX 90 Q n.m.r.
器を用いて85℃においてD2O中、90MHzで測定された。
前記のO-（2,21-ジメトキシエチル）置換されたグルカ
ン（0.4g）を100℃で20分間塩酸（25ml、0.05M）で処理
し、中和し（0.5M NaOHで）、蒸留水に対して透析しつ
いで凍結乾燥させた。アルデヒド基で置換された多糖0.
35gが得られた。第２段階の反応は以下のように説明さ
れうる。
ン（0.4g）を100℃で20分間塩酸（25ml、0.05M）で処理
し、中和し（0.5M NaOHで）、蒸留水に対して透析しつ
いで凍結乾燥させた。アルデヒド基で置換された多糖0.
35gが得られた。第２段階の反応は以下のように説明さ
れうる。
実施例 ２ エポキシ作用基の導入によるグルカン類の調製 ラミナラン（5g）を60ml蒸留水中に溶解した。これにエ
ピクロロヒドリン（10ml）、2M水酸化ナトリウム水溶液
（30ml）および水素化硼素ナトリウム（200mg）を加え
た。この混合物を一夜室温で撹拌しながら放置し、酢酸
（10％、１）および蒸留水（５）に対して透析し、
蒸発させて容量を少なくし（50ml）ついで凍結乾燥させ
た。エポキシ活性化ラミナランの収量は4.5gであつた。
この反応は以下に説明の通りである。
ピクロロヒドリン（10ml）、2M水酸化ナトリウム水溶液
（30ml）および水素化硼素ナトリウム（200mg）を加え
た。この混合物を一夜室温で撹拌しながら放置し、酢酸
（10％、１）および蒸留水（５）に対して透析し、
蒸発させて容量を少なくし（50ml）ついで凍結乾燥させ
た。エポキシ活性化ラミナランの収量は4.5gであつた。
この反応は以下に説明の通りである。
実施例 ３ アミロースの過沃素酸塩酸化 アミロースは以下のように過沃素酸塩（NaIO4）により
酸化される線状のα‐1,4-結合D-グルカンである。アミ
ロース（16.2g）を水（200ml）中に溶解しついで水（50
ml）中のNaIO4（2.0g）の溶液を加える。こうして得ら
れた溶液を撹拌しながら一夜、放置する。その物質を透
析しついで凍結乾燥させる。収量14.5g。
酸化される線状のα‐1,4-結合D-グルカンである。アミ
ロース（16.2g）を水（200ml）中に溶解しついで水（50
ml）中のNaIO4（2.0g）の溶液を加える。こうして得ら
れた溶液を撹拌しながら一夜、放置する。その物質を透
析しついで凍結乾燥させる。収量14.5g。
この反応は以下の通りである。
実施例 ４ アミロースのスルフアチド化 アミロース（0.5g）をジメチルスルホキシド（4ml）中
に溶解する。三酸化硫黄‐ピリジン錯体（3g）を加え、
その混合物を40℃で60分間撹拌する。砕氷（10g）およ
び水（5ml）を加える。ついでこの混合物を水酸化ナト
リウム（2M）を使用して中和し、pH7にする。生成物を
エタノール中で沈殿させ、透析しついで凍結乾燥させ
る。収量0.4g。
に溶解する。三酸化硫黄‐ピリジン錯体（3g）を加え、
その混合物を40℃で60分間撹拌する。砕氷（10g）およ
び水（5ml）を加える。ついでこの混合物を水酸化ナト
リウム（2M）を使用して中和し、pH7にする。生成物を
エタノール中で沈殿させ、透析しついで凍結乾燥させ
る。収量0.4g。
実施例 ５ プラスチツク表面の調製 ポリミンSN（Polymin SN、登録商標）（0.005％、w/w）
および実施例３のようにして製造された過沃素酸塩酸化
されたアミロース（0.5％、w/w）の水溶液をpH9に調整
し（1M NaOHで）ついでこれを組織培養用プレート中の
各ウエルに加える。それらのウエルを蒸留水で洗浄し、
これに実施例４で製造されたアミロース硫酸塩水溶液
（0.02％、w/w、pH3）を50℃において加える。５分後そ
れらのウエルを水洗する。この操作を２回繰り返し、ア
ミロース硫酸塩の最終添加後にpH3においてポリミンSN
の0.01％水溶液を加える。５分後それらのウエルを蒸留
水で洗浄する。
および実施例３のようにして製造された過沃素酸塩酸化
されたアミロース（0.5％、w/w）の水溶液をpH9に調整
し（1M NaOHで）ついでこれを組織培養用プレート中の
各ウエルに加える。それらのウエルを蒸留水で洗浄し、
これに実施例４で製造されたアミロース硫酸塩水溶液
（0.02％、w/w、pH3）を50℃において加える。５分後そ
れらのウエルを水洗する。この操作を２回繰り返し、ア
ミロース硫酸塩の最終添加後にpH3においてポリミンSN
の0.01％水溶液を加える。５分後それらのウエルを蒸留
水で洗浄する。
実施例 ６ 実施例５により調製された組織培養用プレートへの、実
施例１によるアルデヒドグルカンの結合 実施例１により製造されたアルデヒド基置換グルカン
（4mg）を2mlのりん酸塩バツフアー（pH7.0、0.2M）中
に溶解する。実施例５による組織培養用プレートの各ウ
エルに前記グルカン溶液（0.1ml、0.1M）、りん酸塩バ
ツフアー（2.6ml、pH7.0）およびナトリウムシアノボロ
ヒドリド（100μｇ）を加える。それらのプレートを一
夜、室温に放置し、蒸留水で洗浄しついで室温で乾燥さ
せる。糖分析は0.01mgのグルカンが各ウエルに結合され
ていることを示した。結合順序は以下のように式で示さ
れる。
施例１によるアルデヒドグルカンの結合 実施例１により製造されたアルデヒド基置換グルカン
（4mg）を2mlのりん酸塩バツフアー（pH7.0、0.2M）中
に溶解する。実施例５による組織培養用プレートの各ウ
エルに前記グルカン溶液（0.1ml、0.1M）、りん酸塩バ
ツフアー（2.6ml、pH7.0）およびナトリウムシアノボロ
ヒドリド（100μｇ）を加える。それらのプレートを一
夜、室温に放置し、蒸留水で洗浄しついで室温で乾燥さ
せる。糖分析は0.01mgのグルカンが各ウエルに結合され
ていることを示した。結合順序は以下のように式で示さ
れる。
実施例 ７ アミノ化ポリスチレンプレートへの、実施例１によるア
ルデヒドグルカンの結合 実施例１にしたがつてアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（4mg）を実施例６による組織培養用の商業的に入手
しうるアミノ化ポリスチレンプレート（フアルコン（Fa
lcon）（登録商標）3847 PRIMARIA CULTURE PLATES）の
ウエルに結合させる。糖分析は約0.005mgのグルカンが
各ウエルに結合されたことを示した。
ルデヒドグルカンの結合 実施例１にしたがつてアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（4mg）を実施例６による組織培養用の商業的に入手
しうるアミノ化ポリスチレンプレート（フアルコン（Fa
lcon）（登録商標）3847 PRIMARIA CULTURE PLATES）の
ウエルに結合させる。糖分析は約0.005mgのグルカンが
各ウエルに結合されたことを示した。
実施例 ８ アミノ化したポリメタクリレート球への、実施例１によ
るアルデヒドグルカンの結合 実施例１にしたがつてアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（4mg）を25mlりん酸塩バツフアー（pH7.0、0.2M）中
に溶解する。この溶液に、「Adv.Colloid Interface Sc
i.」13（1980）101に記載のJ.Uglestad氏、P.C.Mrk
氏、K.M.Kaggerud氏、T.Ellingsen氏およびA.Berge氏に
よる「SWELLING OF OLIGOMER-POLYMER PARTICLES」、
「NEW METHODS OF PREPARATION OF EMULSIONS AND POLY
MER DISPERSIONS」の方法による、2,3-エポキシプロピ
ルメタクリレートとエチレングリコールメタクリレート
との共重合により製造された2.4μｍの直径を有するア
ミノ化プラスチツク球（0.2g）を加える。さらにナトリ
ウムシアノボロヒドリド（0.005g）を加える。この反応
混合物を一夜室温で振盪し、ガラスフイルター上に過
しついで蒸留水で繰り返し洗浄する。それらの球を室温
で風乾させる。
るアルデヒドグルカンの結合 実施例１にしたがつてアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（4mg）を25mlりん酸塩バツフアー（pH7.0、0.2M）中
に溶解する。この溶液に、「Adv.Colloid Interface Sc
i.」13（1980）101に記載のJ.Uglestad氏、P.C.Mrk
氏、K.M.Kaggerud氏、T.Ellingsen氏およびA.Berge氏に
よる「SWELLING OF OLIGOMER-POLYMER PARTICLES」、
「NEW METHODS OF PREPARATION OF EMULSIONS AND POLY
MER DISPERSIONS」の方法による、2,3-エポキシプロピ
ルメタクリレートとエチレングリコールメタクリレート
との共重合により製造された2.4μｍの直径を有するア
ミノ化プラスチツク球（0.2g）を加える。さらにナトリ
ウムシアノボロヒドリド（0.005g）を加える。この反応
混合物を一夜室温で振盪し、ガラスフイルター上に過
しついで蒸留水で繰り返し洗浄する。それらの球を室温
で風乾させる。
実施例 ９ 実施例５によるプラスチツク表面への、実施例２による
エポキシグルカンの結合 実施例２により製造されたエポキシ活性化ラミナランの
１％溶液をりん酸塩バツフアー（0.2M、pH7.0）中に溶
解しついでこれを実施例５により調製された組織培養用
プレートの各ウエルに加えた。これらのプレートを一夜
室温に放置し、蒸留水で洗浄しついで室温で乾燥させ
た。糖分析は0.005mgのグルカンが各ウエルに結合され
ていることを示した。この結合のための反応は以下に式
で説明される。
エポキシグルカンの結合 実施例２により製造されたエポキシ活性化ラミナランの
１％溶液をりん酸塩バツフアー（0.2M、pH7.0）中に溶
解しついでこれを実施例５により調製された組織培養用
プレートの各ウエルに加えた。これらのプレートを一夜
室温に放置し、蒸留水で洗浄しついで室温で乾燥させ
た。糖分析は0.005mgのグルカンが各ウエルに結合され
ていることを示した。この結合のための反応は以下に式
で説明される。
実施例 10 実施例の６、７および９による固定化グルカンで被覆さ
れた表面を有する大食細胞の刺激 固定されたβ‐1,3-結合D-グルカンの添加されたないし
は添加されていない組織培養プレートのウエルにある大
食細胞培養に14CラベルされたD-グルコースアミンを加
える。大食細胞中の糖蛋白質におけるD-グルコースアミ
ンの増加した混入が大食細胞のための活性化因子であ
る。24時間後これらの細胞を５％トリクロロ酢酸中に溶
解しそして混入されなかつた放射性D-グルコースアミン
を洗浄して除く。これらの洗浄された細胞を水酸化ナト
リウム（1M）中に溶解する。すべての細胞物質が溶解さ
れたらその溶液をメスキユベツトに移しついで放射能を
シンチレーシヨンカウンター中で測定する。活性化度は
以下の式に商によつて表される。
れた表面を有する大食細胞の刺激 固定されたβ‐1,3-結合D-グルカンの添加されたないし
は添加されていない組織培養プレートのウエルにある大
食細胞培養に14CラベルされたD-グルコースアミンを加
える。大食細胞中の糖蛋白質におけるD-グルコースアミ
ンの増加した混入が大食細胞のための活性化因子であ
る。24時間後これらの細胞を５％トリクロロ酢酸中に溶
解しそして混入されなかつた放射性D-グルコースアミン
を洗浄して除く。これらの洗浄された細胞を水酸化ナト
リウム（1M）中に溶解する。すべての細胞物質が溶解さ
れたらその溶液をメスキユベツトに移しついで放射能を
シンチレーシヨンカウンター中で測定する。活性化度は
以下の式に商によつて表される。
最良の結果は実施例６により活性化されたプレートから
得られる。これらの結果は後記で説明される第１図に示
されている。
得られる。これらの結果は後記で説明される第１図に示
されている。
実施例 11 β‐1,3-結合D-グルカン類で被覆された組織培養用プレ
ート上で活性化された大食細胞の細胞静止作用効果 的状赤血球（２×104細胞／ウエル）をトリプシンで処
理しついでそれらを実施例の６、７および９によるグル
カン被覆されたプラスチツク表面の存在下で大食細胞培
養に加えた。相異なる時間の経過後これらの培養に0.5
μCi/mlの放射性チミジン（メチル‐3H、西独のドライ
アイヒにあるNew England Nuclear社製）を加えた。24
時間の培養後に混入を測定した。培養菌を収穫後その高
分子物質を1M過塩素酸で沈殿させ、完全に洗浄しついで
1M水酸化ナトリウム溶液中に溶解した。この溶解された
物質をメスセルに移しそしてシンチレーシヨンカウンタ
ー（スイスのチユーリツヒにあるPackard Instruments,
International社の製品）中で分析した。最良の結果は
実施例６により調製されたプレートから得られた。その
他のものは許容しうる結果を与えた。これらの結果は後
記で説明される第２図に示されている。
ート上で活性化された大食細胞の細胞静止作用効果 的状赤血球（２×104細胞／ウエル）をトリプシンで処
理しついでそれらを実施例の６、７および９によるグル
カン被覆されたプラスチツク表面の存在下で大食細胞培
養に加えた。相異なる時間の経過後これらの培養に0.5
μCi/mlの放射性チミジン（メチル‐3H、西独のドライ
アイヒにあるNew England Nuclear社製）を加えた。24
時間の培養後に混入を測定した。培養菌を収穫後その高
分子物質を1M過塩素酸で沈殿させ、完全に洗浄しついで
1M水酸化ナトリウム溶液中に溶解した。この溶解された
物質をメスセルに移しそしてシンチレーシヨンカウンタ
ー（スイスのチユーリツヒにあるPackard Instruments,
International社の製品）中で分析した。最良の結果は
実施例６により調製されたプレートから得られた。その
他のものは許容しうる結果を与えた。これらの結果は後
記で説明される第２図に示されている。
実施例 12 抗菌効果に関する実験 生体内における抗菌効果を調査するために、実施例８に
よるβ‐1,3結合グルカン被覆のポリメタクリレート球
または塩水のいずれかで前処理されたマウスに106ウイ
ルス性肺炎球菌を腹腔内注射した。塩水グループ（４匹
の動物からなる）においてすべてのマウスは24時間後に
病気になりそして48時間後に死んだのに対してグルカン
処置グループ（８匹の動物からなる）ではどの動物もい
ずれか目に見える病気の症状を全く示さなかつたし、し
かも１週間後に死ななかつた。
よるβ‐1,3結合グルカン被覆のポリメタクリレート球
または塩水のいずれかで前処理されたマウスに106ウイ
ルス性肺炎球菌を腹腔内注射した。塩水グループ（４匹
の動物からなる）においてすべてのマウスは24時間後に
病気になりそして48時間後に死んだのに対してグルカン
処置グループ（８匹の動物からなる）ではどの動物もい
ずれか目に見える病気の症状を全く示さなかつたし、し
かも１週間後に死ななかつた。
ウイルス性連鎖球菌ビリダンス（Viridans）を注射し、
β‐1,3-結合D-グルカン類で処理されたポリメタクリレ
ート球を用いてこの実験を繰り返したが、それらの動物
は全く病気の兆候を示さなかつた。実験は３回繰り返さ
れたが、結果は同じであつた。
β‐1,3-結合D-グルカン類で処理されたポリメタクリレ
ート球を用いてこの実験を繰り返したが、それらの動物
は全く病気の兆候を示さなかつた。実験は３回繰り返さ
れたが、結果は同じであつた。
大食細胞の刺激度は14C-グルコースアミンの導入による
形態学（SEM）およびL-929型の的状赤血球における細胞
静止効果により決定された。
形態学（SEM）およびL-929型の的状赤血球における細胞
静止効果により決定された。
アミノ化プラスチツク（実施例５によるミクロタイター
プレート）または固定化アミロースを有するプラスチツ
ク上で生長した大食細胞は未処理プラスチツク上で生長
した細胞よりもいく分か多い14C-グルコースアミンを混
入した。しかしながら、大食細胞が、固定されたラミナ
ランまたはグルドランを含有する表面上で生長した場合
には10倍の14C-グルコースアミンの混入増加が得られ
た。このことは調製されたプラスチツクのミクロタイタ
ープレート上で48時間培養された大食細胞中における放
射性14C-グルコースアミンの導入を示す添付第１図から
明らかである。第１図における刺激指数は刺激された大
食細胞中における導入（cpm）を通常の刺激されなかつ
た大食細胞における導入で割つた値に関するものであ
る。
プレート）または固定化アミロースを有するプラスチツ
ク上で生長した大食細胞は未処理プラスチツク上で生長
した細胞よりもいく分か多い14C-グルコースアミンを混
入した。しかしながら、大食細胞が、固定されたラミナ
ランまたはグルドランを含有する表面上で生長した場合
には10倍の14C-グルコースアミンの混入増加が得られ
た。このことは調製されたプラスチツクのミクロタイタ
ープレート上で48時間培養された大食細胞中における放
射性14C-グルコースアミンの導入を示す添付第１図から
明らかである。第１図における刺激指数は刺激された大
食細胞中における導入（cpm）を通常の刺激されなかつ
た大食細胞における導入で割つた値に関するものであ
る。
第１図において柱１はアミノ化プラスチツクに関し、柱
２は固定化アミロースを有するプラスチツクに関するも
のであるが、柱の３および４は実施例５にしたがつてグ
ルカンの結合がなされている、それぞれ固定化クルドラ
ンおよび固定化ラミナランを有するプラスチツクに関す
るものである。図に表された結果は平均±標準偏差に関
するものである。
２は固定化アミロースを有するプラスチツクに関するも
のであるが、柱の３および４は実施例５にしたがつてグ
ルカンの結合がなされている、それぞれ固定化クルドラ
ンおよび固定化ラミナランを有するプラスチツクに関す
るものである。図に表された結果は平均±標準偏差に関
するものである。
第１図から明らかなように、本発明技術を使用すること
は実質的に大食細胞の刺激を増加させることになる。
は実質的に大食細胞の刺激を増加させることになる。
大食細胞の細胞静止効果は共培養（co-cultivation）に
関するL-929-細胞中の放射性3H-チミジンの導入を測定
することにより研究された。刺激されていない大食細胞
はL-929-細胞上に一定の細胞静止効果を有しそして単な
るL-929-細胞だけの代表的な実験培養では約55000cpmが
混入された。刺激されていない大食細胞の存在下におけ
るL-929-細胞の相当する培養では約15000cpmが混入され
た。アミノ化プラスチツク上での大食細胞と一緒の共培
養（co-cultivation）における第２図中の100％のL-929
-細胞は前記の規定されていない大食細胞を使用しての
共培養におけるL-929-細胞よりも約50％少ない3H-チミ
ジンを混入した。これは添付第２図に説明されており、
そこでは放射性チミジンの導入が大食細胞と一緒のL-92
9-細胞の多数の培養について示されている。柱１は未調
製プラスチツクのプレート中での培養、柱２はアミノ化
プラスチツクのプレート中で実施された相当する培養を
示しているのに対して柱の３、４および５はそれぞれ固
定化されたアミロース、クルドランおよびラミナランを
有するプラスチツクのプレート中で実施された培養を示
している。本発明による技術の適用が大食細胞により提
供される刺激によつて顕著な生長阻害効果をもたらすこ
とは明らかである。
関するL-929-細胞中の放射性3H-チミジンの導入を測定
することにより研究された。刺激されていない大食細胞
はL-929-細胞上に一定の細胞静止効果を有しそして単な
るL-929-細胞だけの代表的な実験培養では約55000cpmが
混入された。刺激されていない大食細胞の存在下におけ
るL-929-細胞の相当する培養では約15000cpmが混入され
た。アミノ化プラスチツク上での大食細胞と一緒の共培
養（co-cultivation）における第２図中の100％のL-929
-細胞は前記の規定されていない大食細胞を使用しての
共培養におけるL-929-細胞よりも約50％少ない3H-チミ
ジンを混入した。これは添付第２図に説明されており、
そこでは放射性チミジンの導入が大食細胞と一緒のL-92
9-細胞の多数の培養について示されている。柱１は未調
製プラスチツクのプレート中での培養、柱２はアミノ化
プラスチツクのプレート中で実施された相当する培養を
示しているのに対して柱の３、４および５はそれぞれ固
定化されたアミロース、クルドランおよびラミナランを
有するプラスチツクのプレート中で実施された培養を示
している。本発明による技術の適用が大食細胞により提
供される刺激によつて顕著な生長阻害効果をもたらすこ
とは明らかである。
第１図は大食細胞に対する刺激指数をアミノ化プラスチ
ツク、固定化アミロースおよび実施例５に従つてグルカ
ンの結合がなされたものについて測定した結果を柱状グ
ラフで示すものであり、第２図は放射性チミジンを導入
して大食細胞と一緒にL-929細胞を培養した場合につい
ての未調製プラスチツクプレート中での培養、アミノ化
プラスチツクプレート中での培養、および固定化された
アミロースクルドランおよびラミナランを有するプラス
チツクプレート中での培養結果を示すものである。
ツク、固定化アミロースおよび実施例５に従つてグルカ
ンの結合がなされたものについて測定した結果を柱状グ
ラフで示すものであり、第２図は放射性チミジンを導入
して大食細胞と一緒にL-929細胞を培養した場合につい
ての未調製プラスチツクプレート中での培養、アミノ化
プラスチツクプレート中での培養、および固定化された
アミロースクルドランおよびラミナランを有するプラス
チツクプレート中での培養結果を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 999999999 ヤール・ボエーグヴアルド ノルウエー国エン―9000トロムシヨー．ル ンドヴアネツト 118 (72)発明者 カール・オロヴ・ペーテル・ラルム スウエーデン国エス―161 39 ブロンマ. ニユー エングスヴエイエン86 (72)発明者 ヤメス・ホフマン スウエーデン国エス―115 35 ストツク ホルム．リンドヨガタン 28 (72)発明者 ロルフ・セイエリード ノルウエー国エン―9001 トロムシヨー. ボルグトンヴエイエン ３ (72)発明者 ヤール・ボエーグヴアルド ノルウエー国エン―9000トロムシヨー．ル ンドヴアネツト 118 (56)参考文献 特開 昭58−40301（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−115727（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】水溶性であるがそれ自体は大食細胞刺激作
用を有しないβ−1,3−結合グルカンおよびそのグルカ
ンが固定されている非水溶性担体を含有する大食細胞刺
激組成物。 - 【請求項２】グルカンがラミナラン（laminaran）、ク
ルドラン（curdlan）、パヒマン（pachyman）、酵母グ
ルカン（yeast glucan）およびリケナン（lichenan）か
らなる群より選択される特許請求の範囲第１項記載の組
成物。 - 【請求項３】グルカンがクルドランまたはラミナランで
ある特許請求の範囲第１項または第２項に記載の組成
物。 - 【請求項４】単核食細胞を活性化させるのに使用するた
めの特許請求の範囲第１項記載の組成物。 - 【請求項５】癌細胞の生長を抑制するのに使用するため
の特許請求の範囲第１〜３項の各項に記載の組成物。 - 【請求項６】その際にグルカンが担体に共有結合されて
いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成
物。 - 【請求項７】その際に担体がグルカンの結合されるアミ
ノ基を含有することを特徴とする特許請求の範囲第５項
記載の組成物。 - 【請求項８】特にヒトおよび商業的に利用性のある動物
をはじめとする動物の身体防御を改善するのに使用する
ための特許請求の範囲第１項記載の組成物。 - 【請求項９】その際に担体がプラスチック、アミノ化ゲ
ルまたは蛋白質からなることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の組成物。 - 【請求項１０】不溶性β−1,3−結合グルカンを酸中で
減成させて溶解しついでそれをＯ−（2,2′−ジメトキ
シエチル）基と置換させるために２−クロルアセトアル
デヒドジメチルアセタールで処理しそして置換されたグ
ルカンを酸で処理してアルデヒド置換を得、ついでその
アルデヒド置換されたグルカンをジアノボロヒドリドの
存在下でアミノ基含有担体と接触させて担体との共有結
合を生成させることを特徴とする、水溶性であるがそれ
自体は大食細胞刺激作用を有しないβ−1,3−結合グル
カンおよびそのグルカンが固定されている非水溶性担体
を含有する大食細胞刺激組成物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8404699A SE466289B (sv) | 1984-09-19 | 1984-09-19 | Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning |
| SE8404699-4 | 1984-09-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61118320A JPS61118320A (ja) | 1986-06-05 |
| JPH072643B2 true JPH072643B2 (ja) | 1995-01-18 |
Family
ID=20357069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205498A Expired - Lifetime JPH072643B2 (ja) | 1984-09-19 | 1985-09-19 | 大食細胞活性化組成物およびその製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
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