JPH07267993A - 新規なタンパク質ｓｈｂｐ−１０ - Google Patents
新規なタンパク質ｓｈｂｐ−１０Info
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- JPH07267993A JPH07267993A JP6061904A JP6190494A JPH07267993A JP H07267993 A JPH07267993 A JP H07267993A JP 6061904 A JP6061904 A JP 6061904A JP 6190494 A JP6190494 A JP 6190494A JP H07267993 A JPH07267993 A JP H07267993A
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- JP
- Japan
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- shbp
- protein
- amino acid
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトを含む哺乳動物の胎児および新生児の血
液から得られる、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分析で約８〜１２ＫＤａの分子量を有する、ＳＨＢＰ−
１０と名付けられた創傷治療活性を有するタンパク質。 【効果】 本発明により提供される新規なタンパク質は
線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創傷治療剤とし
て有用である。
液から得られる、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分析で約８〜１２ＫＤａの分子量を有する、ＳＨＢＰ−
１０と名付けられた創傷治療活性を有するタンパク質。 【効果】 本発明により提供される新規なタンパク質は
線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創傷治療剤とし
て有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なタンパク質、さ
らに詳しくは、ヘパリン結合性を有しかつ線維芽細胞増
殖作用を有するタンパク質に関する。本発明のタンパク
質はＳＨＢＰ−１０ (Serum Heparin Binding Protein-
10)と名付けられたものであり、ヒトを含む哺乳動物の
胎児及び新生児の血液より得ることができる。
らに詳しくは、ヘパリン結合性を有しかつ線維芽細胞増
殖作用を有するタンパク質に関する。本発明のタンパク
質はＳＨＢＰ−１０ (Serum Heparin Binding Protein-
10)と名付けられたものであり、ヒトを含む哺乳動物の
胎児及び新生児の血液より得ることができる。
【０００２】
【従来の技術】創傷治療の過程において種々の成長因子
が関与していることが知られている（Dijke et al., Bi
otechnology, vol.7, p793-798, 1989)。特に、ＴＧＦ
−β (transforming growth factor-β）やＰＤＧＦ (p
latelet-derived growth factor）は、線維芽細胞を増
殖させ、障害部位へ細胞を誘引し、創傷の修復を促進す
ることが知られている。しかし、本発明物質が線維芽細
胞を増殖させたり、創傷治療に効果があるという報告は
これまでなされていなかった。
が関与していることが知られている（Dijke et al., Bi
otechnology, vol.7, p793-798, 1989)。特に、ＴＧＦ
−β (transforming growth factor-β）やＰＤＧＦ (p
latelet-derived growth factor）は、線維芽細胞を増
殖させ、障害部位へ細胞を誘引し、創傷の修復を促進す
ることが知られている。しかし、本発明物質が線維芽細
胞を増殖させたり、創傷治療に効果があるという報告は
これまでなされていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は創傷治療に対して効果のある新たな治療薬として
用いることのできるタンパク質を提供することである。
課題は創傷治療に対して効果のある新たな治療薬として
用いることのできるタンパク質を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ヒトを含む哺乳類動物の
胎児及び新生児の血液中には、成長の激しい胎児及び新
生児の各細胞組織の成長を刺激する種々の成長因子が含
有されることが考えられる。量的に入手しやすいウシ新
生児血清を出発原料として、新たな線維芽細胞増殖活性
を有する蛋白因子の精製分離を試みた。線維芽細胞増殖
活性測定のためには、例えば、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株
が使用できる。
胎児及び新生児の血液中には、成長の激しい胎児及び新
生児の各細胞組織の成長を刺激する種々の成長因子が含
有されることが考えられる。量的に入手しやすいウシ新
生児血清を出発原料として、新たな線維芽細胞増殖活性
を有する蛋白因子の精製分離を試みた。線維芽細胞増殖
活性測定のためには、例えば、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞株
が使用できる。
【０００５】種々の成長因子は、ヘパリンに結合しやす
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
イカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフィにより、さら
に細かい画分に分けることができる。これらの各画分に
ついて、線維芽細胞増殖活性を測定した。こうして、得
られた活性画分のひとつについて、Ｎ末端のアミノ酸配
列及びアミノ酸組成を決定し、タンパク質及び遺伝子配
列データーベースと参照して、公知のタンパク質である
かどうか調べた結果、新規なタンパク質であることを知
った。
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
イカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフィにより、さら
に細かい画分に分けることができる。これらの各画分に
ついて、線維芽細胞増殖活性を測定した。こうして、得
られた活性画分のひとつについて、Ｎ末端のアミノ酸配
列及びアミノ酸組成を決定し、タンパク質及び遺伝子配
列データーベースと参照して、公知のタンパク質である
かどうか調べた結果、新規なタンパク質であることを知
った。
【０００６】本タンパク質はＳＨＢＰ−１０と名付けら
れた。本発明により提供されるＳＨＢＰ−１０は、下記
の物理的性質及びＮ末端アミノ酸配列を有する、動物の
血液より単離された新規なタンパク質である。 (１) 分子量：約８〜１２ＫＤａ（還元条件下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ法による） (２) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表配列番号１に示すア
ミノ酸配列 (３) 性質：ヘパリン結合性でありかつ線維芽細胞増殖
作用を有する。 ＳＨＢＰ−１０は、線維芽細胞増殖作用を失わせずに、
若干のアミノ酸残基の変更や化学修飾を加えたり、ある
いは、フラグメント化を行なうことにより、更に製剤に
適したタンパク質となることが期待できる。
れた。本発明により提供されるＳＨＢＰ−１０は、下記
の物理的性質及びＮ末端アミノ酸配列を有する、動物の
血液より単離された新規なタンパク質である。 (１) 分子量：約８〜１２ＫＤａ（還元条件下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ法による） (２) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表配列番号１に示すア
ミノ酸配列 (３) 性質：ヘパリン結合性でありかつ線維芽細胞増殖
作用を有する。 ＳＨＢＰ−１０は、線維芽細胞増殖作用を失わせずに、
若干のアミノ酸残基の変更や化学修飾を加えたり、ある
いは、フラグメント化を行なうことにより、更に製剤に
適したタンパク質となることが期待できる。
【０００７】ＳＨＢＰ−１０は、水溶性が高く、創傷治
療には適当な水溶性基剤と混合して局所的に直接患部に
塗布する投与法が最もふさわしいが、その他にも全身性
投与として、静脈内注射剤又は皮下投与剤として投与す
ることができ、また、微粒子のエアロゾル製剤として、
経鼻又は経肺的に投与することができる。投与量は、局
所投与では１〜１００μg／投与部位／人／日、また全
身性投与では０.１〜１０mg／kg／日を投与する。以下
に実施例により、本発明を更に詳しく説明するが本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。
療には適当な水溶性基剤と混合して局所的に直接患部に
塗布する投与法が最もふさわしいが、その他にも全身性
投与として、静脈内注射剤又は皮下投与剤として投与す
ることができ、また、微粒子のエアロゾル製剤として、
経鼻又は経肺的に投与することができる。投与量は、局
所投与では１〜１００μg／投与部位／人／日、また全
身性投与では０.１〜１０mg／kg／日を投与する。以下
に実施例により、本発明を更に詳しく説明するが本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０００８】
実施例１ ウシの新生児血清よりの線維芽細胞（Ｂａｌ
ｂ／３Ｔ３細胞）増殖促進因子の精製 １) ヘパリンアフィニテイクロマトグラフィ法による粗
精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この新生
児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（20mMTris-HC
l, pH7.5, 0.5M NaCl）で平衡化しておいたヘパリン−
トヨパールカラム（直径５cm×長さ５.５cm，東ソー
社）に流速３ml／分で展開する。その後、トリス緩衝液
Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄後、ヘパリン−ト
ヨパールカラムに吸着したペプチド又はタンパク質をト
リス緩衝液Ｂ（２０mM, Tris-HCl, pH７.５, １.０Ｍ N
aCl）で溶出する。溶出液は、吸光度光度計を用い、２
８０nmの吸光度によりモニターし、吸収度の高い画分、
約３００mlを採取した。
ｂ／３Ｔ３細胞）増殖促進因子の精製 １) ヘパリンアフィニテイクロマトグラフィ法による粗
精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この新生
児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（20mMTris-HC
l, pH7.5, 0.5M NaCl）で平衡化しておいたヘパリン−
トヨパールカラム（直径５cm×長さ５.５cm，東ソー
社）に流速３ml／分で展開する。その後、トリス緩衝液
Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄後、ヘパリン−ト
ヨパールカラムに吸着したペプチド又はタンパク質をト
リス緩衝液Ｂ（２０mM, Tris-HCl, pH７.５, １.０Ｍ N
aCl）で溶出する。溶出液は、吸光度光度計を用い、２
８０nmの吸光度によりモニターし、吸収度の高い画分、
約３００mlを採取した。
【０００９】２) 逆相液体クロマトグラフィ法による精
製 操作１)で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいたコ
スモシール５Ｃ１８−３００カラム（直径４.６mm×長
さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開し、０.１％Ｔ
ＦＡを含む水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプ
チド又はタンパク質をアセトニトリル濃度にして０〜８
０％のリニアグラジェントにより溶出した。溶出液は、
２１４nmの吸光度によりモニターし、ピークごとに採取
した。溶出パターンを図１に示す。
製 操作１)で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいたコ
スモシール５Ｃ１８−３００カラム（直径４.６mm×長
さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開し、０.１％Ｔ
ＦＡを含む水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプ
チド又はタンパク質をアセトニトリル濃度にして０〜８
０％のリニアグラジェントにより溶出した。溶出液は、
２１４nmの吸光度によりモニターし、ピークごとに採取
した。溶出パターンを図１に示す。
【００１０】実施例２ 線維芽細胞増殖促進活性の測定 線維芽細胞株のＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより購
入、カタログNo. CCL163-Balb/3T3-clone A31）を９６
ウエル培養プレートに１ウエル当たり５×１０3個、播
種し、１０％仔牛血清添加ダルベーコ改変イーグルＭＥ
Ｍ培地（以下ＤＭＥ）１００μlを加え、培養器中で２
４時間、３７℃で培養した。その後、培養液を除き、細
胞を洗浄後、低血清培地（０.２％仔牛血清添加ＤＭ
Ｅ）１００μlを加え、更に３日間培養した。そこへ、
実施例１により得た各画分を１０μl加え、１５時間培
養した。ついで、3Ｈ−チミジンを７４KBq／mlになるよ
う加え、６時間培養した。培養後、培地を除き、細胞を
集め細胞中に取込まれた3Ｈ−チミジンの量を測定し
た。その結果、図１中のピーク１(矢印)の画分に細胞増
殖促進活性が認められた。
入、カタログNo. CCL163-Balb/3T3-clone A31）を９６
ウエル培養プレートに１ウエル当たり５×１０3個、播
種し、１０％仔牛血清添加ダルベーコ改変イーグルＭＥ
Ｍ培地（以下ＤＭＥ）１００μlを加え、培養器中で２
４時間、３７℃で培養した。その後、培養液を除き、細
胞を洗浄後、低血清培地（０.２％仔牛血清添加ＤＭ
Ｅ）１００μlを加え、更に３日間培養した。そこへ、
実施例１により得た各画分を１０μl加え、１５時間培
養した。ついで、3Ｈ−チミジンを７４KBq／mlになるよ
う加え、６時間培養した。培養後、培地を除き、細胞を
集め細胞中に取込まれた3Ｈ−チミジンの量を測定し
た。その結果、図１中のピーク１(矢印)の画分に細胞増
殖促進活性が認められた。
【００１１】実施例３ ピーク１のペプチドの物理化学
的性質の測定 １) Ｎ末端アミノ酸配列分析 実施例２で活性が確認された画分のペプチドにつき、Ｎ
末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４
７７Ａ（アプライトバイオシステムズ社）により分析し
たところ、配列表配列番号１に示すアミノ酸配列が確認
された。この配列を、タンパク質データベースにより、
一致するものがあるか否かを調べたところ、新規なタン
パク質であることが確認された。
的性質の測定 １) Ｎ末端アミノ酸配列分析 実施例２で活性が確認された画分のペプチドにつき、Ｎ
末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４
７７Ａ（アプライトバイオシステムズ社）により分析し
たところ、配列表配列番号１に示すアミノ酸配列が確認
された。この配列を、タンパク質データベースにより、
一致するものがあるか否かを調べたところ、新規なタン
パク質であることが確認された。
【００１２】２) アミノ酸組成分析 また、ピーク１の画分のペプチドのアミノ酸組成を、ア
ミノ酸分析機により調べた。表１にアミノ酸組成分析の
結果を示す。
ミノ酸分析機により調べた。表１にアミノ酸組成分析の
結果を示す。
【００１３】
【表１】アミノ酸 本件分析結果（*1） Ａｓｐ １０.４（１０） Ｇｌｕ １１.６（１２） Ｓｅｒ ４.８ （５） Ｇｌｙ ５.０ （５） Ｈｉｓ ３.８ （４） Ａｒｇ ４.０ （４） Ｔｈｒ ５.９ （６） Ａｌａ ４.３ （４） Ｐｒｏ ３.５ （４） Ｔｙｒ １.７ （２） Ｖａｌ ６.２ （６） Ｍｅｔ ０ （０）1 /2Ｃｙｓ ０ （０） Ｉｌｅ ５.５ （６） Ｌｅｕ ９.６（１０） Ｐｈｅ ４.４ （４） Ｌｙｓ ８.９ （９） Ｔｒｐ Ｎ.Ｄ. （*2） (*1) 分子量10,000ダルトンとして計算 (*2) 未決定
【００１４】３) 電気泳動による分析 ピーク１のペプチドの分子量を還元条件下のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより確認したところ、約８〜１２ＫＤａの分子
量を示した（図２）。図２はピーク１のペプチドの電気
泳動パターンを示し、図２においてレーン１はピーク１
のペプチドのバンドを示し、レーン２は分子量マーカー
を示す。
ＡＧＥにより確認したところ、約８〜１２ＫＤａの分子
量を示した（図２）。図２はピーク１のペプチドの電気
泳動パターンを示し、図２においてレーン１はピーク１
のペプチドのバンドを示し、レーン２は分子量マーカー
を示す。
【００１５】上記１)、２)及び３)に示された結果よ
り、線維芽細胞の増殖活性を有するピーク１のペプチド
は新規なタンパク質であると確認された。
り、線維芽細胞の増殖活性を有するピーク１のペプチド
は新規なタンパク質であると確認された。
【００１６】実施例４ ＳＨＢＰ−１０の線維芽細胞増
殖活性の測定 さらに、実施例２により得た本タンパク質の用量依存的
細胞増殖促進活性を調べるために、ＳＨＢＰ−１０を各
ウエル当たり０.０３〜１０μg／mlになるように実施例
２の方法に従い加え、3Ｈ−チミジンの取込みを測定し
た。ＳＨＢＰ−１０の線維芽細胞増殖活性の測定の結果
を表２に示す。データは各群（１郡４例）の平均と標準
偏差を示す。
殖活性の測定 さらに、実施例２により得た本タンパク質の用量依存的
細胞増殖促進活性を調べるために、ＳＨＢＰ−１０を各
ウエル当たり０.０３〜１０μg／mlになるように実施例
２の方法に従い加え、3Ｈ−チミジンの取込みを測定し
た。ＳＨＢＰ−１０の線維芽細胞増殖活性の測定の結果
を表２に示す。データは各群（１郡４例）の平均と標準
偏差を示す。
【００１７】
【表２】 添加化合物 用量（μg/ml) 3Ｈ−チミジンの取込み（cpm) 対 照 群 − １００ ＳＨＢＰ−１０ ０.０２５ ９９.４±２６.６ ０.２５ １３６.０±２５.０ ２.５ ４００５.０±２１７.０
【００１８】この結果から、ＳＨＢＰ−１０は用量依存
的に細胞増殖促進活性を有することが確認された。
的に細胞増殖促進活性を有することが確認された。
【００１９】
【発明の効果】本発明により提供されるタンパク質ＳＨ
ＢＰ−１０は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創
傷治療剤として有用である。
ＢＰ−１０は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創
傷治療剤として有用である。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：ウシ（Bos taulus） 組織の種類：血清 配列の特徴：なし 配列： Thr Lys Leu Glu Asp His Leu Glu Gly Ile Ile Asn Ile Phe His Gln Tyr 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Gly His Phe Asp Thr Leu Asn Lys Arg 20 25 30
【図１】ヘパリンアフィニテイカラムクロマトグラフィ
に結合し溶出された画分を、さらに逆相液体クロマトグ
ラフィにより展開したパターンを示す。矢印は本タンパ
ク質を含む活性画分である。
に結合し溶出された画分を、さらに逆相液体クロマトグ
ラフィにより展開したパターンを示す。矢印は本タンパ
ク質を含む活性画分である。
【図２】ピーク１のペプチドの電気泳動パターンを示す
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ
Claims (4)
- 【請求項１】 還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
析で約８〜１２ＫＤａの分子量を有し、アミノ末端配列
が配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク
質ＳＨＢＰ−１０。 - 【請求項２】 哺乳動物の血液由来である、請求項１の
タンパク質ＳＨＢＰ−１０。 - 【請求項３】 ヘパリン結合性である、請求項１または
２のタンパク質ＳＨＢＰ−１０。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの項のタン
パク質ＳＨＢＰ−１０を含む創傷治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6061904A JPH07267993A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 新規なタンパク質ｓｈｂｐ−１０ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6061904A JPH07267993A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 新規なタンパク質ｓｈｂｐ−１０ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07267993A true JPH07267993A (ja) | 1995-10-17 |
Family
ID=13184614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6061904A Pending JPH07267993A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 新規なタンパク質ｓｈｂｐ−１０ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07267993A (ja) |
-
1994
- 1994-03-31 JP JP6061904A patent/JPH07267993A/ja active Pending
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