JPH07270406A - 合成燐脂質試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリンおよびホスファチジルコリンを含んでなる
合成試薬、及び試料の凝固時間の測定において該燐脂質
試薬を使用する方法。 【効果】 本発明の試薬は凝固時間測定検査において天
然源のものを代用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、合成燐脂質試薬および血液凝
固時間を測定するための例えば活性化された部分的トロ
ンボプラスチン時間試験(Activated Partial Thrombopl
astinTime tesまたはプロトロンビン時間試験(Protromb
in Time test)の如き診断検査における該試薬の使用方
法に関する。

【０００２】

【発明の背景】凝固障害に関するスクリーニング試験
は、活性化された部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）を包含する。
特に、凝固障害用のスクリーニング試験は１種以上の凝
固因子中での意義ある異常性を検出するためおよびこの
異常性を凝固経路における種々の段階でつきとめるため
に設定されている。

【０００３】凝固時間を試験する臨床的価値は遺伝的ま
たは病理学的疾病症状の検査に限定されるものではな
く、抗凝固療法の調整においても有用である。抗凝固剤
は典型的には、例えば抗−トロンビンIIIによるヘパリ
ン介在性抑制によるかまたはビタミンＫ依存性因子II、
VII、Ｘ、XI、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓのカルボキシル
化を抑制するクマジン(coumadin)［ワルファリン(warfa
rin）］の作用によるような凝固機構を抑制する。

【０００４】一般的に理解されているように、凝固は二
種の経路、すなわち内因性経路および外因性経路、によ
り起こり得る。前者は一般的には表面の存在により誘発
され（因子XIIを活性化すると考えられている）、そし
て燐脂質類およびカルシウムの存在下で多段階を経て安
定化されているフィブリン塊の生成を最終的に刺激す
る。ＡＰＴＴ試験は典型的にはほとんどの先天的欠損が
起きる内因性経路の凝固因子を測定し、そしてＰＴ試験
は外因性経路の凝固因子を測定する。

【０００５】活性化された部分的トロンボプラスチン時
間、ＡＰＴＴ、試験は血液の凝固時間の評価において使
用される診断試験である。それは種々の凝固因子である
因子XII、XI、IX、VIII、Ｘ、Ｖ、IIおよびＩの存在お
よび量を測定するために使用されており、その理由はそ
れらが異常な血液凝固機構を示す疾病症状と関連してい
るからである。従って、ＡＰＴＴ試験は手術前検査とし
ておよびヘパリン療法の監視用に有用である。

【０００６】ＡＰＴＴ試験は、活性化剤、例えばカオリ
ン、シリカ、エラグ酸などを燐脂質を基にした試薬と共
に血漿に加えることにより、行われる。これは因子XII
およびXIを活性化させる。最近ではＡＰＴＴにおいて使
用される燐脂質は牛または兎の脳から抽出されている
が、例えば大豆の如き源を使用することもできる。ＡＰ
ＴＴ試薬の外因性燐脂質が、因子IX、VIIIおよびＶによ
る因子VIIIの活性化において生体内の血小板により供さ
れる燐脂質を置換する。この凝固試験ではカルシウムを
加えることにより血液凝固が開始される。因子VIIは部
分的なトロンボプラチン時間により影響を受けない唯一
の因子である。従って、ＡＰＴＴは因子VII欠損を有す
る患者では正常である。

【０００７】プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、組織
トロンボプラチンをカルシウムと共に血漿に加えること
により、行われる。これは因子VIIを活性化させ、それ
は次に因子Ｘを活性化させ、それが因子Ｖの存在下でプ
ロトロンビンからトロンビンへの転化をもたらすことに
より凝固を開始させる。このようにして製造されたトロ
ンビンがフィブリノゲンをフィブリンに転化させる。従
ってＰＴは内因性凝固経路を迂回しそして因子XII、X
I、IXおよびVIIIの欠損を有する患者では正常である。
ＰＴは因子VII、Ｘ、Ｖ、プロトロンビンまたはフィブ
リノゲンの欠損を有する患者では異常である。組織トロ
ンボプラチンは、カルシウムが加えられている（兎の脳
または肺および人間の脳または胎盤からの）燐脂質抽出
物である。それは一般的には凍結乾燥された形で供給さ
れ、そして蒸留水で再形成しなければならない。

【０００８】ＡＰＴＴおよびＰＴは、試験で使用される
天然の燐脂質試薬は個々の燐試薬の源および量と一致し
ないという事実にもかかわらず、広く許容されている。
天然燐脂質抽出物を診断検定用試薬として使用すること
の一欠点は、源による合計燐脂質含有量並びに抽出物中
に含有されている個々の燐脂質の比の不一致性である。
これらの天然源からの燐脂質は存在している個々の型の
燐脂質、すなわちホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルリノシトール、ホ
スファチジルセリン、の比が異なっている。それぞれの
燐脂質の天然源によって各脂肪アシル鎖の不飽和度およ
び長さにも大きい変動がある従って、製造において調節
および一致性を示し、個々の燐脂質の比を変えるための
可能性を与え、異なる凝固因子の測定に対してより大き
い信頼性および改良された選択性を保証し、そして個々
の燐脂質類の含有量および不均質脂肪アシル鎖構造にお
ける可変性により引き起こされる評価性能可変性がない
ような診断検査での使用のための合成性の精製された燐
脂質試薬に関する要望がある。

【０００９】

【発明の要旨】本発明は、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリ
ンを含んでなる合成性の精製された試薬に関する。例え
ば試料の凝固時間の測定の如き診断検査における合成燐
脂質試薬の使用方法も提唱される。

【００１０】

【発明の詳細な記載】研究室検査で最近使用されている
天然抽出された燐脂質の使用の代わりに本発明の燐脂質
の合成混合物が使用される。特許が請求されている本発
明の合成燐脂質類は化学源から製造および精製され、そ
してそれらは当技術の専門家には既知である。従って、
特許が請求されている本発明の合成燐脂質は、脳および
大豆を含む天然源から単離されておりそしてこれらの試
薬の製造により供されている最近入手できる燐脂質試薬
とは異なっている。燐脂質類の合成混合物はホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホ
スファチジルセリンを含んでいる。これらの合成燐脂質
は良好に規定された比および同一の脂肪アシル鎖構造を
有している。適切な比で一緒に加えられると、これらの
合成脂質類はそれらの天然産出相当物と同等またはそれ
より良好な性能である混合物を形成する。合成試薬は結
果に対するより大きな一致性も生じ、そして改良された
検査性能を有している。

【００１１】本発明は、試料の凝固時間を測定する際の
精製された燐脂質の使用方法も含んでいる。活性化され
た部分的なトロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）および
プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、ほとんどの前凝固
剤凝固因子における異常性を示すために使用されてい
る。ＡＰＴＴは、ヘパリン応答曲線を得るためおよび二
種の凝固経路の一種である内因性経路における凝固因子
の欠損をスクリーニグするために有用な敏感な工程であ
る。ＰＴは、外因性経路における凝固因子活性の欠損を
測定するために有用な試験である。

【００１２】本発明の方法で意図されている際には、合
成燐脂質試薬を試験血漿と一緒にしそして凝固時間を測
定する。試験血漿は特定の内因性因子、例えば因子VII
I、IX、XI、XIIなど、または特定の外因性因子、例えば
因子VI、Ｘ、Ｖ、プロトロンビン、フィブリノーゲンな
ど、における欠損があるかもしれない。試験血漿はま
た、例えば狼瘡欠損性、ヘパリン欠損性などであるかも
しれない。凝固反応はイオン性カルシウムの添加により
開始され、そして試験結果は塊の生成に必要な時間であ
る。

【００１３】ＡＰＴＴ試験は凝固の三段階全部を含んで
おり、そしてそれにより一つが存在しているならほとん
どの前凝固剤凝固因子における異常性を示す。ＡＰＴＴ
試験は、ヘパリン応答曲線を得るためおよび血小板因子
III以外の凝固の内因性経路における凝固因子の欠損を
スクリーニグするために有用な敏感な工程である。最初
に、燐脂質試薬を試験血漿と混合する。３７℃における
特定時間にわたる培養後に、反応をイオン性カルシウム
の添加により開始させる。塊の生成に必要な時間、秒、
が試験結果である。長いＡＰＴＴ結果は一般的に、内因
性経路における一種以上の凝固因子またはヘパリンの如
き抗凝固剤の存在の水準減少を示している。

【００１４】プロトロンビン時間、ＰＴ、試験は 経路
における先天的または後天的な凝固因子活性の欠損を測
定するために使用されている。外因性経路は血漿凝固因
子VI、Ｘ、Ｖ、プロトロンビンおよびフィブリノゲンを
含んでいる。外因性経路は因子III（組織トロンボプラ
チン）も含んでいるが、それはＰＴ試験では測定されな
い。経口的抗凝固薬により抑制される因子の多くは外因
性経路中にあるため、ＰＴは経路抗凝固剤療法を調整す
る際の選択試験である。

【００１５】組織トロンボプラチンは、カルシウムの存
在下で、凝固の外因性経路を開始させる活性化剤であ
る。組織トロンボプラチンを正常な抗凝固化された血漿
に加えることにより、凝固機構が開始されそしてフィブ
リン塊が特定時間内に生成するであろう。凝固の外因性
経路に因子活性の欠損があるなら、塊の生成用に必要な
時間は正常な血漿に関して予測されるものより長くなる
であろう。下記の結果は、検査試薬中の燐脂質濃度が増
加するにつれて、種々の試料に関する凝固時間は使用さ
れる特定燐脂質および濃度により増加または減少すると
予測されることを示している。表IIおよびIIIのまとめ
である表Ｉを参照のこと。試料は正常（ＯＰＣＣＩ）お
よび異常（ＯＰＣＣＩＩおよびＯＰＣＣＩＩＩ）対照類
を含んでおり、血漿欠損試料は因子VIIIおよびIX（ＦVI
II、ＦIX）、狼瘡およびヘパリン欠損試料を含んでい
る。

【００１６】

【表１】 表Ｉ 燐脂質濃度が増加するにつれて凝固時間 ＰＳ ＰＥ ＰＣ ＯＰＣＣＩ 増加する 減少する 減少する ＯＰＣＣＩＩ 増加する 減少する 減少する ＯＰＣＣＩＩＩ 増加する 減少する 減少する Ｆ ＶＩＩＩ 増加する 増加する 減少する Ｆ ＩＸ 増加する 減少する 減少する 狼瘡 増加する 増加する 減少する ヘパリン 増加する 減少する 減少する 特許が請求されている本発明の合成燐脂質試薬は、調節
された燐脂質濃度および可溶性非硬化性活性化剤を用い
る接触系統の一定な活性化を供する緩衝された試薬であ
る。可溶性活性化剤は溶液から沈澱しないため、それら
は血漿試験試料の均一な活性化を与えて試験結果の再現
性をより大きくする。

【００１７】合成燐脂質試薬は、ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセ
リンの混合物、緩衝剤、例えばＮ−２−ヒドロキシエチ
ル−ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸など、安
定剤、例えばアミノ酸類、デキストロースなど、並びに
防腐剤、例えばチメロサル（例えば０.０１％）、硫酸
ネオマイシン、およびフェノールマジド、を含んでい
る。各成分は下記の濃度で混合物中に存在する：安定剤
−５.０％以下、より好適には０.５％以上、最も好適に
は約０.５％−約５.０％、緩衝剤−１.０Ｍ以下、より
好適には０.０９Ｍ以上、最も好適には約０.０９−約
１.０Ｍ、および防腐剤−０.６％以下、より好適には
０.０１％以上そして最も好適には約０.０１％−約０.
６％。

【００１８】本発明は、動物組織または植物源から誘導
された燐脂質類の代わりに化学的源の合成燐脂質類を使
用して試薬モデルシステム対照としてオルト診断トロン
ボシルを用いる凝固試薬中で血小板のような代用品とし
て作用する可能性を示している。表III、「最近のＴＳ
ＩＬ」欄を参照のこと。

【００１９】本発明を下記の実施例によりさらに説明す
る。実施例は説明用だけであることを意図しており、そ
して本発明を特定態様に限定しようとするものではな
い。

【００２０】

【実施例】個々の燐脂質の意義ある効果を示すために、
コンピューター処理された応答表面（面心立方）実験ス
クリーニング設定を使用した。正常なおよび特定因子が
欠損している血漿を用いる性能特性（凝固時間、秒）に
対する燐脂質比の相互作用が示された。

【００２１】最近入手可能なオルトおよび競合ＡＰＴＴ
試薬中のそれぞれの燐合成燐脂質の濃度をＨＰＬＣによ
り測定することにより、試薬中に加えるホスファチジル
セリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）の最小および
最大範囲（μｇ／ｍｌ）を決めた。表面応答スクリーニ
ング設定は１７種の実験用合成調合物を生じた。

【００２２】それぞれの調合物が異なるＰＳ：ＰＥ：Ｐ
Ｃを有しているこれらの１７種の実験用合成調合物を次
に表面応答試験で評価してそれぞれの調合物の凝固時間
を予測した。表IIを参照のこと。それぞれの調合物を、
ＰＳ、ＰＥまたはＰＣ欠損性血漿試料、凍結乾燥された
正常な血漿試料（ＯＰＣＣＩ）、凍結乾燥された異常な
血漿試料（ＯＰＣＣＩＩ、低い異常度およびＯＰＣＣＩ
ＩＩ、高い異常度）を含む対照試料に対して試験した。
表II、Ａ−Ｆ欄を参照のこと。調合物を因子VIII、IX、
XIおよびXII、正常な血漿プールからのヘパリン、（Ｈ
ＥＰ０Ｕ−０Ｕ／ｍｌ、ＨＥＰ２Ｕ−０.２ Ｕ／ｍｌ）
および狼瘡欠損性試料、狼瘡対照血漿（アラクナーゼ）
を含む凍結乾燥された血漿欠損性試料に対しても試験し
た。表II、Ｇ−Ｍ欄を参照のこと。４週間間隔で、Ｐ
Ｓ、ＰＥおよびＰＣの燐脂質水準における差、並びにＰ
Ｓ、ＰＥおよびＰＣ混合物の合計安定性も試験した。表
II、Ｎ−Ｑ欄を参照のこと。

【００２３】

【表２】 表II 合成ＡＰＴＴ 調節された因子 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ 実験 ＰＳ ＰＥ ＰＣ OPCCI OPCII OPCCIII Ｆ８ Ｆ９ 1 43.00 140.5 72.5 26.40 45.20 59.90 135.30 138.50 2 43.00 27.0 72.5 27.10 51.00 70.80 143.30 137.50 3 43.00 140.5 72.5 29.60 46.40 62.80 135.70 137.70 4 75.00 254.0 17.0 26.60 44.30 59.00 122.80 132.30 5 43.00 140.5 72.5 25.40 45.30 60.70 130.70 131.90 6 75.00 27.0 128.0 27.20 52.50 74.60 144.20 145.30 7 11.00 254.0 128.0 26.30 51.40 71.80 102.40 104.10 8 43.00 254.0 72.5 25.60 48.70 66.70 129.40 129.80 9 11.00 27.0 128.0 38.30 83.20 107.50 150.00 150.00 10 75.00 27.0 17.0 34.20 61.30 88.30 129.70 141.40 11 11.00 254.0 17.0 27.80 46.50 61.70 124.10 125.30 12 75.00 140.5 72.5 26.40 48.60 67.10 118.60 132.70 13 75.00 254.0 128.0 26.20 50.50 70.30 124.60 132.00 14 11.00 27.0 17.0 28.20 48.00 63.80 128.10 131.80 15 11.00 140.5 72.5 27.00 49.20 67.20 112.50 113.40 16 43.00 140.5 128.0 27.90 55.50 77.70 137.40 136.00 17 43.00 140.5 17.0 27.30 46.90 62.90 123.80 129.20 測定された特性 Ｉ Ｊ Ｋ Ｌ Ｍ Ｎ Ｏ Ｐ Ｑ Ｆ11 Ｆ12 HEPOU HEP2U LUPUS PSTAB PESTAB PCSTAB TOSTAB 131.80 150.0 28.60 44.60 62.60 2.00 5.0 5.00 12.0 136.30 150.0 28.90 51.80 60.00 12.00 4.0 4.00 20.0 132.70 150.0 28.10 46.80 58.30 9.00 17.0 2.00 28.0 132.80 150.0 28.40 44.60 58.40 59.00 110.0 10.00 179.0 127.90 150.0 26.90 45.40 58.60 10.00 16.0 13.00 39.0 144.00 150.0 29.00 53.60 59.90 1.00 0.0 0.00 0.0 135.80 150.0 27.70 51.20 76.40 2.00 15.0 5.00 22.0 134.80 150.0 27.60 49.60 59.20 4.00 15.0 3.00 22.0 150.00 150.0 43.50 90.00 127.00 2.00 4.0 3.00 10.0 146.70 150.0 35.00 63.40 74.60 9.00 0.0 1.00 10.0 130.60 150.0 30.40 48.80 58.50 4.00 10.0 4.00 18.0 133.00 150.0 30.10 46.50 50.00 40.00 50.0 28.00 218.0 137.10 150.0 30.10 50.20 51.40 49.00 141.0 34.00 225.0 134.90 150.0 30.60 49.20 61.60 3.00 8.0 1.00 12.0 133.20 150.0 29.70 52.00 73.60 3.00 3.0 0.00 5.0 143.20 150.0 31.30 56.80 63.70 8.00 1.0 8.00 17.0 133.50 150.0 30.90 47.80 54.70 0.00 5.0 0.00 4.0 それぞれの実験調合物を不規則的な順番でＡＰＴＴ凝固
時間を得るための市販のオルト装置上で試験した。次に
データをコンピューター分析用に入力して、二次回帰分
析を測定して、どの因子または因子の相互作用が性能特
性における影響で最も意義があるかを示し、そして残り
を表にして観察されたおよび予期された結果の間の補正
を示す。対照試料である「最近のＴＳＩＬ」は最近市販
されているオルト試薬トロンボシルである。結局、５種
の合成燐脂質試薬の調合物およびそれらの特性が同様に
して測定された。表IIIを参照のこと。５種の調合物中
のそれぞれの燐脂質の濃度範囲（μｇ／ｍｌ）を計算し
た。５７.５μｇ／ｍｌ以下の、より好適には１１.０μ
ｇ／ｍｌ以上の、そして最も好適には約１１.０−約５
７.５μｇ／ｍｌの、濃度のホスファチジルセリンが計
算された。２５４.０μｇ／ｍｌ以下の、より好適には
２７.０μｇ／ｍｌ以上の、そして最も好適には約２７.
０−約２５４.０μｇ／ｍｌの、濃度のホスファチジル
エタノールアミンが計算された。１２８.０μｇ／ｍｌ
以下の、より好適には１７.０μｇ／ｍｌ以上の、そし
て最も好適には約１７.０−約１２８.０μｇ／ｍｌの、
濃度のホスファチジルコリンが計算された。燐脂質試薬
調合物のこれらの濃度範囲はトロンボシルで受けたもの
と同様な凝固特性を生じた。表IIIを参照のこと。

【００２４】

【表３】 表III 合成シリカＡＴＰＰ試薬 因子 形１ 形２ 形３ 形４ 形５ 最近の 特性 ＴＳＩＬ燐脂質μｇ／ｍｌ PS 11.00 34.50000 11.00 11.000 57.50000 101.0 PE 155.00 125.0000 27.00 254.000 75.60000 183.0 PC 110.00 121.00000 57.70 128.000 17.00000 133.0凝固時間特性 OPCCI 29.70 29.00000 30.40 28.800 29.60000 30.9 OPCCII 57.90 56.70000 57.70 57.800 50.20000 55.7 OPCCIII 77.60 76.70000 75.30 80.800 70.00000 83.7 F8 115.00 135.00000 134.00 107.000 130.00000 117.0 F9 119.00 135.00000 134.00 109.000 137.00000 121.8 F11 137.00 140.00000 136.60 140.000 138.00000 130.8 HEPOU/ML 32.80 32.00000 33.10 30.700 31.20000 32.9 HEP.2U/ML 60.00 58.40000 60.20 69.200 50.80000 56.7 LUPUS 87.20 74.50000 82.40 84.600 58.20000 55.6 PS STAB 4.48 0.04160 8.66 -0.962 6.12000 66.0 PE STAB 3.38 0.01990 13.60 10.700 0.00069 23.0 PC STAB 7.25 4.93000 4.71 5.140 0.10500 23.0 TOTAL STAB 37.10 0.00843 37.80 7.350 1.66000 112.1 表III中の最適な表は、因子および因子の相互作用の増
加または減少に関してどんな方法で性能データが動くか
を示すために表されている。

【００２５】燐脂質の最適水準並びに全てのＡＰＴＴ試
薬適用に関して希望される正確さ、精密さおよび安定性
性能を生じるのに必要な他の試薬成分類が決められた。

【００２６】性能基準は、正常患者／対照血漿（ＯＰＣ
ＣＩ）並びに生体内／試験管内ヘパリン処理血漿（ＨＥ
Ｐ ０Ｕ／ｍｌ、ＨＥＰ ０.２Ｕ／ｍｌ）、肝臓疾病
（ＯＰＣＣＩＩ、ＯＰＣＣＩＩＩ）、内因性因子欠損
（Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１１）、狼瘡抗凝固剤（ＬＵＰＵＳ）
および異常対照（ＯＰＣＣＩＩ、ＯＰＣＣＩＩＩ）を含
む異常患者／対照血漿が含んでいる。コンピューター処
理された実験用設定ソフトウェアを使用して実験用調合
物を設定しそして分析した。

【００２７】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。

【００２８】１．合成ホスファチジルセリン、ホスファ
チジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンの
混合物を含んでなる試薬。

【００２９】２．さらに緩衝剤、安定剤および防腐剤を
含んでなる上記１の試薬。

【００３０】３．該緩衝剤が約０.０９−１.０Ｍの濃度
であり、該安定剤が約０.５％−５.０％の濃度であり、
そして該防腐剤が約０.０１％−０.６％の濃度である上
記２の試薬。

【００３１】４．該緩衝剤がＮ−２−ヒドロキシエチル
−ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸である上記
２の試薬。

【００３２】５．該防腐剤がチメロサル、硫酸ネオマイ
シンまたはフェノールマジドである上記２の試薬。

【００３３】６．該安定剤がアミノ酸類またはデキスト
ロースである上記２の試薬。

【００３４】７．ホスファチジルセリンの濃度、μｇ／
ｍｌ、が約１１.０−約５７.５の範囲内にあり、ホスフ
ァチジルエタノールアミンの濃度が約２７.０−２５４.
０の範囲内にあり、そしてホスファチジルコリンの濃度
が約１７.０−約１２８.０の範囲内にある上記１の試
薬。

【００３５】８．上記１の試薬を使用する試料の凝固時
間を測定する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルバート・ベントウリニ アメリカ合衆国ペンシルベニア州18301イ ーストストラウズバーグ・ボツクス1038・ アールデイナンバー１

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 合成ホスファチジルセリン、ホスファチ
   ジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンの混
   合物を含有することを特徴とする試薬。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の試薬を使用することを
   特徴とする試料の凝固時間を測定する方法。