JPH07274974A

JPH07274974A - ビベンジル合成酵素遺伝子

Info

Publication number: JPH07274974A
Application number: JP6268150A
Authority: JP
Inventors: Helmut Kindl; ヘルムート・キンドル; Ruediger Hain; リユデイガー・ハイン; Hans-Joerg Reif; ハンス−イエルク・ライフ
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1993-10-13
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 1995-10-24
Also published as: EP0648839A1; DE4334791A1; US5589620A

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、植物から単離されたビベンジル合
成酵素の新規な遺伝子、ならびにベクター、宿主生物お
よび植物を形質転換するためのそれらの使用、同じく病
害虫（ｐｅｓｔ）に対する抵抗性の高められた植物を生
産するためのそれらの使用に関する。【効果】病害虫に対して植物の抵抗性を高めることの
できる手段が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物から単離されたビ
ベンジル合成酵素の新規な遺伝子、ならびにベクター、
宿主生物および植物を形質転換するためのそれらの使
用、同じく病害虫（ｐｅｓｔ）に対する抵抗性の高めら
れた植物を生産するためのそれらの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】フェノール成分、特に１−（３，５−ジ
ヒドロキシフェニル）−２−（３−ヒドロキシフェニ
ル）−エタンは、ラン類において生成し、病害虫、特に
真菌類、細菌類および昆虫類に対して毒性効果をもつも
のであって、それはビベンジルと呼ばれる。ラン類のこ
れらの物質を合成する能力は、重要な防御機構であると
考えられる。商業上重要な植物が、ビベンジルを生成す
る能力もつこと、または病害虫に対して十分な抵抗性を
与える量においてそれらを生産することは知られていな
い。

【０００３】病害虫に対する抵抗性を高められた植物を
生産するためにスチルベン合成酵素遺伝子を使用するこ
とは、欧州特許出願公開第0 309 862号および欧州特許
出願公開第0 464 461号により知られる。これらの明細
書は、特に、南京豆植物およびブドウの木からのレスベ
ラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）合成酵素遺伝子
について記述している。

【０００４】

【発明の構成】ビベンジルの合成に関する新規な遺伝子
（“ビベンジル合成酵素遺伝子”）は、今初めて発見さ
れたものであって、その遺伝子は、いかなるビベンジル
も生産しないか、ビベンジルを不十分な量においてのみ
生産する植物の遺伝物質（ゲノム）中に組み込まれ、そ
れによって病害虫に対するこれらの植物の抵抗性を高め
る。用語ビベンジルは、フェノール性ビベンジル、好ま
しくは１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２−
（３−ヒドロキシフェニル）−エタンを意味する。

【０００５】驚くべきことに、相当する形質転換植物
は、ビベンジルを発現し、その植物にとって不利益ない
かなる影響をも与えることなく、病害虫に対して良好な
抵抗性を示す。

【０００６】ビベンジル合成酵素遺伝子は、自然環境か
ら単離され、またはベクターに組み込まれ、あるいは
“外来”ＤＮＡとしてまたは“付加”ＤＮＡとして原核
もしくは真核生物ＤＮＡに含有されるこの核酸によっ
て、ＲＮＡへの転写およびタンパク質への翻訳の後、ビ
ベンジル合成酵素の性質をもつ酵素の産成をもたらす
（結果的にビベンジル生成に働く）全ての核酸（ＤＮ
Ａ）を意味すると理解される。

【０００７】ビベンジル合成酵素遺伝子は、また、それ
らの始めおよび／または終わりに、その遺伝子の機能を
妨げないか、またはほとんど問題にならない程度に妨げ
るだけのその他のＤＮＡ配列を含有するビベンジル合成
酵素遺伝子を意味するとも理解される。これらのＤＮＡ
配列、また“遺伝子単位”とも呼ばれるが、それは、例
えば、慣用の制限酵素に対する開裂部位が、ちょうどそ
の遺伝子の始めおよび終わりにおいて存在しない場合
の、制限酵素による切断の結果として生じる。そのビベ
ンジル合成酵素遺伝子および遺伝子単位は、また遺伝子
を操作するために、各場合において企画されるＤＮＡ配
列（例えば、“リンカー”）を、その配列の末端に保持
することもできる。

【０００８】ビベンジル合成酵素遺伝子（または遺伝子
単位）は、それらが植物のゲノム（ビベンジル合成酵素
をコードしていない、そして／または調節効果をもたな
い塩基配列（イントロンのような）を含んでなる“遺伝
子”型）に含まれている形で存在するか、あるいは逆転
写酵素／ポリメラーゼによってｍＲＮＡを経て得ること
ができるｃＤＮＡ（コピーＤＮＡ）に対応する（そして
いかなるイントロンも含まない）形で存在することがで
きる。ビベンジル合成酵素遺伝子は、また、部分的また
は完全合成の形で存在することができる。合成遺伝子
は、また対応する天然の遺伝子の部分の新規なスプライ
シングの結果として生じるものとも理解されている。

【０００９】本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子
（または遺伝子単位）のＤＮＡのセグメントは、その遺
伝子がなおビベンジル形成を起こす限りは、他のＤＮＡ
セグメントまたは本質的に同じ効果をもつＤＮＡによっ
て置換されてもよい。本発明による遺伝子もしくは遺伝
子部分は、また、ＤＮＡ変化が遺伝暗号の縮重に起因し
て存在しているものを包含する。

【００１０】本明細書において、“外来”ＤＮＡは、特
定の原核もしくは真核生物ゲノム中に天然には存在しな
いが、人間の介在の結果としてのみこのゲノム中に取り
入れられる（形質転換）ＤＮＡを意味すると理解され
る。“付加”ＤＮＡは、関連した原核もしくは真核生物
ゲノムには、天然には存在しないが、人間の介在の結果
として付加的な量においてこのゲノム中に取り入れられ
る（形質転換）ＤＮＡを意味することを意図する。特定
の場合の要件および性質に応じて、“外来”ＤＮＡもし
くは“付加”ＤＮＡは、１もしくは複数のコピーにおい
て組み込まれる。本発明によるビベンジル合成酵素遺伝
子（もしくは遺伝子単位）に伴って植物体もしくは植物
細胞内に生成するビベンジル合成酵素は、ビベンジル合
成酵素として働く、すなわち１種もしくは多種のビベン
ジルを生産し、病害虫に対する抵抗性を増大させる各酵
素を意味する。

【００１１】本発明による好適なビベンジル合成酵素遺
伝子は、それが、プラスミドｐｉｎｐ８．１．１に含ま
れるｃＤＮＡ配列もしくはその部分と、または配列番号
（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１もしくはその部分とハイブ
リダイズし、そしてビベンジル合成酵素をコードしてい
ることを特徴とする。

【００１２】本発明による好適なビベンジル合成酵素遺
伝子は、ラン類、特に好ましくはファレノプシス種（Ｐ
ｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓｓｐｐ．）、ブレチラ・スト
リアタ（Ｂｌｅｔｉｌｌａｓｔｒｉａｔａ）もしくは
エピパクチス・パルストリス（Ｅｐｉｐａｃｔｉｓｐ
ａｌｕｓｔｒｉｓ）に存在し、そしてそれらから単離す
ることができるビベンジル合成酵素遺伝子である。

【００１３】その部分塩基配列が、プラスミドｐ８．
１．１（以下に詳細に記載される）上にｃＤＮＡの形で
存在しているビベンジル合成酵素遺伝子、および本質的
に同様な効果を有するそのＤＮＡ塩基配列は、本発明に
よるビベンジル合成酵素遺伝子として著しく適切であ
る。プラスミドｐ８．１．１上のそのｃＤＮＡは、ビベ
ンジル合成酵素をコードしている構造遺伝子に対応す
る。したがって、プラスミドｐ８．１．１上のｃＤＮＡ
は、ビベンジル合成酵素構造遺伝子として直接使用する
ことができる。

【００１４】そのプラスミド上に含まれるｃＤＮＡは、
ファレノプシスから単離された。そのｃＤＮＡは、長さ
が約１，６００塩基対の配列からなる。４５３塩基対の
部分配列は、配列リストの配列番号：１に含まれる。そ
れから生じるタンパク質配列は、配列番号：２に含まれ
る。

【００１５】ラン類（特に、ファレノプシス種、ブレチ
ラ・ストリアタおよびエピパクチス・パルストリス）に
存在するビベンジル合成酵素遺伝子は、長い範囲にわた
ってＤＮＡ配列相同性を表すことが分かっている。それ
故、その配列相同性のために、本発明によるビベンジル
合成酵素遺伝子は、植物から簡単な方法で、プラスミド
ｐ８．１．１または配列番号：１と同一の配列情報を含
むｃＤＮＡもしくはその部分を用いる分子生物学の通常
の既知の方法によって単離される。

【００１６】実際的にあらゆるランの種類、好ましくは
ファレノプシス種、ブレチラ・ストリアタおよびエピパ
クチス・パルストリスが、本発明によるビベンジル合成
酵素遺伝子が単離できる植物としての使用するのに適し
ている。

【００１７】既に述べたように、プラスミドｐ８．１．
１上に存在するｃＤＮＡとハイブリダイズする本発明に
よるビベンジル合成酵素遺伝子もしくはそれらをコード
している領域は、好適である。その遺伝子もしくはその
コード領域は、ｃＤＮＡを用いる常法において得ること
ができる。本発明によれば、プラスミドｐ８．１．１上
に含まれるｃＤＮＡ配列、またはこのｃＤＮＡ配列の塩
基配列を含む対応するＤＮＡ配列は、そのコード領域
（もしくは構造遺伝子）として特に好適である。エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐ８．１．１は、プラスミド
ｐ８．１．１を含有する。この菌株は、Deutsche Samml
ung von Mikroorganismen (DSM) (German Collection o
f Microorganisms), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Bra
unschweig, Federal Republic ofGermanyに、特許手続
き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約
の規定に従って寄託されている（寄託日：1993年9月27
日）。それは寄託番号DSM 8580を与えられた。

【００１８】この菌株およびその変異株は、同様に本発
明の一部をなす。この宿主中に堆積されたプラスミドｐ
８．１．１は、常法においてその菌株を複製し、続いて
そのプラスミドを単離することによって、容易に必要量
を単離することができる。

【００１９】本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子の
ような機能的に完全な遺伝子は、調節部分（特にプロモ
ーターにおいて）およびタンパク質ビベンジル合成酵素
をコードしている構造遺伝子からなる。

【００２０】両遺伝子部分は、互いに独立して使用する
ことができる。したがって、植物遺伝子中への組み込み
に続いて発現されるべきその他のＤＮＡ配列（ビベンジ
ル合成酵素遺伝子とは異なる）を、調節部分の下流に配
置することが可能である。植物体もしくは植物細胞にお
いてその効果を発揮することができる単離プロモーター
は、比較的少数のものが知られているだけであるので、
本発明の同様な構成要素であるビベンジル合成酵素遺伝
子のプロモーターは、形質転換された植物体もしくは植
物細胞の生産において貴重な手助けとなる。

【００２１】“外来”調節部分をビベンジル合成酵素構
造遺伝子の上流に配置することも、同様に可能である。
本明細書において、欧州特許出願公開第0 309 862号お
よび欧州特許出願公開第0 464 461号によるスチルベン
合成酵素プロモーターは、特に有効に使うことができ
る。例えば、ある種の調節遺伝子（例えば、その植物に
とって内在性の）のみが特定の植物において十分に活性
が高い場合には、このことは都合がよい。したがって、
ビベンジル合成酵素構造遺伝子、特に、同様に、プラス
ミドｐ８．１．１のｃＤＮＡに対応するか、またはこの
配列を含む構造遺伝子は、独立して用いられる有効な単
位を代表するものであり、既に説明したように、同じく
本発明の部分である。本発明によるビベンジル合成酵素
遺伝子は、通常の方法によって調節部分と構造遺伝子に
分離することができる。新規な機能的“合成”遺伝子を
作成するために、異なる天然に存在するビベンジル合成
酵素遺伝子を組み合わせることも可能である。本発明に
よる完全な天然のビベンジル合成酵素遺伝子（もしくは
遺伝子単位）は好適に使用される。

【００２２】常法によって、ビベンジル合成酵素遺伝子
（もしくは遺伝子単位）またはその部分を、１回もしく
は１回以上（例えば、縦列配列）、好ましくは１回、任
意に選択された原核生物（好ましくは細菌）もしくは真
核生物（好ましくは植物）の“外来”もしくは“付加”
ＤＮＡのようなＤＮＡ中に組み込むことができる。かく
して、例えば、タンパク質をコードしているＤＮＡが、
調節配列とともに提供され、植物に組み込むことができ
る。例えば、植物体もしくは植物細胞を形質転換するた
めに使用され、そして形質転換に続いて植物体もしくは
植物細胞中に含有されるこの方法において“改変され
た”組み換えＤＮＡは、本発明の構成要素である。

【００２３】ビベンジル合成酵素遺伝子（もしくは遺伝
子単位）および／またはそれらの部分、同じく組み換え
ＤＮＡは、“外来”もしくは“付加”ＤＮＡとして、ベ
クター中に（特定のプラスミド、コスミドもしくはファ
ージに）、形質転換された微生物（好ましくは細菌、特
にＥ．コリのようなグラム陰性細菌）中に、および形質
転換された植物細胞および植物体中に、またはそれらの
ＤＮＡ中に含有され得る。そのようなベクター、形質転
換微生物、ならびに形質転換植物細胞および植物体、そ
してそれらのＤＮＡは、本発明の構成要素を表す。

【００２４】既に示したように、ビベンジル合成酵素遺
伝子（もしくは遺伝子単位）は、本発明に従って、１回
もしくは１回以上（ゲノム中の同一もしくは異なる部位
において）天然の植物ゲノムに組み込まれ、そして互い
に異なる遺伝子を組み合わせることも可能である。ビベ
ンジル合成酵素を既に合成できる植物（ラン類）の場合
には、本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子の１個も
しくは複数個の組み込みは、実質的に抵抗性を改善する
方向に導くことができる。いかなるビベンジル合成酵素
遺伝子をも含まない植物の場合には、病害虫に対する抵
抗性を増大することを、そのような遺伝子を組み込むこ
とによって同様に達成される。好ましければ、本発明に
よる構造遺伝子のみが、その他の植物から、または、そ
の遺伝子の上流に置かれている問題の特定の植物から単
離された調節ＤＮＡ要素とともに使用される。

【００２５】本発明による形質転換植物細胞および植物
体の抵抗性の増大は、農業および林業、観葉植物の栽
培、薬用植物の栽培および植物育種にとって重要性をも
つ。例えば、医薬に利用できる物質を得るために植物細
胞を培養する場合には、微生物的病害、特に真菌類によ
る感染に対して抵抗性の増大を示す有用な植物細胞を利
用することが、また得策である。

【００２６】従って、本発明はまた、病害虫に対して抵
抗性の増加した形質転換された植物細胞（プロトプラス
トを含む）および植物体（植物体部分および種子を含
む）を作製する方法にも関するものであって、その方法
は、次のことを特徴とする：（ａ）ビベンジル合成酵素
をコードするＤＮＡ配列を含有している本発明による１
個もしくは複数個のビベンジル合成酵素遺伝子（もしく
は遺伝子単位）および／またはビベンジル合成酵素遺伝
子（もしくは遺伝子単位）の部分および／または組み換
えＤＮＡが、植物細胞（プロトプラストを含む）のゲノ
ム中に挿入され、そして適宜、（ｂ）完全な形質転換植
物体が、形質転換植物細胞（プロトプラストを含む）か
ら再生され、そして適宜、複製され、そして適宜、
（ｃ）目的の植物体部分（種子を含む）が、かくして得
られた親世代の、またはそれから得られる後の世代の形
質転換植物体から単離される。

【００２７】操作段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、
既知の操作および方法によって常法のとおり実施するこ
とができる。

【００２８】“外来”もしくは“付加”ＤＮＡとして１
個もしくは複数個のビベンジル合成酵素遺伝子（もしく
は遺伝子単位）および／またはビベンジル合成酵素遺伝
子（もしくは遺伝子単位）の部分を含有する形質転換植
物細胞（プロトプラストを含む）および植物体（植物体
部分および種子を含む）、そして先の操作によって得ら
れるそれらの形質転換植物細胞および植物体は、本発明
に同じく包含される。次に挙げることは、また本発明の
部分である：（ａ）植物細胞（プロトプラストを含む）
および植物体（植物体部分および種子を含む）を形質転
換するための、本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子
（もしくは遺伝子単位）の、および／またはそれらの部
分の、および／または組み換えＤＮＡの、および／また
は本発明による形質転換微生物の使用、（ｂ）複製材料
を生産するため、ならびに新規な植物体およびその複製
材料を生産するための、本発明による形質転換植物細胞
（プロトプラストを含む）および植物体（植物体部分お
よび種子を含む）の使用、（ｃ）病害虫を防御するため
の、本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子（もしくは
遺伝子単位）の、および／または本発明によるそれらの
部分のおよび／または組み換えＤＮＡの使用、そして
（ｄ）ビベンジル合成酵素遺伝子もしくはそれらの部分
を植物体から単離するための、そして、植物体におい
て、および（一般的に）トランスジェニック植物細胞
（プロトプラストを含む）および植物体（植物体部分お
よび種子を含む）の生産において、ビベンジル合成酵素
遺伝子を特定するための、プラスミドｐ８．１．１に含
まれるｃＤＮＡまたはその部分の、および配列表の配列
番号：１と同一の配列情報に対応するＤＮＡ配列の使
用、ならびに、ビベンジル合成酵素遺伝子の単離および
検出（例えば、慣用の抗体技術によって）における、ｐ
８．１．１の構造遺伝子によってコードされたタンパク
質配列（ビベンジル合成酵素）および配列番号：２と同
一のタンパク質の使用。本発明によるビベンジル合成酵
素遺伝子（特にｐ８．１．１の構造遺伝子）によってコ
ードされたビベンジル合成酵素、ならびに、配列番号：
２と同一のタンパク質は、本発明に同じく包含される。

【００２９】多くの異なる方法が、ビベンジル合成酵素
遺伝子もしくは遺伝子単位、またはそれらの部分を、
“外来”もしくは“付加”ＤＮＡとして、植物体もしく
は植物細胞の遺伝物質に挿入ために有用である。遺伝子
伝達は、各場合に適する方法を容易に決定できる当業者
にとって通常の一般に既知の方法によって実行すること
ができる。

【００３０】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）からのＴｉプラスミドは、双子葉および単子葉植物
のゲノム中に外来ＤＮＡを伝達するために、特別に好適
な、そして広く応用可能なベクターとして有用である。
ビベンジル合成酵素をコードする遺伝物質は、調節ＤＮ
Ａ配列とともに適切なＴｉプラスミドのＴＤＮＡ中に
挿入され（例えば、Zambryski et al., 1983）、その植
物体の感染、例えば葉片、茎、胚軸、子葉、分裂組織の
ような植物体部分もしくは植物組織および例えば二次胚
およびカルスのようなそこから生じる組織の感染によっ
て、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンスとプ
ロトプラストとの混合培養によって伝達される。

【００３１】その他の方法は、ポリカチオンもしくはカ
ルシウム塩とポリエチレングリコールの存在で、植物プ
ロトプラストにおいて、目的の遺伝子を含む精製ＤＮＡ
をインキュベートすることである（例えば、Hain et a
l., 1985; Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1
984）。

【００３２】ＤＮＡの取り込みは、また、さらにエレク
トロポレーションを用いて促進される（例えば、Fromm
et al., 1986）。

【００３３】ＤＮＡは、また、既知の方法で、植物花粉
の方法によって、花粉、またはＤＮＡを担持する物理的
に加速された粒子によって“砲撃”される他の植物の部
分を用いて導入され得る（欧州特許出願公開第0 270 35
6号参照）。

【００３４】植物体は、適切な栄養培地を用いる既知の
方法で再生される（例えば、Nagy and Maliga 1976）。

【００３５】本発明による方法の好適な実施態様（欧州
特許出願公開第116 718号からの方法による）において
は、本発明の遺伝子もしくは遺伝子単位は、例えば、ｎ
ｐｔＩＩ（Herrera-Estrella et al., 1983）もしくは
ｈｐｔ（Van den Elzen et al. 1986）のようなリポー
ター遺伝子を、さらに含む適切な中間体Ｅ．コリのベク
ター、例えばｐＧＶ７００もしくはｐＧＶ７１０（欧州
特許出願公開第116 718号参照）または好ましくはその
誘導体中に、単離された形においてクローン化される。

【００３６】この方法で構築されたプラスミドは、常法
（例えば、Van Haute et al. 1983）により、例えばｐ
ＧＶ３８５０もしくはその誘導体（Zambryski et al. 1
983）を宿しているアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス中に伝達される。さもなくば、ビベンジル合成酵素
遺伝子単位は、バイナリーベクター、例えばｐＣＶ００
１もしくはｐＣＶ００２（例えば、Koncz and Schell 1
986）中にクローン化され、次いで上記のように適切な
アグロバクテリウム株（Koncz and Schell 1986）中に
伝達される。得られたアグロバクテリウム株は、植物へ
伝達できる形でのビベンジル合成酵素遺伝子もしくは遺
伝子単位を含み、続いてそれは植物の形質転換のために
使用される。

【００３７】さらに好適な実施態様においては、単離さ
れたビベンジル合成酵素遺伝子単位は、植物細胞に対す
るリポーター遺伝子、例えば、カナマイシン耐性（Herr
era-Estrella et al. 1983）もしくはハイグロマイシン
耐性（Van den Elzen 1986）、好ましくはｐＬＧＶｎｅ
ｏ２１０３（Hain et al. 1985）、ｐＭＯＮ１２９（Fr
aley R. T. et al., Proc. National Acad. Sci. USA 8
0, 4803 (1983)），ｐＡＫ１００３，ｐＡＫ２００４
（Velten J. et al., EMBO Journ. Vol. 3, 2723(198
4)）もしくはｐＧＳＳＴｎｅｏ３（ｐＧＳＳＴ３）（欧
州特許出願公開第189 707号）を含有するその他のプラ
スミドと適宜一緒にされて、直接的遺伝子伝達の方法
（例えば、Hain et al. 1985）によって植物プロトプラ
ストに常法により伝達される。このためには、そのプラ
スミドは、環状の形で提供されてもよいが、好ましくは
直鎖状の形で提供される。リポーター遺伝子を含んでい
るプラスミドが使用される場合には、次に、カナマイシ
ン耐性プロトプラストが、ビベンジル合成酵素の発現に
関してスクリーニングされる。そのほかの場合（カナマ
イシン耐性のない場合）には、得られるカルスが、ビベ
ンジル合成酵素遺伝子の発現に関してスクリーニングさ
れる（常法によるスクリーニング）。

【００３８】形質転換（トランスジェニック）植物体も
しくは植物細胞は、既知の方法、例えば、葉片ディスク
を形質転換すること（Horsch et al. 1985）、再生する
植物プロトプラストもしくは細胞培養をアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスとともに混合培養すること（Ma
rton et al. 1979, Hain et al. 1985）、またはＤＮＡ
による直接的トランスフェクションによって生産され
る。得られた形質転換植物は、ノザンブロット分析を用
いて、リポーター遺伝子の発現に関する選択、例えば、
試験管内での硫酸カナマイシンのリン酸化によって（Re
iss et al. 1984:Schreier et al. 1985）、さもなくば
ノパリン合成酵素（Aerts et al.1983）もしくはビベン
ジル合成酵素の発現によって検出される。ビベンジル合
成酵素およびビベンジルは、また既知の方法で、特異抗
体を用いて形質転換植物において検出される。ビベンジ
ル合成酵素は、また、酵素活性試験を用いて検出され
る。形質転換植物細胞は培養され、通常の一般に既知の
方法に従い、各場合において適切な栄養培地を用いて、
完全な植物体に再生される。

【００３９】本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子
（もしくは遺伝子単位）を含み、そして本発明の構成要
素である形質転換植物細胞および形質転換植物体の両方
は、本質的に病害虫、特に植物病原菌に対してより大き
な抵抗性を発揮する。

【００４０】本発明との関連において、表現“植物体
（ｐｌａｎｔｓ）”は、完全な植物体および葉、種子、
塊茎（ｔｕｂｅｒ）、切断部分（ｃｕｔｔｉｎｇｓ）等
のような植物体の部分の両方を表す。“植物細胞”は、
プロトプラスト、細胞系統、植物カルス、等を包含す
る。“複製材料（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｍａｔｅｒ
ｉａｌ）”は、形質転換された植物体および植物細胞を
複製するために使用できる植物体および植物細胞を表
し、そして同様に本発明の一部をなす。

【００４１】本明細書において、表現“本質的に同じ効
果をもつＤＮＡ配列”は、ビベンジル合成酵素遺伝子お
よびその部分の機能が、ビベンジル合成酵素がもはや生
成されないか、またはその調節遺伝子部分がもはや活性
をもたない程度には損なわれていない改変も、本発明が
また包含することを表す。適切な改変は、ＤＮＡセグメ
ント、個々のコドンおよび／または個々の核酸を、置換
し、付加し、および／または除去することによって実施
することができる。それらはまた、遺伝暗号の縮退を考
えて行われる。

【００４２】本発明により使用される微生物の場合にお
いて、“変異体”とは、本発明を実行するために不可欠
な特徴を発揮し、そして特に、プラスミドｐ８．１．１
を宿している改変された微生物を表す。

【００４３】本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子
（もしくは遺伝子単位）の組み込み（形質転換）によっ
て、病害虫に対して抵抗性もしくは増大した抵抗性を付
与できる植物は、ビベンジル合成酵素遺伝子が天然に存
在するラン類以外の全ての植物を実質的に包含する。森
林植物、例えばトウヒ、モミ、ダグラスモミ、マツ、カ
ラマツ、セイヨウブナおよびオーク、同様に食料および
原料を供給する植物、例えば穀類（特にコムギ、ライム
ギ、オオムギ、オートムギ、アワ、コメおよびトウモロ
コシ）、ジャガイモ、豆科植物（マメ類、特にアルファ
ルファおよびダイズ）、野菜類（特にキャベツの種類お
よびトマト）、果物（特にリンゴ、ナシ、イチゴ、グレ
ープ、柑橘類、パイナップルおよびバナナ）、オイルヤ
シ、チャ、ココアおよびコーヒーの木、タバコ、シサル
およびワタ、のような栽培植物の場合において、ならび
にローウォルフィア属およびジギタリス属のような薬用
植物の場合において、自然に抵抗性を持たせることは特
に必要なことである。ジャガイモ、トマトおよびマメ類
は、特に優先的に挙げられるであろう。好ましくは、本
発明によるビベンジル合成酵素遺伝子は、“外来”ＤＮ
Ａとして植物のゲノム中に組み込まれる。

【００４４】昆虫、コナダニおよびネマトーダのような
動物病害虫、および植物病原性真菌、細菌およびウイル
スのような微生物病害菌が、それに対する抵抗性もしく
は増大した抵抗性が、本発明によるビベンジル合成酵素
遺伝子の力によって達成できる病害虫として挙げられる
であろう。微生物病害菌、特に植物病原性真菌類は、特
別に強調される。

【００４５】有害な昆虫は、特に次の目の昆虫を包含す
る：直翅類、ハサミムシ類、シロアリ類、アザミウマ
類、異翅類、同翅類、鱗翅類、甲虫類、膜翅類および双
翅類。

【００４６】有害粉ダニは、特に次のものを包含する：
タルソネムス種（Tarsonemus spp.）、パノニクス種（P
anonychus spp.）およびテトラニクス種（Tetranychus
spp.）。

【００４７】有害ネマトーダは、特に次のものを包含す
る：プラチレンクス種（Pratylenchus spp.），ヘテロ
デラ種（Heterodera spp.）およびメロイドジーン種（M
eloidogyne spp.）。

【００４８】微生物病害菌は、特に植物病原性真菌を包
含する：ネコブカビ類、卵菌類、ツボカビ類、接合菌
類、子のう菌類、担子菌類、不完全菌類。

【００４９】植物病原性細菌は、特にシュードモナス
科、リゾビウム科、腸内細菌科、コリネバクテリア科お
よびストレプトミセス科を包含する。

【００５０】ウイルス病は、特にモザイク、矮化および
黄化ウイルス病を包含する。

【００５１】上記のカテゴリーに入り、実施例として挙
げられるが、境界として挙げられないであろうウイル
ス、真菌および細菌病のある種の原因となるものは、次
のものである：オオムギ黄色矮性ウイルス（ＢＹＤ
Ｖ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、キュウリモザ
イクウイルス（ＣＭＶ）、スイカモザイクウイルス（Ｗ
ＭＶ）、トリステザ（ｔｒｉｓｔｅｚａ）ウイルス、タ
バコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコ壊死ウイルス
（ＴＮＶ）、ビート壊死性黄色葉脈ウイルス（ＢＮＹＶ
Ｖ）、根茎ウイルス。

【００５２】例えば、キサントモナス・カンペストリス
ｐｖ．オリゼー（Xanthomonas campestris pv. oryza
e）のようなキサトモナス種；例えば、シュードモナス
・シリンゲーｐｖ．ラクリマンス(Pseudomonas syringa
e pv. lachrymans)のようなシュードモナス種；例え
ば、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）
のようなエルウィニア種；例えば、ピチウム・ウルチマ
ム（Pythium ultimum）のようなピチウム種；例えば、
フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infes
tans）のようなフィトフトラ種；例えば、シュードペロ
ノスポラ・フムリ（Pseudoperonospora humuli）もしく
はシュードペロノスポラ・クベンセ（Pseudoperonospor
a cubense）のようなシュードペロノスポラ種；例え
ば、プラスモパラ・ビチコラ（Plasmopara viticola）
のようなプラスモパラ種;例えば、ペロノスポラ・ピシ
（Peronospora pisi）もしくはＰ．ブラシカエ（P.bras
sicae）のようなペロノスポラ種；例えば、エリシフェ
・グラミニス（Erysiphe graminis）のようなエリシフ
ェ種；例えば、スフェロテカ・フリジネア（Spherothec
a fuliginea）のようなスフェロテカ種；例えば、ポド
スフェラ・ロイコトリカ（Podosphaera leucotricha）
のようなポドスフェラ種；例えば、ベンツリア・イネカ
リス（Venturia inaequalis）のようなベンツリア種；
例えば、ピレノフォラ・テレス（Pyrenophora teres）
もしくはＰ．グラミネア（P. graminea）のようなピレ
ノフォラ種（分生胞子形：ドゥレクスレラ（Drechsler
a）、ｓｙｎ：ヘルミントスポリウム（Helminthosporiu
m））；例えば、コクリオボルス・サチブス（Cochliobo
lus sativus）のようなコクリオボルス種（分生胞子
形：ドゥレクスレラ（Drechslera）、ｓｙｎ：ヘルミン
トスポリウム（Helminthosporium））；例えば、ウロミ
セス・アペンヂクラツス（Uromyces appendiculatus）
のようなウロミセス種；例えば、プシニア・レコンヂタ
（Puccinia recondita）のようなプシニア種；例えば、
チレチア・カリエス（Tilletia caries）のようなチレ
チア種；例えば、ウスチラゴ・ヌダ（Ustilago nuda）
もしくはウスチラゴ・アベネ（Ustilago avenae）のよ
うなウスチラゴ種；例えば、ペリクラリア・ササキ（Pe
llicularia sasakii）のようなペリクラリア種；例え
ば、ピリクラリア・オリゼー（Pyricularia oryzae）の
ようなピリクラリア種；例えば、フサリウム・クルモル
ム（Fusarium culmorum）のようなフサリウム種；例え
ば、ボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）のよう
なボツリチス種；例えば、セプトリア・ノドルム（Sept
oria nodorum）のようなセプトリア種；例えば、レプト
スフェリア・ノドルム（Leptosphaeria nodorum）のよ
うなレプトスフェリア種；例えば、セルコスポラ・カネ
ッセンス（Cercospora canescens）のようなセルコスポ
ラ種；例えば、アルテルナリア・ブラシカエ（Alternar
ia brassicae）のようなアルテルナリア種；例えば、シ
ュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Pseudoce
rcosporellaherpotrichoides）のようなシュードセルコ
スポレラ種。ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Helm
inthosporium carbonum）もまた挙げられるであろう。

【００５３】次の模範的な実施態様は、より詳細に本発
明を説明することを意図したものである：１．ラン類からのビベンジル合成酵素遺伝子の単離ラン植物体および細胞培養物は、ビベンジル合成酵素
（タンパク質のサイズ９０，０００Ｄ；特異抗血清と反
応）の生成に関与するビベンジル合成酵素の遺伝子を含
有する。その酵素は、４３，０００Ｄのホモダイマーか
らなる。

【００５４】ビベンジル合成酵素遺伝子およびｃＤＮＡ
配列、特にプラスミドｐ８．１．１上に含まれるｃＤＮ
Ａの単離においては、既知の操作、および例えば、次の
マニュアル：Sambrook,J., Fritsch, E. F., Maniatis,
T.: Molecular Cloning: ALaboratory Manual; Cold S
pring Harbor Laboratory, Second Edition 1989 に詳
細に記載されているような分子生物学の方法が使用され
る。

【００５５】“遺伝子ライブラリー”が、まず問題のラ
ンについて構築される：濃厚にされた細胞核からのゲノ
ムＤＮＡ（Bedbrook, J., Plant Molecular Biology Ne
wsletter 2, 24, 1981）が、制限酵素ＮｄｅＩＩを用い
て切断され、約１２，０００塩基対の平均鎖長をもつＤ
ＮＡ断片が、作製される。これらの断片は、λファージ
ＥＭＢＬ４（Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170, 8
27-842, 1983）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化され,
そしてそのファージはＥ．コリにおいて複製される。フ
ァージ集団の全体が、ラン細胞の全ゲノムＤＮＡおよび
したがって同様にビベンジル合成酵素（多重遺伝子族）
の遺伝子を、断片中にクローン化されて含む。

【００５６】ビベンジル合成酵素の遺伝子、それらのｍ
ＲＮＡ、およびビベンジル合成酵素ｃＤＮＡは、各場合
において等価値の核酸配列を含有する。何故なら、それ
らは、互いに他のものから誘導することができるからで
ある（遺伝子→ｍＲＮＡ→ｃＤＮＡ）。このことは、ビ
ベンジル合成酵素の遺伝子が、それぞれのビベンジル合
成酵素ｃＤＮＡもしくは特異的オリゴヌクレオチドとの
特異的ハイブリダイゼーションによって同定できること
を意味する。この方法によれば、ビベンジル合成酵素の
ゲノムファージクローンが同定され、タバコ中に伝達さ
れて、異種の植物において、ビベンジル（１−（３，５
−ジヒドロキシフェニル）−２−（３−ヒドロキシフェ
ニル）−エタン）が生産されることになる。そのトラン
スジェニック植物は、植物病原体に対して増大した抵抗
性を発揮する。その遺伝子を含むファージは、ハイブリ
ダイゼーションによって同定され、次いで単離され、複
製される。これらのファージ中にクローン化されたラン
のゲノムＤＮＡは、次に、種々の制限酵素を用いる解析
によってマッピングされ、ビベンジル合成酵素遺伝子の
位置が、ｃＤＮＡ配列もしくは合成オリゴヌクレオチド
を用いるその他のハイブリダイゼーション実験によって
確立される。最後に、その遺伝子単位が、制限酵素によ
る分解によってファージから切り取られ、適当に切断さ
れたプラスミドベクターｐＵＣ１８（Gibco-BRL GmbH,
Eggenstein, Federal Republic of Germany製）にクロ
ーン化され、組み換えプラスミドとして複製される。

【００５７】２．プラスミドｐ８．１．１の特徴（図
１参照）そのプラスミドは２つの構成分からなる：（ｉ）ビベンジル合成酵素ｃＤＮＡ：プラスミドｐＳｐ
ｏｒｔ１（Gibco/BRL)に挿入されたｃＤＮＡは、長さ
１．６ｋｂであり、ＭＬｕＩを用いてプラスミドｐ８．
１．１から切り取ることができる。

【００５８】（ｉｉ）ベクタープラスミド：そのｃＤＮ
Ａは、ベクターｐＳｐｏｒｔ１（Gibco/BRL、Eggenstei
n、 Federal Republic of Germany）にクローン化され
る。そのベクターのサイズは、４１０９ヌクレオチド対
である。それはアンピシリン耐性を保持する、すなわち
このプラスミドを有するＥ．コリ細胞は、抗生物質アン
ピシリンを含む栄養培地で成長する。Ｏｒｉ：Ｅ．コリ
中でそのプラスミドの複製に必要な配列の名称。

【００５９】プラスミドｐ８．１．１はアンピシリン耐
性遺伝子をもち、ビベンジル合成酵素ｃＤＮＡとして上
記約１．６ｋｂのＭＬｕＩ断片を含む。それは、常法に
より、ｐ８．１．１を宿すＥ．コリ（Ｅ．コリｐ８．
１．１）細胞中で複製できる。

【００６０】ｐ８．１．１を宿すＥ．コリ細胞（Ｅ．コ
リｐｉｎ５−４９）（例えば、JA221, Nakamura, K., I
nouye, M., EMBO J. 1, 771-775, 1982）のための好適
な栄養培地：Ｂａｃｔｏ−ペプトン＊１０ｇ酵母エキス５ｇＮａＣｌ５ｇ寒天２０ｇＨ₂Ｏ１ＬｐＨ７．５発酵：３７℃、好気的（＊Ｂａｃｔｏは、DIFCO Lab., Detroit, USAの商標）３．タバコの形質転換ａ）タバコ・シュートの培養およびタバコ・プロトプラ
ストの単離：ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacu
m)（Petit Havana SR1）が、ホルモン無添加のＬＳ培地
において無菌シュート培養として複製される（Linsmaie
r and Skoog 1965)。

【００６１】シュートのセグメントは、約６−８週間隔
で新鮮ＬＳ培地に移植される。シュート培養は、培養室
中で２４−２６℃、１２時間照明（１０００−３０００
ｌｕｘ）により維持される。

【００６２】葉のプロトプラストを単離するために、約
２ｇの葉（長さ約３−５ｃｍ）が、新しいカミソリの刄
で小片に切断される。葉の材料は、Ｋ３培地（Nagy and
Maliga 1976）、０．４ｍシュークロース、ｐＨ５．
６、２％セルラーゼＲ１０（Serva）および０．５％Ｍ
ａｃｅｒｏｚｙｍＲ１０（Serva）からなる酵素溶液２
０ｍｌ中で、１４−１６ｈ、室温でインキュベートされ
る。その後、プロトプラストは、０．３０ｍｍおよび
０．１ｍｍスチール篩を通して濾過されて、細胞残渣か
ら分離される。その濾液を１００ｘｇ１０分間遠心す
る。遠心の間、インタクトプロトプラストは浮上し、酵
素溶液の上にバンド状に集まる。細胞残渣からなるペレ
ットおよび酵素溶液を、ガラス毛細管ピペットを用いて
吸引廃棄する。予備精製プロトプラストは、新鮮Ｋ３培
地（浸透圧剤として０．４Ｍシュークロース）により１
０ｍｌにされ、もう１回浮上操作に懸けられる。洗浄培
地を吸引除去し、プロトプラストは、培養またはアグロ
バクテリアによる続いての感染（混合培養）のために１
−２ｘ１０⁵／ｍｌに希釈される。そのプロトプラスト
濃度は、カウンティングチャンバーにおいて測定され
る。

【００６３】ｂ）アグロバクテリウム・ツメファシエン
スとの混合培養による再生タバコプロトプラストの形質
転換：次に示すように、Marton et al. 1979の方法が若
干改変して使用される。プロトプラストは、前記のよう
に単離され、Ｋ３培地（０．４ｍシュークロース、０．
１ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．２ｍｌＫ３培地中（０．４ｍシ
ュークロース、０．１ｍｇ／ｌＮＡＡ、０．２ｍｇカイ
ネチン）中１−２ｘ１０⁵／ｍｌの濃度において、２６
℃２日間暗所で、そして１−２日間弱い照明（５００ｌ
ｕｘ）の下でインキュベートされる。最小Ａ（Ａｍ）培
地中のアグロバクテリウム懸濁液３０μｌ（濃度約１０
⁹アグロバクテリア／ｍｌ）が、プロトプラストの分裂
が見られる時点で直ぐに再生プロトプラスト３ｍｌに添
加される。混合培養は、暗所で３−４日間２０℃で続け
られる。その後、タバコ細胞を１２ｍｌ遠心管に添加
し、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）により１０ｍｌに希
釈し、６０ｘｇで１０分間沈殿させる。この洗浄操作
を、さらに１−２回繰り返してアグロバクテリアの殆ど
を除く。細胞懸濁液は、ＮＡＡ（ナフチル−１−酢酸）
１ｍｇ／ｌ、カイネチン０．２ｍｇ／ｌおよびセファロ
スポリン抗生物質セフォタキシン５００ｍｇ／ｌを含む
ｋ３培地（０．３ｍシュークロース）中５ｘ１０⁴／ｍ
ｌの濃度で培養される。細胞懸濁液を、各週新鮮Ｋ３培
地で希釈し、培地の浸透圧を、週に０．０５ｍシューク
ロース（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の割で徐々に減少させ
る。カナマイシン（硫酸カナマイシン（sigma）１００
ｍｇ／ｌ、６６０ｍｇ／ｇ活性Ｋｍ）による選択は、ア
ガロース“ビーズ・タイプ培養”（Shillito et al. 19
83）において混合培養後２−３週に開始される。選択開
始後、３−４週には、カナマイシン耐性コロニーが、生
育の妨げられたコロニーを背景に区別できる。

【００６４】ｃ）ＤＮＡによるタバコプロトプラストの
直接形質転換。硝酸カルシウム−ＰＥＧ形質転換Ｋ３培地１８０μｌ中約１０⁶プロトプラストが、ペト
リ皿中でＤＮＡの水溶液２０μｌと注意深く混合される
が、その水溶液は、欧州特許出願公開第0 309862号もし
くは欧州特許出願公開第0 464 461号に従うスチルベン
合成酵素プロモーターおよびｐ８．１．１由来のビベン
ジル合成酵素のｃＤＮＡからなるゲノムビベンジル合成
酵素遺伝子もしくはキメラ遺伝子、同じく好ましくは欧
州特許出願公開第0 309 862号もしくは欧州特許出願公
開第0 464 461号からのポリアデニル化配列をもつプラ
スミド０．５μｇ／μｌ、およびｐＬＧＶｎｅｏ２１０
３（Hain et al. 1985）０．５μｇ／μｌを含有する。
次いで、融合溶液（０．１ｍ硝酸カルシウム、０．４５
Ｍマニトール、２５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
６０００）、ｐＨ９）２００μｌが注意深く添加され
る。１５分後、洗浄液（０．２７５Ｍ硝酸カルシウム
ｐＨ６）５ｍｌが添加され、さらに５分後、プロトプラ
ストを遠心管に移し、６０ｘｇで沈殿させる。そのペレ
ットを、少量のＫ３培地に採取し、次項で記載するよう
に培養する。あるいはまた、プロトプラストは、Hain e
t al．1985に従って形質転換することができる。

【００６５】形質転換はまた、０．５μｇ／μｌのｐＬ
ＧＶｎｅｏ２１０３を添加することなしに実施すること
もできる。この場合には、リポーター遺伝子は使用され
ないので、ドットブロットハイブリダイゼーションが、
得られるカルスを、ビベンジル合成酵素遺伝子単位もし
くはキメラ遺伝子の存在について選択するために使用さ
れる。ｐ８．１．１由来のｃＤＮＡ配列は、ハイブリダ
イゼーションプローブとして使用することができる。当
然、抗体または真菌抵抗性の存在の確立による試験のよ
うな他の検出方法も、使用することができるであろう。

【００６６】ｄ）ＤＮＡとインキュベートされたプロト
プラストの培養およびカナマイシン耐性カルスの選択改変された“ビーズタイプ培養”技術（Shillito et a
l. 1983）が、下記のカナマイシン耐性コロニーの培養
および選択のために使用される。ＤＮＡによるプロトプ
ラストの処理（ｃ参照）の後１週に、細胞懸濁液３ｍｌ
が、Ｋ３培地（０．３Ｍシュークロース＋ホルモン；
１．２％（Seaplaque）ＬＭＴアガロース（低融解アガ
ロース、Marine Colloids））３ｍｌの入った５ｃｍペ
トリ皿中で混合される。この目的のために、アガロース
は乾燥状態でオートクレーブされ、Ｋ３培地の添加に続
いて、マイクロ波オーブン中で短時間沸騰させる。その
アガロースが固まると、包括されたタバコの微小カルス
を含むアガロースディスク（“ビーズ”）が、その後の
培養および選択のために１０ｃｍペトリ皿に移され、Ｋ
３培地（０．３Ｍシュークロース、１ｍｇ／ｌのＮＡ
Ａ、０．２ｍｇ／ｌカイネチン）１０ｍｌおよび１００
ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン（sigma）を、各皿に添加す
る。その液体培地は、１週毎に交換される。この間、培
地の浸透圧は１回毎に低下する。

【００６７】交換培地（Ｋ３＋Ｋｍ）のシュークロース
量は、各週０．０５ｍ（約６０ｍＯｓｍ）づつ減少され
る。

【００６８】ＤＮＡ形質転換に続くカナマイシン耐性タ
バココロニーの選択スケジュール： 0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M (液体媒体中のシュークロス濃度) U ES K 1 2 3 4 5 6 [週（ＤＮＡ取り込み後) (Ｋ３培地１ｍｇＮＡＡ、０.２ｍｇカイネチン) Ｕ＝ＤＮＡ取り込みＥ＝アガロースへの包括Ｓ＝カナマイシン（硫酸カナマイシン１００ｍｇ／ｌ）
による選択Ｋ＝カナマイシン耐性コロニーが、明瞭にバックグラウ
ンドから区別される。

【００６９】ｅ）カナマイシン耐性植物体の再生：カナ
マイシン耐性コロニーが、約０．５ｃｍの直径に達する
と直ちに、それらの半分は、再生培地（ＬＳ培地、２％
シュークロース、０．５ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン
ＢＡＰ）に置かれ、培養室で２４℃で１２時間の照明
（３０００−５０００ｌｕｘ）下に維持される。他の半
分は、１ｍｇ／ｌＮＡＡ，０．２ｍｇ／ｌカイネチ
ン、０．１ｍｇ／ｌＢＡＰおよび１００ｍｇ／ｌ硫酸カ
ナマイシンを含むＬＳ培地におけるカルス培養として繁
殖させられる。再生シュートが、約１ｃｍの大きさであ
る時には、それを切断し、発根のために成長調節因子な
しの１／２ＬＳ培地（１％シュークロース、０．８％寒
天）上に置かれる。そのシュートは、１００ｍｇ／ｌ硫
酸カナマイシンを含む１／２ＬＳ培地で発根し、後に土
壌に移植される。

【００７０】ｆ）アグロバクテリウム・ツメファシエン
スを用いる葉片ディスクの形質転換葉片ディスク（Horsch et al. 1985）の形質転換のため
に、無菌シュート培養からの長さ約２−３ｃｍの葉が、
直径約１ｃｍのディスクにパンチされ、これらのディス
クが、約５分間適切なアグロバクテリアの懸濁液（約１
０⁹／ｍｌ）（ｂ参照）とともに、Ａｍ培地（下記）で
インキュベートされる。感染した葉片は、ホルモン無添
加のＭＳ培地（下記）で約２４℃で３−４日間維持され
る。この間に、アグロバクテリウムは、葉片に蔓延して
生育する。続いて、葉片は、ＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｍ
ｌＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｍｌＮＡＡ）中で洗浄され、５
００μｇ／ｍｌセフォタキシンと１００μｇ／ｍｌ硫酸
カナマイシン（sigma）を含む同一培地（０．８％寒
天）上に置かれる。２週間後、その培地を更新すべきで
ある。形質転換されたシュートは、さらに２−３週間後
に目に見えるようになる。シュートは、全く選択圧なし
においても、平行して再生されるべきである。次いで、
再生シュートは、生物学的試験を用いて、形質転換につ
いて、例えばノパリン合成酵素もしくはビベンジル合成
酵素活性に関して試験されねばならない。形質転換シュ
ートの１−１０％は、この方法で獲得される。ビベンジ
ル合成酵素もしくは配列番号：２によるタンパク質に対
する抗体が、常法により得られ、同様に形質転換が起き
ているか否かの検出のために使用される。

【００７１】形質転換を検出するための生化学的方法植物組織におけるノパリンの検出：ノパリンは、Otten
and Schilperoort (1978) および Aerts et al. (1979)
による記載のように次のように検出される。植物材料
（カルスもしくは葉片）５０ｍｇが、エッペンドルフチ
ューブ中の０．１Ｍアルギニンを含むＬＳ培地で、室温
で一夜インキュベートされる。その後、植物材料を、吸
収性の紙の上で軽く拭い、ガラス棒を用いて新しいエッ
ペンドルフ遠心管中でホモジナイズし、２分間エッペン
ドルフ遠心機で遠心する。その上澄液２μｌを、電気泳
動用のペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭペーパー）（２
０ｘ４０ｃｍ）上にドットし、乾燥する。そのペーパー
を溶離液（５％ギ酸、１５％酢酸、８０％Ｈ₂Ｏ、ｐＨ
１．８）に浸し、４００Ｖで４５分間電気泳動する。ノ
パリンは、陽極方向に移動する。次に、そのペーパー
を、熱風中で乾燥し、フェナントレンキノン染色剤（エ
タノール中０．０２％フェナントレンキノンおよび６０
％エタノール中１０％ＮａＯＨの等量）中を移動方向に
通して引く。乾燥させたペーパーを、長波ＵＶ光で観察
し、写真に撮る。その試薬は、アルギニンおよびアルギ
ニン誘導体を染色して、黄色の蛍光を発するようにす
る。

【００７２】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（ＮＰＴＩＩ）酵素試験：ＮＰＴＩＩ活性は、次に
示すように、Reiss et al. (1984) により記載され、Sc
hreier et al. (1985) によって改変されたような、カ
ナマイシンのそのままの位置でのリン酸化によって植物
組織中で検出される。植物組織５０ｍｇを、ガラス粉末
を入れた抽出バッファー（１０％グリセロール、５％２
−メルカプトエタノール、０．１％ＳＤＳ、０．０２５
％ブロモフェノールブルー、６２．５ｍＭトリスｐＨ
６．８）５０μｌ中で、氷上でホモジナイズし、次いで
エッペンドルフ遠心機で４℃で１０分間遠心する。その
上澄液５０μｌを、未変生のポリアクリルアミドゲル
（１４５ｘ１１０ｘ１．２ｍｍ；分離用ゲル：１０％ア
クリルアミド、０．３３％ビスアクリルアミド、０．３
７５ＭトリスｐＨ８．８、濃縮用ゲル：５％アクリル
アミド、０．１６５％ビスアクリルアミド、０．１２５
ＭトリスｐＨ６．８）の上に添加し、４℃、６０Ｖで
一夜電気泳動する。ブロモフェノールブルーマーカーが
ゲルを通過するや否や、ゲルを蒸留水で１０分づつ２
回、そして反応バッファー（６７ｍＭトリス−マレイン
酸、ｐＨ７．１、４２ｍＭＭｇＣｌ₂、４００ｍＭ塩化
アンモニウム）で１回３０分洗浄する。そのゲルを、同
じ大きさのガラスプレートに横たえ、基質硫酸カナマイ
シン（２０μｇ／ｍｌ）および２０−２００μＣｉ³²Ｐ
ＡＴＰ（Amersham）を含有する反応バッファー中の１
％アガロース溶液４０ｍｌを重層する。そのサンドウィ
ッチゲルを、室温で３０分間インキュベートし、次に、
ホスホセルロースペーパーＰ８１（Whatman)のシートを
そのアガロースの上に置く。４層の３ＭＭ（Whatman）
濾紙および若干のペーパータオルを、そのホスホセルロ
ースペーパーの上に積み重ねる。その位置でのリン酸化
された放射性リン酸カナマイシンのＰ８１ペーパーへの
転移は、３−４時間後に終了する。そのＰ８１ペーパー
を、プロテイナーゼＫおよび１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）の溶液中で、６０℃３０分間インキュベー
トし、次いで、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．５
２５０ｍｌ中で、８０℃で３−４回洗浄し、乾燥し、続
いて、−７０℃で１−１２時間オートラジオグラフィー
（ＸＡＲ５フィルム、Kodak）を行う。４．ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum)（ジ
ャガイモ）の形質転換形質転換は、欧州特許出願公開第0 242 246号１４〜１
５頁に記載の方法により、ビベンジル合成酵素遺伝子を
もつＴｉプラスミドを宿すアグロバクテリアを用いて的
確に実施される。

【００７３】特に指示しない限り、上記実施例中のすべ
ての％値は、重量％をさす。

【００７４】上記実施例に従って得られた植物細胞およ
び植物体（タバコ）において、ビベンジル合成酵素遺伝
子の存在は、サザンブロット分析によって確認される。
ビベンジル合成酵素遺伝子の発現は、ノザンブロット分
析で検出され、ビベンジル合成酵素およびビベンジル
は、特異抗体を用いて検出される。形質転換および非形
質転換植物（対照）は、ボトリチス・シネラの胞子懸濁
液を散布され、真菌感染の程度は、１週間後に測定され
る。形質転換された植物は、真菌感染に対して抵抗性を
増大したことを示した（対照に用いた非形質転換植物と
比較して）。

【００７５】プラスミドｐ８．１．１のｃＤＮＡ配列お
よび配列番号：１によるｃＤＮＡ配列とのハイブリダイ
ゼーション先に議論したように、本発明による好適なビベンジル合
成酵素遺伝子は、プラスミドｐ８．１．１中に含まれる
ｃＤＮＡ配列もしくはその部分に、または配列番号：１
によるｃＤＮＡ配列もしくはその部分にハイブリダイズ
し、そしてビベンジル合成酵素をコードしていることを
特徴とする。そのハイブリダイゼーションはまた、一般
的な方法で、例えば、植物体もしくは植物体の部分にお
けるビベンジル合成酵素遺伝子を同定し、単離すること
に使用できる。

【００７６】ビベンジル合成酵素遺伝子を含むファージ
クローンは、緊縮性の低い条件下で、優先的に、ｐ８．
１．１（もしくは配列番号：１）とのハイブリダイゼー
ションによって同定できる。クローンのサブ集団が得ら
れ、続いて、そのクローンが、例えば、植物体への直接
遺伝子伝達（Hain et al. 1985 and 1990）およびビベ
ンジル合成酵素もしくは（抗体を用いる）配列番号：２
のタンパク質に関する、またはビベンジル合成酵素の酵
素活性に関する、またはビベンジルに関する、トランス
ジェニック植物組織の分析によって、ビベンジル合成酵
素遺伝子クローンとして同定される。

【００７７】実施例によって、ビベンジル合成酵素遺伝
子クローンは、プローブとしてｃＤＮＡクローンｐ８．
１．１（もしくは配列番号：１）を用いて、標準ハイブ
リダイゼーション条件下で同定された。そのハイブリダ
イゼーションは、２ＳＳＣを含有する標準バッファー中
で６８℃１２時間実施された。洗浄は、２ＳＳＣおよび
０．１％ＳＤＣで７４℃（３０分２回）、続いて０．２
ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＣで（１０分）行われた。フ
ァージクローンＤＮＡは、植物−選択性マーカー（カナ
マイシン耐性）と一緒にタバコプロトプラスト中に同時
伝達され、そのビベンジル合成酵素が、タバコ中で検出
された。対応する結果が、適切なプロモーター（例え
ば、欧州特許出願公開第0 309 862号もしくは欧州特許
出願公開第0464 461号によるスチルベン合成酵素プロモ
ーター）の下でプラスミドｐ８．１．１からｃＤＮＡを
発現することによって得られた。

【００７８】植物体および植物細胞の形質転換に使われ
た若干の培地を、以下に記す：Ａｍ培地３.５ｇＫ₂ＨＰＯ₄ １.５ｇＫＨ₂ＰＯ₄ ０.５ｇクエン酸三ナトリウム０.１ｇＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ１ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２ｇグルコース（１ｌに調整）タバコシュートの無菌培養用培地大量成分、Ｍｓ塩類の１／２濃度微量成分、Ｍｓ塩類の１／２濃度Ｆｅ−ＥＤＴＡムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）ミオイノシトール１００ｍｇ／ｌシュークロース１０ｍｇ／ｌ寒天８ｇ／ｌビタミン類パントテン酸Ｃａ１ｍｇ／ｌビオチン１０ｍｇ／ｌニコチン酸１ｍｇ／ｌピリドキシン１ｍｇ／ｌサイアミン１ｍｇ／ｌｐＨ５.７（オートクレーブ前）Ｋ３培地ニコチアナ・タバクム petit Havana SR1、ニコチアナ
・タバクム Wisconsin38 およびニコチアナ・プルバギ
ニホリア（plubaginifolia）プロトプラストの培養用
（Nagy and Maliga, 1976）大量成分ＮＨ₄ＮＯ₃ ２５０ｍｇ／ｌＫＮＯ₃ ２５００ｍｇ／ｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ９００ｍｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２５０ｍｇ／ｌＮａＨ₂ＰＯ₄・１Ｈ₂Ｏ１５０ｍｇ／ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １３４ｍｇ／ｌＣａＨＰＯ₄・１Ｈ₂Ｏ５０ｍｇ／ｌ微量成分Ｈ₃ＢＯ₃ ３ｍｇ／ｌＭｎＳＯ₄・１Ｈ₂Ｏ１０ｍｇ／ｌＺｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ２ｍｇ／ｌＫＩ０.７５ｍｇ／ｌＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０.２５ｍｇ／ｌＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０.０２５ｍｇ／ｌＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０.０２５ｍｇ／ｌＦｅ−ＥＤＴＡＮａ₂ＥＤＴＡ３７.２ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２７.８ｍｇ／ｌイノシトール１００ｍｇ／ｌシュークロース１３７ｇ／ｌ（＝０.４Ｍ）キシロース２５０ｍｇ／ｌビタミン類ニコチン酸１ｍｇ／ｌピリドキシン１ｍｇ／ｌサイアミン１０ｍｇ／ｌホルモン類ＮＡＡ１.０ｍｇ／ｌカイネチン０.２ｍｇ／ｌｐＨ５.６濾過により無菌化リンスマイヤー・スクーグ培地（Linsmaier and Skoog
1965）再生プロトプラストの培養用、およびタバコ腫瘍および
カルスの組織培養用。リンスマイヤー・スクーグ（Ｌ
Ｓ）培地は、次の改変を行ったムラシゲ・スクーグ培地
（Murashige and Skoog, 1962）である：−サイアミン
が、高濃度で使用される（０．１ｍｇ／ｌの代わりに
０．４ｍｇ／ｌ）；−グリシン、ピリドキシンおよびニ
コチン酸が省かれる。

【００７９】大量成分ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５０ｍｇ／ｌＫＮＯ₃ １９００ｍｇ／ｌＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ４４０ｍｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ３７０ｍｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １７０ｍｇ／ｌ微量成分Ｈ₃ＢＯ₃ ６.２ｍｇ／ｌＭｎＳＯ₄・１Ｈ₂Ｏ２２.３ｍｇ／ｌＺｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ８.６ｍｇ／ｌＫＩ０.８３ｍｇ／ｌＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０.２５ｍｇ／ｌＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０.０２５ｍｇ／ｌＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０.０２５ｍｇ／ｌＦｅ−ＥＤＴＡＮａ₂ＥＤＴＡ３７.２ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２７.８ｍｇ／ｌイノシトール１００ｍｇ／ｌシュークロース３０ｇ／ｌ寒天８ｇ／ｌビタミン類サイアミン０.４ｍｇ／ｌホルモン類ＮＡＡ１ｍｇ／ｌカイネチン０.２ｍｇ／ｌｐＨ５.７（オートクレーブ前）５．ブレチラ・ストリアタ（Bletilla striata）由来
のビベンジル合成酵素の誘導および精製５．１材料および方法５．１．１植物材料ブレチラ・ストリアタの塊根が使用された。

【００８０】５．１．２ボトリチス・シネレアおよび
リゾトニア・クロコルムの固形寒天培養その培養は、ポテト・デキストロース寒天プレート（Ｐ
ＤＡプレート、DIFCODetroit, Mich. USA）上で行われ
た。

【００８１】５．１．３ビベンジル合成酵素の誘導塊根の皮を剥き、メスで厚さ約２ｍｍの切片に切断し、
湿度１００％の中で２０℃で保存した。

【００８２】続いての真菌による処理のために、ボトリ
チスもしくはリゾトニアの１カ月経った寒天プレート
に、水道水１０ｍｌを添加し、菌糸（リゾトニア）もし
くは菌糸＋分生胞子（ボトリチス）を、ヘラを用いて懸
濁液にした。

【００８３】ランの切片を、そのようにして得た懸濁液
に１分間浸漬し、次いで、上記のように保存した。誘導
されたラン切片は、凍結され、−８０℃の液体窒素中で
保存された。

【００８４】５．１．４置換ケイ皮酸およびフェニル
プロピオン酸のＣｏＡエステルの合成ＣｏＡエステルは、Stoeckigt and zenk (1975), Z. Na
turforsch. 30C, 352-358 記載の方法により調製され
た。その酸を、ヒドロキシスクシンイミドエステルに変
換し、次いで、ＣｏＡエステルを得るためにエステル交
換反応を行った。ＣｏＡエステルはペーパークロマトグ
ラフィーによって精製した。

【００８５】５．１．５ビベンジル合成酵素活性試験日常試験は、基質としてジヒドロ−ｍ−クマロイル−Ｃ
ｏＡを用いて実施した。

【００８６】試験混合液：［２−¹⁴Ｃ］マロニル−ＣｏＡ（１．８５ＴＢｑ／ｍｏｌ；３７０Ｂｑ／μｌ）５μｌ酵素溶液４０μｌ基質溶液（１ｍＭ）５μｌインキュベーション：３０℃水浴中で３０分試験停止：二重蒸留水５００μｌナリンゲニン（１ｍｇ／ｍｌ酢酸エチル）１０μｌその試験混合液を、各場合とも酢酸エチル１ｍｌととも
に２０秒間振盪して２回抽出した。その有機相を合わせ
て、真空遠心機で濃縮し、各場合酢酸エチル２０μｌで
２回採取し、シリカゲル薄層プレート（蛍光指示薬２５
４ｎｍ含有）上に、幅２．５ｃｍの線として添加した。

【００８７】溶離液：ＥｔＯＡｃ：トルエン：アセトン
（容量比で５０：３５：１５）そのプレートの放射能プ
ロフィルを、薄層スキャナー（LB2723, Berthold）を用
いて記録した。生産物を含有するゾーンを掻き取り、シ
ンチレーション液（11 eco,Roth）と混合して、カウン
トした。

【００８８】５．１．６タンパク質定量タンパク質濃度は、ＭｉｋｒｏＡｓｓａｙ（Bio-Ra
d）を用いて、 Bradford(1976) Anal. Biochem. 72, 24
8 の変法により実施された。ＢＳＡを算出基準タンパク
質として使用した。

【００８９】５．１．７電気泳動法５．１．７．１サンプル調製タンパク質を、４倍量のアセトンを用いて−２０℃、３
０分間内に沈殿させ、８０％（ｖ／ｖ）アセトンおよび
８０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、真空遠心機で乾
燥し、２分間沸騰させて抽出液に溶解した。

【００９０】５．１．７．２ＳＤＳ−Ｐａｇｅそのタンパク質を、 Laemli (1970) Nature 227,680-68
5 の方法によりミニゲル装置（Biometra）で分画した。

【００９１】５．１．７．３タンパク質染色クーマシー染色：ゲルを染色液中で２０分間浸透させ
た。バックグラウンドを脱色液を用いて脱色した。

【００９２】染色液：クーマシーブリリアントブルーＲ２５００．２５％（ｗ／ｖ）メタノール５０％（ｖ／ｖ）氷酢酸５％（ｖ／ｖ）脱色液：イソプロパノール４０％（ｖ／ｖ）氷酢酸１０％（ｖ／ｖ）銀染色： Wray らの方法を使用した（Wray, W., Bouli
kas, T., Wray, V.P.,Hancock, R. (1981) Anal. Bioch
m. 118, 197-203）。

【００９３】５．１．８クロマトフォーカシング等電点は、ＰＢＥ９４のクロマトフォーカシングによっ
て測定された。そのＣＦは、ビベンジル合成酵素の濃厚
調製液を用いて実施された。

【００９４】５．１．８．１実施クロマトグラフィー材料：ＰＢＥ９４（Pharmacia）カラム寸法：１．０ｘ２２ｃｍ；１７ｍｌ平衡化：２５ｍＭヒスチジン（ＨＣｌ，ｐＨ６．２，
２ｍＭ２−メルカプトエタノール溶離液：Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ７４−ＨＣｌ（二重蒸
留水で１：８希釈）ｐＨ４．０，２ｍＭメルカプトエタノール（始発バッフ
ァー）流速：２２ｍｌ／ｈ分画量：３ｍｌビベンジル合成酵素を、ＨＡＰおよびセファデックスＳ
−２００ＨＲ（精製、参照）によって濃縮し、ＣＦ始発
バッファー中に移した。

【００９５】流速１２ｍｌ／ｈにおけるＳ−２００のク
ロマトグラフィーからの活性のピーク（４８ｍｌ；全活
性＝始発バッファー中５．４ｐｋａｔ）を、クロマトフ
ォーカシングカラムに添加した。

【００９６】１．８．２結果画分ｐＨ１６.２５６.２１０６.１１５５.８２０５.６２５５.３３０５.０３５４.８４０４.５４５４.２５０４.０画分活性（ｐｋａｔ／ｍｌ）３４０.０１３５０.０２３６０.０８３７０.１２３８０.０９３９０.１３４００.１０４１０.０４４２０.０２５．２ビベンジル合成酵素（ブレチラ・ストリアタ由
来）の精製バッファーＰ１：２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０，２ｍＭ２
−メルカプトエタノールＰ２：２５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０，２ｍＭ
２−メルカプトエタノールＰ３：１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４，２ｍＭ２
−メルカプトエタノールＰ４：２５ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０，２ｍＭ２−
メルカプトエタノールカラムクロマトグラフィー法ヒドロキシルアパタイト：クロマトグラフィー材料：Ｂｉｏ−ＧｅｌＨＴＰ(Bio
-Rad) カラム寸法：２．０ｘ２０ｃｍ；６３ｍｌ平衡化：Ｐ１直線濃度勾配：１５０ｍｌＰ１＋１５０ｍｌＰ２溶離流速：２５ｍｌ／ｈ分画量：６ｍｌ分子ふるいクロマトグラフィークロマトグラフィー材料：ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２
００ＨＲ（Pharmasia）カラム寸法：２．３ｘ１０
５ｃｍ；４３６ｍｌ平衡化：Ｐ３溶離流速：３０ｍｌ／ｈ分画量：４ｍｌアフィニティークロマトグラフィークロマトグラフィー材料： Reactive Red 120-agaros
e, Type3000-C1(Sigma) カラム寸法：１．１ｘ６．０ｃｍ；５．７ｍｌ平衡化：Ｐ３溶離液：Ｐ２流速：１０ｍｌ／ｈ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラム：ＭｏｎｏＱＨＲ５／５（Pharmacia）平衡化：Ｐ4 直線濃度勾配：０−２５０ｍＭＮａＣｌ溶離流速：１ｍｌ／ｍｉｎ分画量：１ｍｌ誘導されたラン塊茎８０ｇを、液体窒素下、乳鉢中で微
粉砕し、それにＰ１１０００ｍｌおよびＰｏｌｙｃｌａ
ｒＡＴ（Serva）２０ｇを添加し、そしてその全部をＵ
ｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて５ｘ１５秒混合し、１
２，０００ｇで３０分間遠心した。

【００９７】粗抽出液の粘度が高く、クロマトグラフィ
ーカラムに直接添加することができなかった。それ故、
ヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィーを、一
部、バッチ法で実施した。その粗抽出液をＰ１１００
ｍｌ中でＨＡＰ２０ｇの懸濁液と混合し、次いで２００
ｒｐｍ３時間振盪した。

【００９８】糖および粘質物の大部分を除くために、Ｈ
ＡＰを、低い遠心速度（１５００ｇ）で遠心して落と
し、各場合Ｐ１５００ｍｌで３回洗浄し、カラムに移
した。

【００９９】溶出は、２５−２５０ｍＭリン酸の直線濃
度勾配を用いて行った。ビベンジル合成酵素は、１６０
−１８０ｍＭリン酸濃度で溶出した。

【０１００】高い比活性をもつ画分（４８ｍｌ）を、Ａ
ｑｕａｃｉｄｅ（Calbiochem）を用いる透析で１５ｍｌ
に濃縮し、分子ふるいに懸けた。

【０１０１】ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲクロマ
トグラフィーからの最も活性の高い画分（１２ｍｌ）を
合わせて、ｒｅａｃｔｉｖｅｒｅｄ１２０−ａｇａｒ
ｏｓｅを充填したカラムに添加した（流速６ｍｌ／
ｈ）。

【０１０２】非結合タンパク質は、Ｐ３５０ｍｌを用
いて除去された（流速８０ｍｌ／ｈ）。溶出は、Ｐ２を
用いて実施した。

【０１０３】４．５ｍｌの活性ピークをＰＤ１０（Phar
macia）を通してＰ４で再び平衡にして、ＭｏｎｏＱ上
に流速０．５ｍｌ／ｈで添加した。

【０１０４】溶出は、Ｐ４中０−２５０ｍＭＮａＣｌ
の直線濃度勾配を用いて行った。ビベンジル合成酵素
は、１９５−２３０ｍＭＮａＣｌで溶出した（画分１０
−１８）。

【０１０５】ブレチラ・ストリアタからのビベンジル合成酵素の精製画分総タンパク質全活性比活性活性収率濃縮倍率（ｍｇ） (pkat) (pkat/mg) （％）粗抽出液 408.40 8.32 0.02 100 1 ハイドロキシアパタイト溶出液 17.18 6.86 0.40 82 20 セファクリル S200 ＨＲ−溶出液 2.24 5.74 2.56 69 128 レッドアガロース溶出液 1.16 3.58 3.09 43 155 モノ Q 溶出液 0.11 0.50 4.55 6 228 次の文献が、論題の“ビベンジル類”に関して引用する
ことができる：

【０１０６】

【表１】

【０１０７】次の文献が、植物体および植物細胞の形質
転換に関して引用することができる：

【０１０８】

【表２】

【０１０９】

【表３】

【０１１０】

【表４】

【０１１１】さらに、次の公表された特許出願が引用さ
れる：欧州特許出願公開第１１６７１８号欧州特許出願公開第１５９４１８号欧州特許出願公開第１２０５１５号欧州特許出願公開第１２０５１６号欧州特許出願公開第１７２１１２号欧州特許出願公開第１４０５５６号欧州特許出願公開第１７４１６６号欧州特許出願公開第１２２７９１号欧州特許出願公開第１２６５４６号欧州特許出願公開第１６４５９７号欧州特許出願公開第１７５９６６号国際公開第８４／０２９１３号国際公開第８４／０２９１９号国際公開第８４／０２９２０号国際公開第８３／０１１７６号

【０１１２】

【表５】

【０１１３】

【表６】

【０１１４】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐ８．１．１を表す。ビベンジル合
成酵素ｃＤＮＡは、サイズ約１．６ｋｂのＭｌｕＩ断片
に位置している。図１における略語の意味は、次の通り
である：Ｅ：ＥｃｏＲＩＳ：ＳａｌＩＢ：ＢａｍＨＩＰ：ＰｓｔＩＨ：ＨｉｎｄＩＩＩＮ：ＮｏｔＩＰＬ：プラスミドｐＳｐｏｒｔ１由来のポリリンカ
ー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 14/415 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 9/88 Ｃ１２Ｑ 1/527 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ハンス−イエルク・ライフドイツ50939ケルン・ゴツテスベーク165

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビベンジル合成酵素遺伝子。
【請求項２】プラスミドｐ８．１．１に含まれるビベン
ジル合成酵素ｃＤＮＡ配列もしくはその部分と、または
配列番号：１によるｃＤＮＡ配列もしくはその部分とハ
イブリダイズし、そしてビベンジル合成酵素をコードし
ていることを特徴とするビベンジル合成酵素遺伝子。
【請求項３】ラン類から得ることができる請求項１およ
び２記載のビベンジル合成酵素遺伝子。
【請求項４】ファレノプシス種（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓ
ｉｓｓｐｐ．）、ブレチラ・ストリアタ（Ｂｌｅｔｉ
ｌｌａｓｔｒｉａｔａ）もしくはエピパクチス・パル
ストリス（Ｅｐｉｐａｃｔｉｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ）
から得ることができる請求項１ないし３記載のビベンジ
ル合成酵素遺伝子。
【請求項５】請求項１ないし４記載のビベンジル合成酵
素遺伝子の、特定のプロモーターにおける、調節部分。
【請求項６】請求項１ないし４記載のビベンジル合成酵
素遺伝子の構造遺伝子。
【請求項７】“外来”ＤＮＡもしくは“付加”ＤＮＡと
して、請求項１ないし６記載の１個もしくは複数個のビ
ベンジル合成酵素遺伝子またはその部分を含有する組み
換え原核生物もしくは真核生物のＤＮＡ。
【請求項８】植物細胞（プロトプラストを含む）もしく
は植物体（植物体の部分および種子を含む）に含有され
る請求項７記載の組み換えＤＮＡ。
【請求項９】請求項１ないし８記載の１個もしくは複数
個のビベンジル合成酵素遺伝子またはその部分、および
／または請求項７記載の組み換えＤＮＡを含有するベク
ター。
【請求項１０】ベクタープラスミドｐ８．１．１。
【請求項１１】請求項１ないし６記載の１個もしくは複
数個のビベンジル合成酵素遺伝子またはその部分、およ
び／または請求項７記載の組み換えＤＮＡまたは請求項
９および１０記載のベクターを宿している形質転換微生
物。
【請求項１２】エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）株Ｅ．コリｐ８．１．１およびその
変異株。
【請求項１３】植物細胞（プロトプラストを含む）およ
び植物体（植物体の部分および種子を含む）を形質転換
するための、請求項１ないし１２記載のビベンジル合成
酵素遺伝子および／またはその部分および／または組み
換えＤＮＡおよび／またはベクターおよび／または形質
転換微生物の使用。
【請求項１４】“外来”もしくは“付加”ＤＮＡとし
て、請求項１ないし７記載の１個もしくは複数個のビベ
ンジル合成酵素遺伝子および／またはその部分および／
または組み換えＤＮＡを宿しているトランスジェニック
植物細胞（プロトプラストを含む）および植物体（植物
体の部分および種子を含む）。
【請求項１５】病害虫に対して抵抗性の増大したトラン
スジェニック植物細胞（プロトプラストを含む）および
植物体（植物体部分および種子を含む）を作製する方法
であって、（ａ）請求項１ないし７記載の１個もしくは
複数個のビベンジル合成酵素遺伝子またはその部分およ
び／または組み換えＤＮＡが、植物細胞（プロトプラス
トを含む）のゲノム中に挿入され、そして適宜、（ｂ）
完全な形質転換植物体が、トランスジェニック植物細胞
（プロトプラストを含む）から再生され、そして適宜、
複製され、そして適宜、（ｃ）目的の植物体部分（種子
を含む）が、かくして得られた親世代の、またはそれか
ら得られる後の世代のトランスジェニック植物体から単
離される、ことを特徴とする方法。
【請求項１６】請求項１ないし６記載のビベンジル合成
酵素遺伝子またはその部分または請求項７記載の組み換
えＤＮＡを宿している複製材料を生産するため、ならび
に新規な植物体およびその複製材料を生産するための、
請求項１４記載のトランスジェニック植物細胞（プロト
プラストを含む）および植物体（植物体部分および種子
を含む）の使用。
【請求項１７】請求項１４記載のトランスジェニック植
物細胞および植物体を複製することによって得られる複
製材料。
【請求項１８】植物体からビベンジル合成酵素遺伝子を
単離するために、そしてトランスジェニック植物細胞
（プロトプラストを含む）および植物体（植物体部分お
よび種子を含む）の生産において、プラスミドｐ８．
１．１に含まれるか、または配列番号：１に挙げられる
ｃＤＮＡと完全にもしくは部分的に同一のＤＮＡ配列の
使用。
【請求項１９】本発明によるビベンジル合成酵素遺伝子
によってコードされるビベンジル合成酵素。
【請求項２０】プラスミドｐ８．１．１に含有されるビ
ベンジル合成酵素構造遺伝子によってコードされるビベ
ンジル合成酵素。
【請求項２１】配列番号：２によるタンパク質。
【請求項２２】ビベンジル合成酵素を検出するための、
請求項１９ないし２１記載のビベンジル合成酵素または
タンパク質の使用。