JPH07270415A - 酵素免疫測定法 - Google Patents
酵素免疫測定法Info
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- JPH07270415A JPH07270415A JP6390994A JP6390994A JPH07270415A JP H07270415 A JPH07270415 A JP H07270415A JP 6390994 A JP6390994 A JP 6390994A JP 6390994 A JP6390994 A JP 6390994A JP H07270415 A JPH07270415 A JP H07270415A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ペルオキシダ−ゼ標識物質を用いた酵素免疫
測定法において、基質液中の過酸化水素濃度と感度の応
答曲線から最適過酸化水素濃度を得、その濃度を用いる
酵素免疫測定法。 【効果】 従来よりも簡便な方法で容易に感度を目標値
に調整することを可能にし、安定な高感度酵素免疫測定
法を提供することができる。
測定法において、基質液中の過酸化水素濃度と感度の応
答曲線から最適過酸化水素濃度を得、その濃度を用いる
酵素免疫測定法。 【効果】 従来よりも簡便な方法で容易に感度を目標値
に調整することを可能にし、安定な高感度酵素免疫測定
法を提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高感度の酵素免疫測定
法（Enzyme immunoassay、以下ＥＩＡと略す）に関する
ものであり、さらに詳しくは基質液中の過酸化水素濃度
を最適化することを特徴とする酵素免疫測定法に関する
ものである。
法（Enzyme immunoassay、以下ＥＩＡと略す）に関する
ものであり、さらに詳しくは基質液中の過酸化水素濃度
を最適化することを特徴とする酵素免疫測定法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】ＥＩＡは抗原抗体反応における抗体の抗
原に対する反応特異性と、酵素の標識物質としての優れ
た性能（酵素反応における非常に強い触媒能力と基質特
異性）を組み合わせた測定法として、標識物質としてア
イソト−プを用いる従来のラジオイムノアッセイ（Radi
oimmunoassay、以下ＲＩＡと略す）に代るものとして19
71年に考案され、今日の広範な普及に至っている。
原に対する反応特異性と、酵素の標識物質としての優れ
た性能（酵素反応における非常に強い触媒能力と基質特
異性）を組み合わせた測定法として、標識物質としてア
イソト−プを用いる従来のラジオイムノアッセイ（Radi
oimmunoassay、以下ＲＩＡと略す）に代るものとして19
71年に考案され、今日の広範な普及に至っている。
【０００３】ＥＩＡで用いられる主な酵素としては、ペ
ルオキシダ−ゼ，β−ガラクトシダ−ゼ，アルカリホス
ファタ−ゼ等が挙げられる。価格が相対的に安いことや
標識物質との結合性が良いことなどから一般的にペルオ
キシダ−ゼがよく用いられている。
ルオキシダ−ゼ，β−ガラクトシダ−ゼ，アルカリホス
ファタ−ゼ等が挙げられる。価格が相対的に安いことや
標識物質との結合性が良いことなどから一般的にペルオ
キシダ−ゼがよく用いられている。
【０００４】ＥＩＡを測定原理とするキットにおいて、
その品質を評価する一般的な尺度の一つとして感度（用
量反応曲線から定義されるもので、反応物質の単位量
［ｄＣ］当たりの応答変動［ｄＲ］を表し、ｄＲ／ｄＣ
と等しいもの）が挙げられる［エンザイムイムノアッセ
イ(P.TIJSSEN著，東京化学同人) ］。本発明において
は、この感度について取り上げ、反応物質として被測定
物質を、応答変動としては最終的に検出される信号（吸
光度、蛍光強度、発光強度等）の変動を用いるものとす
る。キットとしての品質を考えた場合、反応条件（反応
時間，反応温度，使用薬液量等）や信号検出方法（分光
光度計，蛍光検出器，ルミノメ−タ−等）は測定の手
技，使用する機器・装置等の制約から限られた条件，方
法をとらざるを得なく、必要な感度を得るには、キット
構成部品のうち感度調整因子を含む部品の組成を工夫す
る必要がある。具体的な感度最適化方法としては、標識
物質に結合させるペルオキシダ−ゼの量を調整する方法
や、使用する抗体濃度や酵素標識物質の濃度を調整する
方法などがあるが、当該部品の安定性が組成によって変
動しやすい、原料である標識物質，ペルオキシダ−ゼ，
抗体等の品質（反応性や比活性等）がロットによって変
動するため、これらの構成試薬からなるキット性能が各
構成試薬の調製ロットが異なることにより感度が変動す
るなど問題点が多い。
その品質を評価する一般的な尺度の一つとして感度（用
量反応曲線から定義されるもので、反応物質の単位量
［ｄＣ］当たりの応答変動［ｄＲ］を表し、ｄＲ／ｄＣ
と等しいもの）が挙げられる［エンザイムイムノアッセ
イ(P.TIJSSEN著，東京化学同人) ］。本発明において
は、この感度について取り上げ、反応物質として被測定
物質を、応答変動としては最終的に検出される信号（吸
光度、蛍光強度、発光強度等）の変動を用いるものとす
る。キットとしての品質を考えた場合、反応条件（反応
時間，反応温度，使用薬液量等）や信号検出方法（分光
光度計，蛍光検出器，ルミノメ−タ−等）は測定の手
技，使用する機器・装置等の制約から限られた条件，方
法をとらざるを得なく、必要な感度を得るには、キット
構成部品のうち感度調整因子を含む部品の組成を工夫す
る必要がある。具体的な感度最適化方法としては、標識
物質に結合させるペルオキシダ−ゼの量を調整する方法
や、使用する抗体濃度や酵素標識物質の濃度を調整する
方法などがあるが、当該部品の安定性が組成によって変
動しやすい、原料である標識物質，ペルオキシダ−ゼ，
抗体等の品質（反応性や比活性等）がロットによって変
動するため、これらの構成試薬からなるキット性能が各
構成試薬の調製ロットが異なることにより感度が変動す
るなど問題点が多い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、感度が変動
することを防ぎ、安定な高感度酵素免疫測定法を提供す
ることを目的とする。
することを防ぎ、安定な高感度酵素免疫測定法を提供す
ることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる技
術的な背景をもとに、前述の問題に鑑み、ＥＩＡにおけ
る感度を最適化する方法について鋭意研究の結果、酵素
反応に用いる基質液中の過酸化水素濃度を最適化するこ
とにより、簡便で容易にペルオキシダ−ゼ標識物質を用
いるＥＩＡの安定かつ高い感度を達成できることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
術的な背景をもとに、前述の問題に鑑み、ＥＩＡにおけ
る感度を最適化する方法について鋭意研究の結果、酵素
反応に用いる基質液中の過酸化水素濃度を最適化するこ
とにより、簡便で容易にペルオキシダ−ゼ標識物質を用
いるＥＩＡの安定かつ高い感度を達成できることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち本発明は、ペルオキシダ−ゼ標識
物質を用いた酵素免疫測定法において、基質液中の過酸
化水素濃度と感度の応答曲線から最適過酸化水素濃度を
得、その濃度を用いることを特徴とする酵素免疫測定法
である。
物質を用いた酵素免疫測定法において、基質液中の過酸
化水素濃度と感度の応答曲線から最適過酸化水素濃度を
得、その濃度を用いることを特徴とする酵素免疫測定法
である。
【０００８】具体的には、キット毎に設定された反応条
件や信号検出方法に応じて、被測定物質の測定したい濃
度を設定し、その条件下で基質液中の過酸化水素濃度を
変化させ、得られた信号強度と過酸化水素濃度との応答
曲線を描く。次に、最適化したい感度目標値（被測定物
質の測定希望濃度における信号強度で規定される）を示
す過酸化水素濃度を応答曲線から求めるというものであ
る。過酸化水素の濃度範囲は０．００２〜０．５％（ｗ
／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）であ
る。感度目標値は信号検出方法により異なるが、信号
（応答変動）として吸光度を用いる場合、被測定物質の
測定上限量あたり吸光度として通常０．８〜２．５であ
る。
件や信号検出方法に応じて、被測定物質の測定したい濃
度を設定し、その条件下で基質液中の過酸化水素濃度を
変化させ、得られた信号強度と過酸化水素濃度との応答
曲線を描く。次に、最適化したい感度目標値（被測定物
質の測定希望濃度における信号強度で規定される）を示
す過酸化水素濃度を応答曲線から求めるというものであ
る。過酸化水素の濃度範囲は０．００２〜０．５％（ｗ
／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）であ
る。感度目標値は信号検出方法により異なるが、信号
（応答変動）として吸光度を用いる場合、被測定物質の
測定上限量あたり吸光度として通常０．８〜２．５であ
る。
【０００９】ＥＩＡの酵素免疫系で用いられる複合体の
形成法としては、抗体などの被標識物質に酵素を直接結
合させる方法や、ビオチン−アビジン系のようにアビジ
ンという物質を介して抗体−酵素複合体を形成させる方
法などがある。
形成法としては、抗体などの被標識物質に酵素を直接結
合させる方法や、ビオチン−アビジン系のようにアビジ
ンという物質を介して抗体−酵素複合体を形成させる方
法などがある。
【００１０】本発明において用いられる標識対象物質は
抗体（いわゆる生体内で産生される免疫グロブリン及び
酵素処理等で誘導される各種抗体フラグメント等），抗
原，アビジン等のタンパク質が主である。これらのタン
パク質の製造法としては、遺伝子組み替え型の製造法も
含む。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体などが用いられるが、好ましくは、分子が均一
で一定のモノクローナル抗体が用いられる。
抗体（いわゆる生体内で産生される免疫グロブリン及び
酵素処理等で誘導される各種抗体フラグメント等），抗
原，アビジン等のタンパク質が主である。これらのタン
パク質の製造法としては、遺伝子組み替え型の製造法も
含む。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体などが用いられるが、好ましくは、分子が均一
で一定のモノクローナル抗体が用いられる。
【００１１】抗体、アビジン等の被標識物質をペルオキ
シダ−ゼで標識化する方法としては、有機化学的結合に
よる標識法（マレイミド法，過ヨウ素酸法，グルタルア
ルデヒド法等），免疫学的標識法（酵素−抗酵素抗体複
合体を抗免疫グロブリン抗体により抗体と架橋する方
法），酵素や抗体以外のタンパク質分子を介する標識法
（アビジン−ビオチン法等）などが挙げられる［エンザ
イムイムノアッセイ(P.TIJSSEN著，東京化学同人) ］。
シダ−ゼで標識化する方法としては、有機化学的結合に
よる標識法（マレイミド法，過ヨウ素酸法，グルタルア
ルデヒド法等），免疫学的標識法（酵素−抗酵素抗体複
合体を抗免疫グロブリン抗体により抗体と架橋する方
法），酵素や抗体以外のタンパク質分子を介する標識法
（アビジン−ビオチン法等）などが挙げられる［エンザ
イムイムノアッセイ(P.TIJSSEN著，東京化学同人) ］。
【００１２】ペルオキシダ−ゼの基質としては、吸光度
法ではｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６
−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、蛍光法ではチラミンやｐ−
ヒドロキシフェニルプロピオン酸（ＨＰＰＡ）、化学発
光法ではルミノ−ルなどが挙げられる［酵素免疫測定法
（蛋白質核酸酵素，別冊Ｎｏ．３１）］。
法ではｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６
−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、蛍光法ではチラミンやｐ−
ヒドロキシフェニルプロピオン酸（ＨＰＰＡ）、化学発
光法ではルミノ−ルなどが挙げられる［酵素免疫測定法
（蛋白質核酸酵素，別冊Ｎｏ．３１）］。
【００１３】本発明の酵素免疫測定法としては、サンド
イッチ法、競合法など種々の測定原理を用いることがで
きるが、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いたサンドイッ
チ法が好ましく用いられる。ペルオキシダーゼ標識抗体
を用いたサンドイッチ法は、 ａ）抗原を含む試料と、測定対象抗原と特異的に反応し
得る抗体を固体担体に固定させた固定化抗体と、測定対
象抗原と特異的に反応し得るペルオキシダーゼ標識抗体
とを反応させる過程、 ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗体−測定対象抗原−ペル
オキシダーゼ標識抗体を未反応のペルオキシダーゼ標識
抗体と分離する過程、および ｃ）固体単体に固定された複合体を該複合体と含まれる
ペルオキシダーゼを利用して検出する過程 を含むことを特徴とする酵素免疫測定法である。固定化
抗体用の担体としては適宜選択されるが、プラスチック
試験管、マイクロタイタープレート、ガラスビーズ、プ
ラスチックビーズ、メンブレン、磁気ビーズ等が用いら
れる。
イッチ法、競合法など種々の測定原理を用いることがで
きるが、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いたサンドイッ
チ法が好ましく用いられる。ペルオキシダーゼ標識抗体
を用いたサンドイッチ法は、 ａ）抗原を含む試料と、測定対象抗原と特異的に反応し
得る抗体を固体担体に固定させた固定化抗体と、測定対
象抗原と特異的に反応し得るペルオキシダーゼ標識抗体
とを反応させる過程、 ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗体−測定対象抗原−ペル
オキシダーゼ標識抗体を未反応のペルオキシダーゼ標識
抗体と分離する過程、および ｃ）固体単体に固定された複合体を該複合体と含まれる
ペルオキシダーゼを利用して検出する過程 を含むことを特徴とする酵素免疫測定法である。固定化
抗体用の担体としては適宜選択されるが、プラスチック
試験管、マイクロタイタープレート、ガラスビーズ、プ
ラスチックビーズ、メンブレン、磁気ビーズ等が用いら
れる。
【００１４】本発明の酵素免疫測定法は、いわゆる１ス
テップサンドイッチ法、２ステップサンドイッチ法のど
ちらにも使用できる。
テップサンドイッチ法、２ステップサンドイッチ法のど
ちらにも使用できる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００１６】実施例１２ステップサンドイッチＥＩＡ法によるＣＡ１９−９定
量キット作成時における過酸化水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
量キット作成時における過酸化水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
【００１７】 抗ＣＡ１９−９モノクロ−ナル抗体を
ポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処理
したのち、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略）やシ
ョ糖を加えて安定化させ、乾燥処理したプレ−ト、 ＣＡ１９−９溶液（濃度３００Ｕ／ｍｌ）、 ペルオキシダ−ゼ標識抗ＣＡ１９−９抗体溶液、 より詳しくは、抗ＣＡ１９−９抗体をメルカプトエチル
アミンで処理してＳＨ基を導入したものに、ペルオキシ
ダ−ゼをε−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミ
ドで処理してマレイミド基を導入したものを加え、カッ
プリング反応をおこなった後、ヒドロキシアパタイトカ
ラムで精製する（ペルオキシダ−ゼ標識抗ＣＡ１９−９
抗体の作成）。さらにバッファー交換後、同標識抗体と
ＢＳＡを含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液の状態で保
管し、使用直前に下記試薬で１０１倍に希釈調製後希
釈する。
ポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処理
したのち、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略）やシ
ョ糖を加えて安定化させ、乾燥処理したプレ−ト、 ＣＡ１９−９溶液（濃度３００Ｕ／ｍｌ）、 ペルオキシダ−ゼ標識抗ＣＡ１９−９抗体溶液、 より詳しくは、抗ＣＡ１９−９抗体をメルカプトエチル
アミンで処理してＳＨ基を導入したものに、ペルオキシ
ダ−ゼをε−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミ
ドで処理してマレイミド基を導入したものを加え、カッ
プリング反応をおこなった後、ヒドロキシアパタイトカ
ラムで精製する（ペルオキシダ−ゼ標識抗ＣＡ１９−９
抗体の作成）。さらにバッファー交換後、同標識抗体と
ＢＳＡを含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液の状態で保
管し、使用直前に下記試薬で１０１倍に希釈調製後希
釈する。
【００１８】 ０．０５〜０．２０％の過酸化水素を
含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液 通常の方法により３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解
後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液と混合調製した
溶液、 １ＮＨ2 ＳＯ4 、 ０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン
(20)ソルビタンモノラウレ−トを含む０．１ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、および ０．０２４％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモ
ノラウレ−トを含むリン酸緩衝液
含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液 通常の方法により３，３’，５，５’−テトラメチ
ルベンジジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解
後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液と混合調製した
溶液、 １ＮＨ2 ＳＯ4 、 ０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン
(20)ソルビタンモノラウレ−トを含む０．１ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、および ０．０２４％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモ
ノラウレ−トを含むリン酸緩衝液
【００１９】Ｂ．操作法 以下の操作手順で測定を行い、感度を調整した。
【００２０】(1) 試薬に試薬をウエルあたり４００
μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄操
作と呼ぶ）。
μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄操
作と呼ぶ）。
【００２１】(2) 次に試薬をウエルあたり１００μｌ
分注し、さらに試薬をウエルあたり２０μｌ分注す
る。プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て２時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
分注し、さらに試薬をウエルあたり２０μｌ分注す
る。プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て２時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
【００２２】(3) 反応終了後、液を吸引除去し、洗浄操
作を３回おこなう。
作を３回おこなう。
【００２３】(4) 試薬をウエルあたり１００μｌ分注
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
【００２４】(5) 反応終了前に試薬と試薬を２０：
１で混合した基質液を予め調製しておく。
１で混合した基質液を予め調製しておく。
【００２５】(6) 反応終了後、液を吸引除去し、洗浄操
作を３回おこなう。
作を３回おこなう。
【００２６】(7) 基質液をウエルあたり１００μｌ分注
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で発色反応をおこなう。
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で発色反応をおこなう。
【００２７】(8) 反応終了後、試薬をウエルあたり１
００μｌ分注して反応を停止させ、４５０ｎｍと６５０
ｎｍにおける吸光度を測定する。
００μｌ分注して反応を停止させ、４５０ｎｍと６５０
ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２８】(9) 測定終了後、過酸化水素濃度と吸光度
差（４５０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ１からＣ１までの
３ロットでの測定結果を表１および図１に示す。
差（４５０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ１からＣ１までの
３ロットでの測定結果を表１および図１に示す。
【表１】 (10)目標感度をＣＡ１９−９濃度が３００Ｕ／ｍｌでの
吸光度差を１．８とした場合、図１の応答曲線から得ら
れた過酸化水素の最適濃度を表２に示す。
吸光度差を１．８とした場合、図１の応答曲線から得ら
れた過酸化水素の最適濃度を表２に示す。
【表２】
【００２９】実施例２２ステップサンドイッチＥＩＡ法によるヒトＩＦＮ−β
定量キット作成時における過酸化水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
定量キット作成時における過酸化水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
【００３０】 抗ヒトＩＦＮ−βポリクロ−ナル抗体
をポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処
理したのち、ＢＳＡやショ糖を加えて安定化させ、乾燥
処理したプレ−ト、 ヒトＩＦＮ−β溶液（２００ＩＵ／ｍｌ）、 ペルオキシダ−ゼ標識抗ヒトＩＦＮ−β抗体溶液、 より詳しくは、抗ヒトＩＦＮ−βモノクロ−ナル抗体を
ペプシン処理してＦ（ａｂ´）2 化したものをメルカプ
トエチルアミンで処理してＦab´化（ＳＨ基を導入）し
たものに、ペルオキシダ−ゼをε−マレイミドカプロイ
ルオキシスクシンイミドで処理してマレイミド基を導入
したものを加え、カップリング反応をおこなった後、ヒ
ドロキシアパタイトカラムで精製する（ペルオキシダ−
ゼ標識抗ヒトＩＦＮ−β抗体の作成）。さらにバッファ
−交換後、同標識抗体とＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液の状態で保管し、使用直前に下記試薬で６倍に希
釈調製後使用する。
をポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処
理したのち、ＢＳＡやショ糖を加えて安定化させ、乾燥
処理したプレ−ト、 ヒトＩＦＮ−β溶液（２００ＩＵ／ｍｌ）、 ペルオキシダ−ゼ標識抗ヒトＩＦＮ−β抗体溶液、 より詳しくは、抗ヒトＩＦＮ−βモノクロ−ナル抗体を
ペプシン処理してＦ（ａｂ´）2 化したものをメルカプ
トエチルアミンで処理してＦab´化（ＳＨ基を導入）し
たものに、ペルオキシダ−ゼをε−マレイミドカプロイ
ルオキシスクシンイミドで処理してマレイミド基を導入
したものを加え、カップリング反応をおこなった後、ヒ
ドロキシアパタイトカラムで精製する（ペルオキシダ−
ゼ標識抗ヒトＩＦＮ−β抗体の作成）。さらにバッファ
−交換後、同標識抗体とＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液の状態で保管し、使用直前に下記試薬で６倍に希
釈調製後使用する。
【００３１】 ０．０１４〜０．０２０％の過酸化水
素を含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液、 、およびの試薬は実施例１と同じ、および ０．１３３％ＢＳＡ，０．０６７％ポリオキシエチ
レン(20)ソルビタンモノラウレ−トを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液
素を含む０．１Ｍ酢酸−クエン酸緩衝液、 、およびの試薬は実施例１と同じ、および ０．１３３％ＢＳＡ，０．０６７％ポリオキシエチ
レン(20)ソルビタンモノラウレ−トを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液
【００３２】Ｂ．操作法 以下の操作手順で測定を行い、感度を調整した。
【００３３】(1）試薬に試薬をウエルあたり４００
μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄操
作と呼ぶ）。
μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄操
作と呼ぶ）。
【００３４】(2）次に試薬をウエルあたり５０μｌ分
注し、さらに試薬をウエルあたり１００μｌ分注す
る。プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て２時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
注し、さらに試薬をウエルあたり１００μｌ分注す
る。プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て２時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
【００３５】(3）〜(8）の操作手順は実施例１に同じ。
【００３６】(9）測定終了後、過酸化水素濃度と吸光度
差（４５０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ２からＣ２までの
３ロットでの測定結果を表３および図２に示す。
差（４５０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ２からＣ２までの
３ロットでの測定結果を表３および図２に示す。
【表３】
【００３７】（10）目標感度をヒトＩＦＮ−β濃度が２
００ＩＵ／mlでの吸光度差を１．８とした場合、図２の
応答曲線から得られた過酸化水素の最適濃度を表４に示
す。
００ＩＵ／mlでの吸光度差を１．８とした場合、図２の
応答曲線から得られた過酸化水素の最適濃度を表４に示
す。
【表４】
【００３８】実施例３アビジン−ビオチン増幅２ステップサンドイッチＥＩＡ
法によるヒトＩＬ−６定量キット作成時における過酸化
水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
法によるヒトＩＬ−６定量キット作成時における過酸化
水素濃度最適化 Ａ．試薬 以下の試薬を用いた。
【００３９】 抗ヒトＩＬ−６モノクロ−ナル抗体を
ポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処理
したのち、ＢＳＡやショ糖を加えて安定化させ、乾燥処
理したプレ−ト、 ヒトＩＬ−６溶液（６００ｐｇ／ｍｌ）、 ビオチン標識抗ヒトＩＬ−６抗体溶液、 より詳しくは、抗ヒトＩＬ−６モノクロ−ナル抗体をペ
プシン処理してＦ（ａｂ´）2 化したものをＮＨＳ−Ｌ
Ｃビオチンで処理してビオチン化後、ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液の状態で保管する。使用直前に下記試薬(10)で
１１倍に希釈調製後使用する。
ポリスチレン製イムノモジュ−ルプレ−トに固定化処理
したのち、ＢＳＡやショ糖を加えて安定化させ、乾燥処
理したプレ−ト、 ヒトＩＬ−６溶液（６００ｐｇ／ｍｌ）、 ビオチン標識抗ヒトＩＬ−６抗体溶液、 より詳しくは、抗ヒトＩＬ−６モノクロ−ナル抗体をペ
プシン処理してＦ（ａｂ´）2 化したものをＮＨＳ−Ｌ
Ｃビオチンで処理してビオチン化後、ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液の状態で保管する。使用直前に下記試薬(10)で
１１倍に希釈調製後使用する。
【００４０】 ペルオキシダ−ゼ標識アビジン溶液、 より詳しくは、ペルオキシダ−ゼをＮＨＳ−ＬＣビオチ
ンで処理してビオチン化したものにストレプトアビジン
を加えてアビジンを導入した後、ＢＳＡを含むリン酸緩
衝液の状態で保管する。使用直前に下記試薬(10)で１１
倍に希釈調製後使用する。
ンで処理してビオチン化したものにストレプトアビジン
を加えてアビジンを導入した後、ＢＳＡを含むリン酸緩
衝液の状態で保管する。使用直前に下記試薬(10)で１１
倍に希釈調製後使用する。
【００４１】 ０．０１２〜０．０１５％の過酸化水
素を含む０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液、 ο−フェニレンジアミン２塩酸塩を１０ｍｇ含む錠
剤、 １ＮＨ2 ＳＯ4 、 １．０％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン(2
0)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液、 ０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン
(20)ソルビタンモノラウレ−トを含むリン酸緩衝液、お
よび(10)０．０２４％ポリオキシエチレン(20)ソルビタ
ンモノラウレ−トを含むリン酸緩衝液。
素を含む０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液、 ο−フェニレンジアミン２塩酸塩を１０ｍｇ含む錠
剤、 １ＮＨ2 ＳＯ4 、 １．０％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン(2
0)ソルビタンモノラウレートを含むリン酸緩衝液、 ０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ポリオキシエチレン
(20)ソルビタンモノラウレ−トを含むリン酸緩衝液、お
よび(10)０．０２４％ポリオキシエチレン(20)ソルビタ
ンモノラウレ−トを含むリン酸緩衝液。
【００４２】Ｂ．操作法 以下の操作手順で測定を行い、感度を調整した。
【００４３】(1) 試薬に試薬(10)をウエルあたり４０
０μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄
操作と呼ぶ）。
０μｌ分注後、吸引除去する（以下この単位操作を洗浄
操作と呼ぶ）。
【００４４】(2) 試薬をウエルあたり５０μｌ分注
し、さらに試薬を１００μｌ分注後室温にて２時間振
とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
し、さらに試薬を１００μｌ分注後室温にて２時間振
とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
【００４５】(3) 反応終了後、液を吸引除去し、洗浄操
作を３回おこなう。
作を３回おこなう。
【００４６】(4) 試薬をウエルあたり１００μｌ分注
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て１時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て１時間振とう条件下で抗原抗体反応をおこなう。
【００４７】(5) 反応終了後、液を吸引除去し、洗浄操
作を３回おこなう。
作を３回おこなう。
【００４８】(6) 試薬をウエルあたり１００μｌ分注
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下でビオチン−アビジン反応をお
こなう。
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下でビオチン−アビジン反応をお
こなう。
【００４９】(7) 反応終了前に試薬１１ｍｌに試薬
１錠を溶解した基質液を予め調製しておく。
１錠を溶解した基質液を予め調製しておく。
【００５０】(8) 反応終了後、液を吸引除去し、洗浄操
作を４回おこなう。
作を４回おこなう。
【００５１】(9) 基質液をウエルあたり１００μｌ分注
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で発色反応をおこなう。
し、プレ−トシ−ルでプレ−トをシ−ルした後、室温に
て３０分間振とう条件下で発色反応をおこなう。
【００５２】(10)反応終了後、試薬をウエルあたり１
００μｌ分注して反応を停止させ、４９２ｎｍと４０５
ｎｍにおける吸光度を測定する。
００μｌ分注して反応を停止させ、４９２ｎｍと４０５
ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００５３】(11)測定終了後、過酸化水素濃度と吸光度
差（４９２ｎｍと４０５ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ３からＣ３までの
３ロットでの測定結果を表５および図３に示す。
差（４９２ｎｍと４０５ｎｍの吸光度の測定値の差）の
相関表と相関図を作成する。ロットＡ３からＣ３までの
３ロットでの測定結果を表５および図３に示す。
【表５】
【００５４】(12)目標感度をＩＬ−６濃度が６００ｐｇ
／ｍｌでの吸光度差を１．８とした場合、図３の応答曲
線から得られた過酸化水素の最適濃度を表６に示す。
／ｍｌでの吸光度差を１．８とした場合、図３の応答曲
線から得られた過酸化水素の最適濃度を表６に示す。
【００５５】
【表６】
【００５６】
【発明の効果】本発明はペルオキシダ−ゼ標識物質を用
いたＥＩＡにおいて、従来よりも簡便な方法で容易に感
度を目標値に調整することを可能にした。従って、安定
な高感度酵素免疫測定法を提供することができる。
いたＥＩＡにおいて、従来よりも簡便な方法で容易に感
度を目標値に調整することを可能にした。従って、安定
な高感度酵素免疫測定法を提供することができる。
【図１】ＣＡ１９−９濃度が３００Ｕ／ｍｌにおける過
酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
【図２】ヒトＩＦＮ−β濃度が２００ＩＵ／ｍｌにおけ
る過酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
る過酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
【図３】ヒトＩＬ−６濃度が６００ｐｇ／ｍｌにおける
過酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
過酸化水素濃度と吸光度差の相関図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 ペルオキシダ−ゼ標識物質を用いた酵
素免疫測定法において、基質液中の過酸化水素濃度と感
度の応答曲線から最適過酸化水素濃度を得、その濃度を
用いることを特徴とする酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6390994A JPH07270415A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6390994A JPH07270415A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 酵素免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07270415A true JPH07270415A (ja) | 1995-10-20 |
Family
ID=13242940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6390994A Pending JPH07270415A (ja) | 1994-03-31 | 1994-03-31 | 酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07270415A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001077182A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Antibody/carrier complex, process for producing the same, method of controlling antigen-antibody reaction by using the same and immunoassay method |
| WO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| JPWO2017056844A1 (ja) * | 2015-09-28 | 2018-07-12 | コニカミノルタ株式会社 | 前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法 |
| CN116577502A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-08-11 | 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌荧光检测试剂盒及其应用 |
-
1994
- 1994-03-31 JP JP6390994A patent/JPH07270415A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001077182A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Antibody/carrier complex, process for producing the same, method of controlling antigen-antibody reaction by using the same and immunoassay method |
| WO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| JPWO2016129444A1 (ja) * | 2015-02-12 | 2017-11-24 | コニカミノルタ株式会社 | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット |
| JPWO2017056844A1 (ja) * | 2015-09-28 | 2018-07-12 | コニカミノルタ株式会社 | 前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法 |
| US11105807B2 (en) | 2015-09-28 | 2021-08-31 | Konica Minolta, Inc. | Method for estimating pathological tissue diagnosis result (Gleason score) of prostate cancer |
| CN116577502A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-08-11 | 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌荧光检测试剂盒及其应用 |
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